Лікування ревматоїдного артриту із застосуванням антитіла проти рецептора il-6 і метотрексату

1. Фармацевтична композиція для лікування ревматоїдного артриту, що включає антитіло проти рецептора IL-6 (антитіло до IL-6R) і Метотрексат (МТХ). 2. Фармацевтична композиція за п. 1, в якій антитіло до IL-6R є моноклональним антитілом. 3. Фармацевтична композиція за п. 1 або 2, в якій антитіло до IL-6R є антитілом до IL-6R людини. 4. Фармацевтична композиція за п. 1, в якій антитіло до IL-6R є рекомбінантним антитілом. 5. Фармацевтична композиція за п. 1, в якій антитіло до IL-6R є химерним антитілом, гуманізованим антитілом або людським антитілом. 2 (19) 1 3 Даний винахід має відношення до способів лікування інтерлейкін-6 (IL-6) - залежних захворювань за допомогою комбінації антагоніста інтерлейкіну-6 (антагоніст IL-6), особливо антитіла до рецептора інтерлейкіну-6 (IL-6R) (антитіло до IL6R), та імунодепресантів, і за допомогою введення антитіла до IL-6R у високому дозуванні. IL-6 є цитокіном, що його також називають фактором-2, який стимулює В-клітини (BSF2, В cell stimulating factor-2), чи інтерфероном β2. IL-6 було відкрито як фактор диференціювання, який приймає участь в активації клітин, що походять з Влімфоцитів (Hirano T. et al., Nature, 324:73-76, 1986), і згодом було виявлено, що IL-6 є поліфункціональним цитокіном, який впливає на функції різних клітин (Akira S. et al., Adv. in Immunology, 54:1-78, 1993). Було показано, що IL-6 індукує дозрівання клітин, що походять з Т-лімфоцитів (Lotz Μ. et al., J. Exp. Med., 167:1253-1258,1998). IL-6 надає клітинам своєї біологічної активності через два типи білків. Один з них - рецептор IL-6 (IL-6R) , який є ліганд-зв'язуючим білком, з молекулярною масою близько 80кДа, до якого приєднується IL-6 (Taga Т. et al., J. Exp. Med., 166:967-981, 1987; Yamasaki K. et al. , Science, 241:825-828, 1987) . Крім мембрано-зв'язаного типу, який проникає і експресується в клітинній мембрані, рецептор IL-6 також був виявлений у вигляді розчинного рецептора IL-6, який складається в основному з екстраклітинноі частини рецептора. Міжнародна публікація WO 92/19759 описує різні типи антитіл до IL-6R, такі як гуманізовані антитіла до IL-6R і химерні антитіла до IL-6R. WO 96/11020 описує терапевтичний засіб при ревматоїдному артриті й інгібітор росту синовіальних клітин (клітини внутрішньої оболонки суглобів), первинним інгредієнтом якого є антагоніст IL-6, такий як антитіло до IL6R. W0 96/12503 описує лікування захворювань, для яких властиве продукування IL-6, таких як плазмоцитоз, гіперімуноглобулінемія, анемія, нефрит, кахексія, ревматоїдний артрит, хвороба Кастлемана (CastleMan's disease) і мезангіальний проліферативний нефрит. WO 98/42377 описує захисні/терапевтичні засоби при захворюваннях, які мають відношення до сенсибілізованих Тклітин, таких як множинний склероз, увеїт, хронічний тиреоідит, уповільнена гіперчутливість, контактний дерматит і атопічний дерматит, активним інгредієнтом яких є антитіло до IL-6R. WO 98/42377 описує терапевтичні засоби при системному еритематозі, активним інгредієнтом яких є антитіло до IL-6R. W0 99/47170 описує терапевтичні засоби при хворобі Крона, активним інгредієнтом яких є антитіло до IL-6R. WO 00/10607 описує терапевтичні засоби при панкреатиті, активним інгредієнтом яких є антитіло до IL6R. WO 02/3492 описує терапевтичні засоби при псоріазі, активним інгредієнтом яких є антитіло до IL-6R. Крім того, WO 02/080969 описує терапевтичні засоби при ювенільному ідіопатичному артриті, активним інгредієнтом яких є антитіло до IL-6R. Як було описано вище, були відомі різні превентивні і терапевтичні засоби, активним інгредієнтом яких є антитіло до IL-6R. Однак не було відомо, що при лікуванні IL-6-залежних захворювань 86587 4 комбінацією антитіла до IL-6R і імунодепресантів, таких як метотрексат (МТХ), можна одержати синергічні ефекти, що імунодепресант, такий як метотрексат (МТХ) може послабити чи попередити алергійні реакції при лікуванні ревматоїдного артриту за допомогою антитіла до IL-6R, і що антитіло до IL-6R у високому дозуванні може знизити або попередити алергійні реакції при лікуванні ревматоїдного артриту за допомогою метотрексату. Отже, даний винахід забезпечує фармацевтичну композицію для лікування IL-6-залежних захворювань, яка включає антагоніст інтерлейкіну-6 (антагоніст IL-6) і імунодепресанти. Винахід також забезпечує фармацевтичну композицію, яка включає імунодепресанти, для посилення ефекту при використанні антагоніста IL6R при лікуванні IL-6-залежних захворювань. Винахід також забезпечує фармацевтичну композицію, яка включає імунодепресанти, для попередження чи послаблення алергійних реакцій при лікуванні IL-6-залежних захворювань за допомогою антагоніста IL-6. Винахід також забезпечує терапевтичний засіб, який включає антагоніст IL-6, для лікування IL6-залежних захворювань шляхом прийому високої дози препарату. Винахід також забезпечує фармацевтичну композицію, яка включає антагоніст IL-6 у високій дозі, для попередження чи послаблення алергійних реакцій при лікуванні IL-6-залежних захворювань. Антагоніст IL-6 переважно є антитілом до IL6R. Антитіло до IL-6R переважно є моноклональним антитілом до IL-6R. Бажано, щоб антитіло до IL-6R було моноклональним антитілом до IL-6R людини. Або бажано, щоб антитіло до IL-6R було моноклональним антитілом до IL-6R миші. Краще, щоб антитіло до IL-6R було антитілом рекомбінантного типу. Бажано, щоб моноклональне антитіло до IL-6R людини було, наприклад, антитілом РМ-1. Краще, коли моноклональне антитіло до IL-6R миші є, наприклад, антитілом MR16-1. Крім того, антитіло може бути химерним антитілом, гуманізованим антитілом чи людським антитілом до IL-6R. Найкращим антитілом до IL-6R є, наприклад, гуманізоване антитіло РМ-1. При використанні антагоніста IL-6, особливо антитіла до IL-6R, поєднаному з використанням імунодепресанта, дозування антагоніста IL-6, особливо антитіла до IL-6R, становить, наприклад, при внутрішньовенному уведенні від 0,02 до 150мг/кг/за 4 тижні чи дозування, при якому у крові досягаються еквівалентна концентрація антитіла до IL-6R, бажано використовувати від 0,5 до 30мг/кг/за 4 тижні або дозування, при якому у крові досягається еквівалентна концентрація антитіла до IL-6R, та найкраще використання від 2 до 8мг/кг/за 4 тижні або дозування, при якому у крові досягається еквівалентна концентрація антитіла до IL-6R. При введенні антагоніста IL-6, особливо антитіла до IL-6R у високій дозі, дозування антагоніста IL-6, особливо антитіла до IL-6R, складає, наприклад, при внутрішньовенному введенні не менше ніж 4мг/кг/за 4 тижні чи дозування, при якому у 5 86587 6 крові досягаються еквівалентна концентрація андозування засобу за один прийом збільшують при титіла до IL-6R, а краще використовувати від 6 до тривалому інтервалі між прийомами, тоді як дозу16мг/кг/за 4 тижні або дозування, при якому у крові вання засобу знижують при короткому інтервалі досягається еквівалентна концентрація антитіла між прийомами. до IL-6R, та найкраще використання від 6 до Кращим ефективним дозуванням і способом 10мг/кг/за 4 тижні або дозування, при якому у крові введення антитіла до рецептора IL-6, наприклад, є досягається еквівалентна концентрація антитіла така кількість, при якій з крові виявляють вільне до IL-6R. При використанні МТХ як імунодепресанантитіло. Як типові приклади існують способи ввета дозування МТХ складає, наприклад, від 1 до дення лікарського засобу з поділом дози на кілька 100мг/людину/ тиждень або дозування, при якому прийомів, наприклад, за допомогою внутрішньоу крові досягається еквівалентна концентрація венної ін'єкції, такої як краплинне введення, і підМТХ, краще використання від 4 до 50мг/людину/ шкірної ін'єкції, що проводять відповідно до розтиждень або дозування, при якому у крові досягакладу прийому двічі на тиждень, один раз на ється еквівалентна концентрація МТХ, та найкратиждень, один раз на два тижні, один раз на 4 тище використання від 10 до 25мг/людину/ тиждень жні, один раз на 6 тижнів, один раз на 8 тижнів і або дозування, при якому у крові досягається еквіт.