Застосування анти-a5b1 антитіл для пригнічення проліферації ракових клітин

1 Спосіб пригнічення проліферації ракової . клітини, яка експресує α5β1 інтегрин на своїй поверхні, у пацієнта, який включає введення пацієнту терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, яка включає рідку лікарську форму, що містить: приблизно від 1,0 мг/мл до 15 мг/мл анти-α5β1 антитіла; приблизно від 22 мМ до 27 мМ цитрату; приблизно від 145 мМ до 165 мМ хлориду натрію; приблизно від 0,04 % до 0,06 % полісорбату (TWEEN®) 80; і має рН приблизно від 5,5 до 7,5. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що згадане антитіло нейтралізує щонайменше одну біологічну активність α5β1 інтегрину. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що антиα5β1 антитіло зв'язується з тією самою анти 2 (19) 1 3 88294 4 13. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що рак вибраний з групи, яку складають рак сечового міхура, рак молочної залози, рак товстої кишки, фібросаркома, рак легень, метастатична меланома, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак яєчника, рак нирок і рак селезінки. 14. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що раком є рак нирок або метастатична меланома. 15. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що терапевтично ефективна доза становить приблизно 10 мг/кг. 16. Спосіб за п. 10, який додатково включає введення суб'єкту хіміотерапевтичного засобу, або послідовно, або одночасно з антитілом. 17. Фармацевтична композиція, яка включає рідку лікарську форму, що містить: приблизно від 1,0 мг/мл до 15 мг/мл анти-α5β1 антитіла; приблизно від 22 мМ до 27 мМ цитрату; приблизно від 145 мМ до 165 мМ хлориду натрію; приблизно від 0,04 % до 0,06 % полісорбату (TWEEN®) 80; і має рН приблизно від 5,5 до 7,5. 18. Фармацевтична композиція за п. 17, яка відрізняється тим, що концентрація анти-α5β1 антитіла становить приблизно 10 мг/мл. 19. Фармацевтична композиція за п. 17, яка відрізняється тим, що анти-α5β1 антитілом є М200. 20. Фармацевтична композиція за п. 17, яка відрізняється тим, що анти-α5β1 антитіло вибране з групи, яку складають М200, F200 і IIA1. 21. Фармацевтична композиція за п. 17, яка відрізняється тим, що додатково містить хіміотерапевтичний засіб. Цей винахід пропонує антитіла, які специфічно розпізнають α5β1 інтегрин, що експресується на поверхні ракових клітин, та способи застосування згаданих антитіл для пригнічення проліферації цих ракових клітин. Зв'язок α5β1 інтегрину з пухлинним ангіогенезом є добре встановленим (дивись, наприклад, публікацію заявки на патент США 2002/0172675 Α1, яку було подано 7 травня 1999 року і яку включено до цього опису шляхом посилання). α5β1 являє собою гетеродимерний інтегрин, який специфічно зв'язує ліганд фібронектин. α5β1 експресується на поверхні ендотеліальних клітин і опосередковує адгезію до фібронектину та міграцію у його напрямку. Було показано, що зв'язувальна взаємодія між α5β1 та фібронектином є важливою для пухлинного ангіогенезу. Ангіогенез у межах пухлини розпочинається тоді, коли виділення одного або декількох проангіогенних факторів росту (наприклад, FGF (фактор росту фібробластів), VEGF (фактор росту судинного ендотелію), PDGF (тромбоцитарний фактор росту)) локально активізує ендотеліальні клітини. Ці активізовані ендотеліальні клітини у подальшому формують нові кровоносні судини шляхом зв'язування, через посередництво їх α5β1 інтегрину, з фібронектином у екстрацелюлярній матриці. Було показано, що анти-α5β1 антитіла пригнічують ангіогенез на in vivo пухлинних моделях (дивись, наприклад, US 2002/0172675 Α1). Основу ангіогенезної терапії раку становить пригнічення васкуляризації пухлин і, тим самим, запобігання продовження росту пухлин та утворення метастазів (оглядові статті дивись, наприклад, Маркс (Marx), "A Boost for Tumor Starvation", Science 301, 452 (2003); Сато (Sato), "Molecular Diagnosis of Tumor Angiogenesis and AntiAngiogenic Cancer Therapy", Int. J. Clin. Oncol. 8, 200 (2003); Біссачі (Bissachi) та інші, "AntiAngiogenesis and Angioprevention: Mechanisms, Problems and Perspectives", Cancer Detec. Prev. 27, 229 (2003)). Зараз на стадії клінічної розробки знаходиться більше ніж 60 терапевтичних засобів анти-ангіогенезної дії для лікування раку. У той час як деякі ракові пухлини можна "заморити голодом" шляхом запобігання їх васкуляризації, сучасні дослідження показують, що існують такі типи раку, які видаються невразливими до антиангіогенезного лікування (дивись Сато, вище). Наприклад, терапевтичний засіб на основі антиVEGF антитіла, AVASTIN™ (бевасізумаб (bevacizumab)) успішно пройшов клінічні випробування проти раку товстої кишки, але виявився неефективним проти раку молочної залози (дивись Маркс, вище). На додаток до цього, способи лікування, основу яких становить запобігання ангіогенезу, є не зовсім придатними для лікування на ранніх стадіях, коли процес васкуляризації пухлин ще не розпочався. α5β1 інтегрин, завдяки його функції у ангіогенезі, було запропоновано як терапевтичну мішень для численних захворювань, які опосередковуються процесами ангіогенезу, у тому числі, ріст ракових пухлин. Були розроблені химерні та гуманізовані антитіла проти α5β1, які блокують специфічне зв'язування з фібронектином. Було показано, що химерне α5β1 антитіло, М200 (відоме також під його родовою назвою волосіксимаб (volociximab)), індукує апоптоз активізованих ендотеліальних клітин in vitro незалежно від стимулу, роль якого відіграє фактор росту. Таким чином, залишається потреба у терапії раку та способах лікування на ранніх стадіях, здатних до безпосереднього убивання ракових клітин ще до початку процесу васкуляризації пухлин або тоді, коли цілеспрямована антиангіогенезна терапія виявляється неефективною. Цей винахід пропонує способи убивання ракових клітин за допомогою анти-α5β1 антитіл. За загальним варіантом здійснення, згаданий спосіб включає введення в контакт ракової клітини, що експресує α5β1 на своїй поверхні, з анти-α5β1 антитілом. За одним із варіантів здійснення, якому віддається перевага, цей винахід пропонує спосіб пригнічення проліферації ракової (або пухлинної) клі 5 тини, що експресує α5β1 інтегрин на своїй поверхні, який включає введення в контакт згаданої пухлинної клітини з антитілом, що зв'язується з α5β1 інтегрином, експресованим на поверхні пухлинної клітини. Згідно з варіантом здійснення, якому віддається перевага, згадана пухлинна клітина знаходиться у хворого із солідною пухлиною, несприйнятливою до лікування. За іншим варіантом здійснення, якому віддається перевага, згадана пухлинна клітина походить із раку, вибраного з групи, яку складають: рак сечового міхура, рак молочної залози, рак товстої кишки, фібросаркома, рак легень, метастатична меланома, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак яєчника, рак нирок і рак селезінки. За іншим варіантом здійснення, цей винахід пропонує спосіб індукування смерті пухлинної клітини, яка експресує α5β1 інтегрин на своїй поверхні, який включає введення в контакт згаданої пухлинної клітини з антитілом, яке зв'язується з α5β1 інтегрином, експресованим на поверхні пухлинної клітини. Згідно з варіантом здійснення, якому віддається перевага, згадана пухлинна клітина знаходиться у хворого із солідною пухлиною, несприйнятливою до лікування. За іншим варіантом здійснення, якому віддається перевага, згадана пухлинна клітина походить із раку, вибраного з групи, яку складають: рак сечового міхура, рак молочної залози, рак товстої кишки, фібросаркома, рак легень, метастатична меланома, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак яєчника, рак нирок і рак селезінки. За додатковим варіантом здійснення, цей винахід пропонує спосіб пригнічення проліферації ракової клітини у хворого, причому згадана ракова клітина експресує α5β1 інтегрин на своїй поверхні. За цим варіантом здійснення, спосіб включає введення хворому терапевтично ефективної кількості антитіла, причому згадане антитіло конкурентно пригнічує зв'язування М200 з α5β1 інтегрином на поверхні ракової клітини. За іншим варіантом здійснення, згадане антитіло містить варіабельну ділянку з амінокислотною послідовністю, по суті ідентичною Послідовностям №2, №4, №6 та №8. Згідно з варіантом здійснення цього способу, якому віддається перевага, згадане антитіло, яке ввели хворому, нейтралізує щонайменше одну біологічну активність α5β1 інтегрину. За іншим варіантом здійснення, згадане антитіло, яке ввели хворому, містить терапевтичну ефекторну складову (наприклад, кон'югат антитіло-лікарський засіб). За ще іншим додатковим варіантом здійснення цього способу, згадане антитіло вводять хворому почергово або разом з іншим хіміотерапевтичним засобом. За іншим варіантом здійснення цього способу, якому віддається перевага, згадане антитіло вводять хворому із солідною пухлиною, несприйнятливою до лікування, почергово або разом з іншим хіміотерапевтичним засобом. За іншим варіантом здійснення, цей винахід пропонує спосіб лікування суб'єкта, у якого підозрюють розвиток раку, що експресує α5β1 на поверхні своїх клітин, де у згаданого суб'єкта пухлина ще не розвинулась, який включає введення хворому терапевтично ефективної кількості фар 88294 6 мацевтичної композиції, що містить антитіло, яке зв'язується з α5β1 інтегрином. Згідно з варіантом здійснення, якому віддається перевага, рак вибраний з групи, яку складають рак сечового міхура, рак молочної залози, рак товстої кишки,фібросаркома, рак легень, метастатична меланома, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак яєчника, рак нирок і рак селезінки. За іншим варіантом здійснення, цей винахід пропонує спосіб лікування суб'єкта з генетичною схильністю до раку, який експресує α5β1, де у згаданого суб'єкта пухлина ще не розвинулась, який включає введення згаданому суб'єкту терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить антитіло, яке зв'язується з α5β1 інтегрином. Згідно з варіантом здійснення, якому віддається перевага, рак вибраний з групи, яку складають рак сечового міхура, рак молочної залози, рак товстої кишки, фібросаркома, рак легень, метастатична меланома, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак яєчника, рак нирок і рак селезінки. До aнти-α5β1 антитіл, яким віддається перевага, придатних для застосування у способах за цим винаходом, належать ІІА1, М200, F200 та антитіла, які специфічно зв'язуються з тією самою антигенною детермінантою на α5β1, що і ІІА1, М200 та F200. За іншим варіантом здійснення, до анти-α5β1 антитіл, придатних для застосування у способах за цим винаходом, належать антитіла, які конкурентно пригнічують зв'язування ІІА1 та/або М200 з α5β1 інтегрином, експресованим на поверхні пухлинної клітини. До інших антитіл, придатних для застосування у способі за цим винаходом, належать