Спосіб одночасного виявлення й ідентифікації антибіотиків різних класів in vitro і відповідний діагностичний набір
Формула / Реферат
1. Діагностичний набір для одночасного визначення антибіотиків різних класів щонайменше -лактамів і тетрациклінів, який відрізняється тим, що він включає:
- по-перше, єдину реакційну суміш, яка включає щонайменше перший рецептор, що специфічно розпізнає -лактами, другий рецептор, що специфічним і конкурентним чином розпізнає тетрациклін, і біотинільований фрагмент нуклеїнової кислоти, причому обидва рецептори, переважно, є міченими частинками колоїдного золота або безпосередньо, або за допомогою антитіла або антитіла в поєднанні з білком А;
- по-друге, регенераційну систему у вигляді твердої підкладки, що включає нітроцелюлозну мембрану, на якій в двох відомих і різних ділянках, що називаються тестовими зонами, закріплені антибіотик з -лактамним ядром і авідин, у вказаному порядку або навпаки;
таким чином, щоб інтенсивність мітки, що виявляється в регенераційній системі в обох тестових зонах незалежно, була б результатом конкурентного розпізнавання кожного антибіотика своїм міченим рецептором.
2. Діагностичний набір за п. 1, який відрізняється тим, що антибіотик з -лактамним ядром і авідин, закріплений на нітроцелюлозній мембрані, є, відповідно, пеніцилін або цефалоспорин, переважно, ампіцилін, імобілізований на
-лактоглобулині, і авідин яєчного білка.
3. Діагностичний набір для одночасного визначення антибіотиків різних класів щонайменше -лактамів і сульфамідів, який відрізняється тим, що він включає:
- по-перше, єдину реакційну суміш, яка включає щонайменше перший рецептор, який специфічно розпізнає -лактами, мічений безпосередньо або не безпосередньо, переважно, частинками колоїдного золота; біотинільовані антитіла проти сульфамідів і аналог сульфаміду, мічений безпосередньо або не безпосередньо колоїдним золотом;
- по-друге, регенераційну систему у вигляді твердої підкладки, що включає нітроцелюлозну мембрану, на якій в двох відомих і різних ділянках, що називаються тестовими зонами, закріплені антибіотик з -лактамним ядром і авідин, у вказаному порядку або навпаки;
таким чином, щоб інтенсивність мітки, що виявляється на регенераційній системі в обох тестових зонах незалежно, була б результатом конкурентного розпізнавання кожного антибіотика.
4. Діагностичний набір для одночасного визначення аналізованих речовин, відповідних антибіотикам різних класів щонайменше тетрацикліну і сульфамідів, який відрізняється тим, що він включає:
- по-перше, єдину реакційну суміш, що включає щонайменше рецептор, який специфічним і конкурентним чином розпізнає тетрациклін, і біотинільований фрагмент нуклеїнової кислоти, де рецептор є мічений, переважно, частинками колоїдного золота, безпосередньо або не безпосередньо за допомогою антитіла, а також антитіло проти сульфаміду і аналог сульфаміду, мічений або безпосередньо, або не безпосередньо, переважно, колоїдним золотом;
- по-друге, регенераційну систему у вигляді твердої підкладки, що включає нітроцелюлозну мембрану, на якій в двох відомих і різних ділянках, що називаються тестовими зонами, закріплено відповідно антитіло, специфічно направлене або проти рецептора тетрацикліну, або проти специфічного антитіла проти рецептора тетрацикліну, і антитіло, специфічно направлене проти антитіла до сульфаміду, у вказаному порядку або навпаки.
5. Діагностичний набір за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що специфічні антитіла проти рецепторів, що додаються в реакційну суміш, є або моноклональними, або поліклональними антитілами, модифікованими або не модифікованими хімічно або рекомбінантно, очищеними або не очищеними, кон'югованими або не кон'югованими безпосередньо або не безпосередньо з міченими частинками, переважно з частинками колоїдного золота.
6. Діагностичний набір за будь-яким із пп. 1-5, який відрізняється тим, що нітроцелюлозна мембрана, нанесена на підкладку діагностичної смужки, одним кінцем стикається з мембраною, а іншим кінцем зі всмоктуючим папером і має дві різні тестові зони, одну за іншою у напрямі руху рідини, і контрольну зону, яка може розділяти дві тестові зони.
7. Діагностичний набір за п. 6, який відрізняється тим, що контрольна зона одержана за допомогою якого-небудь білкового препарату, міченого, переважно, частинками колоїдного золота, переважніше, за допомогою бичачого сироваткового альбуміну (БСА), кон'югованого з частинками колоїдного золота.
8. Діагностичний набір для одночасного визначення -лактамів, тетрациклінів і сульфамідів за пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що реакційна суміш також містить специфічне антитіло, що розпізнає сульфаміди, мічене, переважно, частинками колоїдного золота, безпосередньо або не безпосередньо; і тим, що регенераційна система додатково включає препарат білка, кон'югованого з сульфамідами, імобілізований на нітроцелюлозній мембрані.
9. Діагностичний набір для одночасного визначення -лактамів, тетрациклінів і сульфамідів за п. 8, який відрізняється тим, що нітроцелюлозна мембрана, нанесена на підкладку діагностичної смужки, одним кінцем стикається з мембраною, а іншим кінцем зі всмоктуючим папером і несе три різні тестові зони і контрольну зону, розташовані послідовно одна за одною у напрямку руху рідини, або дві контрольні зони, кожна з яких альтернативно розташована між двома тестовими зонами.
10. Діагностичний набір для одночасного визначення аналізованих речовин, відповідних антибіотикам різних класів щонайменше -лактамів, тетрациклінів і сульфамідів, який відрізняється тим, що він включає:
- по-перше, єдину реакційну суміш, яка включає щонайменше перший рецептор, що специфічно розпізнає -лактами, другий рецептор, який специфічним і конкурентним чином розпізнає тетрациклін, і біотинільований фрагмент нуклеїнової кислоти, при цьому обидва рецептори, переважно, є міченими частинками колоїдного золота, або безпосередньо, або не безпосередньо за допомогою антитіла або антитіла в поєднанні з білком А, або антитіла проти сульфаміду, а також аналог вільного сульфаміду, мічений безпосередньо або не безпосередньо колоїдним золотом;
- по-друге, регенераційну систему у вигляді твердої підкладки, що включає нітроцелюлозну мембрану, на якій в трьох відомих і різних ділянках закріплені, відповідно, антибіотик з -лактамним ядром, авідин і антитіло, направлене проти антитіла до сульфаміду;
так, щоб інтенсивність мітки, що виявляється на регенераційній системі незалежно в трьох тестових зонах, була б результатом конкурентного розпізнавання кожного антибіотика.
11. Діагностичний набір за будь-яким із пп. 1-10, який відрізняється тим, що проба є по суті рідкою, і її одержують з молока, меду, м'яса, яєць або біологічних рідин.
12. Діагностичний набір за будь-яким із пп. 1-11, який відрізняється тим, що рецептори, що використовуються для визначення -лактамів або тетрациклінів, є, відповідно, рецептори BlaR і TetR, виділені з відомих класів мікроорганізмів, переважно, з Staphylococcus aureus для BlaR і з плазміди pSClOl Е. соlі 600 для TetR відповідно.
13. Спосіб застосування діагностичного набору за будь-яким із пп. 1-12, який відрізняється тим, що він включає наступні стадії:
- вищезазначену реакційну суміш приводять в контакт з пробою, яку потрібно класифікувати, з отриманням розчину, який витримують при температурі від 30 °С до 50 °С протягом від 3 до 15 хвилин;
- діагностичну смужку, що несе вищезазначену регенераційну систему, занурюють в одержаний розчин і витримують протягом від 3 до 15 хвилин;
- результат, одержаний на діагностичній смужці, оцінюють або візуально, або за допомогою оптичного пристрою, що прочитує зображення зі смужок.