п. Розклад прийому можна регулювати шляхом валентна концентрація МТХ, збільшення інтервалу між прийомами від двох раДозування, при якому у крові виявляють лікарзів на тиждень чи одного разу на тиждень до односький засіб (наприклад, антитіло до IL-6R чи МТХ), го разу на 2 тижні, одного разу на 3 тижні, один раз вважають за таке, що дає еквівалентний терапевна 4 тижні, один раз на 6 тижнів і один раз на 8 тичний ефект, і навіть у тому випадку, коли певні тижнів при контролі за перебігом захворювання і концентрації в крові розрізняються внаслідок різзмінами результатів лабораторних досліджень них способів уведення засобу, наприклад, при крові. внутрішньовенній ін'єкції чи підшкірній ін'єкції, його При прийомі антитіла до IL-6R поєднаному з розцінюють як дозування, при якому у крові виявМТХ дозування антитіла є звичайним, наприклад, ляють таку концентрацію лікарського засобу (напри лікуванні ревматоїдного артриту це дозування приклад, антитіла до IL-6R чи МТХ), при якій досябільше ніж 0,5мг/кг на тиждень чи дозування, при гається еквівалентний терапевтичний ефект. якому у крові досягається еквівалентний або більш Приклади IL-6-залежних захворювань вклювисокий антиревматичний ефект. Наприклад, при чають внутрішньовенному введенні, проведеному один гострі хронічні запальні захворювання й аутоіраз на чотири тижні, дозування становить від 0,02 мунні захворювання: нефрит, мезангіальний продо 150мг/кг, переважно від 0,5 до 30мг/кг, а ще ліферативний нефрит, хвороба Крона, виразковий краще від 2 до 8мг/кг. коліт, панкреатит, ювенільний ідіопатичний артрит Антитіло до IL-6R та імунодепресант вводять чи системний ювенільний ідіопатичний артрит, одночасно чи з інтервалом у часі. васкуліт, хвороба Кавасакі, ревматоїдний артрит, Імунодепресанти також включають антиревсистемний еритематоз, псоріаз, синдром Шегрена, матичні засоби, адренокортикоїдні гормональні хвороба Стілла у дорослих; засоби і т.п. та включають, наприклад, наступні на пухлинні захворювання: множинна мієлома, лікарські засоби. хвороба Кастлемана, злоякісна лімфома, рак ниІмунодепресанти, антиревматичні засоби, зарок; соби, які включають адренокортикоїдні гормони інфекційні захворювання: інфекція ВІЛ, інфекІмунодепресанти ція вірусом Епштейн-Варр (EBV); Алкіліруючі засоби кахексію: кахексія; Циклофосфамід інші захворювання: плазмоцитоз, гіперімуногМетаболічні антагоністи лобулінемія, анемія і т.п.., та переважно це ревмаАзатіопрін, метотрексат, мізорібін тоїдний артрит, плазмоцитоз, гіперімуноглобуліІнгібітори активності Т-клітин немія, анемія, нефрит, кахексія, множинна Циклоспорин, такролімус мієлома, хвороба Кастлемана, мезангіальний проАнтиревматичні засоби: ліферативний нефрит, системний еритематоз, Гідроксихлороквін, сульфасалазін, лефлунохвороба Крона, панкреатит, псоріаз, ювенільний мід, етанерсепт, інфліксимаб, адалімумаб, Dідіопатичний артрит чи системний ювенільний пеніцилламін, пероральні препарати золота, преідіопатичний артрит. парати золота для ін'єкцій (для внутрішньом'язевої Фармацевтичну композицію даного винаходу ін'єкції), міноциклін, золота натрію тіомалат, аураможна вводити перорально чи парентерально і нофін, лобензарит, буцилламін, актарит; систематично або за необхідності. Наприклад, Засоби, які включають адренокортикоїдні горможна вибрати внутрішньовенну ін'єкцію, таку як мони: введення за допомогою крапельниці, внутрішньоКортизон, гідрокортизони м'язову ін'єкцію, внутрішньочеревинну ін'єкцію, Кортизону ацетат, гідрокортизон, гідрокортипідшкірну ін'єкцію, суппозиторій, введення в пряму зону натрію фосфат, гідрокортизону натрію сукцикишку, пероральні лікарські засоби, покриті кишконат, фторкортизону ацетат во-розчинною оболонкою, і т.п., та придатний споПреднізолон, преднізолони сіб уведення лікарських засобів можна вибирати Преднізолон, преднізолону натрію сукцинат, правильним чином залежно від віку і стану пацієнпреднізолону натрію фосфат, галопредона та. Верхня і нижня межі ефективного дозування ацетат залежать від частоти введення засобу, наприклад, Метилпреднізолон 7 86587 8 Метилпреднізолон, метилпреднізолону ацетат, продукуються клітинами хазяїна, що були трансметилпреднізолону натрію сукцинат формовані за допомогою експресійного вектора, Триамцінолони який включає генетично сконструйований ген анТриамцінолон, триамцінолону ацетат, триамтитіла. Це антитіло, зв'язуючись з IL-6, блокує зв'яцінолону актинід зування IL-6 з рецептором IL-6 і, таким чином, блоДексаметазони кує передачу біологічно активного сигналу IL-6 у Дексаметазон, дексаметазону ацетат, дексаклітини. метазону натрію фосфат, дексаметазону пальміПриклади таких антитіл включають антитіло тат МН166 (Matsuda Т. et al., Eur. J. Immunol., 18:951Бетаметазони 956, 1988) і антитіло SK2 (Sato К. et al., The 21st Бетаметазон, бетаметазону натрію фосфат Proceedings of the Japanese Society for Параметазони Immunology, 21:166, 1991). Параметазону ацетат Гібрідоми, які продукують антитіла до IL-6, Дозування імунодепресанта, наприклад, при можна в основному сконструювати, використовуюйого прийомі поєднаному з МТХ для лікування чи відому процедуру, описану нижче. Тобто, гібріревматоїдного артриту, наприклад, при пероральдоми можна одержати, проводячи імунізацію, виному прийомі, складає від 1 до 100мг/людину на користовуючи як сенсибілізуючий антиген IL-6, тиждень, краще від 4 до 50мг, і найкраще від 7,5 відповідно до традиційного методу імунізації; злидо 25мг/людину. ваючи отримані імунні клітини з відомими в техноТакож високе дозування антитіла до IL-6R пелогії батьківськими клітинами в звичайному методі редбачає дозування, яке здатне попередити чи клітинного злиття; і відбираючи клітини, які продупослабити алергійну реакцію, таке дозування еквікують моноклональне антитіло, за допомогою травалентне або перевищує мінімальне дозування, диційного методу скринінгу. ефективне для лікування IL-6-залежних захворюЗокрема, антитіло до IL-6 можна отримати в вань. Наприклад, при лікуванні ревматоїдного арттакий спосіб. Наприклад, людський IL-6, застосориту при внутрішньовенному краплинному вливуваний як сенсибілізуючий антиген для одержанванні, яке проводять кожні чотири тижні, ня антитіла, можна одержати, використовуючи дозування становить 4мг/кг або більше, переважно ген/амінокислотну послідовність IL-6, докладно від 6 до 16мг/кг та найкраще від 6 до 10мг/кг. описану в Eur. J. Biochem., 168:543-550, 1987; J. Описані вище способи прийому, інтервал між Immunol., 140:1534-1541, 1987; чи в Agr. Biol. прийомами і дозування є ілюстрацією кращих приChem., 54:2685-2688, 1990. кладів, отож належним чином можна вибрати споПослідовність гена IL-6 вставляють у відомий сіб прийому, інтервал і дозування, при якому досяекспресійний вектор, яким трансформують придагається подібний терапевтичний ефект. тні для цього клітини хазяїна, потім за допомогою Наприклад, вимірюючи концентрації різних лікарвідомого методу цікавлячий білок IL-6 очищають з ських засобів у крові, можна вибрати спосіб приклітин або супернатанта культури клітин, і очищейому, інтервал і дозування, при яких досягаються ний білок IL-6 може бути використаний як сенсибіефекти, подібні до тих, котрі приведені вище як лізуючий антиген. Також, як сенсибілізуючий