антитіла, які містять амінокислотну послідовність варіабельної ділянки, по суті ідентичну Послідовностям №2, №4, №6 та №8. До них також належать антитіла, що містять амінокислотні послідовності варіабельної ділянки із щонайменше приблизно 90%, 95%, 98% або, згідно з варіантом, якому віддається перевага, 99% або більшою ідентичністю до Послідовностей №2, №4, №6 та №8. За іншим варіантом здійснення, цей винахід пропонує анти-α5β1 антитіла, що входять до складу фармацевтичних композицій. Ці фармацевтичні композиції є придатними для застосування у різних способах за цим винаходом, які розкривають у описі. За різними варіантами здійснення, фармацевтичні композиції, що містять анти-α5β1 антитіло, можуть вводитись у терапевтично ефективній кількості суб'єкту різними шляхами, у тому числі, але без обмеження, перорально, підшкірно, місцево, внутрішньовенно, інтраназально, черезшкірно, внутрішньоочеревинно, внутрішньом'язово, внутрішньолегенево, вагінально, ректально, внутрішньоочно, інтравентрикулярно або підоболонково. Згідно з варіантом здійснення, якому віддається перевага, фармацевтична композиція являє собою рідку лікарську форму, що містить від приблизно 1,0мг/мл до 15мг/мл анти-α5β1 антитіла, приблизно 22-27мМ цитрату, приблизно 145-165мМ хлориду натрію, від приблизно 0,04% до 0,06% полісорбату (TWEEN®) 80 при рН від приблизно 5,5 до 7 7,5. За іншим варіантом здійснення, якому віддається перевага, фармацевтична композиція являє собою рідку лікарську форму, що містить приблизно 10мг/мл анти-α5β1 антитіла, приблизно 25мМ цитрату, приблизно 150мМ хлориду натрію, приблизно 0,05% полісорбату (TWEEN®) 80 при рН приблизно 6,5. Згідно з варіантом здійснення, якому віддається особлива перевага, фармацевтична композиція являє собою рідку лікарську форму, що містить приблизно 10мг/мл М200, приблизно 25мМ цитрату, приблизно 150мМ хлориду натрію, приблизно 0,05% полісорбату (TWEEN®) 80 при рН приблизно 6,5. За іншими варіантами здійснення, яким віддається перевага, кожна з фармацевтичних композицій, опис яких наведено, може додатково містити хіміотерапевтичний засіб. За іншим варіантом здійснення, фармацевтична композиція, що містить анти-α5β1 антитіло, може бути введеною хворому разом із фармацевтично ефективною кількістю іншого хіміотерапевтичного засобу. Фармацевтичні композиції, опис яких наведено вище, можуть застосовуватись у способі лікування хворого, у якого діагностовано або якого підозрюють на присутність раку, вибраного з групи, яку складають рак сечового міхура, рак молочної залози, рак товстої кишки, фібросаркома, рак легень, метастатична меланома, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак яєчника, рак нирок і рак селезінки, причому згаданий спосіб включає: внутрішньовенне введення хворому терапевтично ефективної дози рідкої лікарської форми, що містить від приблизно 1,0мг/мл до 15мг/мл анти-α5β1 антитіла, приблизно 22-27мМ цитрату, приблизно 145-165мМ хлориду натрію, від приблизно 0,04% до 0,06% полісорбату (TWEEN®) 80 при рН від приблизно 5,5 до 7,5. За одним із варіантів здійснення згаданих способів лікування, введена терапевтично ефективна доза становить приблизно 10мг/кг. Згідно з варіантом здійснення, якому віддається перевага, у хворого, якого лікують за допомогою згаданої фармацевтичної композиції, було діагностовано або його підозрюють на присутність раку нирок або метастатичної меланоми, і терапевтично ефективна доза становить приблизно 10мг/кг. На Фіг.1 зображено: (А) нуклеїновокислотна послідовність (Послідовність №1) і амінокислотна послідовність (Послідовність №2) VН IIA1; (В) нуклеїновокислотна послідовність (Послідовність №3) і амінокислотна послідовність (Послідовність №4) VL ІІА1. На Фіг.2 зображено: (А) нуклеїновокислотна послідовність (Послідовність №5) і амінокислотна послідовність (Послідовність №6) VH M200; (В) нуклеїновокислотна послідовність (Послідовність №7) і амінокислотна послідовність (Послідовність №8) VL M200. Для ясності і розуміння, наведений нижче опис докладно розкриває цей винахід за допомогою ілюстративних варіантів здійснення та прикладів. Включені до цього розкриття варіанти здійснення та приклади не призначені для обмеження обсягу цього винаходу. Пересічному фахівцю у цій галузі техніки буде очевидною можливість застосування еквівалентних матеріалів та/або способів та/або 88294 8 очевидні зміни, варіанти або модифікації, які можуть бути внесені до будь-якого з розкритих варіантів здійснення та прикладів без відходу від обсягу формули винаходу, що додається. Усі публікації та заявки на патенти, згадані у цьому описі, включені до нього шляхом посилання таким чином, як якби кожна окрема публікація або заявка на патент були б конкретно та індивідуально призначені до включення шляхом посилання. Якщо не визначено інше, усі застосовані у цьому описі терміни мають звичайне традиційне значення, яке приписується їм пересічним фахівцем у тій галузі, до якої належить цей винахід. Основу цього винаходу становить несподіване відкриття того, що α5β1 інтегрин експресується на поверхні пухлинних епітеліальних клітин багатьох типів раку. На додаток до цього, було встановлено, що наслідком спрямованого зв'язування антитіл із цим поверхневим α5β1 є безпосереднє убивання цих ракових клітин. Оскільки цей спосіб ураження і убивання ракових клітин є безпосереднім, він є придатним для лікування на дуже ранніх стадіях (тобто до суттєвого утворення пухлини). На додаток до цього, спосіб безпосереднього убивання ракових клітин за цим винаходом може бути особливо придатним для лікування раків, що експресують α5β1 на поверхні клітин, але які виявились несприйнятливими до способів лікування, основу яких становить запобігання ангіогенезу. До раків цієї категорії належать, але ними не обмежуються, рак сечового міхура, рак молочної залози, рак нирок, рак підшлункової залози, рак легень, рак передміхурової залози, рак яєчника та метастатична меланома. Цей винахід пропонує способи убивання або запобігання іншим шляхом проліферації ракових клітин за допомогою анти-α5β1 антитіл. За найзагальнішим варіантом здійснення, згаданий спосіб включає введення в контакт ракової клітини, що експресує α5β1 на своїй поверхні, з анти-α5β1 антитілом і, тим самим, викликання смерті (наприклад, шляхом апоптозу) згаданої ракової клітини. Способи за цим винаходом можуть застосовуватись для убивання ракових клітин in vivo (наприклад, у організмі хворого) і, тим самим, запобігання або зменшення швидкості утворення і росту пухлин. На додаток до цього, згаданий спосіб може застосовуватись для лікування раніше утворених пухлин і може застосовуватись разом з іншими терапіями раку (наприклад, хіміотерапевтичними засобами або іншими протираковими терапевтичними засобами на молекулярній основі). Наприклад, хворого, що страждає на ріст ракової пухлини, можна лікувати за допомогою лікарської форми, що містить антитіло М200, разом із хіміотерапевтичною сполукою, наприклад, доксорубіцином. Оскільки М200 являє собою химерне антитіло з відносно низькою токсичністю для людей, цей комбінований спосіб лікувального впливу може забезпечити порівнянну здатність до убивання ракових клітин без побічних токсичних ефектів, пов'язаних із підвищеною дозою самого хіміотерапевтичного засобу. Цей винахід пропонує спосіб, за яким антиα5β1 антитіла безпосередньо убивають та/або 9 пригнічують проліферацію ракових клітин, навіть за відсутності будь-якої пухлинної судинної сітки, яка може бути сприйнятливою до антиангіогенного ефекту цих антитіл. Таким чином, згаданий спосіб є особливо придатним для профілактики або лікування раків, що експресують α5β1, але не сформували інтенсивно васкуляризованих пухлин та/або не є іншим чином сприйнятливими до терапевтичних засобів, які запобігають ангіогенезу, наприклад, раку підшлункової залози, раку нирок, метастатичної меланоми, раку легень і раку молочної залози. Більше того, завдяки здатності М200 (та інших анти-α5β1 антитіл, які розкривають у цьому описі) до безпосереднього убивання ракових клітин, ці антитіла можна застосовувати на ранніх стадіях терапії раку перед утворенням васкуляризованих пухлин. Спосіб лікування на ранніх стадіях є особливо важливим, приймаючи до уваги появу нових, більш чутливих діагностичих тестів на рак, які були розроблені із застосуванням інформації щодо генетичних маркерів, яку одержали з геномної послідовності людини. Ймовірно, що багато розповсюджених раків буде виявлено та діагностовано на дуже ранній стадії, тобто на передпухлинній стадії, коли ракові клітини можуть бути присутніми у тканині та/або кровотоці, але ще не утворили пухлинної структури, яку можна було б виявити менш чутливими негенетичними діагностичними засобами. За таким сценарієм діагностування на ранній стадії, способи лікування, основу яких становить запобігання ангіогенезу, мали б незначний або зовсім не мали б ефекту, оскільки пухлинна судинна сітка це не розвинулась, а традиційні хіміотерапевтичні засоби можуть спричинити забагато токсичних побічних ефектів, які виключають їх застосування. Оскільки наслідком застосування способу за цим винаходом є безпосереднє убивання ракових клітин, які експресують α5β1 інтегрин на своїй поверхні, шляхом спрямованого введення антитіл, цей спосіб є особливо придатним для профілактики раку на ранній стадії. До числа тих суб'єктів, для яких, найімовірніше, буде корисним згаданий спосіб лікування на ранній стадії, належать (але ними не обмежуються): 1) суб'єкт, у якого, за результатами передпухлинних тестів, існує висока ймовірність розвитку та/або присутності пухлин (або мікропухлин); 2) суб'єкт, який зазнає надзвичайно інтенсивного впливу канцерогенного середовища, у якого високою є ймовірність розвитку пухлин; та 3) суб'єкт, який має високий рівень генетичної схильності до розвитку раку, де ракові клітини експресують α5β1 на своїй поверхні. Анти-α5β1 антитіла У способах за цим винаходом анти-α5β1 антитіла застосовують як засоби безпосереднього убивання ракових клітин. Термін "антитіло", яке вживають у цьому описі, означає молекулу імуноглобуліну, яка специфічно зв'язується з або є здатною до імунологічного реагування з конкретним антигеном і включає поліклональні, моноклональні, модифіковані генно-інженерними та іншими способами форми антитіл, у тому числі (але без обмеження), химерні антитіла, гуманізовані 88294 10 антитіла, гетерокон'югатні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла, ди-, три- та тетратіла) і антигензв'язувальні фрагменти антитіл, у тому числі, наприклад, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rlgG та scFvфрагменти. Термін "scFv" означає одноланцюгове Fv-антитіло, у якого варіабельні домени важкого ланцюга і легкого ланцюга традиційного антитіла були об'єднані з одержанням одного ланцюга. На додаток до цього, термін "антитіло", який застосовують у контексті цього винаходу, який розкривається наведеним описом, означає суміш більше ніж одного антитіла, яка є здатною до реагування зі специфічним антигеном (наприклад, суміш моноклональних антитіл різних типів, яка реагує з α5β1 інтегрином). Згідно з варіантом, якому віддається перевага, анти-α5β1 антитілами, які застосовують за способами за цим винаходом, є моноклональні антитіла. Моноклональні антитіла, придатні для застосування за способами за цим винаходом, можна одержати за допомогою різноманітних методів, відомих у цій галузі, у тому числі за допомогою гібридомних технологій, методів рекомбінантних ДНК, методів проявлення у фагах або їх комбінації. Моноклональні антитіла можна, наприклад, одержати за допомогою гібридомних технологій, у тому числі за допомогою відомих у цій галузі та розкритих, наприклад, у довіднику Харлоу (Harlow) та Лейн (Lane), "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988); Хаммерлінг (Hammerling) та інші, у: "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas", Elsevier, New York (1981), стор.563-681 (обидві роботи у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання). Продукування антитіл шляхом селекції бібліотек рекомбінантних антитіл у фагах або подібних векторах, дивись, наприклад, Хьюз (Huse) та інші, Science 246: 1275-1281 (1989); Уорд (Ward) та інші, Nature 341: 544-546 (1989); та Вон (Vaughan) та інші, Nature Biotech. 