Застосування бактеріального штаму lactobacillus reuteri dsm 17938 для зниження колік у немовлят

1. Бактеріальний штам роду Lactobacillus reuteri, депонований в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Німеччина) під депозитарним номером DSM 17938, де вказаний штам здатний знижувати коліки у немовлят. 2. Композиція, що містить бактеріальний штам за п. 1. 3. Спосіб отримання продукту, який знижує коліки у немовлят, який включає тестування бактеріального штаму молочної бактерії на здатність стимулювати експресію IL-10 у прийнятих клітинаххазяїнах, і отримання продукту, що містить клітини вибраного штаму. 4. Продукт для зниження дитячих колік, отриманий способом за п. 3. 5. Продукт за п. 4, де штамом молочнокислих бактерій є штам Lactobacillus reuteri. 6. Продукт за п. 5, де штамом молочнокислих бактерій є штам Lactobacillus reuteri DSM 17938. 7. Продукт за п. 5, що додатково містить середньоланцюжково-тригліцеридне масло. UA (21) a200813986 (22) 30.05.2007 (24) 25.03.2011 (86) PCT/SE2007/050371, 30.05.2007 (31) 11/446,628 (32) 05.06.2006 (33) US (46) 25.03.2011, Бюл.№ 6, 2011 р. (72) КОННОЛЛІ ЕАМОНН, SE, МЕЛЛЬСТАМ БО, SE (73) БІОГАЙА АБ, SE (56) WEIZMAN Z. ET AL.: 'Effect of a Probiotic Infant Formula on Infections in Child Care Centers: Comparison of Two Probiotic Agents' PEDIATRICS vol. 115, 2005, pages 5 - 9 SAVINO F. ET AL.: 'Lactobacillus reuteri ATCC 55730 versus simethicone in the treatment colic: A perspective randomised study: 328' PEDIATRIC RESEARCH vol. 58, no. 2, August 2005, page 411 US А 200527164, 08.12.2005 US А 2004185032, 23.09.2004 US А 2006251634, 09.11.2006 C2 2 (19) 1 3 розвитку. Психосоціальні фактори включають: варіанти нормального плачу, вплив на поведінку атипового виховання і проблеми у взаємовідносинах батьків і дітей. Гастроінтестинальні порушення пов'язують з колікою при певному положенні ніг немовляти і кривлянні під час нападу плачу. Гастроінтестинальні фактори коротко викладені нижче. Неправильні способи годування, такі як годування з пляшечки, годування в горизонтальному положенні або недостатнє зригування після годування, розглядають як причинні фактори. Грудне вигодовування в перші шість місяців вважають єдиним профілактичним фактором. Ризик дитячих колік в 1,86 разу вищий у дітей на штучному вигодовуванні (Saavedra М. A., Dacosta J. S., Garcias G., Horta В. L., Tomasi E., Mendoca R. Infantile colic incidence and associated risk factors: a cohort study. Pediatr (Rio J) 2003; 79(2): 115-122). Lothe et al. показати, що коліка відбувається через чутливість до сироваткового білка коров'ячого молока (Lothe L., Lidberg Т. Cow's milk whey protein elicits symptoms of infantile colic in colicky formula fed infants: A double blind cross over study. Pediatrics 1989; 83: 262). У недавньому дослідженні був зроблений висновок, що харчова гіперчутливість може розцінюватися як причина лише в незначній кількості випадків дитячих колік (Hill D. J., Hosking C. S. Infantile colic and food hypersensitivity. Pediatr Gastreenterol Nutr 2000; 30 (Suppl): S67-76). Недавно Buchanan показав, що випробування гіпоалергенного молока при дитячих коліках не підкріплене достатньою кількістю даних (Buchanan P. Effectiveness of treatment for infantile colic. Trial of hypoallergenic milk is not supported by strong enough evidence. BMJ 1998; 317(7170): 1451-1452). Вважається, що немовлята з дитячими коліками мають більший ризик алергічних захворювань. Однак, в недавньому дослідженні було показано, що маркери атопії, алергічного риніту, астми, стридору і мінливості максимального об'єму видиху порівнянні у немовлят, страждаючих дитячою колікою і без неї (Castro-Rodriguez J. A., Stern D. A., Halonen M., Wright A. L., Holberg С. J. et al. Relationship between infantile colic and Asthma/atopy: A prospective study in an unselected population. Pediatrics 2001; 108(4): 878-882). Автори описували мальабсорбцію лактози на основі проб на вміст водню у повітрі, що видихається (Hyams J., Geerstama M., Etienne N., Treem W. Colonic hydrogen production in infants with colic. J Pediatr 1989; 115: 592). He було відмічено відмінностей в концентрації водню у випорожненнях немовлят, страждаючих дитячою колікою або без неї. Однак було виявлено, що у дітей з більш високим рівнем метану коліки виявляються в меншій мірі, що передбачає роль продукції метану в її пом'якшенні (Belson A., Shetty A. K., Yorgin P. D., Bujanover Y., Peled Y., Dar М. H., Riaf S. Colonic hydrogen elimination and methane production in infants with and without infantile colic syndrome. Dig Dis Sci 2003; 48(9): 1762-1766). Було показано, що гастроінтестинальні гормо 93911 4 ни (GIT), такі як мотилін, вазоактивний інтестинальний пептид, мають патологічно високий рівень у немовлят з коліками. Lothe et al. показали підвищення рівнів з перших днів життя у дітей, у яких пізніше розвивалися коліки, передбачаючи патологічну фізіологію GIT при дитячих коліках (Lothe L., Ivasson S. A., Ekman R., Lindberg Т. Motilin and infantile colic: A prospective study. Acta Pediart Scand 1990; 79(4) 410-416). Основуючись на порушеннях розвитку нервової системи, було