антиприклади. Винахід включає спосіб прийому, інтерген можна використовувати злитий білок, вал і дозування, при яких у крові досягаються конутворений комбінацією білка IL-6 та іншого білка. центрації, еквівалентні тим, що описані в приведеАнтитіло до рецептора IL-6, що його застосоних вище прикладах. вують в даному винаході, може бути отримане у Здійснення винаходу. вигляді поліклонального або моноклонального Антагоністи IL-6, застосовувані в даному винаантитіла з використанням методу, відомого в даній ході, можуть бути використані не залежно від їхгалузі техніки. В даному винаході, має перевагу нього походження, типу і форми доти, доки вони моноклональне антитіло, яке застосовують як андемонструють превентивний або терапевтичний титіло до рецептора IL-6, особливо, антитіло, яке ефект при IL-6-залежних захворюваннях. походить від ссавців. Моноклональні антитіла ссаАнтагоністи IL-6 є речовинами, які інгібують вців включають антитіла, які продукуються гібрібіологічну активність IL-6. Антагоністи IL-6 бажано домами, і антитіла, які продукуються в клітинах є речовинами, які проявляють інгібуючу активність хазяїна, що були трансформовані за допомогою щодо зв'язування будь-яких білків з IL-6, IL-6R чи експресійного вектора, який включає генетично gp130. Антагоністи IL-6 включають антитіло до ILсконструйований ген антитіла. Це антитіло, зв'я6, антитіло до IL-6R, антитіло до gp130, модифікозуючись з рецептором IL-6, блокує зв'язування IL-6 ваний IL-6, модифікований розчинний IL-6R або з рецептором IL-6 і, таким чином, блокує передачу неповні пептиди IL-6 чи IL-6R, а також речовини з біологічно активного сигналу IL-6 у клітини. низькою молекулярною масою, які проявляють Приклади таких антитіл включають антитіло подібну активність. MR16-1 (Tamura Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Антитіло до IL-6, застосовуване в даному ви90:11924-11928, 1993), антитіло PM-1 (Hirata Y. et наході, можна одержати у вигляді поліклональних al., J. Immunol., 143:2900-2906, 1989), антитіло або моноклональних антитіл, використовуючи заAUK12-20, антитіло AUK64-7 чи антитіло AUK146соби, відомі в цій області техніки. Кращими антиті15 (International Patent Application Publication No. лами до IL-6, застосовуваними в даному винаході, WO 92-19759). Серед них найкращим є антитіло є моноклональні антитіла, які походять від ссавців. РМ-1. Моноклональні антитіла ссавців включають антиКлітинна лінія гібрідоми РМ-1, яка продукує тіла, які продукуються гібрідомами, і антитіла, які антитіло РМ-1, була депонована для міжнародного 9 86587 10 визнання 12 липня 1989 року за умовами Будаперистанням відомого методу. Як антитіло до gp130, штського договору як FERM ВР-2998 Міжнародним що його застосовують в даному винаході, перевадепозитарієм для патентованих мікроорганізмів жно використовується моноклональне антитіло, (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, яке походить від ссавців. Моноклональні антитіла Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.). Клітинна лінія пацюковоссавців включають антитіла, продуковані гібрідомишиної гібрідоми MR16-1, яка продукує антитіло мами, та антитіла, продуковані в клітинах хазяїна, MR 16-1, була депонована для міжнародного виякі були трансформовані за допомогою експресійзнання 13 березня 1997 року за умовами Будапеного вектора, що включає генетично сконструйоштського договору як FERM BP-5875 Міжнародним ваний ген антитіла. Це антитіло, зв'язуючись з депозитарієм для патентованих мікроорганізмів gp130, інгібує зв'язування комплексу IL-6/рецептор (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, IL-6 з gp130, блокує передачу біологічно активного Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.). сигналу IL-6 у клітини. Гібрідоми, які продукують моноклональне анПриклади таких антитіл включають антитіло титіло до рецептора IL-6, можуть бути отримані за АМ64 (JP-A-3-219894), антитіло 4В11 і антитіло допомогою відомої процедури, описаної нижче. 2Н4 (US 5571513), антитіло B-S12 і антитіло В-Р8 Тобто, гібрідоми можна одержати, проводячи іму(JP-A-8-291199). нізацію, використовуючи як сенсибілізуючий антиГібрідоми, які продукують моноклональне анген рецептор IL-6, відповідно до традиційного метитіло до gp130, можуть бути отримані за допомотоду імунізації; зливаючи отримані імунні клітини з гою відомої процедури, описаної нижче. Тобто, відомими в технології батьківськими клітинами в гібрідоми можна одержати, проводячи імунізацію, звичайному методі клітинного злиття; і відбираючи використовуючи як сенсибілізуючий антиген клітини, які продукують моноклональне антитіло, gp130, відповідно до традиційного методу імунізаза допомогою традиційного методу скринінгу. ції; зливаючи отримані імунні клітини з відомими в Зокрема, антитіло до рецептора IL-6 можна технології батьківськими клітинами в звичайному одержати в такий спосіб. Наприклад, людські реметоді клітинного злиття; і відбираючи клітини, які цептори IL-6, що їх застосовують як сенсибілізуюпродукують моноклональне антитіло, за допомочий антиген для одержання антитіла, можна одергою традиційного методу скринінгу. жати, використовуючи генну чи амінокислотну Зокрема, моноклональне антитіло можна одепослідовності рецептора IL-6, докладно описані в ржати в такий спосіб. Наприклад, gp130, що його European Patent Application Publication No. застосовують як сенсибілізуючий антиген для одеEP325474 і JP-A-3-155795, відповідно. ржання антитіла, можна одержати, використовуюІснує два типи білків рецептора IL-6: один з чи ген/амінокислотну послідовність gp130, докладних експресований на клітинах, а інший - відділено описану в European Patent Application ний від клітинної мембрани (розчинний рецептор Publication No. ЕР 411946. IL-6) (Yasukawa К. et al, J. Biochem., 108:673-676, Послідовність гена gp130 включають у відому 1990). Розчинний рецептор IL-6 формується значсистему експресійного вектора, яким трансфорною мірою з екстраклітинної ділянки рецептора ILмують клітини придатного хазяїна, потім цікавля6 і відрізняється від мембрано-зв'язаного рецепточий білок gp130 очищають з клітин чи супернатанра IL-6 тим, що не містить трансмембранну ділянку та клітинної культури за допомогою відомого або трансмембранну ділянку разом із внутрішньометоду, і очищений білок gp130 може бути викориклітинною ділянкою. Обидва білки рецептора IL-6 станий як сенсибілізуючий антиген. Також як сенможна використовувати в як сенсибілізуючий антисибілізуючий антиген можна використовувати кліген для продукції антитіла до рецептора IL-6, що тини, експресуючі gp130, чи злитий білок, його застосовують в даному винаході. утворений комбінацією gp130 і іншого білка. Послідовність гена рецептора IL-6 включають Перелік тварин - ссавців, імунізованих за доу відомий експресійний вектор, яким трансформупомогою сенсибілізуючого антигену, ніяк не обмеють клітини придатного хазяїна, потім цікавлячий жено, але бажано їх відбирати виходячи з їх сумісбілок рецептора IL-6 очищають з клітин чи суперності з батьківськими клітинами, що їх натанта культури за допомогою відомого методу, і використовують для клітинного злиття. Звичайно очищений білок рецептора IL-6 може бути викориданий перелік включає гризунів, таких як миша, станий у як сенсибілізуючий антиген. Також, у як пацюк і хом'як. сенсибілізуючий антиген можна використовувати Імунізацію тварини сенсибілізуючим антигеном клітини, експресуючі рецептор IL-6, або злитий проводять, використовуючи відомий спосіб. Як білок, утворений комбінацією білка рецептора IL-6 основні способи, наприклад, застосовують внутріі іншого білка. шньочеревинну або підшкірну ін'єкцію тварини Штам Е.