14: 309-314 (1996) або шляхом імунізації тварини антигеном або ДНК, що кодує згаданий антиген. За варіантами здійснення, яким віддається перевага, способи безпосереднього убивання ракових клітин за цим винаходом можуть здійснюватись за допомогою анти-α5β1 антитіл, ІІА1, М200 або F200, характеристики яких були наведені вище. ІІА1 являє собою батьківське мишаче антитіло класу IgGl, яке, як було показано, пригнічує зв'язування α5β1 інтегрину з фібронектином (дивись, наприклад, публікацію заявки на патент США US 2002/0172675 ΑΙ, яку було подано 7 травня 1999 року, яку включено до цього опису шляхом посилання). М200 являє собою химерне антитіло IgG4, яке одержали з ІІА1. F200 являє собою Fabфрагмент, який одержали з М200. Ці антитіла одержали, визначили їхні функціональні характеристики і специфічні амінокислотні послідовності розкрили у заявках на патент США №10/724,274, яку було подано 26 листопада 2003 року, та №10/830,956, яку було подано 23 квітня 2004 року, кожну з яких включено до цього опису шляхом посилання. Було показано, що як М200, так і F200 демонструють in vivo ефективність на моделях ока мавпи і ока кролика (дивись заявки на патент США 11 №10/724,274, яку було подано 26 листопада 2003 року, та №10/830,956, яку було подано 23 квітня 2004 року). До антитіл, придатних для застосування за способом за цим винаходом, належать також антитіла, які специфічно зв'язуються з тією самою антигенною детермінантою на α5β1, що й ІІА1, М200 та F200. Термін "антигенна детермінанта" означає сайт на антигені, з яким зв'язується антитіло. Антигенні детермінанти можуть утворюватись як із суміжних амінокислот, так і з несуміжних амінокислот, розміщених поряд при укладанні ланцюга білка до третинної структури. Наприклад, антигенна детермінанта на α5β1 інтегрині може включати амінокислоти на кожному з α та β поліпептидних ланцюгів, завдяки чому утворюється гетеродимерна структура. Антигенні детермінанти, утворені суміжними амінокислотами, як правило, зберігаються у разі піддання впливу денатуруючих розчинників, у той час як антигенні детермінанти, утворені укладанням ланцюга білка до третинної структури, як правило, втрачаються у разі обробки денатуруючими розчинниками. Антигенна детермінанта, як правило, включає щонайменше 3 амінокислоти, частіше щонайменше 5 амінокислот або 6-10 амінокислот у специфічній просторовій конформації. Способи визначення просторової конформації антигенних детермінант включають, наприклад, рентгенівську кристалографію та двовимірний ядерний магнітний резонанс. Дивись, наприклад, "Epitope Mapping Protocols" у "Methods in Moledcular Biology", том 66, під редакцією Гленн Ε. Moppic (Glenn E. Morris) (1996). Кажуть, що два антитіла зв'язуються з однією і тією самою антигенною детермінантою, якщо амінокислотні мутації у білку, які ослаблюють або ліквідують зв'язування одного антитіла, також ослаблюють або ліквідують зв'язування другого антитіла. Можна також дійти висновку, що два антитіла зв'язують одну й ту саму антигенну детермінанту, якщо два антитіла конкурують за зв'язування з білком, тобто зв'язування одного антитіла з білком конкурентно пригнічує, ослаблює або ліквідує зв'язування другого антитіла. Унаслідок цього, способи за цим винаходом можуть здійснюватись з антитілом, яке, як було визначено, конкурентно пригнічує зв'язування ІІА1, M200 (волосіксимабу) або F200 з α5β1 інтегрином, експресованим на поверхні ракової клітини. Анти-α5β1 антитіла, придатні для застосування за способами за цим винаходом, не обмежуються ІІА1, М200 та F200, але можуть включати антитіла, що містять амінокислотну послідовність варіабельної ділянки, каркасної ділянки або гіперваріабельної ділянки, яка є по суті ідентичною відповідним амінокислотним послідовностям ІІА1, М200 та F200. Довжина варіабельних ділянок, каркасних ділянок та гіперваріабельних ділянок є добре відомою пересічним фахівцям у цій галузі (дивись, наприклад, Кебот (Kabat) та інші, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Як вживається у цьому описі, варіабельна ділянка важкого ланцюга ("VH" або "VH") або легкого ланцюга ("VL" або "VL") антитіла включає важкі або 88294 12 легкі ланцюги антигензв'язувального фрагмента, наприклад, Fv, scFv, dsFv або Fab. Варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюга антитіла містять також чотири "каркасні" ділянки, які перемежовуються трьома гіперваріабельними ділянками, які називають також "hv-ділянками". Згадані гіперваріабельні ділянки відповідають, головним чином, за зв'язування з антигенною детермінантою антигену. "По суті ідентична" варіабельна, константна, каркасна ділянка або гіперваріабельна ділянка означає ділянку антитіла, на якій амінокислотна послідовність є щонайменше приблизно на 8590%, а згідно з варіантом, якому віддається перевага, щонайменше на 95% ідентичною варіабельній або константній ділянці природного або незміненого антитіла. Терміни "ідентичний" або відсоток "ідентичності", у контексті двох або декількох амінокислотних або нуклеотидних послідовностей, означає дві або декілька послідовностей або підпослідовностей, які є такими самими або мають визначений відсоток амінокислотних залишків або нуклеотидів, які є такими самими (тобто приблизно 60% ідентичність, згідно з варіантом, якому віддається перевага, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або більша ідентичність на визначеній ділянці, у разі порівняння та впорядкованого розміщення для максимальної відповідності у порівняльному "вікні" або на визначеній ділянці), як визначено за допомогою алгоритмів порівняння послідовностей BLAST або BLAST 2.0 з параметрами, що розуміються, які описані нижче, або шляхом ручного впорядкованого розміщення і порівняльного аналізу первинної структури та візуальної перевірки (дивись, наприклад, опис BLAST на веб-сайті Національного Центру з Біотехнологічної Інформації (National Center for Biotechnology Information (NCBI)), який знаходиться на www.ncbi.nlm.nih.gov). Ідентичні або по суті ідентичні послідовності включають послідовності, що мають делеції та/або додання, а також послідовності, що мають заміни, а також природні, наприклад, поліморфні або алельні варіанти та штучні варіанти, наприклад, консервативно модифіковані варіанти. Добре відомі алгоритми визначення ідентичності послідовностей можуть скласти звіт про "прориви" тощо. Згідно з варіантом, якому віддається перевага, ідентичність послідовності існує на ділянці, довжина якої становить щонайменше приблизно 25 амінокислот чи нуклеотидів або, згідно з варіантом, якому віддається більша перевага, на ділянці, довжина якої становить 50-100 амінокислот або нуклеотидів. Амінокислотні послідовності анти-α5β1 антитіл, придатних для застосування за способами за цим винаходом, не обмежуються послідовностями, які знаходяться у природних антитілах; антитіла можуть бути переконструйовані для одержання бажаних характеристик за допомогою добре відомих методів рекомбінантних ДНК. Такі "генетично змінені антитіла" включають антитіла, у яких амінокислотна послідовність відрізняється від амінокислотної послідовності батьківського (тобто незміненого) антитіла. Можливі різниці коливаються у межах від зміни лише однієї або декількох аміно 13 кислот до повного переконструювання, наприклад, варіабельної або константної ділянки. Зміни, шляхом сайтспрямованої мутації, на константній ділянці можуть здійснюватись із метою поліпшення або зміни функціональних характеристик терапевтичного антитіла, наприклад, імуногенності, фармакокінетичних характеристик (наприклад, часу напіввиведення у сироватці), зв'язування комплементу, взаємодії з мембранами та інших ефекторних функцій. Взагалі, зміни варіабельної ділянки антитіла можуть здійснюватись із метою поліпшення зв'язувальних характеристик антигену. За одним із варіантів здійснення, якому віддається перевага, химерне антитіло, М200, може застосовуватись у способах безпосереднього убивання ракових клітин за цим винаходом. Термін "химерне антитіло" означає молекулу імуноглобуліну, у якої (а) константна ділянка або її частина є зміненою або заміненою таким чином, що антигензв'язувальний сайт (варіабельна ділянка) є зв'язаним із константною ділянкою іншого або зміненого класу, ефекторної функції та/або виду чи із зовсім іншою молекулою, яка надає нові властивості згаданому химерному антитілу, наприклад, ферментом, токсином, гормоном, фактором росту, лікарським засобом тощо; або (b) варіабельна ділянка або її частина є зміненою або заміненою варіабельною ділянкою, що має іншу або змінену антигенну специфічність. Способи одержання химерних антитіл є добре відомими пересічним фахівцям у цій галузі. Дивись, наприклад, Моррісон (Morrison) та інші, Science 229: 1202-1207 (1985); Оуі (Оі) та інші, Bio Techniques 4:214-221 (1986); Джілліс (Gillies) та інші, J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989); та патенти США №5,807,715; №4,816,567; та №4,816,396, кожен з яких у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. За іншим варіантом здійснення, якому віддається перевага, гуманізовані анти-α5β1 антитіла можуть застосовуватись у способах безпосереднього убивання ракових клітин за цим винаходом. Додаткові людські послідовності в гуманізованих антитілах додатково знижують можливу імуногенність антитіла, коли воно застосовується