Текст
1. Діагностичний набір для одночасного визначення антибіотиків різних класів щонайменше -лактамів і тетрациклінів, який відрізняється тим, що він включає: - по-перше, єдину реакційну суміш, яка включає щонайменше перший рецептор, що специфічно розпізнає -лактами, другий рецептор, що специфічним і конкурентним чином розпізнає тетрациклін, і біотинільований фрагмент нуклеїнової кислоти, причому обидва рецептори, переважно, є міченими частинками колоїдного золота або безпосередньо, або за допомогою антитіла або антитіла в поєднанні з білком А; - по-друге, регенераційну систему у вигляді твердої підкладки, що включає нітроцелюлозну мембрану, на якій в двох відомих і різних ділянках, що називаються тестовими зонами, закріплені антибі 2 (19) 1 3 91359 4 допомогою антитіла, а також антитіло проти сульфаміду і аналог сульфаміду, мічений або безпосередньо, або не безпосередньо, переважно, колоїдним золотом; - по-друге, регенераційну систему у вигляді твердої підкладки, що включає нітроцелюлозну мембрану, на якій в двох відомих і різних ділянках, що називаються тестовими зонами, закріплено відповідно антитіло, специфічно направлене або проти рецептора тетрацикліну, або проти специфічного антитіла проти рецептора тетрацикліну, і антитіло, специфічно направлене проти антитіла до сульфаміду, у вказаному порядку або навпаки. 5. Діагностичний набір за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що специфічні антитіла проти рецепторів, що додаються в реакційну суміш, є або моноклональними, або поліклональними антитілами, модифікованими або не модифікованими хімічно або рекомбінантно, очищеними або не очищеними, кон'югованими або не кон'югованими безпосередньо або не безпосередньо з міченими частинками, переважно з частинками колоїдного золота. 6. Діагностичний набір за будь-яким із пп. 1-5, який відрізняється тим, що нітроцелюлозна мембрана, нанесена на підкладку діагностичної смужки, одним кінцем стикається з мембраною, а іншим кінцем зі всмоктуючим папером і має дві різні тестові зони, одну за іншою у напрямі руху рідини, і контрольну зону, яка може розділяти дві тестові зони. 7. Діагностичний набір за п. 6, який відрізняється тим, що контрольна зона одержана за допомогою якого-небудь білкового препарату, міченого, переважно, частинками колоїдного золота, переважніше, за допомогою бичачого сироваткового альбуміну (БСА), кон'югованого з частинками колоїдного золота. 8. Діагностичний набір для одночасного визначення -лактамів, тетрациклінів і сульфамідів за пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що реакційна суміш також містить специфічне антитіло, що розпізнає сульфаміди, мічене, переважно, частинками колоїдного золота, безпосередньо або не безпосередньо; і тим, що регенераційна система додатково включає препарат білка, кон'югованого з сульфамідами, імобілізований на нітроцелюлозній мембрані. 9. Діагностичний набір для одночасного визначення -лактамів, тетрациклінів і сульфамідів за п. 8, який відрізняється тим, що нітроцелюлозна мембрана, нанесена на підкладку діагностичної смужки, одним кінцем стикається з мембраною, а іншим кінцем зі всмоктуючим папером і несе три різні тестові зони і контрольну зону, розташовані послідовно одна за одною у напрямку руху рідини, або дві контрольні зони, кожна з яких альтернативно розташована між двома тестовими зонами. 10. Діагностичний набір для одночасного визначення аналізованих речовин, відповідних антибіотикам різних класів щонайменше -лактамів, тетрациклінів і сульфамідів, який відрізняється тим, що він включає: - по-перше, єдину реакційну суміш, яка включає щонайменше перший рецептор, що специфічно розпізнає -лактами, другий рецептор, який специфічним і конкурентним чином розпізнає тетрациклін, і біотинільований фрагмент нуклеїнової кислоти, при цьому обидва рецептори, переважно, є міченими частинками колоїдного золота, або безпосередньо, або не безпосередньо за допомогою антитіла або антитіла в поєднанні з білком А, або антитіла проти сульфаміду, а також аналог вільного сульфаміду, мічений безпосередньо або не безпосередньо колоїдним золотом; - по-друге, регенераційну систему у вигляді твердої підкладки, що включає нітроцелюлозну мембрану, на якій в трьох відомих і різних ділянках закріплені, відповідно, антибіотик з -лактамним ядром, авідин і антитіло, направлене проти антитіла до сульфаміду; так, щоб інтенсивність мітки, що виявляється на регенераційній системі незалежно в трьох тестових зонах, була б результатом конкурентного розпізнавання кожного антибіотика. 11. Діагностичний набір за будь-яким із пп. 1-10, який відрізняється тим, що проба є по суті рідкою, і її одержують з молока, меду, м'яса, яєць або біологічних рідин. 12. Діагностичний набір за будь-яким із пп. 1-11, який відрізняється тим, що рецептори, що використовуються для визначення -лактамів або тетрациклінів, є, відповідно, рецептори BlaR і TetR, виділені з відомих класів мікроорганізмів, переважно, з Staphylococcus aureus для BlaR і з плазміди pSClOl Е. соlі 600 для TetR відповідно. 13. Спосіб застосування діагностичного набору за будь-яким із пп. 1-12, який відрізняється тим, що він включає наступні стадії: - вищезазначену реакційну суміш приводять в контакт з пробою, яку потрібно класифікувати, з отриманням розчину, який витримують при температурі від 30 °С до 50 °С протягом від 3 до 15 хвилин; - діагностичну смужку, що несе вищезазначену регенераційну систему, занурюють в одержаний розчин і витримують протягом від 3 до 15 хвилин; - результат, одержаний на діагностичній смужці, оцінюють або візуально, або за допомогою оптичного пристрою, що прочитує зображення зі смужок. Область винаходу [0001] Даний винахід відноситься до способу, що викликає в колекції різних біологічних молекул, що розпізнають і здатні специфічно виявляти деякі аналізуємі речовини з високою чутливістю, одночасну реакцію в одній реакційній суміші, а також розпізнавання класу аналізуємих речовин, до якого належить кожна із сполук, що виявляються, за умови, що принцип розпізнавання, специфічний для одного даного класу аналізуємих речовин, не створює перешкод принципу розпізнавання, специфічному для іншого класу аналізуємих речовин. 5 [0002] Даний винахід також відноситься до діагностичного набору, спеціально розробленого для здійснення вказаного способу. Передумови винаходу [0003] Фундаментальний принцип, що лежить в основі належного контролю над харчовим ланцюгом, наказує проводити контрольні тести на можливо більш ранніх стадіях виробництва, щоб якнайскоріше виявити і відбракувати харчові продукти, які можуть виявитися забрудненими. [0004] Як правило, при здійсненні виявляючих тестів, часто що називаються «скринінгові тести», проба, визначена як позитивна за підсумками першого пробного аналізу, тільки передбачається позитивною і повинна обов'язково пройти другий тест, названий «підтверджуючим». Інакше, якщо первинний скринінговий тест дає негативну відповідь, цього достатньо, і не потрібно проводити ніякого додаткового аналізу для підтвердження негативної відповіді (1). [0005] Першим слідством такої практики є те, що перший спосіб скринінгу повинен забезпечувати виявлення можливо більшої кількості сполук. Отже, скринінгові тести, переважним і логічним чином, повинні бути тестами на декілька аналізуємих речовин. [0006] Іншим слідством з цього правила є те, що важливим виявляється знати клас, до якого належить сполука, виявлена в позитивній пробі на етапі скринінгового тесту, для того, щоб мати можливість точно вибрати спосіб підтвердження, який, як правило, є дуже вузько специфічним, оскільки для підтвердження рекомендується виділити і розпізнати відповідну сполуку. [0007] Третім слідством з цього правила є те, що