соlі HB101-pIBIBSF2R, клітини якого сенсибілізуючим антигеном. Зокрема, у кращому містять плазміду pIBIBSF2R, яка включає кДНК, варіанті сенсибілізуючий антиген, який придатним що кодує рецептор IL-6 людини, був депонований способом розводять і суспендують у PBS (фосфадля міжнародного визнання 9 січня 1989 року за тно-сольовий буфер) або фізіологічному розчині, умовами Будапештського договору як FERM ВРзмішують для емульгування з придатною кількістю 2232 Міжнародним депозитарієм для патентовазвичайного ад'юванта, наприклад, повного ад'юваних мікроорганізмів (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, нта Фрейнда, і потім вводять його ссавцю впроHigashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.) . довж декількох прийомівз інтервалом від 4 до 21 Антитіло до gp130, яке застосовується в даднів. Також під час імунізації сенсибілізуючим анному винаході, може бути отримане у вигляді політигеном може бути використаний придатний носій. клонального чи моноклонального антитіла з вико 11 86587 12 Тварину імунізують в такий спосіб, і імунізацію декількох тижнів, протягом часу, достатнього для підтверджують тим, що в сироватці крові підвищузагибелі клітин (тих, що не злилися), які відрізняється рівень цікавлячого антитіла. Потім імунізоються від бажаних гібридом. Потім застосовують вані клітини видаляють із організму ссавця і викозвичайний метод граничного розведення і провористовують для клітинного злиття. Кращими дять скринінг і клонування гібридом, які продукуклітинами для клітинного злиття, зокрема, є клітиють бажане антитіло. ни селезінки. Крім одержання зазначеної вище гібрідоми, Серед клітин мієломи ссавців, що їх застосоімунізуючи антигеном тварину (але не людину) за вують як батьківські клітини-партнери для злиття з допомогою сенсибілізування лімфоцитів людини описаними вище імунізованими клітинами, перебілком-антигеном або клітинами, які експресують важно використовують уже відомі клітинні лінії, такі антиген in vitro, і злиття сенсибілізованих Вяк P3X63Ag8.653 (Kearney J. F. et al., J. Immunol., лімфоцитів із клітинами мієломи людини, напри123:1548-1550, 1979), P3X63Ag8U.l (Current Topics клад, із клітинами U26.6 (див. JP-B-1-59878), можin Microbiology and Immunology, 81:1-7, 1978), NS-1 на одержати бажане антитіло людини, яке прояв(Kohler G. and Milstein C, Eur. J. Immunol., 6:511ляє активність зв'язування з бажаним антигеном 519, 1976), MOC-11 (Margulies D.H. et al., Cell, або клітинами, які експресують антиген. Крім цьо8:405-415, 1976), SP2/0 (Shulman M. et al., Nature, го, антиген чи клітини, які експресують антиген, 276:269-270, 1978), FO (de St. Groth S. F. et al., J. можна ввести трансгенним тваринам, які мають Immunol. Methods, 35:1-21, 1980), S194 набір генів антитіл людини, щоб одержати бажане (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med., 148:313-323, 1978) і людське антитіло у відповідності зі способом, опиR210 (Galfre G. et al., Nature, 277:131-133,1979). саним вище (див. International Patent Application Злиття зазначених вище імунних клітин із кліPublication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO тинами мієломи власне кажучи може бути прове94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO дене відповідно до відомого способу, такого як 96/33735). спосіб, описаний у роботі Milstein et al. (Kohler G. Сконструйовану в такий спосіб гібрідому, яка and Milstein C, Methods Enzymol., 73:3-46, 1981). продукує моноклональне антитіло, можна культиБільш конкретно, зазначене злиття клітин провувати в стандартному культуральному середоводять, наприклад, у звичайному поживному кульвищі або можна зберігати тривалий час у заморотуральному середовищі в присутності каталізатора женому стані при температурі рідкого азоту. клітинного злиття. Як каталізатор клітинного злитЩоб одержати моноклональне антитіло з гібтя можна використовувати, наприклад, поліетилеридом, можна використовувати спосіб, у якому нгліколь (PEG), вірус Сендай (HVJ) або щось подігібрідоми культивують звичайним чином і одержубне, і, крім того, щоб підсилити ефективність ють моноклональне антитіло у вигляді супернатазлиття, потім за бажанням можна доданта клітинної культури, або за допомогою способу, ти/використовувати допоміжний засіб, такий як у якому гібрідому вводять і вирощують у тваринах, диметилсульфоксид. сумісних із зазначеною гібрідомою, а антитіла Кращим співвідношенням імунних клітин до одержують у вигляді асцитів. Перший спосіб підклітин мієломи є, наприклад, від 1- до 10-кратного ходить для одержання високоочищених антитіл, надлишку імунних клітин відносно клітин мієломи. тоді як останній спосіб підходить для виробництва Як середовище для клітинного злиття, можливе великих кількостей антитіл. використання середовища RPMI 1640, середовиНаприклад, одержання гібрідоми, яка продукує ща MEM, яке підходить для росту клітинної лінії антитіло до рецептора IL-6, можна проводити, вимієломи, і іншого стандартного середовища, яке користовуючи спосіб, розкритий у JP-A-3-139293. застосовують для такого типу клітинної культури, і, Можна застосувати спосіб, у якому гібрідоми,·які крім цього, можна вводити сироваткові добавки, продукують антитіло РМ-1, депоновані для міжнатакі як фетальна сироватка теляти (FCS). родного визнання 12 липня 1989 року за умовами Для клітинного злиття, цікавлячі злиті клітини Будапештського договору як FERM ВР-2 998 Між(гібрідоми) формують шляхом ретельного змішународним депозитарієм для патентованих мікровання певної кількості описаних вище імунізованих організмів (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1клітин із клітинами мієломи в зазначеному вище chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.), вводять внутрісередовищі, додаючи розчин PEG, наприклад, шньочеревинно мишам BALB/c для одержання розчин PEG з молекулярною масою від 1000 до асцитів, і антитіла РМ-1 очищають з цих асцитів. 6000, попередньо прогрітий до 37°С, у стандартній Також, можна застосувати спосіб, у якому зазнаконцентрації від 30 до 60% (вага/об'єм), з наступчені гібрідоми культивують у придатному культуним перемішуванням. Потім, за допомогою процеральному середовищі, наприклад, у середовищі дури повторного, послідовного додавання придатRPMI 1640, у гібрідомному середовищі SFM (вироного культурального середовища і бництво фірми GIBCO-BRL), у середовищі PFHM-II центрифугування можна видалити супернатант, (виробництво фірми GD3CO-BRL) , що містять агенти клітинного злиття і т.п., присутність яких 10%-ну фетальну сироватку теляти і 5%-ний МВнебажана для росту гібрідоми. Condimed HI (виробництво фірми Boehringer Гібрідоми можуть бути відібрані за допомогою Mannheim), і антитіло РМ-1 очищають із супернакультивування в звичайному селекційному серетанта клітинної культури. довищі, наприклад, у культуральному середовищі У даному винаході як моноклональне антитіло HAT (середовище, яке містить гіпоксантин, аміноможна використовувати антитіло рекомбінантного птерин і тімідин). Культивування в середовищі типу, продуковане за допомогою клонування гена HAT продовжують звичайно від декількох днів до антитіла з гібрідоми, включення цього гена в при 13 86587 14 датний вектор, введення його в клітину хазяїна, і Application Publication No. ЕР 125023, International використання генно-інженерних технологій (див., Patent Application Publication No. WO 92/19759). За наприклад, Borrebaeck С.А.К., and Larrick J.W. допомогою цих відомих методів можна одержати Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the химерне антитіло, корисне в даному винаході. United Kingdom by Macmillan Publishers Ltd. 1990). Наприклад, плазміди, які містять ДНК, що коЗокрема, мРНК, яка кодує варіабельну (V) обдує V-області L- і Н-ланцюги химерного антитіла ласть бажаного антитіла, виділяють із клітин, яка РМ-1, були названі рРМ-к3 і pPM-h1, відповідно, і продукують цікавляче антитіло, таких як гібрідоми. штами Е.