як терапевтичний засіб для людей. Гуманізовані варіанти ІІА1 розкривають у заявках на патент США №10/724,274, яку було подано 26 листопада 2003 року, та №10/830,956, яку було подано 23 квітня 2004 року, кожну з яких включено до цього опису шляхом посилання. Термін "гуманізоване антитіло" означає імуноглобулін, що містить людський каркас, щонайменше одну, а згідно з варіантом, якому віддається перевага, усі гіперваріабельні ділянки нелюдського антитіла, і у якого будь-яка присутня константна ділянка є по суті ідентичною константній ділянці людського імуноглобуліну, тобто ідентичною щонайменше на приблизно 85-90%, а згідно з варіантом, якому віддається перевага, щонайменше на 95%. Таким чином, усі частини гуманізованого імуноглобуліну, за виключенням гіперваріабельних ділянок, є по суті ідентичними відповідним частинам однієї або декількох нативних людських імуноглобулінових послідовностей. Відповідно, такі гуманізовані антитіла є химерними 88294 14 антитілами, де по суті менше аніж інтактний людський варіабельний домен було замінено відповідною послідовністю від виду, окрім людини. Каркасні залишки на людських каркасних ділянках можуть бути замінені відповідним залишком із гіперваріабельної ділянки антитіла-донора для зміни, згідно з варіантом, якому віддається перевага, поліпшення зв'язування антигену. Ці каркасні заміни можуть бути ідентифіковані способами, добре відомими у цій галузі техніки, наприклад, моделюванням взаємодії залишків гіперваріабельної і основної ділянок для ідентифікування каркасних залишків, важливих для зв'язування антигену і порівнянням послідовностей для ідентифікування незвичних каркасних залишків у конкретних положеннях. Дивись, наприклад, Куш (Queen) та інші, патенти США №5,530,101; №5,585,089; №5,693,761; №5,693,762; №6,180,370 (кожен з яких у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання). Антитіла можуть гуманізуватись різноманітними способами, відомими у цій галузі, у тому числі, наприклад, шляхом перенесення гіперваріабельної ділянки (ЕР 239,400; WO 91/09967; патенти США №5,225,539; №5,530,101 та №5,585,089), покриття або відновлення поверхні (ЕР 592,106; ЕР 519,596; Падлан (Padlan), Моl. Immunol., 28: 489-498 (1991); Студніцка (Studnicka) та інші, Prot. Eng. 7: 805-814 (1994); Рогуска (Roguska) та інші, Рrос. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973 (1994)) та перестановки ланцюгів (патент США №5,565,332), усі з яких у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. За іншим варіантом здійснення, людські антитіла (тобто антитіла, що містять як людську варіабельну, так і людську константну ділянку) проти α5β1 можуть застосовуватись для лікування хворих людей за способами за цим винаходом. Людські антитіла можна одержувати різноманітними способами, відомими у цій галузі, у тому числі методами проявлення у фатах, описаними вище, із застосуванням бібліотек антитіл, одержаних із людських імуноглобулінових послідовностей. Дивись патенти США №4,444,887 та №4,716,111; і WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735 та WO 91/10741, кожну з яких у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. Людські антитіла можна одержати також із застосуванням трансгенних мишей, які є нездатними до експресії функціональних ендогенних імуноглобулінів, але які можуть експресувати людські імуноглобулінові гени. Для загального огляду цієї технолога продукування людських антитіл дивись Лонберг (Lonberg) та Гушар (Huszar), Int. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). Для детального обговорення цієї технолога продукування людських антитіл та людських моноклональних антитіл і методики продукування таких антитіл дивись, наприклад, WO 98/24983; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; європатент №0 598 877; патенти США №5,413,923; №5,625,126; №5,633,425; №5,569,825; №5,661,016; №5,545,806; №5,814,318; №5,885,793; №5,916,771 та №5,939,598, які у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. Повністю людські 15 антитіла, які розпізнають вибрану антигенну детермінанту, можна також одержати за допомогою методу, який називають "спрямованою селекцією". За цим підходом, вибране нелюдське моноклональне антитіло, наприклад, мишаче антитіло, застосовують для спрямування селекції повністю людського антитіла, що розпізнає ту саму антигенну детермінанту (Джесперс (Jespers) та інші, Biotechnology 12: 899-903 (1988)). За альтернативним варіантом здійснення, приматизовані антитіла (тобто антитіло, що містить варіабельні ділянки мавпи і константні ділянки людини) можуть застосовуватись для лікування за способами за цим винаходом. Способи продукування приматизованих антитіл є відомими у цій галузі. Дивись, наприклад, патенти США №5,658,570; №5,681,722 та №5,693,780, які у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. Функція антитіл У способах за цим винаходом застосовують функціональні антитіла, які демонструють специфічне зв'язування з α5β1 інтегрином. Випробування авідності антитіл до специфічного зв'язування з антигеном надає можливість фахівцю уцій галузі ідентифікувати антитіла, які специфічно розпізнають одну або декілька антигенних детермінант α5β1 інтегрину. Антитіла визначаються як такі, що специфічно зв'язуються, якщо: 1) вони демонструють пороговий рівень зв'язувальної активності; та/або 2) вони демонструють незначний рівень перехресної реактивності зі спорідненими поліпептидними молекулами. По-перше, анти-α5β1 антитіла, придатні для застосування за способами, розкритими у цьому описі, специфічно зв'язуються (або "специфічно реагують" чи "специфічно імунно реагують"), якщо вони зв'язуються з α5β1 інтегриновим поліпептидом, пептидом або антигенною детермінантою зі зв'язувальною спорідненістю (Ka) 106моль -1 або вище, згідно з варіантом, якому віддається перевага, 107моль -1 або вище, згідно з варіантом, якому віддається більша перевага, 108моль -1 або вище і згідно з варіантом, якому віддається найбільша перевага, 109моль -1 або вище. Зв'язувальна спорідненість антитіла може бути легко визначена пересічним фахівцем у цій галузі, наприклад, за допомогою аналізу Скетчарда (Скетчард (Scatchard), Ann. NY Acad. Sci., 51: 660-72, 1949) або за поверхневим плазмонним резонансом із застосуванням ВІАсоrе. Різноманітні аналізи зв'язування антитіл, придатні для визначення характеристик анти-α5β1 антитіл, розкривають у заявках на патент США №10/724,274, яку було подано 26 листопада 2003 року, та №10/830,956, яку було подано 23 квітня 2004 року, кожну з яких включено до цього опису шляхом посилання. По-друге, антитіла специфічно зв'язуються, якщо вони не демонструють значної перехресної реакції зі спорідненими поліпептидами. Антитіла не демонструють значної перехресної реакції зі спорідненими поліпептидними молекулами, наприклад, якщо вони виявляють α5β1 інтегриновий поліпептид, але не розпізнають споріднених поліпептидів під час проведення стандартного вес 88294 16 терн-блотингу (дивись, наприклад, "Current Protocols in Molecular Biology", під редакцією Осбел (Ausubel) та інших, 1995). Прикладами відомих споріднених поліпептидів є ортологи, білки того самого виду, що є членами інтегринового сімейства білків, або мутантні α5β1 інтегринові поліпептиди, де мутація змінює анти-α5β1 антигенну детермінанту. Більше того, антитіла можуть "відбиратись проти" відомих споріднених поліпептидів для виділення популяції, яка специфічно зв'язується з α5β1 інтегрином. Наприклад, антитіла, одержані проти людських α5β1 інтегринових поліпептидів, адсорбуються на споріднені поліпептиди, прикріплені до нерозчинної матриці; антитіла, специфічні до людських α5β1 інтегринових поліпептидів, протечуть через матрицю за відповідних буферних умов. Такий відбір надає можливість виділення поліклональних і моноклональних антитіл, які не вступають до перехресної реакції з близько спорідненими поліпептидами (Antibodies: A Laboratory Manual, під редакцією Харлоу (Harlow) та Лейн (Lane), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, під редакцією Куліген (Cooligan) та інших, National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). Відбір та виділення специфічних антитіл є добре відомими у цій галузі (дивись Fundamental Immunology, під редакцією Пол (Paul), Raven Press, 1993; Гетцофф (Getzoff) та інші, Adv. In Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, під редакцією Годинг Дж.У. (Goding J.W.), Academic Press Ltd., 1996; Бенджамін (Benjamin) та інші, Ann. Rev. Immunol. 2: 67101, 1984). Репрезентативними прикладами таких аналізів є: протитечійний імуноелектрофорез, радіоімуноаналіз, радіоімунопреципітаційний аналіз, твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA), дот-блотинг або вестерн-блотинг, аналіз пригнічення або конкуренції і сендвіч-аналіз. Огляд імунологічних та імуноаналітичних процедур дивись у Basic and Clinical Immunology (під редакцією Стайте (Stites) і Терр (Terr), 7-е видання, 1991). Анти-α5β1 антитіла зі специфічним зв'язуванням, придатні для застосування за способами за цим винаходом, можна одержати шляхом відбору на зв'язування α5β1. Взагалі, поліклональні антитіла, одержані для специфічного зв'язування з конкретним білком або його поліморфними варіантами, алелями, ортологами, консервативно модифікованими варіантами, сплайсованими варіантами, можуть відбиратись для одержання лише тих антитіл, які є специфічно імунореактивними з вибраним білком (наприклад, α5β1 інтегрином), а не з іншими білками. Відбір за специфічним зв'язуванням забезпечують шляхом видалення антитіл, які вступають у перехресну реакцію з іншими молекулами. Для відбору антитіл, які специфічно реагують з α5β1 інтегриновим поліпептидом, можуть застосовуватись найрізноманітніші імуноаналітичні формати. Наприклад, для відбору антитіл, що специфічно реагують із білком може застосовуватись твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) (дивись, наприклад, Харлоу (Harlow) та Лейн (Lane), "Antibodies: A Laboratory Manual" (1988) для опису імуноаналітичних форматів та 17 умов, які можуть застосовуватись для визначення специфічної імунореактивності). Кон'югати антитіло-лікарський засіб За деякими варіантами здійснення, у способі убивання ракових клітин може застосовуватись анти-α5β1 антитіло, кон'юговане з ефекторною складовою. Згаданою складовою може бути будьяка кількість молекул, у тому числі складові-мітки, наприклад, радіоактивні мітки або флуоресцентні мітки, або, згідно з варіантом, якому віддається перевага, це може бути терапевтична складова. Ефекторна складова (або "ефекторний компонент") може бути зв'язаною (сполученою за допомогою лінкера, кон'югованою) з анти-α5β1 антитілом ковалентно, за допомогою лінкера або хімічного зв'язку, чи нековалентно, за допомогою іонних, ван-дер-ваальсових, електростатичних або водневих