зроблене припущення, що абдомінальне защемлення і коліка можуть бути результатом гіперперистальтики. Ця теорія підтверджується тим, що при прийомі антихолінергічних засобів симптоми колік знижуються (Gupta S. К. Is colic a gastrointestinal disorder? Curr Opin Pediatr 2002; 14:588-92). Той факт, що у більшості немовлят коліки проходять до чотиримісячного віку, підтверджує нейрогенну причину колік (Barr R. G. Colic and crying syndromes in infants. Pediatrics 1998; 102(5 suppl E): 1282-6). Пробіотик, за загальноприйнятим визначенням, являє собою живу бактеріальну кормову добавку, яка впливає сприятливим чином на тварину-хазяїна, поліпшуючи бактеріальний баланс кишечнику. Незважаючи на те, що пробіотики спочатку належать до добавок, до тваринних кормів для сільськогосподарських тварин, їх визначення також можна застосовувати і для людини. Основне споживання пробіотиків людьми відбувається у формі молочних продуктів харчування, що містять кишкові види лактобактерій і біфідобактерій. У визначенні пробіотиків указано, що їх споживання впливає на склад кишкової мікрофлори. Було зроблене припущення, що такий ефект пробіотиків на кишкову екосистему благотворно впливає на споживача. Кількість вірогідних переваг, що є результатом змін кишкового середовища завдяки пробіотикам, була описана в статтях і до них належать: підвищена стійкість до інфекційних захворювань, зокрема до кишкових, знижена тривалість діареї, зниження кров'яного тиску, зниження концентрації холестерину в сироватці, зменшення алергії, стимулювання фагоцитозу лейкоцитами периферичної крові, модулювання експресії гена цитокіну, ад'ювантний ефект, регресія пухлин і зниження продукції канцерогенів або співканцерогенів. Christensen et al. були першими, хто повідомив про те, що пробіотичні молочнокислі бактерії виявляють свої імуномодулюючі ефекти шляхом модуляції Th1/Th2/Th3/Tr1/Treg-cтимyлюючoї здатності дендритних клітин (ДК). Вони показали, що при одночасному культивуванні мишачих ДК і різних видів Lactobacillus, включаючи Lactobacillus reuteri, у них вибірно модулювалася продукція цитокінів TL-6, IL-10, IL-12 і TNF- і активація поверхневих маркерів залежним від концентрації чином. Всі поверхневі маркери MHC класу II і CD86, активовані лактобактеріями, є показниками дозрівання ДК. Зокрема, значним в цих дослідженнях було те, що L. reuteri (штам 12246) був слабким індуктором IL-12, але при одночасному культивуванні з L. johnsonii або L. casei він вибірково інгібував проду 5 кцію протизапальних сигнальних цитокінів IL-12, IL-6 і TNF-, які стимулювали два інших види. Продукція IL-10 залишалася незмінною за цих умов. Ці відкриття привели до висновків про те, що «L. reuteri може додавати внесок в екзогенну модуляцію розмноження дендритних клітин кишечнику, що сприяє стійкості до антигенів, що не несуть «сигнал небезпеки», при цьому не впливаючи на здатність відповідати на патогени, розпізнавані через такий сигнал небезпеки, як LPS», що «L. reuteri може бути потенційною мішеневою терапією, ефективною для інгібування продукції IL-12 і TNF- (і IL-6), і при цьому індукувати протизапальний IL-10, надаючи, таким чином, альтернативний терапевтичний підхід для компенсації протизапального середовища цитокінів кишечнику», і, таким чином, «існує можливість регулювання Th1/Th2/Th3-стимулюючих здатностей кишечнику, виходячи зі складу кишкової мікрофлори, включаючи споживані пробіотики» (Christensen Н. R., Frokiaer H., Pestka J. J. (2002) Lactobacilli differentially modulate expression of cytokines and maturation surface markers in murine dendritic cells. J Immunol 168 171-178). Smits et al. продовжили ці дослідження і показали, що L. reuteri має здатність примувати ДК для стимуляції продукції регуляторних Т-клітин (TR). Вони використовували три різних види Lactobacillus, культивованих одночасно in vitro з ДК людини моноцитарного ряду диференціювання. Використовували два види молочнокислих бактерій, штам L. reuteri (ATCC 53609) людини і L. casei, але не використовували штам L. Plantarum, які примували ДК для стимуляції розвитку TR-клітин. Було показано, що ці TR-клітини продукують підвищені рівні IL-10 і здатні інгібувати проліферацію фонових Т-клітин IL-10-залежним способом (Smits Н. H., Engering A., van der KIeIj D., de Jong Е. С, Schipper K., van Capel Т. M. M., Zaat В. A. J., Yazdanbakhsh M., Wierenga Е. A., van Kooyk Y., Kapsenderg L. (2005) Selective probiotic bacteria induce IL-10-producing regulatory T cells in vitro by modulating dendritic cell function through dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3grabbing nonintegrin. J Allergy Clin Immunol 115 1260-1267). Одним з перших доказів, підтверджуючих дію L. Reuteri, що надходять перорально, на хазяїна, по суті, було збільшене співвідношення CD4+/CD8+ клітин, що спостерігалося в клубовій кишці курчат (Walter J. Dobrogosz, NUTRAfoods 2005 4(2/3) 15-28). Valeur et al. продовжили ці спостереження, включивши в них клубову кишку людини. Вони одержали прямі in situ докази у людини, що показують (а) розподіл індивідуальних специфічних для людини клітин L. reuteri ATCC 55730 по всьому кишечнику