скринінговий тест не може давати "помилковонегативних" результатів, оскільки такі результати потім уникатимуть аналізу на даній попередній стадії і не підтвердяться надалі. [0008] В даний час відомі різні способи виявлення антибіотиків: - мікробіологічні тести, в яких вимірюється переважна дія проби на зростання штаму бактерій. Тести такого типу вимагають порівняно тривалого часу інкубації (від 3 до 16 годин), перед отриманням результату. В цілому, такі тестові системи (Delvotest® SP, BRT Test Copan™, Eclipse™, Valio™) володіють здатністю розпізнавати декілька класів антибіотиків одночасно, оскільки використовувані в них штами бактерій часто чутливі до багатьох сполук різних класів. В той же час, тести такого типу не дозволяють з'ясувати, до якого саме класу належить антибіотик, який виявляється; - тести in vitro для виявлення низькомолекулярних сполук, засновані на принципі конкуренції між шуканою сполукою, присутньою в пробі, і міченим конкурентом, що навмисно вноситься в пробу, за одну і ту ж ділянку розпізнавання, яка може представляти собою рецептор або молекулу антитіла. У тестових системах типу ELISA (Enzyme Linked Iiamuno Sorbent Assay - твердофазний імуноферментний аналіз) або RIA (Radio Immuno Assay радіоімунний аналіз) / RRA (Radio Receptor Assay радіорецепторний аналіз) час, необхідний для аналізу, складає від 2 до 6 годин. Деякі з цих спо 91359 6 собів, наприклад, лабораторні способи з використанням RRA, дозволяють одночасно виявляти декілька сполук різних класів. Проте у такий спосіб не можна визначити, до якого класу відноситься сполука, що дала позитивну відповідь; - складніші фізико-хімічні способи, що дозволяють виділити і розпізнати шукану сполуку, з недавнього часу є, головним чином, способи, в яких система хроматографічного розділення зв'язана з мас-спектрометричною системою реєстрації (GC/MS - Gase Chromatography/Mass Spectrometry (газова хроматографія/масова спектрометрія) або LC/MS - Liquid chromatography/Mass Spectrometry (рідинна хроматографія/масова спектрометрія)). Ці способи вимагають у кожному випадку вибору особливого режиму роботи для розпізнавання конкретних різних сполук. В деяких випадках у такий спосіб можна виявляти одну сполуку або одночасно декілька сполук одного і того ж класу, іноді можна навіть виявляти всі сполуки якого-небудь одного класу, але це є непридатним для сполук, що належать до різних класів. Фактично, принцип хроматографічного розділення залежить від фізико-хімічних властивостей даної сполуки, які є різними у сполук різних класів. У випадку якщо досліднику невідомий тип сполуки, яку потрібно виявити, йому доводиться випробувати стільки методик, скільки існує класів сполук. [0009] Протягом останніх років з'явилися швидші способи. Ці способи, відомі як експрес-тести ("rapid tests"), використовують для швидкого скринінгу великого числа проб. Звичайно ці способи засновані на розпізнаванні досліджуваних сполук біологічними молекулами за конкурентним принципом. Щоб спосіб був швидким і практичним, тестові системи такого типу працюють за допомогою мембранних пристроїв з радіальним розтіканням (Tetrasensor™, SNAP®, Beta-STAR™, ROSA). Такі тестові системи класифікують залежно від різних варіантів антибіотиків, проте в даний час невідомі системи, що дозволяють за одну операцію розпізнати сполуки, що належать до різних класів. [0010] Якщо доцільно планувати і застосовувати первинний скринінг в сільськогосподарському і продовольчому секторі, то в даному секторі потрібне проведення якомога повнішого аналізу, за допомогою якого, переважно, можна було б розпізнати можливо більшу кількість передбачуваних сполук. Дійсно, більш практично і більш економічно провести один полівалентний тест на одному зразку, ніж виявляти кожну окремо сполуку за допомогою окремого тесту. Така практика вимагає значних витрат часу, вимагає великої роботи із зразками і пов'язана з великими грошовими витратами. Це є перешкодою для ефективного контролю продуктів харчування. [0011] Таким чином, на цій стадії мають місце істотні обмеження ефективності перевірки, викликані відсутністю полівалентних тестових систем, які дозволяли б за одну операцію і, наприклад, менше, ніж за 10 хвилин, виявити сукупність сполук, що належать до різних класів. [0012] Зокрема, сільськогосподарський і продовольчий сектор зацікавлений в новому способі, що дозволяє в ході однієї аналітичної операції 7 виявити сполуку, що належать, щонайменше, до двох різних класів антибіотиків. [0013] Типи антибіотиків, які можуть вводити тваринам, можуть бути різними залежно від того, з профілактичною або з лікувальною метою їх вводять; від виду тварин, від патогена, проти якого вони направлені; від ветеринарної практики, чинного законодавства, доступних засобів, і навіть від географічного положення. У деяких специфічних випадках лікування тварин застосовують суміші ліків. Як правило, ветеринаром використовуються антибіотичні засоби, які вибираються зі всієї сукупності сполук, доступних у продажу, з міркувань найбільшої ефективності. [0014] Основними використовуваними класами антибіотиків і протибактерійних засобів є: пеніциліни і цефалоспоріни, тетрацикліни, сульфаміди, аміноглікозиди і аміноциклитоли, макроліди, хлорамфеніколи або інші пептиди, іонофори, нітрофурани, хінолони, карбадокс та ін. Всі ці класи складають дуже широку сукупність різних у хімічному відношенні сполук. [0015] Вважається, що в деяких випадках інтенсивне використання антибіотиків у ветеринарній практиці і рослинництві може бути причиною виникнення бактерійних штамів, що стали стійкими до антибіотиків. З метою охорони людського здоров'я і законодавчого регулювання даної області багато країн (Європейський Союз, США, Канада та ін.) встановили максимальні значення остаточного змісту (MRL - maximum residue level) антибіотиків в харчових продуктах (2). Ці значення MRL служать свого роду межею між позитивною і негативною пробами, іншими словами, між прийнятною пробою і пробою, яка підлягає відбракуванню. [0016] 3 іншого боку, Рішення Комісії від 12 серпня 2002 встановлює межі мінімального придатного дозволу стосовно способів аналізу, використовуваних для вивчення проб, і визначає загальні критерії оцінки результатів (3). [0017] Очевидно, що для скринінгу відповідно до Директиви 96/23/ЕС повинні застосовуватися тільки такі аналітичні методи, для яких на основі достовірних даних можна довести, що вони є достовірними, і що частота виникнення помилок в них складає менше 5% на даному рівні значень. [0018] У 1995р. в середньому 1% всіх проб, перевірених на вміст в них антибіотиків в кількостях, що перевершують MRL, давали позитивну відповідь. У тих випадках, коли ці позитивні результати підтверджувалися, найчастіше виявляли такі речовини, як пеніциліни і тетрацикліни (4). Рівень техніки [0019] Система виявлення тетрацикліну описана в поданій даним заявником заявці WO-A03/048770, озаглавленої "Спосіб здійснення діагностики in vitro за допомогою механізмів Генетичної регуляції і відповідний діагностичний набір» ("Procede pour effectuer un diagnostic in vitro au moyen de mecanismes de regulation genetique et trousse de diagnostic correspondante"). Цей спосіб дозволяє виявляти тільки тетрациклін. У переважному складі реагенти включають рецептор tetR, виділений з механізму генетичної регуляції Е.