зв'язків. За одним з аспектів, згаданою терапевтичною складовою є невелика молекула, яка модулює активність α5β1 інтегрину. За іншим аспектом, згадана терапевтична складова впливає на активність молекул або клітин, які є зв'язаними з або знаходяться у безпосередній близькості до α5β1 інтегрину. Наприклад, згаданою терапевтичною складовою може бути цитотоксичний агент. Термін "цитотоксичний агент", який вживається у цьому описі, означає речовину, що пригнічує або запобігає функціонуванню клітин та/або спричинює деструкцію клітин. Згаданий термін означає радіоактивні ізотопи (наприклад, І131, І125, Υ90 та Re186), хіміотерапевтичні засоби і токсини, наприклад, ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження або їхні фрагменти. До відповідних токсинів та їхніх відповідних фрагментів належить дифтерійний А ланцюг, А ланцюг ендотоксину, А ланцюг рицину, А ланцюг абрину, курцин, кротин, феноміцин, еноміцин, ауристатини (наприклад, ауристатин Ε або ауристатин F) тощо. Цілеспрямована доставка терапевтичної складової до α5β1 інтегрину, експресованого на поверхні ракової клітини, сприяє не тільки підвищенню місцевої концентрації терапевтичної складової на ділянці, ураженій раком, але також сприяє і зниженню шкідливих побічних ефектів, які можуть бути пов'язані зі згаданою терапевтичною складовою. Приклади хіміотерапевтичних засобів, які можуть застосовуватись як терапевтичні складові з анти-α5β1 антитілами за цим винаходом, включають (але ними не обмежуються) адріаміцин (adriamycin), доксорубіцин (doxorubicin), доксил (doxil), епірубіцин (epirubicin), 5-фторурацил, арабінозид цитозину ("Аrа-С"), циклофосфамід, тіотепа (thiotepa), бісульфан (busulfan), цитоксин (cytoxin), таксоїди (taxoids), наприклад, паклітаксел (paclitaxel) (TAXOL™, фірма Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, штат Нью-Джерсі) та доксетаксел (doxetaxel) (TAXOTERE™, фірма RhonePoulenc Rorer), токсотер (toxotere), метотрексат (methotrexate), цисплатин (cisplatin), мелфалан (melphalan), вінбластин (vinblastine), блеоміцин (bleomycin), етопозид (etoposide), іфосфамід (ifosfamide), мітоміцин С (mitomycin С), мітоксантрон (mitoxantrone), вінкристин (vincristine), віноре 88294 18 лбін (vinorelbine), карбоплатин (carboplatin), теніпозид (teniposide), дауноміцин (daunomycin), карміноміцин (carminomycin), аміноптерин (aminopterin), дактиноміцин (dactinomycin), мітоміцини (mitomycins), еспераміцини (esperamicins) (дивись патент США №4,675,187), 5-FU, 6тіогуанін, 6-меркаптопурик, актиноміцин D (actinomycin D), VP-16, хлорамбуцил (chlorambucil), мельфалан (melphalan) та інші споріднені азотні мазі. До цього визначення включаються також гормональні засоби, дія яких полягає у регулюванні або пригніченні гормонального впливу на пухлини, наприклад, тамоксифен (tamoxifen) та онапристон (onapristone). За альтернативним варіантом, спосіб за цим винаходом може здійснюватись таким чином, коли хіміотерапевтичні засоби, розкриті вище, вводять до складу лікарській формі разом з анти-α5β1 антитілом, хоча і не у вигляді кон'югату. Ознаки раку Цей винахід спрямовано на способи убивання ракових клітин, пригнічення проліферації ракових клітин та/або метастазування шляхом спрямованої доставки антитіла до α5β1 інтегрину, що знаходиться на поверхні ракової клітини. Рак являє собою фізіологічний стан, характерною особливістю якого, як правило, є присутність клітин, у яких відбувається процес нерегульованого росту. Рак включає усі злоякісні пухлини, у тому числі, але без обмеження, карциноми, лімфоми, бластоми, саркоми і лейкоз. Конкретнішими прикладами раків, що експресують α5β1 на клітинній поверхні, який може відігравати роль мішені у разі застосування способів, що розкриваються у наведеному описі, є (але ними не обмежуються) рак сечового міхура, рак молочної залози, рак товстої кишки, фібросаркома, рак легень, метастатична меланома, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак яєчника, рак нирок і рак селезінки. Пухлина являє собою масу клітин, що розростаються, яким бракує нормального контролю росту. Пухлина може бути доброякісною або злоякісною і може містити передракові або ракові клітини і тканини. Ракові клітини, як правило, утворюють пухлини в міру розвитку раку. Ріст пухлини супроводжується підвищенням густини кровоносних судин. Ця нова судинна сітка пухлини забезпечує необхідне живлення, яке надає пухлині можливість росту. Антиангіогенні лікарські засоби на основі анти-α5β1 та анти-VEGF (VEGF=фактор росту судинного епітелію) антитіл продемонстрували ефективність щодо перешкоджання росту пухлин на багатьох моделях раку (дивись, наприклад, Кім (Кіm) та інші, J. Clin. Invest, 110(7): 933-941 (2002); Феррара (Ferrara), Nat. Rev. Cancer, 2(10): 795-803 (2002). Було показано, що анти-α5β1 антитіло, М200, пригнічує ангіогенез in vitro та in vivo на кролячій та мавпячій моделях ангіогенних захворювань очей (наприклад, прогресуюча дегенерація жовтої плями; дивись заявки на патент США №10/724,274, яку було подано 26 листопада 2003 року, та №10/830,956, яку було подано 23 квітня 2004 року, кожну з яких включено до цього опису шляхом посилання). 19 Основою цього винаходу є несподіване відкриття, яке полягає у тому, що у разі раку багатьох типів на поверхні епітеліальних клітин пухлин (на додаток до ендотеліальних клітин судинної сітки пухлин) експресується α5β1 інтегрин і що наслідком спрямованого зв'язування антитіла з цим поверхневим α5β1 є безпосереднє убивання цих ракових клітин. Унаслідок цього, раки, які характеризуються проліферацією епітеліальних клітин, що експресують α5β1, можуть лікуватись та/або до них можуть спрямовано доставлятись анти-α5β1 антитіла навіть за повної відсутності формування судинної сітки пухлини. Оскільки цей спосіб ураження і убивання ракових клітин є безпосереднім, він є придатним для лікування на дуже ранніх стадіях (тобто до суттєвого утворення пухлини). До числа хворих, для яких найімовірніше буде корисним згаданий спосіб лікування на ранній стадії, належать (але ними не обмежуються): 1) хворий, у якого, за результатами передпухлинних тестів, існує висока ймовірність розвитку та/або присутності пухлин (або мікропухлин); 2) хворий, який зазнає надзвичайно інтенсивного впливу канцерогенного середовища, у якого високою є ймовірність розвитку пухлин; та 3) хворий, який має високий рівень генетичної схильності (на що вказують, наприклад, генетичні маркери раку) до розвитку раку, де ракові клітини експресують α5β1 на своїй поверхні. Наприклад, хворий з генетичною схильністю до раку молочної залози (наприклад, позитивний за геном BRCA) або у якого було виявлено певний передпухлинний раковий маркер (наприклад, мікрометастази, виявлені за допомогою ПЛР), буде особливо придатним об'єктом для застосування профілактичного способу безпосереднього убивання ракових клітин на ранній стадії, за яким вводять фармацевтичну композицію антиα5β1 антитіла. Гени, що вказують на підвищену схильність до раку і пухлинні маркери, що вказують на ймовірність розвитку пухлини, можна знайти у біомедичній літературі, присвяченій раку та у базах даних. На додаток до цього, переліки канцерогенів та рівні експозиції, які значно підвищують ризик виникнення раку, є доступними у біомедичній літературі, добре відомій пересічним фахівцям у цій галузі. Пересічний фахівець може використати ці літературні джерела разом із добре відомими способами виявлення експресії α5β1 інтегрину на ракових клітинах, розкритими нижче, для визначення того, чи може суб'єкт бути придатним для застосування способів лікування раку на ранній стадії за цим винаходом. Як описано у Прикладі 2, протоковоцитометричний аналіз показує, що α5β1 інтегрин експресується на поверхні ліній клітин, що походять щонайменше з наведених нижче раків: рак сечового міхура, рак молочної залози, рак товстої кишки, фібросаркома, рак легень, метастатична меланома, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак яєчника, рак нирок і рак селезінки. Більше того, спосіб безпосереднього убивання ракових клітин за цим винаходом може бути особливо придатним для лікування раків, що експресують α5β1, але виявились несприйнятливими до 88294 20 антиангіогенних заходів. Ця категорія раків включає (але ними не обмежується) рак сечового міхура, рак молочної залози, фібросаркому, рак нирок, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак яєчника, рак легень і метастатичну меланому. Згідно з варіантом здійснення, якому віддається особлива перевага, способи за цим винаходом можуть застосовуватись для лікування будь-якого з вищенаведених раків, де хворий має несприйнятливі до лікування солідні пухлини. Анти-α5β1 антитіло, М200 (волосіксимаб), продемонструвало деяку ефективність щодо лікування хворих людей з різноманітними раками, що мають несприйнятливі до лікування солідні пухлини, у тому числі: рак анастомозу ободової та прямої кишок (CRC), меланома (MEL), рак нирок (RCC), злоякісна гепатома (НСС), рак легень (NSCLC), рак підшлункової залози (PC), рак привушної залози (PARO) і рак молочної залози (ВС). Пересічний фахівець може визначити раки, що експресують α5β1 на поверхні пухлинних епітеліальних клітин, за допомогою анти-α5β1 антитіла (наприклад, ІІА1 або М200) шляхом зондування пухлинних біоптатів за стандартними імуногістохімічними методами. Як описано у наведеному нижче Прикладі 1, імуногістохімічний (ІНС) аналіз пухлинних біоптатів усіх хворих на меланому, рак легень, рак нирок, рак підшлункової залози та рак молочної залози показав експресію α5β1 інтегрину на пухлинних епітеліальних клітинах. Логічно очікувати, що у разі застосування ІНС (або інших методів), буде встановлено, що інші згадані раки експресують α5β1 на поверхні пухлинних епітеліальних клітин, і визнається, що ці раки будуть сприйнятливими до способу убивання ракових клітин за цим винаходом. На додаток до ІНС аналізу зразків пухлин, лінії ракових клітин можуть перевірятись на експресію α5β1 на поверхні клітин за допомогою анти-α5β1 антитіла та стандартних протоковоцитометричних методів, добре відомих пересічним фахівцям у цій галузі. Як докладно описується у наведеному нижче Прикладі 2, перевірка засобами протокової цитометрії виявила експресію α5β1 на поверхні 21 добре відомої лінії ракових клітин. Виходячи з цих результатів, ці лінії клітин є сприйнятливими до безпосереднього убивання клітин за допомогою анти-α5β1 антитіл за способами за цим винаходом. Більше того, якщо визначено, що лінія ракових клітин експресує α5β1 на своїй поверхні і згадана лінія відповідає, походить або одержана з ракових клітин, присутніх у хворого на рак, для лікування такого хворого можуть застосовуватись способи за цим винаходом. Наприклад, лінія клітин NW231, яка, як було встановлено у Прикладі 2, експресує α5β1 інтегрин на