людини, і (б) виражену участь L. reuteri ATCC 55730 у рекрутингу і/або проліферації CD4+ Т-клітин, зокрема, в клубових областях кишечнику. Ними був зроблений висновок про те, що «введення L. reuteri викликає рекрутинг CD4+ Т-хелперних клітин до епітелію людини. Цей рекрутинг може бути одним з факторів, що пояснюють ефект пробіотиків цього штаму L. 93911 6 reuteri у людини» (Valeur N., Engel P., Carbajal N., Connolly E., Ladefoged К. (2004) Colonization and immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointestinal tract, Appl Environ Microbiol 70 1176-1181). Toll-подібні рецептори (TLR) розпізнають бактеріальні мотиви і активують набір генів, що веде до продукції цитокінів. Звичайно TLR розглядаються як сенсори мікробних інфекцій, і їх роллю є індукція запальної відповіді. Однак мотиви, які розпізнаються за допомогою TLR, не є унікальними для патогенів, але є поширеними мотивами, загальними для цілих класів мікроорганізмів, і не до кінця зрозуміло, яким чином імунна система розрізнює коменсальні і патогенні бактерії за допомогою TLR. Одержані недавно дані вказують, що TLR, крім їх ролі в індукції запальної відповіді, також грають роль в гомеостазі кишечнику, розпізнаючи коменсальну мікрофлору (Rakoff-Nahoum S., Paglino J., Eslami-Varzaneh F., Edberg S., Medzhitov R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 2004 Jul 23; 118(2):229-41). Штами різних видів Lactobacillus, включаючи L. reuteri, були використані в композиціях пробіотиків. L. reuteri є одним з природних мешканців шлунково-кишкового тракту тварин, і звичайно її виявляють в кишечнику здорових тварин, включаючи людей. Відомо, що вона має антимікробну активність. Див., наприклад, патенти США №№ 5,439,678, 5,458,875, 5,534,253, 5,837,238 і 5,849,289. Якщо клітини L. reuteri вирощують в анаеробних умовах в присутності гліцерину, то вони продукують антибактеріальну речовину, відому як гідроксипропіональдегід (3-НРА). Існують чіткі і складні взаємовідношення між кишковою імунною системою і коменсальною флорою. Недавно було показано, що люмінальна ендогенна флора може ініціювати ключовий процес бактеріальної природи і адаптивну відповідь хазяїна шляхом активації toll-подібних рецепторів (TLR) і NOD-рецепторів, розташованих на клітинах кишкового епітелію (Haller D., Jobin С. Interaction between resident luminal bacteria and the host: can a healthy relationship turn sour? J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004; 38: 123-36. Rakoff-Naholm S., Paglino J., Eslami-Varzaneh F., Edberg S., Medzhitov R. Recognition of commensal microflora by Toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell 2004; 118: 229-241). На моделях людини цитокіни можуть ініціювати гіперрефлекторну реакцію ентеральної мускулатури за допомогою нервових і м'язових імунних взаємодій (MiIIa P. J. Inflammatory cells and the regulation of gut motility. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004; 39: S750). В експериментальних і клінічних роботах було показано, що специфічні штами пробіотиків інгібують проліферацію Т-клітин і зменшують секрецію як цитокіну Th1, так і Th2, в той же час переважно виробляючи супресорні цитокіни, такі як IL-10 і TGF- (Rautava S., Kalliomaki M., Isolauri Е. Probiotics during pregnancy and breast-feeding might confer immunomodulatory protection against atopic disease in the infants. J Allergy Clin Imunol 2002; 109: 119-121). Крім того, у людей-добровольців L. 7 reuteri заселяє шлунково-кишковий тракт людини і здатна виявляти імуномодулюючу активність, включаючи рекрутинг CD4+ Т-хелперних клітин в епітелії клубової кишки людини (Valeur N., Engel P., Carbajal N., Connoly E., Laderfoged К. Colonization and immunomodulation by Lactobacillus reutery ATCC 55730 in the human gastrointestimal tract. Appl Environ Microbiol 2004; 70: 1176-81). Дозрівання ДК являє собою процес, який перетворює незрілі ДК в зрілі антигенпрезентуючі клітини, які мігрують в лімфатичні вузли. Цей процес приводить до втрати сильної здатності поглинати антигени, характерної для незрілих ДК і до активації експресії костимуляторних молекул і різних цитокінів (Mellman I., Steinman R. M.: Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines. Cell 2001, 106:255-8. Banchereau J., Briere F., Caux C, Davoust J., Lebecque S., Liu Y. J. Pulendran B., Palucka K.: Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 2000, 18:767-811). Відомі протоколи дозрівання основані на оточенні, з яким, як вважається, ДК стикаються після або під час представлення антигенам. Кращим прикладом цього підходу є використання середовища, кондиціонованого моноцитами (МСМ). MCM одержують in vitro, культивуючи моноцити і потім використовуючи культуральну супернатантну рідину як джерело факторів дозрівання. Головними компонентами в МСМ, відповідальними за дозрівання, є протизапальні цитокіни інтерлейкін-1 (IL1), IL-6 і TNF- (Reddy A., Sapp M., Feldman М., Subklewe M., Bhardwaj N.: А monocyte condidioned medium is more effective than defined cytokines in mediating the terminal maturation of human dendritic cells. Blood 1997, 90:3640-6). Зрілі ДК продукують велику кількість