соlі, для стійкості до тетрацикліну; антитіла, здатні роз 91359 8 пізнавати цей рецептор, і препарат білка А, кон'югованого з колоїдними частинками золота. Крім цього, регенераційна система включає біотинілований специфічний фрагмент ДНК, який може бути іммобілізованим на молекулі авідину, закріпленій на нітроцелюлозній мембрані. В ході інкубації у присутності випробовуваної проби взаємодія рецептора і фрагмента ДНК відбувається тільки за відсутності тетрацикліну. В цьому випадку фрагмент ДНК утворює комплекс з рецептором, і частинки золота, прикріплені до рецептора, утворюють сигнал. Інакше рецептор, що заздалегідь розпізнав молекулу тетрацикліну, стає нездатний зв'язуватися з фрагментом ДНК, унаслідок чого сигнал не з'являється. [0020] Система виявлення -лактамів описана в патенті WO-A-99/67416, озаглавленому “Спосіб визначення антибіотиків з (3-лактамним ядром в біологічній рідині" ("Procede pour la determination d'antibiotiques a noyaux -lactame dans un liquide biologique"). Цим способом можна виявляти тільки β-лактами. Як переважний склад винахідники описують, по-перше, ізольований рецептор Bacillus licheniformis, очищений і хімічно пов'язаний з молекулами біотину, асоційований з препаратом антитіл проти біотину, кон'югованих з колоїдними частинками золота і, по-друге, кон'югат цефалоспорину з людським імуноглобуліном, закріпленим на нітроцелюлозній мембрані. У випадку, якщо проба не містить -лактаму, рецептор прикріпляється до антибіотика, іммобілізованого на мембрані, і частинки золота, закріплюючись на комплексі рецептор-біотин за допомогою антитіл проти біотинів, пов'язаних із золотом, утворюють сигнал, який детектують. Інакше, якщо рецептор інгібується в ході попередньої інкубації з випробовуваною пробою, він втрачає здатність зв'язуватися з імобілізованим анибіотиком, унаслідок чого сигнал не з'являється. [0021] Відома також система швидкого розпізнавання сульфамідів, описана Р. Верхейен і ін. (5) під заголовком "Розробка одностадійного тесту у формі смужки для виявлення залишків сульфадимідину" ("Development of a one step strip test for the detection of sulfadimidine residues"). У цій системі використовується принцип, схожий з тим, що описаний вище для виявлення -лактамів. З одного боку, специфічні антитіла до сульфадимідинам кон'юговані з колоїдними частинками золота, з іншого боку, сульфадимідин кон'югований з альбуміном яєчного білка і закріплений на нітроцелюлозній мембрані. Якщо проба містить сульфадимідини, що розпізнаються антитілами, утворюється комплекс, який не може надалі зв'язатися з імобілізованим антигеном. Інакше, у відсутність сульфадимідину в пробі, кон'юговані антитіла можуть розпізнавати імобілізований сульфадимідин, і з'являється кольоровий сигнал. Процитована стаття не вказує, наскільки така тестова система вибіркова. [0022] Всі швидкі способи і способи використанням радіального розтікання, відомі сьогодні, застосовуються лише для виявлення одного єдиного класу сполук, і в даний час не існує способу, що дозволяє виявити за одну єдину операцію всі 9 сполуки, що належать хоч би до двох різних класів антибіотиків. Основними причинами цього є технічна неможливість включити в один і той же спосіб незалежним чином і без взаємодії один з одним всі реагенти, необхідні для виявлення кожного з класів. Інша складність полягає в здійсненні розпізнавання класу, до якого відноситься виявлена сполука. [0023] Коротко,відомі системи швидкого виявлення низькомолекулярних сполук (молекулярна маса < 2000) діють на основі принципу конкуренції, який вимагає використання двох елементів: поперше, молекули, яка могла б специфічно розпізнати шукану сполуку, яка є звичайно бактерійним рецептором або імуноглобуліном (молекулу антитіл); а по-друге, конкурента за ділянку зв'язування. Залежно від вибраного способу, один із елементів закріплюють на підкладці, а інший елемент є міченим. У деяких випадках (формат 1, див. нижче) мітять молекулу, що саме розпізнає, а імобілізують аналог аналізованої речовини; у інших же випадках (формат 2, див. нижче) мітять аналог аналізованої речовини, а молекула, що розпізнає, пов'язана з нерозчинною фракцією. [0024] Оригінальність системи виявлення тетрацикліну полягає в тому, що на рецепторі є дві незалежні ділянки розпізнавання, унаслідок чого конкурент є не аналогом шуканої речовини, а фрагментом ДНК, здатним зв'язуватися з іншою ділянкою розпізнавання того ж самого рецептора. [0025] У всіх способах, що називаються експрес-аналізами ("RAPID TESTS"), оцінку здійснюють за допомогою порівняння інтенсивності сигналу, одержаного в "тестовій" зоні, тобто там, де імобілізований регенераційний елемент активного рецептора, з інтенсивністю сигналу, одержаного в контрольній зоні, тобто там, де зв'язані інші реагенти (або надлишок реагентів). Як правило, у випадку, якщо інтенсивність сигналу в тестовій зоні більш виражена, ніж в контрольній зоні, результат є негативним відносно шуканої речовини. [0026] У всіх випадках, пов'язаних з аналізом b-лактамів, молекулу, яка розпізнає, одержують з Bacillus, і у всіх випадках цю молекулу мітять після очищення. Для здійснення такого мічення слід хімічно модифікувати поверхню. Наприклад, вона може бути хімічно пов'язана з ферментом, як, наприклад, у випадку з рецептором Bacillus stearothermophillus, пов'язаним з пероксидазою (ЕР-А-0 593112 і US-A-5,434,053) або з біотином, як у випадку з біотинілованим рецептором Bacillus licheniformis (WO-A-99/67416 і US-A-6,524,804), і або ж з рецептором Bacillus stearothermophillus, безпосередньо кон'югованим з колоїдним золотом (US-A-6,475,805). За винятком методики Tetrasensor™, у решті відомих на сьогодні випадків необхідно хімічно модифікувати розпізнаючу молекулу для отримання забарвленого комплексу. Для цього молекулу, що розпізнає, необхідно виділити в чистому вигляді і потім модифікувати деякі із заступників на її поверхні, ризикуючи при цьому небажаним чином змінити і такі важливі властивості, як функціональність або стійкість. [0027] Таким чином, в більшості відомих на сьогодні випадках, як правило, неможливо працю 91359 10 вати з неочищеними екстрактами, або з рецепторами, не модифікованими хімічно. [0028] В той же час, тип мічення, якого використовують при аналізі "тетрацикліну", не сумісний з аналізом -лактамів, оскільки в останньому випадку у всіх відомих методиках в "контрольній" зоні імобілізується імуноглобулін. У документі WO99/67416 білком для заякорювання конкурента в "тестовій" зоні також служить імуноглобулін. Застосування білка А, як при аналізі тетрацикліну, неминуче викликало б неспецифічне фарбування однієї або обох ліній зв'язування, необхідних для виявлення b-лактамів. [0029] По-друге, якщо потрібно буде використати комбінації авідин-біотин для полегшення закріплення на підкладці або мічення, така комбінація авідин-біотин може використовуватися в даному конкретному методі для одного специфічного розпізнавання. Насправді, якщо авідин є точкою прикріплення, то всі біотиніловані молекули зможуть на ньому закріпитися. В цьому випадку, зрозуміло, неможливо створити випробувальну систему для сумісного виявлення -лактамів і тетрацикліну, на основі, наприклад, об'єднання аналітичних принципів, описаних в документах WO-A99/67416 і WO-A-03/048770. Насправді, в першому випадку рецептор біотинілований, і потім його мітить кон'югат антитіл проти біотину з золотом, а в другому випадку авідин імобілізований для захоплення біотинілованого фрагменту ДНК. Об'єднання цих двох принципів приведе і до конфлікту між двома незалежними системами, в яких застосовуються комбінації авідин-біотин. При об'єднанні двох існуючих систем біотинілований рецептор системи визначення b-лактамів закріпився б на авідині, необхідному для виділення ДНК із тетрациклінової системи і, як наслідок, з'явився б причиною неспецифічного мічення, незалежного від вмісту в пробі тетрацикліну. Понад це, присутність в рухомій фазі комплексу антитіл проти біотину з золотом перешкодило б біотинілованій ДНК зв'язуватися з авідином, необхідним для її захоплення, що привело б до додаткового конфлікту. [0030] По-третє, об'єднання