соlі, які мають вказані плазміди, були деДля виділення мРНК одержують сумарний препапоновані для міжнародного визнання 12 лютого рат РНК із використанням відомого способу, тако1991 року за умовами Будапештського договору як го, наприклад,як метод ультрацентрифугування в NCIMB 40366 і NCIMB 40362, відповідно, Компаніприсутності гуанідіну (Chirgwin J.M. et al., єю Національної колекції промислових, харчових і Biochemistry, 18:5294-5299, 1979), метод AGPC морських бактерій (23 St. Machar Drive, Aberdeen (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 162:156-159, AB2 1RY, Scotland, United Kingdom). 1987), і мРНК одержують, використовуючи набір Гуманізовані антитіла, які відносяться до людфірми Pharmacia «mRNA Purification Kit». Також ських антитіл зі зміненою формою, є антитілами, у мРНК можна виділити безпосередньо, використояких ділянка, яка детермінує компліментарність вуючи набір фірми Pharmacia «QuickPrep mRNA антитіла (CDR, complementarity determining region) Purification Kit». ссавця, але не людини, наприклад, мишачого анкДНК V-області антитіла синтезують з отриматитіла, трансплантують у CDR ділянку антитіла ної мРНК, використовуючи зворотну транскрипталюдини за допомогою відомого, загальноприйнязу. Синтез кДНК проводять, використовуючи набір того методу рекомбінантних ДНК (див. European «AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Patent Application Publication No. ЕР 125023, Synthesis Kit» і подібні набори. Також, для синтезу International Patent Application Publication No. WO й ампліфікації кДНК можна використовувати набір 92/19759). «5'-Ampli FINDER RACE kit» (виробництво фірми Зокрема, послідовність ДНК, яка була сконстClontech), і метод 5'-RACE, в якому використовуруйована для літування CDR мишачого антитіла в ється полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) антитіло людини без порушення рамки зчитування (Frohman Μ.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (FR, framework region), синтезується за допомогою 85:8998-9002, 1988; Belyavsky A. et al., Nucleic методу ПЛР із використанням олігонуклеотидів, які Acids Res., 17:2919-2932, 1989) . Бажаний фрагмають на кінцях області, які перекриваються. мент ДНК очищають із продукту ПЛР і лігують у Отриману ДНК літують у ДНК, що кодує С-область ДНК вектора. Потім отриманий рекомбінантний антитіла людини, і потім включають у експресійний вектор вводять в Е. соlі, і відбирають колонії для вектор, який вводять у клітини хазяїна для продуквиділення бажаного рекомбінантного вектора. Поції гуманізованого антитіла (див. European Patent слідовність основ бажаної ДНК підтверджують за Application Publication No. EP 239400, International допомогою відомого способу, такого як дідезоксиPatent Application Publication No. WO 92/19759). метод секвенування. Серед FR антитіл людини, лігованих через Якщо одержують ДНК, що кодує V-область CDR, вибирають ті, у яких ділянка, що визначає бажаного антитіла, її лігують у молекулу ДНК, що компліментарність, формує придатну область зв'якодує константну область (С-область) бажаного зування антигену. При бажанні можна замінити антитіла, і потім її включають у експресійний векамінокислоти без порушення рамки зчитування у тор. Або ДНК, що кодує V-область антитіла, можна варіабельній ділянці антитіла, так щоб ділянка, що включити в експресійний вектор, який містить Свизначає компліментарність антитіла людини зі область антитіла. зміненою формою, могла утворити відповідну обЩоб продукувати антитіло, застосовуване в ласть зв'язування антигену (Sato K. et al., Cancer даному винаході, ген антитіла включають у ексRes., 53:851-856, 1993). пресійний вектор для того, щоб його експресія Для химерного антитіла і гуманізованого антийшла під контролем експресійних регуляторних тіла використовують С-область антитіла людини. ділянок, наприклад, енхансера і промотору, як С-область антитіла людини включає Сg, і, наприописано нижче. Потім, за допомогою цього експреклад, можна використовувати Сg1, Сg2, Сg3 і Сg4. сійного вектора можна трансформувати клітини С-область антитіла людини можна модифікувати хазяїна. для поліпшення стабільності антитіла чи його проУ даному винаході з метою зниження алогендукції. ної антигенності для людини можна застосовувати Химерне антитіло включає варіабельну обрекомбінантне антитіло зі штучно модифікованим ласть антитіла, що походить із ссавця, відмінного геном, наприклад, химерне антитіло, гуманізоване від людини, і С-область, що походить з антитіла антитіло і людське антитіло. Ці модифіковані антилюдини. Гуманізоване антитіло включає CDR дітіла можна одержати за допомогою відомих метолянку антитіла, що походить із ссавця, відмінного дів. від людини, а також область рамки зчитування і СХимерне антитіло можна одержати за допомообласть, що походить з антитіла людини. Відповігою літування отриманої, як описано вище, ДНК, дно до цього, вони мають низку антигенність в що кодує V-область антитіла, у ДНК, що кодує Сорганізмі людини і, таким чином, корисні як антитіобласть антитіла людини, з наступним її включенла, застосовувані у даному винаході. ням у експресійний вектор, який вводять у клітини Кращі характерні приклади гуманізованого анхазяїна для продукування (див. European Patent титіла, застосовуваного в даному винаході, вклю 15 86587 16 чають гуманізоване антитіло РМ-1 (див. придатної зміни просторової структури антитіла International Patent Application Publication No. WO (див., наприклад, W0 96/30394). 92/19759). Як точки початку реплікації (origin) можна виТакож, у доповненні до способів, описаних користовувати вірусні оріджини, отримані з SV40, вище, для одержання антитіла людини відома вірусу поліоми, аденовірусу, вірусу бичачої папітехнологія, яка використовує перегляд бібліотеки ломи (BPV). Крім того, для збільшення числа копій людських антитіл. гена в клітинній системі хазяїна, експресійний векНаприклад, варіабельну область антитіла лютор може включати як селективні маркери ген амідини можна експресувати на поверхні фага у виноглікозидфосфотрансферази (ΑΡΗ), ген тімідингляді окремого ланцюга антитіла (scFv) за допомокінази (ТК), ген ксантин-гуанінгою методу фагового відображення (phage фосфорибозилтрансферази Е. соlі (Ecogpt), ген display), і з бібліотеки можна відібрати фаги, які дигідрофолатредуктази (dhfr) і т.п. зв'язуються з антигеном. При генному аналізі відіДля продукування антитіла, застосовуваного в браного фага можна визначити послідовність ДНК, даному винаході, можна використовувати будь-яку що кодує варіабельну область антитіла людини, продукуючу систему. Для одержання антитіла ісяка зв'язується з антигеном. Якщо послідовність нують системи продукування in vitro і in vivo. СисДНК ланцюга scFv, яка зв'язує антиген, була виявтема продукування in vitro включає продукуючу лена, то за допомогою придатного експресійного систему, у якій використовують еукаріотичні клітивектора можна сконструювати послідовність для ни, і продукуючу систему, у якій використовують одержання антитіла людини. Ці способи вже добре прокаріотичні клітини. відомі, і їх можна знайти в W0 92/01047, W0 При використанні еукаріотичних клітин існують 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, W0 продукуючі системи, в яких використовують кліти93/19172, WO 95/01438 і WO 95/15388. ни тварин, рослинні клітини або клітини грибів. Ген антитіл, сконструйований, як було описано Клітини тварин включають (1) клітини ссавців, такі вище, можна експресувати і одержати за допомояк СНО, COS, клітини мієломи, ВНК (клітини з нигою відомого методу. У випадку клітин ссавців ген рок дитинчат хом'яка), HeLa, Vero і т.