цитокінів, які стимулюють і направляють Т-клітинну відповідь. Двома з цих цитокінів є IL-10 і IL-12. Ці цитокіни надають протилежну дію на напрямок індукованої Т-клітинної відповіді: IL12 індукує відповідь Th1 типу, в той час як IL-10 інгібує цю відповідь. Таким чином, стан активації APC (антигенпрезентуючих клітин), включаючи ДК, визначає тип і величину CD4+-клітинної відповіді. Зупинка APC у фазі G0 (включаючи епітеліальні клітини в тимусі) може сприяти розвитку CD4+CD25+TR-клітин. Під час зараження патогенами розпізнавання бактеріальних молекул TLR приводить до активації APC. Тоді APC продукують IL-6 і додаткові розчинні фактори, які разом перекривають супресивний ефект TR-клітин, дозволяючи ефективне утворення Теклітин (Т-ефекторних клітин) проти патогену. Динамічна рівновага між APC у фазі спокою і активованими APC також буде піддаватися дії як TR-, так і ТЕ-клітин (фіг. 1). Pessi et al. (2000) описують утворення IL-10 у дітей з алергією після перорального прийому Lactobacillus rhamnosus GG. Але на відміну від представленого в цьому документі винаходу, в дослідженні не описані специфічні штами зі здатністю продукувати великі кількості IL-10, відібрані за їх ефективністю проти порушення моторики і колік (Pessi T., Sutas Y., Hurme M., Isolauri Е. Interleukin-10 generation in atopic children following oral Lactobacillus rhamnosus. GG. Clin Exp Allergy. 93911 8 2000 Dec; 30(12):1804-8). Дослідження Hermelijn et al. (2005) показує, що примування ДК моноцитарного ряду диференціювання L. reuteri і Lactobacillus casei, але не Lactobacillus plantarum, керує розвитком TR-клітин. Ці TR-клітини продукували підвищені рівні IL-10. На відміну від даного винаходу автори не пов'язують збільшення IL-10 з моторикою кишечнику або коліками. Навіть, якщо справа стосується штамів, автори згадують два різних види бактерій, які ефективно підвищують рівні IL-10. Це відрізняється від даного винаходу, в якому указано, що пробіотик, який буде найбільш ефективно зменшувати коліки, потрібно визначити і відібрати на рівні штаму, оскільки різні штами одного і того ж виду мають різну здатність ефективно збільшувати рівні IL-10. У даний момент не існує лікування від колік. Прийнята схема лікування колік складається з фармакологічного і/або нефармакологічного методів, що забезпечують щонайбільше незначне зниження симптомів. Типовий терапевтичний вплив на коліки, який пропонується пацієнтам, знаходиться в межах чотирьох категорій, включаючи дієтичну, фізичну, поведінкову і фармакологічну. Дієтичні процедури включають професійну пораду з приводу різної техніки годування або використання гіпоалергенного молока, молочних сумішей без сої або лактози і раннє введення твердої їжі (Lothe L. et al. Cow's milk formula as a cause of infantile colic: a double-blind study. Pediatrics 1982; 70:7-10; Forsyth B. W.C. Colic and the effect of changing formulas: a double-blind multiple-crossover study. J Pediatr 1989; 115,521-6; Treem W. R., et al. Evaluation of the effect of a fiber-enriched formula of infant colic. J Pediatr 1991; 119695-701). Однак, ні використання соєвих молочних сумішей, ні зміни в техніці годування не ефективні для кожного з випадків колік. Огляд інформації, що вивчає ці рекомендації, показав, що використання гіпоалергенних молочних сумішей, таких як частково гідратовані або основані на амінокислотах, може бути успішним тільки у близько 25% немовлят (Lucassen, Р. L. В. J. et al. Infantile colic: crying time reduction with a whey hydrolysate: a double-blind? Randomized placebo-controlled trial. Pediatrics 2000; 106:1349-54; Estep D. C., et al. Treatment of infant colic with amino acid-based infant formula: a prelimitary study. Acta Pediatr 2000; 89:22-7). Фізична стратегія для керування коліками включає фізичну зміну позицій тіла для полегшення газоутворення/рефлюксу, носіння на руках, сповивання, застосування натиснення на живіт або масаж дитини. Інші методи включають створення почуття абстрагованості, щоб мінімізувати усвідомлення колік немовлям, такі як катання немовляти на машині, використання стимулятора поїздки, вібратора для дитячого ліжка або дитячі гойдалки (Lipton Е. L. Swadding and child care practice: historical, cultural and experimental observations. Pediatrics 1965; 35: 521-67; Byrne J. M., Horowitz F. D. Rocking as a soothing intervention: the influence of direction and type of movement. Infant Behav Dev 1981; 4:207-18). Іншим способом є програвання звукового запису, який заспокоює немовля. Однак в медичній 9 літературі існують докази, що ці методи не працюють (Parkin P. С., Schwartz С. J., Manuel В. A. Randomized controlled trial of three inventions in the management of persistent crying of infancy. Pediatrics 1993; 92(2): 197-201). Ці стратегії, щонайбільше, лише трохи ефективні відносно зниження симптомів колік. Рекомендації для поведінкового впливу для лікування колік є найбільш суперечливими з доступних способів терапії. Деякі автори пропагують збільшення Сенсорної стимуляції, в той час як інші пропагують зменшення такої стимуляції (Balon A. J., Management of infantile colic. Amer Pharm Physician 1997; 