двох незалежних систем зажадало б досить складної системи реєстрації і оцінки результату, де б кожна з міток оцінювалася б на основі відношення інтенсивності мітки до інтенсивності внутрішнього контролю. Відповідно, при цьому повинні бути присутніми дві тестові смуги ("бета" і "тетра") і дві "контрольні" смуги. Така аналітична методика непроста і непрактична. При об'єднанні двох тестових систем було б зручніше оцінювати інтенсивність кожної відповіді шляхом порівняння між собою. В такому випадку "тестова зона" для аналізованої речовини №1 стала б "контрольною" зоною для аналізованої речовини №2 і навпаки. В тому випадку, якщо б обидва класи аналізуємих речовин одночасно були присутні в одній і тій же пробі, при такому підході система не давала б взагалі або майже не давала б сигналу. Таке зустрічається рідко, проте якщо зустрічається, то щоб уникнути утруднення в оцінці результату при подвійному забрудненні як bлактамами, так і тетрацикліном, слід було б передбачити додатковий контроль у вигляді однієї 11 єдиної контрольної лінії, що дозволяє простіше визначати відносну інтенсивність обох тестових сигналів. Очевидно, що ця контрольна лінія стає необхідною в тому випадку, якщо один і той же аналітичний спосіб об'єднує більше двох тестових систем. [0031] По-четверте, матеріали, спеціально і переважно вибрані для того, щоб формувати з них діагностичну смужку діагностичного набору, повинні бути сумісні з проведенням одночасного аналізу двох класів речовин. Насправді, в переважному варіанті здійснення, описаному WO99/67416, рекомендується використовувати мембрану типу "Leukosorb®", яка несумісна з підходом, який пропонують автори винаходу для виявлення тетрацикліну, що не відповідає потребам полівалентного аналізу. Насправді, що дуже дивно, в складі, де обидва рецептори виявляються за допомогою відповідних антитіл, неможливо одержати точної межі розділу при додаванні лактамів, оскільки реагенти зустрічаються з мембраною Leukosorb®, перш ніж досягнуть ділянки зв'язування. Ця мембрана, ефективність якої показана для очищення молока і при використанні в тестових системах з радіальним розтіканням, є причиною неспецифічних відповідей, коли виявлення аналізуємих речовин проводиться за допомогою антитіл і білка А, міченого колоїдним золотом. [0032] По-п'яте, важливий вибір рецепторів, що використовуються для розпізнавання сукупності сполук кожного з класів. Цей вибір визначається не тільки з міркувань розпізнавання сполук, але і з міркувань стійкості, структури, антигенної реактивності, амінокислотного складу і т.п. [0033] Отже, апріорі представляється неможливим, виходячи з відомих способів, об'єднати в одному способі дві або більше незалежних тестових системи, наприклад, для виявлення за допомогою рецепторів -лактамів і тетрацикліну, не стикаючись з необхідністю істотних змін, що дозволяють об'єднати всі необхідні елементи, при тому, щоб система виявлення однієї сполуки не впливала б небажаним чином на систему виявлення іншої сполуки. Цілі винаходу [0034] Метою даного винаходу є створення нового діагностичного способу, що дозволяє одночасно виявляти сукупність - теоретично необмежену - сполуки, які можуть належати, щонайменше, до двох різних класів речовин, і визначати клас, до якого належить виявлена сполука. [0035] Зокрема, метою даного винаходу є демонстрація технічної і практичної можливості об'єднання в рамках одного способу, щонайменше, двох різних механізмів детекції, так, щоб при цьому робота якого-небудь з цих механізмів не впливала б небажаним чином на роботу іншого механізму. [0036] Додатковою метою даного винаходу є демонстрація технічного здійснення полівалентного аналізу, який міг би здійснюватися швидко, наприклад, менше ніж за 30 хвилин, в одну стадію і за допомогою однієї проби. 91359 12 [0037] Додатковою метою даного винаходу є створення способу і набору для діагностики in vitro, що служать одночасно для виявлення і кількісного визначення, щонайменше, двох класів аналізуємих речовин. Основні ознаки винаходу [0038] Перша мета даного винаходу, згідно п.п. 1, 3, 4 і 10 формули винаходу, відноситься до діагностичного набору для одночасного і специфічного виявлення або кількісного визначення, щонайменше, двох аналізуємих речовин, що належать до різних класів антибіотиків, а саме, щонайменше, до двох класів, вибраних з лактамів, тетрацикліну і сульфамідів, який відрізняється тим, що він в загальному випадку включає, наприклад: - по-перше, єдину реакційну суміш, переважно, у вигляді розчину або ліофілізату, що містить, щонайменше, дві різні біологічні молекули, кожна з яких здатна розпізнати, відповідно, одночасно і специфічно, конкретна аналізована речовина, присутня в пробі, яка може містити речовини, що належать до вищезазначених різних класів; - і, по-друге, регенераційну систему у вигляді єдиної твердої підкладки, на якій в різних відомих положеннях в просторі закріплені відповідні ліганди, здатні специфічно, вибірково і виключно регенерувати кожний з нащо називаються різновидів біологічних молекул, що містяться в названій реакційній суміші, так щоб за місцем закріплення останніх на вказаній підкладці можна було б визначити клас, до якого належить кожна з аналізуємих речовин, присутніх в пробі. [0039] У кожному конкретному випадку або імобілізований регенераційний елемент є конкурентним аналогом речовини, що виявляється, а рецептор, що знаходиться в розчині, є міченим, або конкурентний аналог, що знаходиться в розчині, є міченим, а імобілізованим регенераційним елементом є рецептор. Згідно даного винаходу, також можуть співіснувати змішані системи. [0040] Переважні варіанти здійснення даного винаходу описані в залежних пп. 2, 5-9 і 11-12. [0041] Інша мета винаходу, згідно в п. 13 формули винаходу, відноситься до способу застосування діагностичного набору, що відповідає будьякому з п.п. з 1 по 12, який відрізняється наявністю наступних етапів: - вищезазначену реакційну суміш приводять в контакт з пробою, яку потрібно класифікувати, з отриманням розчину, який витримують при температурі від 30 до 50°С протягом від 3 до 15 хвилин; - в одержаний розчин занурюють діагностичну смужку, що несе вищезазначену регенераційну систему, і витримують протягом від 3 до 15 хвилин; - результат, одержаний на діагностичній смужці, оцінюють або візуально, або за допомогою оптичного пристрою, що прочитує зображення із смужок. [0042] У переважних втіленнях даного винаходу рекомендується уникати, з однієї сторони, очищення, а з іншого боку, хімічної модифікації рецептора, наприклад, шляхом використання антитіл проти рецептора, мічених або безпосередньо ко 13 лоїдним золотом, або, переважно, білком А, кон'югованим з колоїдним золотом. З іншого боку, в рамках концепції множинності речовин, що виявляються, білок А, мічений колоїдним золотом, міг би служити загальною міткою для всіх антитіл, внесених до розчину. [0043] Одним із принципів, вживаних з метою якнайкращого збереження функціональних можливостей рецепторів і антитіл, використовуваних в даному винаході, є те, що мічення за допомогою хімічних модифікацій не відбувається. Отже, даний винахід задіює бактерійні рецептори в їхньому можливо більш природному стані. Ці рецептори мітять за допомогою антитіл, які, у свою чергу, розпізнаються білком А, кон'югованним з колоїдним золотом. У такому разі, виключно маркуючий білок пов'язаний з золотом, а не чутливі молекули, що служать для розпізнавання аналізуємих речовин. [0044] При такому підході зберігаються всі функціональні угрупування чутливих молекул, що розпізнають. Ця перевага використовується в повному об'ємі, коли потрібно задіювати активність рецепторів, механізм розпізнавання яких залежить від деяких бічних