своїй поверхні, походить із пухлин раку молочної залози. Унаслідок цього, пересічний фахівець негайно визнає, що анти-α5β1 антитіло може застосовуватись для лікування хворого на рак молочної залозі за способами, які розкриваються у цьому описі. Композиції, лікарські форми і введення антитіл Анти-α5β1 антитіла, придатні для застосування за способами за цим винаходом, можуть застосовуватись у виділеній та очищеній формі і безпо 21 середньо контактувати з раковими клітинами або пухлинами. Способи очищення aнти-α5β1 антитіл (наприклад, ІІА1, М200 та F200) розкривають у заявках на патент США №10/724,274, яку було подано 26 листопада 2003 року, та №10/830,956, яку було подано 23 квітня 2004 року, кожну з яких включено до цього опису шляхом посилання. F200 може також бути одержаним як Fab'-NAC (Nацетилцистеїн)-фрагмент за способами, які розкривають у заявці на патент США №60/583,127, яку було подано 25 липня 2004 року, яку включено до цього опису шляхом посилання. F200-Fab'-NAC демонструє підвищену стійкість у рідких та ліофілізованих лікарських формах згаданого антитіла. Чистота і гомогенність можуть визначатись за допомогою стандартних методів аналітичної хімії, наприклад, електрофорезом у поліакриламідному гелі або високоефективною рідинною хроматографією. Антитіло, яке є переважаючим видом, присутнім у препараті, вважається по суті очищеним. Наприклад, розчин антитіла, який демонструє по суті одну смугу у електрофоретичному гелі, є по суті очищеним. Згідно з варіантом, якому віддається перевага, антитіло, яке застосовують у фармацевтичних композиціях за цим винаходом, є чистим на щонайменше 85%, згідно з варіантом, якому віддається більша перевага, є чистим на щонайменше 95% і згідно з варіантом, якому віддається найбільша перевага, є чистим на щонайменше 99%. За варіантами здійснення, яким віддається перевага, спосіб безпосереднього убивання ракових клітин здійснюється шляхом введення очищених анти-α5β1 антитіл до складу фармацевтичної композиції, яку вводять суб'єкту у терапевтично ефективній кількості. Словосполучення "терапевтично ефективна кількість", яке вживають у цьому описі, означає кількість фармацевтичної лікарської форми або композиції, яка є достатньою для вилікування, полегшення, ослаблення або щонайменше часткової затримки розвитку раку та/або його симптомів, та/або ускладнень. Клінічні методи визначення терапевтично ефективної кількості антиα5β1 антитіла для лікування раку є добре відомими пересічним фахівцям у цій галузі і вона може бути визначеною емпіричним шляхом за допомогою рутинного експериментування. Наприклад, у контексті лікування раку, "терапевтично ефективною кількістю" є кількість, здатна викликати один або декілька з наведених нижче ефектів: (1) пригнічення, деякою мірою, росту пухлини, у тому числі уповільнення і повну затримку росту; (2) зменшення кількості ракових клітин; (3) зменшення розміру пухлини; (4) пригнічення (тобто зменшення, уповільнення або повну зупинку) інфільтрації ракових клітин до периферичних органів; (5) пригнічення (тобто зменшення, уповільнення або повну зупинку) метастазування ракових клітин; (6) посилення протиракової імунної реакції, наслідком якої може, але не повинен, бути регрес або відторгнення пухлини; та/або (7) полегшення, деякою мірою, одного або декількох симптомів, пов'язаних зі згаданим розладом. Фармацевтичні композиції для введення будуть, як правило, містити анти-α5β1 антитіло, роз 88294 22 чинене у фармацевтично прийнятному носії або наповнювачі, згідно з варіантом, якому віддається перевага, у водному носії. Прийнятними носіями, наповнювачами або стабілізаторами для фармацевтичної композиції є носії, наповнювачі або стабілізатори, що не є токсичними для клітини або ссавця, яких піддають її дії у застосованих дозах та концентраціях. Прикладами фізіологічно прийнятних носіїв є буфери, наприклад, фосфат, цитрат та інші органічні кислоти, антиоксиданти, у тому числі аскорбінова кислота; поліпептид низької молекулярної маси (менше ніж приблизно 10 залишків); білки, наприклад, сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, наприклад, полівінілпіролідон; амінокислоти, наприклад, гліцин, глутамін, аспарагін, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, у тому числі глюкоза, маноза або декстрани; хелатоутворювачі, наприклад, EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота); спирти з цукру, наприклад, маніт або сорбіт; солетворні протиіони, наприклад, натрій; та/або неіонні поверхнево-активні речовини, наприклад, TWEEN®, поліетиленгліколь (PEG) і PLURONICS™. Можуть застосовуватись різноманітні водні носії, наприклад, забуферений фізіологічний розчин тощо. Ці розчини повинні бути стерильними і, як правило, вільними від небажаної речовини. Фармацевтичні композиції можуть стерилізуватись за традиційними, добре відомими способами стерилізації. Фармацевтичні композиції можуть також містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, які є необхідними для наближеного відтворення фізіологічних умов, наприклад, речовини для регулювання рівня рН та буферні речовини, речовини для регулювання рівня токсичності тощо, наприклад, ацетат натрію, хлорид натрію, хлорид калію, хлорид кальцію, лактат натрію та інші фармацевтично прийнятні солі, до числа яких входять як солі, одержані доданням кислот, так і солі, одержані доданням основ. До складу фармацевтичних композицій може також входити один або декілька з наведених нижче: білки-носії, наприклад, сироватковий альбумін; буфери; заповнювачі, наприклад, мікрокристалічна целюлоза, лактоза, кукурудзяний та інші крохмалі; зв'язувальні речовини; підсолоджуючі речовини та інші ароматизатори; барвники; і поліетиленгліколь. Концентрація антитіла у цих лікарських формах може коливатись у широких межах і буде вибиратись, головним чином, виходячи з об'єму рідини, в'язкості, маси тіла тощо у відповідності до конкретного обраного шляху введення і потреб хворого (наприклад, "Remington's Pharmaceutical Science" (15-е видання, 1980); Гудмен (Goodman), Гіллмен (Gillman) "The Pharmacological Basis of Therapeutics" (під редакцією Хардмен (Hardman) та інших, 1996)). За варіантами здійснення способів за цим винаходом, яким віддається перевага, анти-α5β1 антитіло вводять до складу фармацевтичної композиції, що містить розчин від приблизно 1,0мг/мл до 15мг/мл антитіла, від приблизно 22мМ до 28мМ цитрату, від приблизно 135мМ до 165мМ хлориду натрію, 0,04%-0,06% полісорбату (TWEEN®) 80 при рН від 5,5 до 7,5. Згідно з варіантом здійснення, 23 якому віддається перевага, діапазон рН згаданої рідкої лікарської форми знаходиться у межах від приблизно рН 6,0 до рН 7,0 і згідно з варіантом, якому віддається найбільша перевага, у межах від приблизно рН 6,3 до рН 6,7. Згідно з варіантом здійснення, якому віддається особлива перевага, фармацевтична композиція містить розчин приблизно 10,0мг/мл антитіла, приблизно 25мМ цитрату, приблизно 150мМ хлориду натрію, приблизно 0,05% полісорбату (TWEEN®) 80 при рН приблизно 6,5. За іншими варіантами здійснення, вищезгадана фармацевтична композиція антиα5β1 антитіла може додатково містити хіміотерапевтичний засіб, або альтернативно, може вводитись хворому разом із фармацевтично ефективною кількістю іншого хіміотерапевтичного засобу. Згідно з варіантом, якому віддається перевага, рідка лікарська форма фармацевтичної композиції являє собою стійкий, безбарвний, або у межах від прозорого до дещо опалесціюючого, розчин, який, за результатами визначення засобами високоефективної рідинної гель-хроматографії, містить не більше за 10%, а згідно з варіантом, якому віддається перевага, 5% або менше деградованої мономерної форми антитіла. Згідно з варіантом, якому віддається перевага, спостерігається не більший за 10%, а згідно з варіантом, якому віддається перевага, 5% або менший рівень гідролітичного вирізання і спостерігається не більший за 10%, а згідно з варіантом, якому віддається перевага, 5% або менший рівень агрегації антитіл. Згідно з варіантом, якому віддається перевага, спостерігається не більша на ±10% зміна концентрації, рН і осмотичного тиску лікарської форми. Активність знаходиться у межах 70-130%, згідно з варіантом, якому віддається перевага, 80120% від контрольної. Введення фармацевтичних композицій, що містять анти-α5β1 антитіла, суб'єкту може здійснюватись різноманітними шляхами, у тому числі (але без обмеження), перорально, підшкірно, внутрішньовенно, інтраназально, місцево, черезшкірно, внутрішньоочеревинно, внутрішньом'язово, внутрішньолегенево, вагінально, ректально, внутрішньочно, інтравентрикулярно або підоболонково. Добре відомо, що антитіла, у разі перорального введення, повинні бути захищеними від розщеплення. Це, як правило, здійснюють шляхом утворення комплексу молекул із композицією для надання їм стійкості до кислотного та ферментативного гідролізу або шляхом вміщення молекул у відповідний стійкий носій, наприклад, ліпосому або захисний бар'єр. Засоби захисту агентів від розщеплення є добре відомими у цій галузі. Фармацевтичні композиції можуть вводитись у різноманітних дозованих лікарських формах у залежності від способу введення. Наприклад, дозовані лікарські форми, придатні для перорального введення, включають (але ними не обмежуються) порошок, таблетки, драже, капсули і пастилки. Точна доза для застосування за конкретним варіантом здійснення за способом за цим винаходом буде залежати від цілі лікування і може бути встановлена фахівцем у цій галузі за допомогою 88294 24 добре відомих методів (наприклад, Ансел (Ansel) та інші, "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery"; Ліберман (Lieberman), "Pharmaceutical Dosage Forms" (том 1-3, 1992); Деккер (Dekker), ISBN 0824770846, 082476918X, 0824712692, 0824716981; Ллойд (Lloyd), "The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding" (1999); та Пікар (Pickar), "Dosage Calculations" (1999)). Як відомо у цій галузі, може бути необхідним підбір з урахуванням розпаду під впливом раку, системної або місцевої доставки та швидкості синтезу нових протеаз, а також віку, маси тіла, загального стану здоров'я, статі, раціону, часу введення, взаємодії лікарських засобів і тяжкості стану, що буде здійснюватись шляхом рутинного експериментування фахівцями у цій галузі. За одним із варіантів здійснення способів за цим винаходом, фармацевтичні композиції, що містять анти-α5β1 антитіло, вводять хворому, виходячи з маси антитіла (у мг) на масу тіла хворого (у кг). Таким чином, дози, яким віддається перевага, становлять щонайменше приблизно 0,5мг/кг, 1,0мг/кг, 2,5мг/кг, 5,0мг/кг, 10,0мг/кг та 15мг/кг. Згідно з варіантом, якому віддається перевага, згадану дозу вводять хворому шляхом внутрішньовенного вливання впродовж 1год. Додаткові дози можуть вводитись впродовж тривалого