55:235-242; Lucassen P. L. B., Assendeift W. J. J., Gubbels J. W., van Eijk T. M., van Geldrop W. J. Effectiveness of treatments for infantile colic: systematic review. BMJ 1998; 316(5): 1563-9; і Carey W. B., «Colic» - primary excessive crying as an infant-environmental interaction. Pediatr Clin North Am 1984; 31:993-1005). Інші рекомендації включають ранню відповідь на плач або дозвіл немовляті плакати, пропозиція соски, введення певного графіка годування, використання візуального контакту і розважальних ігор. Фармакологічний підхід до лікування колік привів до використання рецептурних і нерецептурних препаратів. Застосовувані в цей час рецептурні препарати включають алкалоїди беладони і опіати (камфорна настойка опію), які можуть забезпечити полегшення, але здатні викликати ризики, включаючи додаткові пірамідальні симптоми, пригнічення дихання і констипацію. Наприклад, антихолінергічні лікарські засоби, подібні за своєю дією з дією атропіну, такі як Хіосціамін (Левізин® або Гастросед®) і Дицикломін розширюють зіниці, збільшують серцебиття, зменшують слиновідділення, послаблюють спазми шлунковокишкового і сечового трактів, а також бронхів. Крім того, антихолінергічні лікарські засоби є єдиними рецептурними препаратами на ринку США, які, як було багато разів показано, ефективно лікують дитячі коліки, але, на жаль, у 5% дітей, які були піддані лікуванню, можуть розвинутися побічні ефекти, включаючи ускладнення дихання, апное, епілептичний напад, непритомність, асфіксію, кому і м'язову гіпотонію (Williams J., Watkin-Jones R. Dicyclomine: worrying symptoms associated with its use in some small babies. BMJ 1984; 288:901; Myers J. H., Moro-Sutherland D., Shook J. E. Anticholinergic poisoning in colicky infants treated with hyoscyamine sulfate. Am J Emerg Med 1997; 15:532-5). До того ж повідомлялося про декілька випадків смерті у дітей, що приймали дицикломін (Garriott J. С., Rodriguez R., Norton L. Е. Two cases of death involving dicyclomine in infants. Clinical Toxicol 1984; 22(5):455-462). Нерецептурні препарати, які описувалися як ефективні для лікування дитячих колік, включають декілька седативних або снодійних лікарських засобів, включаючи надфізіологічну дозу (високу дозу) дифенгідраміну (Бенадрил®), фенобарбіталу, гідрату хлорану і навіть спирту. Однак існує ймовірність серйозних побічних ефектів, пов'язаних з декількома з цих агентів, у дітей з респіраторним захворюванням, обмежуючи, таким чином, їх 93911 10 широке застосування при лікуванні колік (Balon A. J. Management of infantile colic. Amer Pharm Physician 1997; 55:235-242; Gurry D. Infantile colic. Australian Pharm Phys 1994; 23(3):337-34632). Більш безпечні нерецептурні препарати для лікування колік включали, головним чином, введення Симетикону або диметилполісилоксану, нерозсмоктуваного, що відпускається без рецепта, лікарського засобу, який зменшує розмір кишкових бульбашок газу. Симетикон має дуже безпечний профіль і часто рекомендується, незважаючи на декілька досліджень, які показують, що ефективність Симетикону відносно дитячих колік не більша, ніж у плацебо (Metcalf Т. J. et al., Pediatrics 1994 July; 94(1):29-34. Sferra Т. J. et al., Pediatr Clin North Am 1996 Aril; 43(2):189-510. Danielson B. et al., Acta Paediatr scand 1985 May; 74(3):446-50. Colon A. R., et al., Am Fam Physician 1989 December; 10(6):122-4). В результаті, найбільш поширеним лікуванням колік на сьогоднішній день є просто чекати, коли немовля переросте цей стан. Отже, в цей час існує потреба в безпечних і ефективних сполуках і композиціях, а також способах, які можуть бути ефективні для лікування колік у немовлят і маленьких дітей. Композиції і способи за даним винаходом відповідають цим потребам, пропонуючи продукт, який може безпечно і ефективно усувати симптоми, пов'язані з колікою у немовлят. У патентній публікації ЕР1364483А10 описані пробіотики для лікування кишково-нервовом'язових аномалій, таких як коліки у немовлят. Як пробіотики заявники згадують декілька різних видів бактерій. Навпаки, у даному винаході пробіотик для найбільш ефективного зменшення колік є специфічним штамом молочнокислої бактерії, відібраним для ефективного збільшення рівнів IL-10, і не належить до всього класу бактерій, оскільки автори даного винаходу показали, що існують істотні відмінності в стимуляції продукції IL-10 між штамами одного і того ж виду. У 2005 p. Savino показав, що додавання L. reuteri ATCC 55730 істотно поліпшує симптоми колік у немовлят, які вигодовуються груддю, в порівнянні зі стандартною терапією за допомогою Симетикону протягом 7 днів лікування. Процент відповіді на лікування L. reuteri становив 95%, в той час як лише 7% немовлят відповідали на Симетикон. Ці результати були представлені на Європейському Товаристві Вивчення Педіатрії (European Society for Pediatric Research (ESPR)) з 31 серпня 2005 р. по 3 вересня 2005 p., Сієна, Італія (Pediatr Res. 2005; 58(2):411). Незважаючи на те, що результати Savino показали позитивний ефект, він не визначав зв'язок між окремими штамами, сприяючими продукції IL-10, і зниженням моторики кишечнику і, отже, колікою. Прикладений