ланцюгів, таких, наприклад, як залишки лізину. Це тим більше важливо, що коли має місце хімічна модифікація, ця модифікація, в більшості описаних випадків, зачіпає групи NН3+ бічних ланцюгів лізину. Отже, хімічне зшивання по лізину може вивести з ладу залишки лізину в активному центрі і, таким чином, частково інактивувати препарат. [0045] Мічення за допомогою антитіл характеризується гнучкістю нефіксованого мічення. Насправді, хімічне мічення задіює необоротний ковалентний зв'язок, тоді як прикріплення антитіл є оборотним і знаходиться в рівновазі, яка може бути зміщене під впливом діючих на нього сил. Іншою перевагою є можливість видозмінювати етап мічення на другій стадії. Насправді, тільки після фази розпізнавання аналізованої речовини рецептором, будь то вільна аналізована речовина у складі проби або речовина, імобілізована для регенерації, рецептор розпізнається антитілами. [0046] Виходячи з різних міркувань, пов'язаних з ціною і стабільністю, а також унаслідок довершеної інтеграції в полівалентну тестову систему, згідно даного винаходу переважно рекомендується використання рецептора -лактаму, виділеного з Staphylococcus aureus (6). [0047] Насправді, цей рецептор, що походить з бактерійного штаму, найбільш ефективного відносно боротьби з антибіотиками і, зокрема, з лактамом, будучи випробуваний in vitro, проявив виняткові властивості відносно розпізнавання всіх -лактамів, як пеніцилінів, так і цефалоспоринів (див. посилання (6) і результати, приведені в прикладі). [0048] Інша перевага цього рецептора полягає в тому, що він має лужну ізоелектричну точку (рI). Це дає можливість легко виділити його в чистому вигляді з неочищеного клітинного екстракту для отримання антитіл до нього. [0049] До того ж вибір авторів даного винаходу був обумовлений і дуже хорошою імунною реакці 91359 14 єю у кролика, який був дуже специфічним і не викликав якої-небудь неспецифічної відповіді у присутності решти реагентів, використовуваних в полівалентному аналізі. [0050] Відповідно до даного винаходу був успішно розроблений спосіб, при якому можливо об'єднати в одну операцію всі елементи, необхідні для сумісного виявлення безлічі сполук різних класів із застосуванням абсолютно різних механізмів розпізнавання. [0051] Даний винахід додатково володіє тією перевагою, що пропонує достовірну і економічну полівалентну тестову систему. Насправді, відсутня необхідність очищення рецепторів або препаратів антитіл, крім цього рецептори не піддаються хімічним модифікаціям, що повинно приводити до збереження їх реакційної здатності, а також їх стабільності. Короткий опис фігур [0052] На Фіг.1 схематично представлений приклад розташування регенераційних елементів, відповідних даному винаходу, на твердій нітроцелюлозній підкладці у разі одночасного аналізу тільки двох антибіотиків, при якому також присутня імобілізована контрольна зона. [0053] На Фіг.2 схематично представлений приклад розташування регенераційних елементів, відповідних даному винаходу, на твердій нітроцелюлозній підкладці у разі одночасного аналізу тетрацикліну, -лактамів і сульфамідів, при якому також присутня імобілізована контрольна зона. Опис переважних перевтілень винаходу Попереднє зауваження [0054] Як відмічено в "Рівні техніки", конкурентна тестова система, запропонована відповідно до даного винаходу, може, зокрема, бути представлена в двох різних форматах. У першому випадку (формат 1) з колоїдними частинками золота кон'юговані рецептори, а сполуки-конкуренти, аналоги шуканої речовини, виступають як регенераційний елемент, будучи імобілізованими в зоні специфічного зв'язування. У іншому випадку (формат 2) з колоїдними частинками золота кон'юговані сполуки-конкуренти, аналоги шуканої речовини, як регенераційний елемент виступають рецептори, будучи імобілізованими в зоні специфічного зв'язування. В деяких випадках полівалентного аналізу система може бути і змішаною (присутні формат 1 і формат 2). Приклад 1. Одночасний аналізтетрациклінів і ( -лактамів за допомогою специфічних рецепторів (формат 1 для обох визначень) [0055] У цьому способі використовують реакційну суміш, що містить обидва рецептори, відповідні -лактамам і тетрациклінам, а також реагенти до них і регенераційний елемент, на якому імобілізовані у визначених і різних ділянках специфічні ліганди до цих рецепторів. Приготування реакційної суміші [0056] Реакційна суміш для виявлення лактами містить специфічний рецептор, що розпізнає -лактами, специфічні антитіла до нього і препарат білка А, кон'югованого з колоїдним золотом. Для виявлення тетрацикліну реакційна суміш містить рецептор тетрацикліну, специфічні антиті 15 ла до нього, специфічний фрагмент ДНК, кон'югований з біотином, і препаратом білка А, кон'югованого з колоїдним золотом. [0057] Рецептор -лактамів одержують способом, описаним у Големі-Котра та ін.(6). Неочищений препарат, що містить рецептор, фільтрують через мембрану Millex HV (Millipore, Іnс, USA) і зберігають при 4°С у присутності 50% гліцерину (об/об). Рецептор тетрацикліну одержують способом, описаним в патентній заявці WO-A-03/048770. [0058] Обидва препарати антитіл одержують способом, описаним у Кахаб та ін.(7). Ці препарати антитіл одержували шляхом ін'єкції препарату рецептора, очищеного до білкової гомогенності згідно Големі-Котра та ін.(6) у разі рецептора лактамів і згідно заявки WO-A-03/048770 у разі рецептора тетрацикліну. Обидва препарати антитіл переважно використовують в неочищеному вигляді, що означає, що неочищену сироватку безпосередньо додають в реакційну суміш. Відповідно до іншого переважного втілення, специфічні антитіла поліклонального або моноклонального типу піддають очищенню способами, відомими фахівцям, для здійснення надалі їх кон'югування безпосередньо або небезпосередньо з колоїдними частинками золота способом Френса(8). [0059] Фрагмент ДНК беруть в компанії Eurogentec SA (Бельгія), послідовність і приготування описані в патентній заявці WO-A-03/048770. У цьому конкретному випадку фрагмент ДНК не імобілізують в зоні зв'язування на нітроцелюлозній мембрані, а безпосередньо включають до реакційної суміші. Цей фрагмент буде регенерований в ході випробування завдяки своєму біотинілованому кінцю на авідині, імобілізованому в зоні зв'язування (див. далі). [0060] Сукупність необхідних реагентів вносять без якої-небудь хімічної модифікації або заміщення, з метою збереження всіх властивостей активності і стабільності. Ці молекули можуть бути очищеними або неочищеними, що представляє очевидну економічну перевагу. [0061] У цьому конкретному прикладі реакційна суміш містить: 5 частин рецептора -лактаму (RSA) в концентрації 360 нМ; 5 частин рецептора тетрацикліну (TetR) в концентрації 4,2 мкМ; 1 частину сироватки проти RSA, розведенням в 4 рази в буфері NaPi 50 мМ, NaCl 150 мМ, pH 7,8; 1 частину сироватки проти TetR, розведенням в 4 рази в тому ж самому буфері; 1 частину нуклеїнової кислоти в концентрації 25 мкМ в NaCl 690 мМ; 15 частин комплексу білку А з 40 нм колоїдним золотом з OD =10 при 520 нм; 22 частини буфера Hepes 120 мМ, рН 8, БСА 2%, декстран 1%, сахароза 5%. Цю суміш або готують перед вживанням, або ліофілізують протягом 20 год. Регенераційна система [0062] Регенераційна система складається з нітроцелюлозної мембрани, на якій в різних місцях закріплені елементи, здатні утворити комплекс з 91359 16 молекулами реакційної суміші, які розпізнають. Такими елементами є: - для сигналу "бета" ( -лактами) - антибіотик, переважно типу пеніциліну або цефалоспорину, імобілізований на молекулі, що не проявляє ніякої певної активності відносно білка А, біотину або авідину. У переважному втіленні даного винаходу використовують ампіцилін, імобілізований на лактоглобуліні; - для сигналу "тетра" (тетрациклін) - авідин, здатний розпізнавати фрагмент ДНК, що несе на кінці молекулу біотин. Переважно використовують авідин яєчного білку. [0063] Зони зв'язування "бета" і "тетра" можуть розташовуватися послідовно, одна перед одною, або навпаки, без особливих переваг відносно того або іншого розташування, достатньо, щоб вони розташовувалися в рознесених у просторі і притому відомих зонах. Фактично, саме роздільне розташування дозволить далі виявити тип антибіотика, присутнього в аналізованому розчині. Якби обидві системи зв'язування розташовувалися в одному і тому ж місці, це не вплинуло б на аналітичний процес, проте при цьому не було б можливим визначити, який тип сполук присутній у випробовуваному зразку. Приготування -лактоглобуліну, кон'югованного з ампіциліном [0064] Був вибраний -лактоглобулін, оскільки він є молочним білком, який містить багато лізінових залишків (10%), і в ньому тривимірна структура показує, що більшість залишків лізіну звернені бічними аміногрупами назовні (Pubmed, структура, 1GXA). [0065] 100 міліграм -лактоглобуліну і 15 міліграм 2-імінотіолану витримують в Na-фосфатному буфері, рН 8,5, в реакційному об'ємі 4 мл протягом 60 хв. при 25°С. Далі суміш наносять на колонку PD10 (Amersham-Biosciences, Великобританія), заздалегідь урівноважену ФБР (фосфатним буферним розчином) рН 7, ЕДТК (етилендиамінтетраоцтовою кислотою) 5мМ і яка елююється тим же буфером. Білкові фракції збирають добре відомими способами. [0066] Крім цього, 2 мл ДМСО (диметилсульфоксиду), що містять 100 міліграм SICC, витримують з 2 мл розчину натрієвої солі ампіциліну (50 міліграм/мл) в буфері NaPi 25 мМ, рН 8, протягом 60 хв. при 25°С, після чого суміш витримують у присутності 50 міліграм білкового розчину протягом 4 год. при 4°С, і нарешті, розчин діалізують двічі по 6 годин в 100 об'ємів буферу NaPi 25 мМ, рН 7,5. Приготування розчину нейтралізованого авідину. [0067] Розчин 5 міліграм/мл авідину яєчного білку, що виробляється компанією Pierce Inc (США), готують на буфері NaPi 50 мМ, рН 7,5. Приготування контрольного розчину БСАзолото [0068] Згідно даному винаходу рекомендується використання контрольної лінії, що має постійну інтенсивність фарбування, видиму до і після проведення випробування. Переважно ця лінія має 17 91359 колір, схожий з фарбуванням, що виявляється на тестових лініях, і її готують, як описано нижче. [0069] До 27 мл препарату 40 нм колоїдного золота, одержаного способом Френча (8), оптична щільність (optical density) якого OD max складає 3, додають 3 мл 10% розчину БСА (бичачого сироваткового альбуміну) (Sigma) на 10 мМ зворотному буфері, рН 6,5. Суміш витримують 60 хв. при 20°С, а потім центрифугують 45 хв. при 10000 об/хв. у роторі SS34 (Sorvall). Осад потім розводять в буфері NaPi 50 мМ, NaCl 150 мМ до досягнення OD max = 45. Розчин, який буде нанесений на нітроцелюлозну мембрану, додатково розводять в 15 разів тим же буфером до досягнення кінцевої ODmax = 3. Імунохроматографічна процедура [0070] Імунохроматографічна процедура відома і описана в літературі (Developing Immunochromatographic Test Strips: A short Guide, Millipore, Lit. No. TB500 Printed in USA 11/96, 96204). В рамках даного винаходу препарати, одержані вище, наносять на конкретні окремі зони нітроцелюлозної мембрани, переважно послідовно один за іншим в напрямку руху ліганду. Далі нітроцелюлозну мембрану одним кінцем приводять в зіткнення з мембраною, наприклад, типу 142, компанією Ahlstrom, Inc, що випускається. (США), або типу GFDVA (Whatman, Великобританія), але не типу Leukosorb® (Pall, Великобританія), а іншим кінцем - з яким-небудь фільтрувальним папером, наприклад, типу 17CHR (Whatman, Великобританія). Нанесення регенераційних елементів на нітроцелюлозну підкладку [0071] Саме розташування регенераційних елементів дозволить розпізнати тип небажаної домішки, виявленої в пробі. Розчини наносять "розподільником" Biodot (Великобританія) з розрахунку 1 пл/см. 18 [0072] У разі виявлення двох параметрів препарати -лактоглобуліну і авідину наносять у різні сторони від контрольної лінії. Наприклад, приготовлений, як описано вище, кон'югат лактоглобуліну наносять під контрольною лінією, а розчин нейтралізованого авідину - над контрольною лінією (Фіг. 1). Відповідно, наявність сполуки -лактаму виявиться у відсутності мічення на лактоглобуліні, тобто на тестовій лінії, розташованій під контрольною лінією, а присутність тетрацикліну виявиться у відсутності мічення на тестовій лінії, розташованій над контрольною лінією. У випадку якщо в пробі в достатній кількості присутні обидва класи речовин, ні з одного боку від контрольної лінії сигнал не з'явиться (див. Фіг. 1). Одночасне визначення -лактамів і тетрациклінів в зразку молока [0073] 200 мкл холодного молока витримують при 50°С у присутності 50 мкл реактивів, приготовлених і/або ліофілізованих, як описано вище. З хвилини опісля описаний вище регенераційний елемент занурюють в розчин. Остаточну оцінку результату проводять після трихвилинної інкубації за допомогою оптичного пристрою, що прочитує результат із смужок, що випускається компанією Matest (Німеччина). [0074] Результати приведені в Таблиці 1. Спосіб дозволяє вважати позитивною пробу молока, що містить 4 частин на мільйон ампіциліну або 75 частин на мільйон тетрацикліну. [0075] У таблиці 2 приведені межі виявлення даним способом різних -лактамів тетрацикліну. Взагалі кажучи, коли відношення інтенсивності тестових сигналів до контролю менше або рівне 1, проба розглядається як позитивна за відповідним параметром (сполукою). Таблиця 1 Абсолютні і відносні значення інтенсивності сигналу, виміряні в зонах зв’язування Концентрація антибіотику (частини на мільйон) Ампі 0 + Тетра 0 Ампі 1 Ампі 2 Ампі 3 Ампі 4 Ампі 5 Ампі 10 Ампі 0 + Тетра 25 Ампі0 + Тетра 50 Ампі 0 + Тетра 75 Ампі 0 + Тетра 100 Ампі 0 + Тетра 75 Інтенсивність. Зона B (*) Відношення B/C Іінтенсивність. Зона Т Відношення Т/C 520 380 250 155 105 55 25 505 521 523 508 122 2.5 1.9 1.2 0.8 0.5 0.3 0.1 2.5 2.5 2.6 2.6 0.6 410 380 405 408 386 397 414 340 288 162 55 165 2.0 1.9 1.9 2.0 1.9 2.0 2.1 1.7 1.4 0.8 0.3 0.8 Інтенсивність. Контрольна зона 208 199 211 205 201 197 200 206 206 203 199 202 19 91359 20 Таблиця 2 Межі виявлення Антибіотик МRL/EC (частин на мільйон) бензилпеніцилін ампіцилін амоксицилін клоксациклін цефапірин цефтіофур тетрациклін окситетрациклін хлортетрациклін доксициклін 4 4 4 30 60 100 100 100 100 100 Безпечний ріКонцентрація вень/США (частин на міль(частин на мільйон) йон) 5 2 10 4 10 4 10 10 20 8 50 10 300 75 300 50 300 50 300 20 Приклад 2. Одночасне виявлення тетрацикліну, -лактамів і сульфамідів (формат 1 для трьох випробувань) [0076] У цьому переважному втіленні в даний спосіб додатково до двох рецепторів тетрацикліну і -лактамів включають специфічні антитіла, що розпізнають сульфадиметоксини. Приготування реакційної суміші [0077] У вищенаведену суміш додатково включені антитіла проти сульфадиметоксину відповідно до наступного протоколу: 5 частин рецептора -лактаму (RSA) в концентрації 360 нМ; 5 частин рецептора тетрацикліну (TetR) в концентрації 4,2 мкМ; 1 частину сироватки проти RSA, розведенням в 4 рази в буфері NaPi 50 мМ, NaCl 150 мМ, рН7,8; 1 частину сироватки проти TetR, розведенням в 4 рази в тому ж самому буфері; 1 частину сироватки проти сульфадиметоксину, розведенням в 2 рази в тому ж самому буфері 1 частину нуклеїнової кислоти в концентрації 50 мкМ 20 частин комплексу білка А з 40 нм золотом з OD = 10 при 520 нм; 16 частин буфера Hepes 120 мМ, рН 8, БСА 2%, декстран 1%, сахароза 5%. Цю суміш або готують перед вживанням, або ліофілізують протягом 20 год. Регенераційна система [0078] Регенераційна система аналогічна такій з Прикладу 1, куди включена четверта лінія, що специфічно зв'язує молекули антитіл проти сульфадиметоксину (3-а тестова лінія). Решта зон зв'язування ті ж, що в Прикладі 1, але розташовані інакше, відповідно до Фіг. 2. Приготування БСА, кон'югованого з сульфадиметоксином [0079] Приготування здійснюють відповідно до протоколу, описаного у Діксон-Холланд і Катц (9). 