періоду часу таким чином, щоб у сироватці хворого встановлювалась постійна концентрація. Наприклад, вливання 10мг/кг може здійснюватись один раз на тиждень впродовж року. За одним із варіантів здійснення, якому віддається перевага, дозоване введення анти-α5β1 антитіла та схему застосування згаданого лікарського засобу підбирають таким чином, щоб згадана доза забезпечувала максимальну концентрацію у сироватці нижче безпечної середньої максимальної сироваткової концентрації, яка спостерігалась під час фармакокінетичних досліджень, які здійснювались на мавпах (наприклад, макакахкрабоїдах). Наприклад, у макак-крабоїдів, середній максимальний рівень М200 при дозі 50мг/кг після 4 тижнів введення становив 1862мкг/мл (діапазон: 1000-2606мкг/мл). При згаданих сироваткових концентраціях ознак токсичності у мавп не спостерігалось. На додаток до цього, або як альтернативний варіант, доза може підбиратись такими чином, що кінцевий рівень у сироватці дорівнює >1мкг/мл, тобто встановлюється така концентрація, яка забезпечує 80% пригнічення зв'язування α5β1 з фібронектином під час in vitro аналізу активності. За одним із варіантів здійснення способів терапевтичного убивання ракових клітин за цим винаходом, фармацевтичну композицію, що містить анти-α5β1 антитіло, вводять хворому внутрішньовенно у фіксованій дозі, як правило, приблизно від 0,1мг/хворого/добу до 10мг/хворого/добу. За варіантами здійснення, за якими фармацевтичну композицію вводять до ізольованої ділянки, наприклад, до порожнини тіла або до просвіту органу, а не до кровотоку, можуть застосовуватись фіксовані дози у межах від 0,1мг/хворого/добу до приблизно 100мг/хворого/добу. У разі варіантів здійснення, за якими бажаним є місцеве введення, можливими є значно вищі дози. Фактичні способи 25 одержання композицій для парентерального введення будуть відомими або очевидними для фахівців у цій галузі, дивись, наприклад, "Remington's Pharmaceutical Science" та Гудмен (Goodman) і Гіллмен (Gillman) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", вище. Фармацевтичні композиції, які застосовують у способі убивання ракових клітин за цим винаходом, можуть вводитись як складова частина курсу лікування або профілактики. У разі лікування, фармацевтичну композицію вводять хворому, який вже страждає на рак, у кількості, достатній для вилікування або щонайменше часткової затримки розвитку захворювання та його ускладнень. Взагалі, у контексті лікування, хід лікування може визначатись за зменшенням розміру пухлини або зниженням швидкості росту пухлини. Кількість, достатня для досягнення згаданого, визначається як "терапевтично ефективна доза". Кількості, ефективні для подібного застосування, будуть залежати від тяжкості раку і загального стану здоров'я хворого. Може здійснюватись одноразове або багаторазове введення фармацевтичних композицій, у залежності від дози та частоти, яка переноситься хворим. Спосіб лікування на ранній стадії спрямовується на запобігання або уповільнення розвитку раку у суб'єкта, який підозрюється на розвиток захворювання, або застосовується на дуже ранній стадії захворювання. Конкретна доза, необхідна для лікування на ранній стадії, буде залежати від медичного стану та історії хворого, конкретного типу раку, профілактика якого здійснюється, а також інших факторів, наприклад, віку, маси, статі, шляху введення, ефективності тощо. Спосіб лікування на ранній стадії може також застосовуватись із профілактичною метою, наприклад, щодо хворого, який раніше мав рак, для запобігання рецидиву раку, або щодо хворого, відносно якого мають підозру значної ймовірності розвитку раку. Наприклад, хворий із генетичною схильністю до раку молочної залози, у якого було виявлено якийсь передпухлинний раковий маркер (наприклад, мікрометастази, виявлені ПЛР), буде особливо придатним для застосування способу лікування на ранній стадії. За альтернативним варіантом здійснення цього винаходу, спосіб безпосереднього убивання ракових клітин може здійснюватись таким чином, за яким, на додаток до анти-α5β1 антитіла, вводять хіміотерапевтичний засіб. Типові хіміотерапевтичні засоби, придатні для застосування за цим варіантом здійснення, були розкриті вище. Цьому комбінованому способу лікувального впливу може віддаватись особлива перевага на ранній стадії або у профілактичному контексті, коли у хворого 88294 26 відсутні повністю розвинуті симптоми захворювання. На цій ранній стадії або у профілактичному контексті багато хворих можуть не погодитись на піддання впливу побічних токсичних ефектів, які супроводжують самостійне застосування стандартного хіміотерапевтичного засобу. Профілактика раку або лікування на дуже ранній стадії може здійснюватись шляхом введення меншої дози стандартного хіміотерапевтичного засобу разом із відносно нетоксичним анти-α5β1 антитілом за схемою, яка є ефективною і набагато більше стерпною хворим. Наведені нижче приклади призначені для ілюстрування, а не для обмеження винаходу, який розкривається у цьому описі. Приклади Приклад 1: Експресія α5β1 на пухлинному зразку, яка виявляється засобами ІНС Пухлинні біоптати, що відбирались у хворих на меланому, рак легень, рак нирок, рак підшлункової залози та рак молочної залози, перевіряли на експресію α5β1 інтегрину шляхом імуногістохімічного (ІНС) аналізу. Матеріали і методи Заморожені зразки тканин (одержані з клініки Майо (Mayo Clinic) або з Клівлендської клініки (Cleveland Clinic)) заморожували у сполуці, яка забезпечувала оптимальну температуру для одержання зрізів замороженої тканини (ОСТ) і зберігали при температурі -70°С. Зрізи тканин (7мкм), одержані у кріостаті, фіксували у суміші 75% ацетону/25% етанолу впродовж 1хв. Зразки інкубували або з анти-α5β1 мишачим антитілом ІІА1 (5мкг/мл), або з контрольним мишачим IgGl (антитринітрофеніл, гібридомний клон 1В7.11 з АТСС (Американська колекція типових культур)) впродовж 30хв. Зв'язування антитіл виявляли за допомогою біотинілованого вторинного антитіла, козячого анти-мишачого IgG (3мкг/мл, 30хв; фірма Jackson ImmunoResearch) і проявляли за допомогою набору Vectastain Elite ABC Kit (фірма Vector Laboratories) та стійкого DAB (діамінобензидин і Н2О2; фірма Research Genetics). Забарвлювання здійснювали на апараті DAKO Autostainer при кімнатній температурі. Результати Як показано у Таблиці 1, майже усі проаналізовані пухлинні зрізи забарвлювались позитивно на α5β1 на судинній сітці пухлини. Подив викликало те, що значна частина пухлинних зразків також демонструвала позитивне забарвлення на експресію α5β1 інтегрину на самому пухлинному епітелії. Ці результати вказують на те, що анти-α5β1 антитіло, окрім проникнення до новоутвореної судинної сітки, безпосередньо спрямовано досягає ракових клітин. 27 88294 28 Таблиця 1 Результати імуногістохімічного аналізу пухлинних зразків, забарвлених анти-α5β1 антитілом ІІА1 Тип пухлини Судинна сітка пухлини (кількість зразків) негативний 1+ 2+ 3+ Ниркова пухлина 2 2 13 18 (n=39) Пухлина підшлунко0 1 17 12 вої залози (n=32) Легенева пухлина 0 1 0 28 (n=39) Пухлина товстої киш2 2 3 8 ки (n=21) Меланома (n=19) 3 0 2 13 Метастази сальника 0 0 1 3 яєчника (n=4) Пухлина сечового 0 0 4 3 міхура (n=8) Приклад 2: Експресія α5β! на лініях ракових клітин, яка виявляється за допомогою протокової цитометрії Набір з 24 ліній ракових клітин перевіряли за допомогою протокової цитометрії на експресію α5β1 інтегрину на поверхні клітин. Як показано у Таблиці 2, ці 24 лінії клітин походили з найрізноманітніших раків, у тому числі: сечового міхура, молочної залози, товстої кишки, фібросаркоми, легень, меланоми, підшлункової залози, передміхурової залози, яєчника, нирок і селезінки. Матеріали і методи Клітини за допомогою 5мМ розчину EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота) видаляли до Трис-НСІ (рН8,0) і блокували шляхом центрифугування у зрівноваженому фізіологічному розчині Хенкса, що містив 3% термоінактивованої FBS (сироватка плода корови), 1% нормальної козячої сироватки (фірма Sigma) і 1% BSA (сироватковий альбумін великої рогатої худоби), при температурі 4°С впродовж 5хв. Клітини інкубували впродовж 30-60хв. при температурі 4°С з мишачим антиα5β1 антитілом, ІІА1 (10мкг/мл), у FACS буфері (PBS (забуферений фосфатом фізіологічний розчин), що містить 0,1% BSA). Надлишок моноклонального антитіла видаляли шляхом центрифугу Епітелій пухлини 1+ 2+ 3+ 4+ негативний 4+ 4 27 8 4 0 0 2 15 2 7 7 1 1 19 14 3 2 1 6 19 0 1 1 0 1 13 5 1 0 0 0 2 2 0 0 0 1 5 2 1 0 0 вання, а клітини двічі промивали FACS буфером перед ресуспендуванням у РЕ-анти-мишачому IgG (H+L) антитілі (фірма Southern Biotech, розведення 1:400) впродовж 30-60хв. при температурі 4°С. Після промивання клітини ресуспендували у FACS буфері, що містив йодид пропідію (1мкг/мл). Середню інтенсивність флуоресценції (MFI) визначали на установці FACSCalibur (фірма Becton Dickinson). Фонова MFI дорівнювала ~5. Результати Як показано у Таблиці 2, значна експресія α5β1 інтегрину на поверхні клітин, яка піддавалась виявленню, спостерігалась у 21 з 24 ліній клітин, які піддавали визначенню. Три лінії ракових клітин, CHL-1, COLO 357 і С32, демонстрували значення MFI, які були дуже близькими до фонових рівнів, що свідчило про незначну або повністю відсутню поверхневу експресію α5β1 інтегрину. 