винахід належить до способу селекції таких кращих штамів. Collins описав, що порушення моторної функції забезпечують різноманітні симптоми, які можуть виникати в контексті запалення або активації імунітету в різних областях кишечнику і включати такі звичайні розлади, як езофагіт, гастрит і спонтанне 11 запальне захворювання кишечнику (IBD). Ці спостереження передбачають, що моторика кишечнику також схильна до впливу імунної системи. У цьому контексті моторна система може відігравати важливу роль у захисті кишечнику від токсичних стимулів, присутніх в просвіті (Collins S. The Immunomodulation of Enteric Neuromuscular Function: Implications for Motility and Inflammatory Disorders. Gastroenterology 1996; 111:1683-1699). Ця точка зору відображена, наприклад, в спостереженнях Vantrappen et al., які показали, що надмірне зростання бактерій в тонкому кишечнику супроводжується порушенням нормальної циклічної травної моторики в тонкому кишечнику (Vantrappen G., Jannssens J., Hellemans J., Ghoos Y. The interdigestive motor complex of normal subjects and patients with bacterial overgrowth of small intestine. J Clin Invest 1977; 9:1158-1168). Добре відомо протягом багатьох років, що підвищені рівні IL-10 супресують надмірно активовані системи імунітету. Раніше було також показано, що моторика кишечнику контролюється неврологічними сигналами, які пов'язані з імунною системою кишечнику, і що коліка є наслідком підвищеної моторики кишечнику, наприклад, внаслідок надмірного росту бактерій. У промислово розвинених країнах гігієнічні заходи починаються з моменту народження, що порушує здатності новонародженого засвоювати мікрофлору матері. Внаслідок цього немовля одержує іншу мікрофлору. Замість вмісту, наприклад, Escherichia coli і Lactoba cilli, новонароджені одержують Staphylococcus aureus і інші шкірні бактерії. Автори винаходу зробили несподіване відкриття, що надмірне зростання шкірних бактерій надмірно активує імунну систему немовляти, що приводить до надмірно активованої моторики кишечнику і, як наслідок, до колік, більша кількість специфічних кишкових бактерій, таких як L. reuteri DSM 17938, зі здатністю стимулювати продукцію IL-10 приводить до дозрівання TR-системи, тобто проліферації CD4+CD25+TR-клітин. Активація СD4+СD25+-клітин приводить до спокійної моторики кишечнику і, отже, до сприятливих ефектів на немовлят з колікою. Завдяки цим відкриттям були відібрані непатогенні бактеріальні штами за властивостями, які посилюють IL-10, і несподівано було виявлено, що ці властивості штамів корелюють зі зниженням колік у дітей. Отже, винахід належить до застосування L. reuteri DSM 17938 для одержання препаратів для профілактики і/або лікування колік і інших штамів, відібраних тим же шляхом. Іншим об'єктом винаходу є продукти, що містять вказані штами, для введення тваринам, включаючи людину. Інші цілі і переваги будуть очевидні з наступного опису і прикладеної формули винаходу. Даний винахід належить до певних штамів молочнокислих бактерій, відібраних за здатністю сприяти продукції IL-10 і, отже, проліферації CD4+CD25+TR-клітин, для профілактики і/або лікування колік, до способу селекції таких штамів і до продуктів, що містять такі штами. Інші об'єкти і ознаки винаходу будуть очевидні 93911 12 з наступного опису і прикладеної формули винаходу. Фіг. 1 - передбачувана роль визначених відібраних штамів молочнокислих бактерій в стимуляції розвитку CD4+CD25+TR-клітин. Фіг. 2а - продукція IL-10 ДК клітинами у вигляді стовпчастої діаграми. Фіг. 2Б - продукція IL-10 ДК клітинами в таблиці. Колонізація шкірних бактерій в кишечнику і дефіцит TR-клітин надмірно активують імунну систему новонародженого немовляти, що приводить до і надмірної активації моторики кишечнику і, отже, до колік. Велика кількість клітин специфічних кишкових бактерій, таких як L. reuteri DSM 17938, що мають здатність стимулювати продукцію IL-10, приводить до дозрівання TR-системи, тобто до проліферації CD4+CD25+TR-клітин. Інші штами молочнокислих бактерій, як повідомлялося багатьма дослідниками раніше, індукують продукцію IL10, наприклад Rautava et al. (див. вище). Активація CD4+CD25+TR-КЛІТИН приводить до помірної моторики кишечнику і, отже, до сприятливих впливів на коліки. Несподівано було виявлено, що штами, які приводять до підвищення рівнів цитокіну IL-10, одночасно є штамами, які здатні зменшувати середній час плачу (приклад 2). Даний винахід належить до штамів молочнокислих бактерій, які були відібрані за здатністю знижувати коліки, включаючи L. reuteri DSM 17938. Продукти, такі як продукти харчування, харчові добавки і молочні суміші, лікарські препарати або медичне обладнання, що містять суцільні клітини або компоненти, виділені з цих штамів, можуть бути одержані згідно з відомою в даній галузі рецептурою і включають, як відомо, в основному, перетравлювану основу плюс штам Lactobacillus або виділений з нього компонент. Дослідження in vitro можуть використовуватися як спосіб селекції штамів молочнокислих бактерій за здатністю стимулювати продукцію IL-10 в ДК моноцитарного ряду диференціювання і за допомогою цього індукувати розвиток