п. (2) клітини антитіла можна експресувати за допомогою ДНК, у амфібій, такі як ооцити Xenopus або (3) клітини якій ефективно з'єднані звичайно використовувакомах, такі як sf9, sf21, Tn5 і т.п. Серед клітин росний промотор, експресований ген антитіла і сигналин відомі, наприклад, клітини, які походять з льна послідовність полі-Α, розташована на 3'-кінці Nicotiana tabacum, і які можна культивувати у виДНК, або за допомогою вектора, що включає їх. гляді каллуса (недиференційована тканина росНаприклад, як промотор/енхансер можна викорислин, яку можна культивувати in vitro). Клітини гритовувати ближній ранній промотор/енхансер цитобів включають дріжджі, наприклад, рід мегаловірусу людини. Saccharomyces, зокрема, Saccharomyces Крім того, серед інших промоторів/енхансерів, cerevisae, або нитчасті гриби, такі як рід які можуть бути використані для експресії антитіла, Aspergillus, зокрема, Aspergillus niger. застосовуваного в даному винаході, можна викоЯкщо використовують прокаріотичні клітини, ристовувати вірусні промотори/енхансери ретровіто існують продукуючі системи, у яких застосовурусу, вірусу поліоми, аденовірусу і вірусу 40 мавп ють бактеріальні клітини. Бактеріальні клітини (SV40), а також промотор/енхансер, який походить включають Е. соlі і Bacillus subtilis. Антитіло можна одержати шляхом введення з гена фактора елонгації людини 1a (HEF1a) клігена бажаного антитіла в ці клітини за допомогою тин ссавців. їх трансформації і культивування трансформоваНаприклад, експресію можна проводити за доних клітин in vitro. Культивування проводять за помогою методу Mulligan et al. (Mulligan R. et al., допомогою відомих методів. Наприклад, як кульNature, 277:108-114, 1979) при використанні протуральне середовище можна використовувати мотору/енхансера SV40 чи за допомогою методу DMEM, MEM, RPMI 1640 і IMDM, і разом з ними Mizushima et al. (Mizushinaa S. and Nagata S., можна використовувати сироваткові добавки, такі Nucleic Acids Res., 18:5322, 1990) при використанні як фетальна сироватка теляти (FCS). Антитіла промотору/енхансера гена HEF1a. можна одержувати in vivo за допомогою переносу У випадку Е.соlі ген можна експресувати за клітин, до яких було введено ген антитіла, у чередопомогою ефективної сполуки звичайно викорисвну порожнину тварини. товуваного промотору, сигнальної послідовності З іншого боку, системи, які продукують in vivo, для секреції антитіла і експресованого гена антивключають системи, у яких використовують тватіла. Наприклад, промотори можуть включати рин, і ті, у яких використовують клітини рослин. промотори генів lacZ і аrаВ. При використанні проПри використанні клітин тварин існують продукуюмоторів генів lacZ і аrаВ можна застосовувати мечі системи, у яких застосовують ссавців і комах. тод Ward et al. (Ward E. S. et al., Nature, 341:544Серед ссавців можуть бути використані кози, 546, 1989; Ward E. S. et al., FASEB J., 6:2422-2427, свині, вівці, миші, велика рогата худоба і т.п. (Vicki 1992) та метод Better et al. (Better M. et al., Science, Glaser, Spectrum Biotechnology Application, 1993). 240:1041-1043, 1988), відповідно. Також, серед комах може бути використаний шовЯк сигнальну послідовність для секреції антиковичний шовкопряд. При використанні рослин тіла можна використовувати сигнальну послідовможна застосовувати, наприклад, тютюн. ність pelB (Lei S. P. et al., J. Bacteriol., 169:4379Гени антитіла вводять до клітин названих тва4383, 1987) у випадку продукування білка в перирин або рослин, і в організмі таких тварин чи росплазмі Е. соlі. Антитіло, яке продукується в перилин продукуються антитіла, які потім виділяють. плазмі, виділяють і потім використовують після 17 86587 18 Наприклад, ген антитіла одержують у вигляді злитіл. Як пептидний лінкер для з'єднання V-областей того гена шляхом вставки в середину гена, який може бути використаний, наприклад, певний одкодує білок, що спадково продукується в молоко, ноланцюговий пептид, який включає 12-19 амінонаприклад, у такий як ген β-казеїну кози. Фрагмент кислотних залишків. ДНК, що містить злитий ген, у котрий було вставДНК, яка кодує scFv, одержують методом ПЛР лено ген антитіла, уводять за допомогою ін'єкції в за допомогою ампліфікації ділянки ДНК, що кодує ембріон кози, і ембріон вводять у самку кози. Бабажану амінокислотну послідовність, ділянки ДНК, жане антитіло одержують з молока, виробленого що кодує Η-ланцюг чи V-область Н-ланцюга затрансгенною козою, народженою від кози, якій бузначеного вище антитіла, які використовують як ло підсаджено ембріон, чи з молока потомства матриці, застосовуючи пару праймерів, що визнатакої трансгенної кози. Щоб збільшити кількість чають обидва їх кінці; потім на наступному етапі молока, що містить бажане антитіло, трансгенній ампліфікують ДНК, що кодує ділянку пептидного козі можна давати придатні гормони (Ebert Κ. Μ. et лінкера, і обидва кінці зазначеної ДНК з'єднують з al., Bio/Technology, 12:699-702, 1994). парою праймерів, які визначають їх з'єднання з НЯкщо використовують шовковичного шовколанцюгом і L-ланцюгом, відповідно. пряда, то його інфікують бакуловірусом, у який Крім того, після конструювання молекул ДНК, вставили ген бажаного антитіла, і бажане антитіло що кодують scFv, за допомогою загальноприйнявиділяють з рідини, одержаної з тіла шовкопряда тих методів можна одержати експресійний вектор, (Maeda S. et al., Nature, 315:592-594, 1985). Крім який містить ці ДНК, і хазяїна, якого трансформоцього, якщо використовують тютюн, то ген бажановано експресійним вектором, і відповідно до загаго антитіла вставляють у рослинний експресійний льноприйнятих методів, можна одержати scFv, вектор, наприклад, у pMON 530, і цей вектор ввовикористовуючи отриманий трансформований дять у бактерію, таку як Agrobacterium tumefaciens. організм хазяїна. Тютюн, наприклад, Nicotiana tabacum, інфікують Для таких фрагментів антитіла можна одержацими бактеріями, і з листів цього тютюну одержути їх гени, експресувати і продукувати їх в організють бажане антитіло (Julian К. С, Ma, et al., Eur. J. мі хазяїна, як було відзначено вище. Термін «антиImmunol., 24:131-138,1994). тіло», як його вживають у даному винаході також Якщо антитіло одержують за допомогою провключає ці фрагменти антитіла. дукуючої системи in vitro чи і in vivo, як описано Як модифіковане антитіло можна використовище, ДНК, що кодує важкий ланцюг (Н-ланцюг) вувати антитіло, зв'язане з різними молекулами, або легкий ланцюг (L-ланцюг) антитіла можна такими як поліетиленгліколь (PEG). Термін «антиокремо інтегрувати в експресійні вектори, якими тіло», як його вживають у даному винаході також можна одночасно трансформувати хазяїна, або включає ці модифікації антитіла. Щоб одержати ДНК, яка кодує Н- і L-ланцюги можна включити в такі модифікації антитіла, отримане антитіло хімічтой же самий експресійний вектор, яким можна но модифікують. Ці методи є вже добре відомими трансформувати хазяїна (див. International Patent в даній галузі техніки. Application Publication No. WO 94-11523). Отримане і експресоване, як описано вище, Антитіло, що його застосовують в даному виантитіло можна ізолювати із зовнішніх і внутрішніх наході, може бути фрагментами антитіл або їх компартментів клітин і хазяїна й очистити до гомомодифікованими варіантами до тієї межі, поки ангенного стану. Виділення і очищення антитіла, титіло можна адекватно використовувати. Напризастосовуваного в даному винаході, можуть бути клад, фрагменти антитіла можуть включати Fab, виконані за допомогою афінної хроматографії. F(ab')2, Fv чи одноланцюговий Fv (scFv), у яких Fv Колонки, які використовують для афінної хроматофрагменти Η-ланцюга і L-ланцюга з'єднані за дографії, включають Protein A та Protein G колонки. помогою придатного лінкера. Носії, які використовуються в Protein A колонці, Зокрема, щоб одержати фрагменти антитіла, включають Hyper D, POROS, Сефарозу F і т.