21 лінія клітин, що експресували α5β1 інтегрин на своїй поверхні, повинні бути приступними для безпосереднього убивання клітин анти-α5β1 антитілом. На додаток до цього, рак, з якого походили ці лінії клітин, може бути сприйнятливим до лікування терапевтичним засобом на основі анти-α5β1 антитіла. Таблиця 2 Результати FACS (клітинний сортер зі збудженням флуоресценції) аналізу різних ліній ракових клітин з ІІА1 та in vitro аналізу проліферації з М200 Лінія клітин А549 Н460 SW839 MIA PACA-2 НСТ-116 786-0 EKVX SW1990 Вихідний рак рак легень рак легень рак нирок рак підшлункової залози рак товстої кишки рак нирок рак легень рак селезінки Поверхнева експресія α5β1 (MFI) 71,41 87,5 65,8 61,9 42,5 144,4 36,7 nd1 Відсоток пригнічення росту -сироватка +сироватка 40 0 40 0 30 0 20 0 15 0 10 0 10 0 10 0 29 88294 30 Продовження таблиці 2 SN12C А498 А375 А2058 CHL-1 ТК-10 COLO 357 НТ144 С8161 НТ1376 DU145 UACC-62 НТ1080 ES-2 CAPAN-1 CAPAN-2 ASPC-1 С32 LOX NW231 1 2 рак нирок рак нирок меланома меланома меланома рак нирок рак підшлункової залози меланома меланома рак сечового міхура рак передміхурової залози меланома фібросаркома рак яєчника рак підшлункової залози рак підшлункової залози рак підшлункової залози меланома меланома рак молочної залози 129,1 67,1 156,1 36,2 6,8 36,6 7,8 102,1 122 111,9 87,5 88,5 421,7 132,8 nd1 nd1 nd1 5,7 261,6 132,2 5 5 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 402 102 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 35 35 nd=He визначалось; Значення % пригнічення росту визначали 2-денним, а не 4-денним аналізом. Приклад 3. Пригнічення in vitro проліферації ракових клітин за допомогою М200 Набір із 28 ліній ракових клітин оцінювали на чутливість до химерного анти-α5β1 антитіла М200 у аналізі проліферації клітин у присутності та за відсутності сироватки. Матеріали і методи Лінії ракових клітин висівали з густиною 2500 клітин/лунку на 96-лункові планшети у IMDM (середовище Дульбекко, модифіковане за способом Ісков) з додатками у присутності або за відсутності 10% FBS. Під час висівання клітини стимулювали різними концентраціями М200 або нефункціонального блокувального анти-α5 антитіла, VC5. Через чотири дні життєздатність клітин визначали аналізом CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (фірма Promega) за інструкціями виробника. Усі дослідження росту здійснювали щонайменше 3 рази з трьома повтореннями. Результати Як показано у Таблиці 2, М200 пригнічувало ріст тринадцяти ліній ракових клітин за відсутності сироватки і двох ліній клітин у присутності сироватки. Було встановлено, що дві лінії клітин, LOX і NW231, були чутливими до М200 за обох умов. Виходячи з цих результатів, ймовірно, що раки, з яких походять ці лінії клітин (меланома і рак молочної залози), будуть реагувати на лікування із застосуванням М200. Приклад 4: In vivo пригнічення проліферації пухлинних клітин на моделях NW231 і LOX трансплантатів Клітини NW231 і LOX вирощували як ортотопічні ксенотрансплантати у SCID (синдром тяжкого комбінованого імунодефіциту) мишах і стимулювали анти-α5β1 антитілами М200 та ІІА1 шляхом внутрішньоочеревинної ін'єкції. Матеріали і методи Мишей з порушеною імунологічною реактивністю СВ-17 SCID (лінія C.B-Ighl/IcrTac-Prkdc) одержали від фірми Taconic Farms (Germantown, штат Нью-Йорк). Дослідження здійснювали на мишахсамицях віком 6-10 тижнів (масою ~20г). Тваринам попередньо внутрішньоочеревинно вводили М200, ІІА1 або контрольний IgG у дозі 10мг/кг за 1год. до інокуляції NW231 (1х107 клітин у IMDM (середовище Дульбекко, модифіковане за способом Ісков)) до скупчення жирової тканини молочної залози. Дозоване (10мг/кг) введення здійснювали впродовж 3 тижнів із частотою 3 рази/тиждень. Об'єм пухлини визначали двічі на тиждень за допомогою штангенциркуля і обчислювали за формулою p/6´довжина´ширина´висота. Клінічні спостереження і реєстрацію смертності здійснювали щоденно за нормами IACUC. Результати Було встановлено, що ІІА1 на цій моделі відтворювано пригнічує ріст NW231 та LOX ксенотрансплантатних пухлин. Відтворюваного пригнічення росту пухлини на цих моделях М200 встановлено не було. Оскільки ІІА1 не розпізнає мишачого α5β1 у судинній сітці ксенотрансплантатної пухлини, повний пригнічувальний ефект ІІА1 на ріст пухлини може бути віднесений на рахунок прямого антипроліферативного ефекту на ракові клітини пухлини. Приклад 5: ІІА1 ν комбінації з DOXIL® запобігає формуванню пухлини у in vivo NW231 ксенотрансплантатній моделі Наведений нижче експеримент здійснювали з метою визначення ефективності анти-α5β1 інтегринового антитіла, ІІА1, у комбінації з хіміотерапевтичним засобом, DOXIL®, щодо запобігання формування людських NW231 пухлин in vivo. DOXIL® 31 являє собою упаковану у ліпосому лікарську форму доксорубіцину HCL, цитотоксичного антрациклінового антибіотика, виділеного з Streptomyces peucetius. Лінія клітин NW231 походить із раку молочної залози і вважається доброю моделлю для дослідження лікарських заходів для лікування раку молочної залози. Матеріали і методи SCID мишам-самицям віком від чотирьох до шести тижнів, яких одержали від фірми Taconic Farms і утримували у клітках-мікроізоляторах, до скупчення жирової тканини молочних залоз інокулювали 1´107 клітин NW231. Тварини, як контроль, одержали препарат TIB (n=20) або М200 (n=20) у дозі 5мг/кг із першою ін'єкцією під час інокуляції пухлинних клітин. У подальшому доза становила 0,7мг/кг/ін'єкцію. Введення DOXIL® розпочали через 5 днів після інокуляції пухлинних клітин. Доза хіміотерапевтичного засобу під час першої ін'єкції становила 4мг/кг і 2мг/кг під час подальших ін'єкцій. Реактиви вводили внутрішньоочеревинною ін'єкцією чотирма дозами. Об'єм пухлини визначали двічі на тиждень, клінічні спостереження і реєстрацію смертності здійснювали щоденно за нормами IACUC. Результати Обробка ІІА1 продемонструвала значний ефект щодо уповільнення формування NW231 пухлин у мишей. Через 24 дні після імплантації NW231 пухлин, середній об'єм пухлин контрольних ксенотрансплантатів, оброблених препаратом TIB, збільшився експоненціальним чином до ~425мм3, у той час як оброблені ІІА1 ксенотрансплантати збільшились до середнього об'єму ~175мм3. Обробка, яку здійснювали лише DOXIL®, також продемонструвала значний ефект щодо запобігання формування пухлин. У разі ксенотрансплантатів, які оброблялись лише DOXIL®, середній об'єм пухлин початково збільшився лише до ~25мм3 впродовж перших 45 днів після імплантації, а потім поступово збільшився до ~275мм3 на 74 день. Обробка мишей комбінацією ІІА1 і DOXIL® продемонструвала ще більший пригаічувальний ефект на швидкість формування пухлин, порівняно з індивідуальною обробкою кожним зі згаданих засобів. У разі обробки ксенотрансплантатів ІІА1 плюс DOXIL®, середній об'єм пухлин залишався майже нульовим до 54 дня, після чого поступово збільшився, але лише до ~125мм3 на 74 день. Ці результати вказують на підвищену ефективність (тобто комбінований ефект пригнічення пухлин) in vivo у разі комбінованого лікування анти-α5β1 антитілом, ІІА1 і хіміотерапевтичним засобом, DOXIL®. Приклад 6: Ефективність М200. визначена на кролячій моделі VX2 пухлини Незважаючи на те, що М200 не вступає у перехресну реакцію з мишачим або пацючим α5β1 інтегрином, воно розпізнає α5β1 інтегрин у кролів. Так, кроляча VX2 карцинома може представляти добру модель для визначення in vivo ефективності безпосереднього убивання ракових клітин М200. VX2 являє собою широко прийняту кролячу модель для дослідження лікування первинних пухлин різних місцезнаходжень (дивись, наприклад, Чен 88294 32 Дж. Г. (Chen J.G.) та інші, Lab Anim. 2004 Jan; 38(1): 79-84; Пурді Т.Г. (Purdie T.G.) та інші, Phys. Med. Biol. 2001 Dec; 46(12): 3161-3175; Гешвінд Дж.Г. (Geschwind J.G.) та інші, Cancer Res. 2002 Jul 62(1): 3909-3913). А. Пошукове дослідження М200 на УХ2 Початкове пошукове дослідження здійснювали з метою визначення загальних параметрів проведення дослідження ефективності М200 на кролячій моделі VX2 пухлини. Інокуляція пухлини Кролям у день 0 інокулювали клітинну суспензію (100мкл) підшкірно (ліва задня лапка) і внутрішньом'язово на глибину приблизно 3мм (права задня лапка). Внутріпшьом'язову інокуляцію здійснювали таким чином. Кролику, якого було анестезовано сумішшю кетаміну/ізофлурану, скальпелем робили ~2см надріз паралельно правому стегну на передній бічній поверхні вздовж осі стегнової кістки на ~1/3 загальної довжини стегнової кістки дистально від тазостегнового суглобу. М'язові групи відокремлювали з утворенням порожнини глибиною ~0,5см. До порожнини вміщували один фрагмент VX2 пухлини від тварини-донора. Шкіру надійно стягували стерильними хірургічними скобами або накладанням швів і на ділянку рани наносили антибіотик місцевої дії. Вимірювання пухлин Розпочинаючи з дня 5, розміри пухлини (довжину, ширину і висоту) визначали у міліметрах за допомогою електронного штангенциркуля, підключеного до портативного комп'ютера з мінімальною частотою двічі на тиждень. Для узгодженості, вимірювання пухлин впродовж дослідження здійснювалось одним кваліфікованим техніком. Об'єм пухлин обчислювали за формулою: довжина´ширина´висота´0,52. Після умертвіння тварини, пухлини обережно вирізували, приводили у порядок і зважували. На додаток до цього, тварин зважували як мінімум один раз на тиждень. Репрезентативні зразки кожної пухлини зберігали у касеті для зразків у формаліні або ОСТ і піддавали надшвидкому заморожуванню у рідкому азоті. In vivo пасажування VX2 пухлин VX2 пухлини, які застосовувались як під час пошукового дослідження, так і під час дослідження ефективності М200, підтримували шляхом щомісячного in vivo пасажування. Для внутрішньом'язової інокуляції до кожної задньої лапки застосовували клітинну суспензію (100мкл) або шматочки пухлини (~5-10мм3). Тварин і пухлини контролювали візуальним шляхом; пухлини видаляли до досягнення ними 2 см діаметра для in vivo пасажування. In vivo пасажування здійснювали шляхом умертвіння тварини, видалення пухлини і поділу пухлини на 5-10мм3 шматочки. Згадані шматочки після цього реімплантували наступній групі з 2 кроликів. Імуногістохімічні (ІНС) аналізи VX2 пухлин від кролів, оброблених М200 Кролику з пухлиною внутрішньовенно вводили М200 у дозі 10мг/кг і пухлину вирізали через 1год. Зрізи пухлини забарвлювали (і) антилюдським вторинним антитілом, специфічним до зв'язаного 33 пухлиною М200; (іі) ІІА1, з подальшим антимишачим вторинним антитілом для виявлення загальної кількості α5β1; або (ііі) контрольним IgG і антимишачим вторинним антитілом. Результати За результатами імуногістохімічних аналізів було встановлено, що як підшкірні пухлини, так і внутрішньом'язові пухлини були доступними для М200, який вводили тваринам внутрішньовенним шляхом. Імуногістохімічний аналіз забарвлених зрізів виявив високі рівні експресії α5β1 як у VX2 пухлинних клітинах, так і у пухлинній судинній сітці кролів. В. Дослідження ефективності М200 на VX2 Виходячи з результатів імуногістохімічних аналізів пошукових досліджень, кролячу VX2 модель застосовували для визначення ефективності М200 in vivo. Методи Кролям (загальною кількістю 30 голів) інокулювали, підшкірно або внутрішньом'язово, клітинну суспензію VX2 (100мкл) або шматочки пухлини (~5-10мм3). Експериментальній групі з 20 кролів двічі на тиждень впродовж З тижшв внутрішньовенно вводили М200 у дозі 10мг/кг. Контрольну групу з 10 тварин обробляли контрольним IgG, який вводили таким самим чином, що і М200. Вимірювання пухлин, умертвіння тварин, зважування, консервацію пухлин і тривалість досліджень здійснювали за способами, опис яких наведено вище для пошукового дослідження. На додаток до цього, з вушної кровоносної судини для аналізу сироватки щотижнево відбирали 1мл крові. Результати У тварин спостерігали високий рівень кореляції між пригніченням росту пухлин і циркулюючими рівнями М200. Взагалі, коли вміст М200 підтримували на рівні або вище 50мкг/мл, тоді ріст пухлин пригнічувався. Оскільки М200 є імуногенним у кролів, у деяких тварин з експериментальної групи вже через два тижні після введення М200 розвинулась імунна реакція на М200 і було встановлено, що зрештою в усіх тварин відбулась сероконверсія. У тварин експериментальної групи, у яких розвинулась анти-ідиотипова реакція, що призвела до виведення М200 (тобто М200