CD4+CD25+TRклітин (Приклад 1). Дані описують показник сильної стимуляції IL10 за допомогою специфічних штамів L. reuteri ATCC 55730 і L. reuteri DSM 17938 і те, що ця регуляція опосередкована речовиною, що виділяється в ростове середовище двома цими специфічним штамами під час пізньої логарифмічної/стаціонарної фази росту. Два штами L. reuteri, навпаки, не були здатні стимулювати відповідну продукцію IL-10. Для підтвердження клінічної значущості відібраних штамів для профілактики або лікування колік проводяться додаткові дослідження у немовлят, що вигодовуються груддю, з діагнозом дитячих колік. Ознаки даного винаходу будуть зрозумілі з наступних прикладів, які не треба тлумачити як такі, що обмежують винахід. Приклад 1 Вивчення здатності штамів пробіотиків стимулювати експресію IL-10 ДК моноцитарного ряду диференціювання. 13 Незрілі ДК утворюються з моноцитів периферичної крові (Hilkens С. М. U., Kalinski P., De Boer М. and Kapsenberg. 1997. Human dendritic cells require exogenous interleukine-12-inducing factors to direct the development of native T-helper cells toward the Th1 phenotype. Blood 90:1920), культивованих в IMDM (Life Technologies, Пейслі, Сполучене королівство), що містить 10% FCS (HyClone, Логан, штат Юта), рекомбінантний людський (rh)GM-CSF (500 од./мл; Schering-Plough, Юден, Нідерланди) і rhIL-4 (250 од./мл; Pharma Biotechnologie Hannover, Ганновер, Німеччина) (Kalinski P., Schuitemaker J. Н. N., Hilkens С. М. U., Wierenga Е. A. and Kapsenberg М. L. 1999. Final maturation of dendritic cells is associated with impaired responsiveness to IFN- and to bacterial IL-12 inducers: decreased ability of mature dendritic cells to produce IL-12 during the interaction with Th cells. J. Immunol. 162:3231). Штами, які будуть протестовані в експерименті, є Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938, Lactobacillus reuteri ATCC PTA 4660 і Lactobacillus reuteri ATCC PTA 4964, доступні в ATCC (Manassas, шт. Вірджинія, США і DSMZ, Брауншвейг, Німеччина). Штами культивують на агарі Columbia (Oxoid, Базінгсток, Сполучене королівство), що містить 6,25% овечої крові. Молочнокислі бактерії інкубують при 37 C в атмосфері 5% CO2. Через 3 дні кількість бактерій визначається вимірюванням оптичної густини при 620 нм (OD620). Звичайно OD620, яка дорівнювала 0,35, 8 відповідала 1х10 колонієутворювальних одиниць (КУО) для всіх тестових штамів. На 6 день дозрівання незрілих ДК індукують за допомогою LPS (Е. coli; Sigma-Aidrich, Сент Льюїс, Марокко) і тестують Lactobacilli на присутність сполучання цитокінів IL-1 (25 нг/мл) і TNF- (50 нг/мл), використовуваних разом як факторів дозрівання (цитокіни, придбані у Peprotech, Роки Хіл, Нью-Джерсі). Продукція цитокінів IL-12, IL-10 і IL-6 зрілих ДК визначається за допомогою 24-годинної стимуляції за допомогою CD40 лігандекспресуючих клітин плазмоцитоми миші (J558), як описано Vieira P. L. et al. (Vieira P. L., de Jong E. С, Wierenga E. A., Kapsenberg M. L., Kalinski P. Development of Th1inducing capacity in myeloid dendritic cells requires environmental instruction. J Immunol 2000; 164:450712). Після 24 год. супернатанти збирають і вимірюють концентрації IL-10 за допомогою ELISА. Результати див. на фіг. 2. Як видно з результатів, існує істотна відмінність у впливі різних штамів Lactobacillus і їх здатності стимулювати продукцію IL-10 у ДК. Приклад 2 Відібрані штами пробіотиків в порівнянні з Симетиконом у лікуванні дитячих колік. Немовлят, що вигодовуються груддю, з діагнозом дитячих колік набирали у Відділенні дитячої і підліткової науки (Лікарня університету Дротінг Сильвія, Ґетеборг). Пацієнти у віці 21-90 днів, відповідні внутрішньоутробному віку з масою при народженні між 2500 і 4000 г, з симптомами колік, що задовольняють критеріям Вессела і виникли майже за 6±1 днів до реєстрації, розглядаються для 93911 14 включення в дослідження (Wessel М. A., Cobb J. С., Jackson E. В., Harris G. S., Detwiler A. C. Paroximal fussing in infancy, sometimes called «colic». Pediatrics 1954; 14: 421-35). Всі зареєстровані немовлята знаходяться виключно на грудному вигодовуванні, щоб зменшити варіабельність кишкової мікрофлори через варіації в дієті, які могли б, в свою чергу, викликати відповідь на пробіотики. Немовлята виключалися, якщо у них існували клінічні докази хронічної хвороби або гастроінтестинальних порушень, або якщо вони одержували антибіотики або пробіотики на тижні, що передував набору. У цьому дослідженні немовлят з коліками випадково відбирали для одержання пробіотиків або Симетикону в подальшому лікуванні: (P1) Lactobacillus reuteri штам ATCC 55730, який називається також SD2112; (Р2) Lactobacillus reuteri штам DSM 17938 (виділений DSMZ-Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Брауншвейг) 6 лютого 2006 p., під Budapest Treaty); (P3) Lactobacillus reuteri штам ATCC PTA 4660; і (S) Симетикон. L. reuteri вводять в дозі 108 колонієутворювальних одиниць (КУО) в 5 краплях МСТ-олії (середньоланцюгової тригліцеридної олії), що серійно випускається, через 30 хв. після їжі, один раз на день, протягом 28 днів. МСТ-олію одержують природним шляхом, і найбільш поширеним