п. Без антитіло обробляють за допомогою ферменту, яких-небудь обмежень можуть бути використані наприклад, папаїну, пепсину, чи конструюють ген, будь-які придатні загальноприйняті методи роздіщо кодує фрагмент антитіла, і вставляють його в лення/очищення звичайних білків. експресійний вектор, який експресують у клітинах Наприклад, антитіло, застосовуване в даному придатного хазяїна (див., наприклад, Co Μ. S. et винаході, може бути виділене за допомогою вибal., J. Immunol., 152:2968-2976, 1994; Better M. and раної певним чином і комбінованої хроматографії, Horwitz A. N., Methods in Enzymology, 178:476-496, відмінної від зазначеної вище афінної хроматог1989; Plueckthun A. and Scerra Α., Methods in рафії, за допомогою фільтрації, ультрафільтрації, Enzymology, 178:497-515, 1989; Lamoyi E., Methods знесолення, діалізу і т.п. Приклади хроматографії in Enzymology, 121:652-663, 1989; Rousseaux J. et включають іонообмінну хроматографію, гідрофобal., Methods in Enzymology, 121, 663-666, 1989; Bird ну хроматографію, гель-фільтрацію і т.п. Ці різноR. E. et al., TIBTECH, 9:132-137, 1991). види хроматографії можна застосовувати в HPLC Фрагмент scFv можна одержати літуванням V(рідинна хроматографія високого розрізнення). області H-ланцюга і V-області L-ланцюга антитіла. Також можна використовувати обернено-фазову У цьому scFv V-область Η-ланцюга і V-область LHPLC. ланцюга переважно з'єднують через лінкер, бажаВимірювання концентрації антитіла, отриманоно це пептидний лінкер (Huston J. S., et al., Proc. го, як описано вище, можна проводити, вимірюючи Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988). Vоптичне поглинання чи за допомогою імуноферобласть H-ланцюга і V-область L-ланцюга в scFv ментного аналізу (ELISA). Тобто, при вимірюванні можуть походити з кожного зі згаданих вище антиоптичного поглинання, антитіло розводять певним 19 86587 20 чином за допомогою PBS (-) а потім вимірюють 1994 і Savino et al., EMBO J., 13:1357-1367, 1994, оптичне поглинання при 280нм і розраховують WO 96/18648 і WO 96/17869. концентрацію, приймаючи, що 1мг/мл дає поглиНеповні пептиди IL-6 чи неповні пептиди реценання, рівне 1,35 OD. При використанні методу птора IL-6, застосовувані в даному винаході, проELISA вимірювання проводять у такий спосіб. Отявляють активність зв'язування з рецептором IL-6 же, 100мкл козячих антитіл до імуноглобулінів IgG чи з IL-6, відповідно, і є речовинами, які не перелюдини (виробництво фірми TAG), розведених до дають біологічної активності I.L-6. Тобто, неповні концентрації 1мкг/мл у 0,1М бікарбонатному буфепептиди IL-6 або неповні пептиди рецептора IL-6 рі (рН 9, 6), вносять у 96-лунковий планшет (вироспецифічно інгібують зв'язування IL-6 з рецептобництво фірми NUNC) та інкубують протягом ночі ром IL-6, приєднуючись до рецептора IL-6 або IL-6, при 4°С для іммобілізації антитіл. Після блокуванвідповідно, і фіксуючи їх. У результаті, оскільки ня, вносять по 100мкл кожного розведеного певвони не передають біологічно активного сигналу ним чином антитіла, застосовуваного в даному IL-6, вони блокують передачу сигналу IL-6. винаході, або зразка, що включає антитіло, або Неповний пептид IL-6 чи неповний пептид реIgG людини (виробництво фірми Сарреї) як станцептора IL-6 є пептидами, які включають деяку дарт і інкубують при кімнатній температурі протячастину чи повну амінокислотну послідовність, яка гом 1 години. приймає участь у зв'язуванні IL-6 з рецегітором ILПісля промивання вносять 100мкл розведених 6, в амінокислотній послідовності IL-6 чи рецептоу 5000 разів антитіл до імуноглобулінів IgG людира IL-6. Такий пептид звичайно включає від 10 до ни, мічених лужною фосфатазою (виробництво 80, краще від 20 до 50, ще краще від 2 0 до 4 0 фірми Bio Source), і інкубують при кімнатній темамінокислотних залишків. Неповний пептид IL-6 чи пературі протягом 1 години. Після промивання неповний пептид рецептора IL-6 можуть бути скододають і інкубують розчин субстрату, а потім, нструйовані шляхом визначення ділянки, яка прищоб розрахувати концентрацію бажаного антитіла, ймає участь в зв'язуванні з IL-6 або з рецептором вимірюють поглинання при 405 нм за допомогою IL-6 в амінокислотній послідовності IL-6 чи рецепфотометра Microplate Reader Model 3550 (виробтора IL-6, і за допомогою синтезу деякої частини ництво фірми Bio-Rad). або всієї амінокислотної послідовності загальноМодифікований IL-6, застосовуваний у даному прийнятими методами, такими як генна інженерія винаході, належить до речовин, які проявляють або метод пептидного синтезу. активність зв'язування з рецептором IL-6 і які не Щоб одержати неповний пептид IL-6 чи неповпередають біологічно активного сигналу IL-6. Моний пептид рецептора IL-6 за допомогою генної дифікований IL-6 не передає біологічно активного інженерії, послідовність ДНК, що кодує бажаний сигналу IL-6 тому, що він конкурентно щодо IL-6 пептид, вводять у експресійний вектор, використозв'язується з рецептором IL-6, блокуючи, таким вуючи способи експресії, продукції й очищення, чином, передачу сигналу IL-6. згадані вище для рекомбінантного антитіла. Модифікований IL-6 конструюють шляхом Щоб одержати неповний пептид IL-6 чи неповодержання варіантів IL-б за допомогою заміни ний пептид рецептора IL-6 за допомогою пептидамінокислотних залишків в амінокислотній посліного синтезу, можна використовувати методи, звидовності IL-6. IL-6, який є джерелом модифіковачайно застосовувані в пептидному синтезі, ного IL-6, може бути будь-якого походження, але наприклад, твердофазовий метод синтезу або якщо брати до уваги антигенність, то бажано він рідиннофазовий метод синтезу. повинний бути IL-6 людини. Зокрема, можна проводити синтез відповідно Зокрема, модифікацію IL-6 проводять, прогнодо методу, описаного у роботі Zoku Iyakuhin, зуючи вторинну структуру амінокислотної послідоKaihatsu, Vol. 14, Peptido Gousei, (Ed. Yajima, H., вності IL-6 з використанням відомої в цій галузі Hirokawa Shoten, 1991). Як твердофазовий метод техніки програми молекулярного моделювання синтезу застосовується, наприклад, метод, у якоамінокислотної послідовності, наприклад, програму пептидний ланцюг нарощують шляхом приєдми WHATIF (Vriend et al. J. Моl. Graphics, 8:52-56, нання амінокислоти, яка відповідає С-кінцю синте1990), оцінюючи потім вплив заміни окремих амізованого пептиду, до підложки, яка нерозчинна в нокислотних залишків у цілому білку. Після того, як органічних розчинниках, і почергово повторюють було зроблено вибір придатних амінокислотних реакцію, у якій певну амінокислоту послідовно залишків для амінокислотної заміни, одержують конденсують у напрямку від С- до N-кінців в аміноген, який кодує модифікований IL-6, одержуючи кислотах, у яких α-аміногрупа і функціональні груйого варіанти за допомогою методу, який звичайно пи бічного ланцюга захищені за допомогою придазастосовують для цього полімеразної ланцюгової тних захисних груп, і реакцію, у якій зазначену реакції (ПЛР), у якому амінокислоти заміщують, захисну групу α-аміногрупи амінокислоти видалявикористовуючи як матрицю вектор, який включає ють з амінокислот чи пептиду, приєднаних до підпослідовність основ, яка кодує людський ген IL-6. ложки. Методи твердофазового пептидного синтеМодифікований IL-6 можна одержати, за необхідзу загалом класифікуються