джерелом є кокосова олія. Велику частину МСТ-олії переробляють з кокосової олії. МСТ-олія являє собою прозору світлозабарвлену рідину з приємним запахом і низькою в'язкістю. Ця масляна суспензія стабільна протягом 21 місяця при 2-8 °С (як описано виробником, BioGaia AB, Стокгольм, Швеція) (альтернативним джерелом МСТ-олії є Alkomed R, Karlshamns AB, Карлшамн, Швеція). Під час дослідження батьків інформували, щоб вони тримали продукт в холодильнику, коли він не використовується. Симетикон (S) давали в дозі 60 мг на день в 3 мл розчину (Mylicon Infant Gas Relief Drops, J&J, 7050 Кемп Хіл Роад, Форт Вашингтон, Пенсільванія, 19034-2210, США), що серійно випускається, після їжі, двічі на день, протягом 28 днів. Сказано, що при реєстрації всіх матерів просили додержуватися дієти, яка виключає коров'яче молоко: відмінити молоко, йогурт, м'який і твердий сир, сметану, олію, тістечка. Суворе додержання дієти відстежується за допомогою щоденника дієти, що ведеться протягом всього періоду лікування. На 7, 14, 21 і 28 день один з дослідників перевіряє відповідність дієті. Етичний комітет в Інституті схвалив протокол дослідження, і немовлята реєструються в дослідженні тільки після одержання письмової інформованої згоди від батьків. Контрольні відвідування День, в який педіатр дивився дитину перший раз, визначений як -1 день. У цьому випадку кожна дитина проходила медичне обстеження, а батьків опитували з метою одержання основоположної інформації, що стосується типу розродження, ваги 15 93911 при народженні і внутрішньоутробного віку, сімейного анамнезу шлунково-кишкового захворювання і атопії. Зокрема, останнє вважалося позитивним, якщо у немовлят був один або більше членів сім'ї (мати, батько і/або старший родич) з атопічною екземою, алергічним ринітом або астмою. Більше того, реєструвалися будь-які ознаки і симптоми атопічного захворювання в період дослідження. Батьків також запрошували, щоб зареєструвати інформацію, що стосується середнього часу плачу на день і кількості нападів колік на день після набору (0 день). Лікар випадковим чином приписував немовля до будь-якої з досліджуваних груп. Введення досліджуваних продуктів почалося в 1 день. Батькам видавали письмову інформацію про дослідження і просили реєструвати кількість нападів невтішного плачу на день і їх тривалість, консистенцію випорожнення і частоту, а також будьякі спостережувані побічні ефекти (констипація, блювання, шкірні реакції і т. д.), починаючи з 0 дня до 28 дня, використовуючи структурований щоденник. Щоб впевнитися, що всі батьки відмічали час плачу однаковим способом, і впевнитися, що препарати правильно даються немовлятам, один з дослідників завжди доступний по телефону, щоб допомогти батькам. Кожного пацієнта оглядає один і той же педіатр на 1, 7, 14, 21 і 28 день. Результати Зі 120 зареєстрованих немовлят, що вигодовуються груддю, 30 випадковим чином приписані до лікування Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (P1), 16 30 випадковим чином приписані до лікування Lactobacillus reuteri DSM 17938 (Р2), 30 випадковим чином приписані до лікування Lactobacillus reuteri ATCC РТА 4660 (Р3) і 30 - до лікування Симетиконом (S). Жодного немовляти не вибуло через побічний ефект, пов'язаний з дослідом. Групи подібні за віком, вагою при народженні, статтю, типом розродження, сімейним анамнезом атопії або шлунково-кишкових захворювань і впливом куріння. Середній час плачу на день схожий в лікувальних групах в 0 день і в 1 день. Було показане істотне зменшення щоденного часу плачу у немовлят, які одержували Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (P1) і DSM 17938 (Р2), до 7 дня, в порівнянні з немовлятами, яких лікували ATCC PTA 4660 (Р3) і Симетиконом (S). На 14, 21 і 28 день час плачу істотно відрізняється між чотирма лікувальними групами. Відмінність між (P1) і (S) за середнім часом плачу на день від початку до кінця дослідження становить 82 хвилини, а відмінність між (Р2) і (S) за середнім часом плачу на день від початку до кінця дослідження становить 83 хвилини за станом на 28 день (Таблиця). Як видно з результатів, чотири лікувальні групи більш або менш подібні до введення тестових продуктів. Вже після 7 днів існує ясна відмінність на користь Lactobacillus reuteri штамів ATCC 55730 і DSM 17938 в порівнянні з двома іншими альтернативами. Після 28 днів відмінність збільшилася. Таблиця Час плачу (значення в хвилинах на день) в групах L. reuteri і Симетикону Немовлята з коліками N=120 0 день 1 день 7 день 14 день 21 день 28 день L. reuteri ATCC 55730 N=30 206 191 147 98 75 58 L. reuteri DSM 17938 N=30 203 190 148 100 77 59 Незважаючи на те, що винахід був описаний на основі специфічних втілень, буде високо оцінене те, що можлива безліч варіацій, модифікацій і L. reuteri ATCC РТА 4660 N=30 204 198 171 156 150 145 Симетикон N=30 205 194 172 155 148 141 втілень, і, отже, всі подібні варіації, модифікації і втілення потрібно розглядати як такі, що входять в суть і в рамки винаходу. 17 93911 18 19 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 93911 Підписне 20 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601