як Вос-метод і Fmocності, вставляючи його в придатний експресійний метод, залежно від типу. захисних груп, які застовектор у відповідності зі способами експресії, просовуються. дукції й очищення згаданого вище рекомбінантноПісля синтезу бажаного пептиду, проведеного го антитіла. таким способом, проводять реакцію зняття захисту Типові приклади модифікованого IL-6 розкриті і реакцію відщеплення пептидного ланцюга від в роботі Brakenhoff et al., J. Biol. Chem., 269:86-93, підложки. У реакції відщеплення пептидного ланцюга від носія у Вос-методі звичайно використо 21 86587 22 вують фтористий водень або трифторметансульв комбінації з метотрексатом, оцінювалася в паціфонат, а у Fmoc-методі - TFA. У Вос-методі згадаєнтів з активним ревматоїдним артритом, незвану вище підложку захищеного пептиду обробляють жаючи на лікування метотрексатом протягом певфтористим воднем у присутності анізолу. Потім ного проміжку часу, і її порівнювали з для одержання пептиду проводять видалення замонотерапією метотрексатом. Оцінювали ефектихисної групи і відщеплення пептиду від підложки. вність, безпеку і ι легкість перенесення MRA. Для одержання неочищеного препарату пептиду Методи. його ліофілізують. З іншого боку, у Fmoc-методі, Суб'єкти. Реєстрували пацієнтів з ревматоїднаприклад, у TFA, реакцію зняття захисту і реакцію ним артритом, який було діагнозовано на підставі відщеплення пептиду з підложки можна проводити класифікації захворювань Американської колегії за допомогою процедури, подібної до описаної ревматології (ACR) 1987 року, і який тривав, щовище. найменше, 6 місяців. У пацієнтів повинна була Отриманий неочищений пептид можна виділибути активна форма захворювання і неадекватна ти й очистити за допомогою методу HPLC. Елюювідповідь чи спалах захворювання після прийому вання можна проводити за оптимальних умов, тільки метотрексата (МТХ), який давали пацієнвикористовуючи систему розчинників водатам, щонайменше, протягом 6 місяців у дозуванні, ацетонітрил, яку звичайно використовують для щонайменше, 12,5мг щотижня чи 10мг щотижня у очищення білків. Фракції, що відповідають пікам випадку важкого перенесення. профілю результуючої хроматографії, збирають і Модель вивчення. Двічі сліпий, рандомізоваліофілізують. Очищені в такий спосіб пептидні ний (випадковий) метод, вивчення паралельних фракції ідентифікують, аналізуючи молекулярну груп за допомогою центрального рандомізованого масу за допомогою мас-спектроскопічного аналізу, методу. аналізу амінокислотного складу чи аналізу аміноДозування і прийом засобу. Сім груп: 0 мг/кг кислотної послідовності. MRA (плацебо, лікарська форма, що містить нейтТипові приклади неповних пептидів IL-6 і реральні речовини) + МТХ, 2мг/кг MRA+ МТХ, 4мг/кг цептора IL-6 розкриті в JP-A-2-188600, 7-324097 і MRA+ МТХ, 8мг/кг MRA+ МТХ, 2мг/кг MRA+ МТХ 8-311098, а також у патенті US 5210075. плацебо, 4мг/кг MRA+ МТХ плацебо і 8мг/кг MRA+ Фармацевтичні композиції даного винаходу МТХ плацебо. Прийом MRA чи плацебо здійснюможуть включати фармацевтично прийнятні носії ють за допомогою внутрішньовенного введення з або добавки, вибір яких залежить від - способу інтервалами в 4 тижні. введення засобу. Приклади таких носіїв або добаПрийом МТХ чи МТХ плацебо здійснюють певок включають воду, фармацевтично прийнятні рорально, один раз на тиждень у дозуванні 10органічні розчинники, колаген, полівініловий спирт, 25мг/тиждень. полівінілпіролідон, карбоїссивініловий полімер, Спосіб вивчення. Призначену дозу вводили за натрієву сіль карбоксиметилцелюлози, поліакридопомогою внутрішньовенного введення за чотири лат натрію, альгінат натрію, водорозчинний декрази з 4х-тижневими інтервалами, і ефективність і стран, натрієву сіль карбоксиметильованного кробезпеку оцінювали з 2х-тижневими інтервалами хмалю, пектин, метилцелюлозу, етилцелюлозу, протягом 16 тижнів, і заключне спостереження ксантанову камедь, гуміарабік, казеїн, желатин, проводили на 20 тижні. Вихідною границею ефекагарозу, дигліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгтивності був рівень ACR, рівний 20, на 16 тижні (4 ліколь, вазелін, парафін, стеариловий спирт, стеатижні після останньої дози). Вторинні границі ринову кислоту, сироватковий альбумін людини включали рівні ACR, рівні 50 і 70, на 16 тижні (4 (HSA), маніт, сорбіт, лактозу, фармацевтично притижні після останньої дози). йнятні поверхнево-активні речовини і т.п. У залежКритерії поліпшення ACR. Випадки, коли в наності від композиції добавки, які застосовуються ступних 7 пунктах за числом опухлих суглобів і вибирають з перерахованих вище сполук або їх числом суглобів, які болять відбувається поліпкомбінацій, але цим списком не обмежуються. шення на 201 чи більше, і поліпшення на 20% чи Приклади. більше спостерігається в трьох з п'яти пунктів, що Даний винахід тепер буде детально описано залишилися, визначаються як 20%-ний чи більш нижче за допомогою прикладів і типових приклависокий відсоток поліпшення за критеріями ACR. дів, але обсяг даного винаходу не обмежується Крім цього, випадки 50%- і 70%-ного поліпшення цими прикладами. означають випадки, коли стан більше ніж 20% часПриклад 1. тин тіла пацієнта з поліпшеними показниками поMRA є рекомбінантним гуманізованим монокліпшується на 50% і 70%, відповідно: лональним антитілом (підтипу IgGl) до рецептора (1) число опухлих суглобів; інтерлейкіну-6 людини, який інгібує функцію цито(2) число суглобів, що болять; кіну інтерлейкін-6 (IL-6). У ранніх дослідженнях у (3) оцінка болю пацієнтом; Японії і Європі MRA демонстрував перспективи в (4) загальна оцінка активності хвороби пацієнлікуванні ревматоїдного артриту і добре перенотом; сився пацієнтами. (5) загальна оцінка активності захворювання Це був великомасштабні клінічні випробування терапевтом; MRA II стадії для визначення оптимальної дози (6) оцінка фізичної функції пацієнтом; MRA, що давали окремо або в комбінації з метот(7) CRP або ESR. рексатом для лікування ревматоїдного артриту, Статистично значимий у порівнянні з контроПотенційна ефективність багаторазових внутрішльною групою відсоток поліпшення, більш високий, ньовенних прийомів MRA як при монотерапії, так і ніж ACR 20, спостерігався у всіх групах, за винят 23 86587 24 ком групи, яка одержувала тільки MRA у кількості дно, що статистично було більш значиме в порів2мг/кг. У групі (MRA 8мг/кг + МТХ) відсоток поліпнянні з контрольною групою, у якій ці показники шення ACR 50 і 70 складав 53,1% і 36,7%, відповіскладали 28,6% і 16,3%, відповідно (таблиця 1). Таблиця 1 ACR 20 ACR 50 ACR 70 ACR 20 ACR 50 ACR 70 2мг/кг MRA 30,8% 5,8% 1,9% 2мг/кг MRA+MTX 64,0% 32,0% 14,0% 4мг/кг MRA 61,1% 27,8% 5,6% 4мг/кг MRA+MTX 63,3% 36,7% 12,2% У групах, які приймали тільки MRA, статистично значиму дозо-залежність спостерігали для ACR 20. Крім того, для ACR 50 і ACR 70 статистично значиму дозо-залежну відповідь спостерігали як у групі, яка приймала тільки MRA, так і в МТХкомбінованій групі. Зменшення числа опухлих суглобів (Таблиця 2). Усереднена кількість опухлих суглобів на вихідному рівні була однаковою серед усіх груп, підданих лікуванню. Відбувалося зменшення, яке накопичувалось, середньої кількості опухлих суглобів при збільшенні часу впливу у всіх сімох групах, підданих лікуванню. Середнє зменшення кількості опухлих 8мг/кг MRA 62,7% 41,2% 15,7% 8мг/кг MRA+MTX 73,5% 53,1% 36,7% MTX 40,8* 26,6% 16,3% суглобів у «MRA 8мг/кг» групі було статистично значимим у порівнянні зі зменшенням у «МТХ» групі (р=0,010). На 16-ому тижні середнє розходження (95% СІ) між «MRA 8мг/кг» групою і «МТХ» групою склало -2,31 (-4,07, -0,55). Виявлена статистично значима лінійна дозо-залежність між групами, підданими монотерапії MRA (р