100 міліграм сульфадиметоксину і 200 міліграм БСА розчиняють в 25 мл суміші, що містить 2 частини 50 мМ фосфатного буферу рН 7,2 і 1 частини діоксану, витримують у присутності 120 мл 25% Відношення інтенсивності параметр/контрольна зона 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.5 0.8 0.8 0.8 0.8 глутарового альдегіду протягом 3 годин при перемішуванні при 25°С. Потім розчин діалізують 6 днів при 4°С в 100 об'ємах буфера NaPi 50 мМ, рН 7,2 із зміною буфера кожні 12 годин. Нанесення регенераційних елементів на нітроцелюлозну підкладку [0080] У разі визначення трьох параметрів лінії зв'язування розташовують в конкретних окремих зонах нітроцелюлозної мембрани, переважно послідовно, одну за іншою у напрямі руху рідини. Відповідно до переважного втілення, зони зв'язування -лактаму, тетрацикліну, сульфадиметоксину і контрольна зона розташовані, відповідно, на першому, на другому, на третьому і, нарешті, на четвертому рівні у напрямку руху рідини (Фіг. 2). Одна єдина зона служить контролем для всіх трьох маркерів. Інше розташування зон, як і в попередньому прикладі, полягає у включенні двох контрольних зон, тобто по одній контрольній зоні після першої і після другої тестових зон. [0081] Слід зазначити, що відповідно до даного винаходу загальним правилом є те, що тестові і контрольні лінії не обов'язково повинні бути неодмінно розташовані в одному і тому ж порядку у напрямку руху рідини. Так, діагностичний набір працює однаково добре, або в порядку «бета тетра» розташовані лінії або ж в порядку «тетрабета», «бета-суьфа» або ж «сульфа-бета» (див. приклад нижче), «бета-тетра-сульфа» або ж «сульфа-тетра-бета» і т.п. Одночасне визначення -лактамів, тетрацикліну і сульфадиметоксинів в зразку молока [0082] 200 мкл холодного молока витримують при 50°С у присутності 50 мкл реактивів, приготовлених і/або ліофілізованих, як описано вище. Після інкубації протягом 3 хв. при 50°С у розчин занурюють регенераційний елемент, приготовлений, як описано вище. Остаточну оцінку проводять після закінчення трихвилинної витримки за допомогою оптичного пристрою для прочитування зі смужок (Matest, Німеччина). [0083] Отримані результати приведені в Таблиці 3. Спосіб дозволяє вважати позитивною пробу молока, яка містить 4 частин на мільйон ампі 21 91359 циліну і/або 45 частин на мільйон тетрацикліну і/або 100 частин на мільйон сульфадиметоксину. [0084] У таблиці 4 приведені межі виявлення різних -лактамів, тетрацикліну і сульфадиметоксину способом за даним винаходом. Взагалі кажу 22 чи, коли відношення інтенсивності тестових сигналів до контролю менше або рівне 1, пробу розглядають як позитивну за відповідним параметром (сполукою). Таблиця 3 Відношення виміряних інтенсивностей Концентрація антибіотика (частин на мільйон) А(*) Т s 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 10 0 0 0 25 0 0 50 0 0 75 0 0 100 0 0 0 50 0 0 100 0 0 150 0 0 200 4 75 100 Відношення інтенсивностей В/С Т/С S/C 2.5 2.0 1.9 1.9 1.9 1.7 1.2 1.9 2.1 0.8 2.0 2.2 0.5 1.9 2.0 0.3 2.0 2.0 0.1 2.1 1.9 2.5 2.7 1.9 2.5 1.4 2.2 2.6 0.8 2.0 2.6 0.3 1.8 2.4 1.9 1.3 2.2 1.9 0.8 1.9 2.1 0.6 2.4 2.1 0.4 0.6 0.8 0.7 (*)А: ампіцилін; Т: тетрациклін Бхульфамид; С: контроль Таблиця 4 Межі виявлення Антибіотик Бензилпеніцилін Ампіцилін Амоксицилін Клоксациклін Цефапірин Цефтіофур Тетрациклін Окситетрациклін Хлортетрациклін Доксициклін Сульфадиметоксин Гранична виявлена концентрація (частин на мільйон) 2 4 4 10 8 10 75 50 50 20 100 Приклад 3. Одночасне виявлення -лактамів і сульфамідів (формат 1 для -лактамів і формату 2 для сульфамідів) Приготування реакційної суміші [0085] Реакційна суміш містить: 5 частин рецептора -лактамів (RSA) в концентрації 360 нМ; 10 частин моноклональних антитіл проти RSA, мічених колоїдним золотом (OD=10 при 520 нм); 1 частину біотинілованих анитіл проти сульфадиметоксину, розведених в NaPi 50 мМ, NaCl 150 мМ, pН7,8; 10 частин комплексу БСА з сульфадиметоксином і 40 нм колоїдним золотом; Відношення тест/контроль 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.5 0.8 0.9 0.7 0.6 0.8 24 частини буфера Hepes 120 мМ, рН 8, БСА 2%, декстран 1%, сахароза 5%. Цю суміш або готують перед вживанням, або ліофилізують протягом 20 годин. Біотинілування антитіл проти сульфадиметоксину [0086] 825 мкл розчину, що містить 5 міліграм/мл антитіл проти сульфадиметоксину, діалізованих в 100 мМ карбонатного буферу з рН 9,2, витримують у присутності 165 мкл розчину біотинLC-NHS в концентрації 1,5 міліграм/мл (Perbio, Іnс) протягом 2 годин при 25°С в темноті. Реакція зупиняється додаванням 10 мкл буфера 1М трис рН 8 на 30 хвилин з подальшим діалізом 2 рази по 10 23 91359 годин проти буферу NaPi 50 мМ, NaCl 150 мМ, рН 7,8. Приготування комплексу БСА з сульфадиметоксином, кон 'югованного з частинками золота [0087] Препарат комплексу БСА з сульфадиметоксином, описаний в прикладі 2, використовують для кон'югування з частинками колоїдного золота за прописом, аналогічному тому, який описаний в прикладі 1, для приготування контрольного розчину комплексу БСА із золотом. Регенераційна система [0088] Регенераційна система аналогічна описаній в прикладі 1, проте в даному випадку на аві 24 дині, імобілізованому в другій зоні зв'язування (над контрольною зоною), імобілізують біотинвловані антитіла проти сульфаміду. Одночасне визначення -лактамів і сульфадиметоксину в пробі молока [0089] 200 мкл холодного молока витримують 15хв. при 30°С у присутності 50 мкл реагентів, приготовлених, як описано вище. Після цього в розчин занурюють регенераційний елемент, приготовлений, як описано вище. Остаточну оцінку проводять після додаткової 15-хі плинної витримки. Результати приведені в Таблиці 5. Таблиця 5 Вішення виміряних інтенсивностей концентрація антибіотика (частин на мільйон) В(*) S 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 10 0 0 0 0 50 0 200 0 150 0 200 4 100 відношення інтенсивностей В/С S/C 2 3 1.5 2.8 1.2 2.9 0.95 3 0.8 3.1 0.65 3.1 0.35 2.9 2 2.9 1.95 2 1.9 2 2.2 0.85 2.1 0.7 0.84 0.95 (*) В: -лактам; S: сульфамід; С: контроль Приклад 4. Одночасне визначення тетрацикліну і сульфамідів (формат 2 для обох визначень). Приготування реакційної суміші [0090] Реакційна суміш містить : 5 частин рецептора тетрацикліну (TetR) в концентрації 4,2 мкМ; 1 частину мишачих моноклональних антитіл проти TetR, розведених в буфері NaPi 50 мМ, NаСl 150мМ, рН 7,8; 1 частину кролячих антитіл проти сульфаміду, розведених в тому ж буфері; 10 частин розчину комплексу БСА з сульфадиметоксином і 40 нм золотом; 1 частину біотинілованої нуклеїнової кислоти в концентрації 50 мкМ; 10 частин комплексу 40 нм антитіл проти біотину із золотом (ОД=10 при 520 нм); 22 частини буфера Hepes 120 мМ, рН 8, БСА 2%, декстран 1%, сахароза 5%. Цю суміш або готують перед вживанням, або ліофілізують протягом 20 годин. Регенераційна система [0091] Регенераційна система аналогічна опису в прикладі 1, проте в даному випадку першу зону зв’язування, де будуть імобілізовані моноклональні антитіла проти TetR, складають антитіла проти миші, а другу зону зв’язування, де будуть імобілізовані антитіла проти сульфаміду, складають антитіла курчати проти кролика. Одночасне визначення тетрацикліну і сульфамідів в пробі м’яса [0092] До 10 г свинячого м’яза додають 30 мл буфера NaPi 50 мМ, рН 8, і одержану суміш подрібнюють за допомогою блендера MiniMix (Interscience, Франція) протягом 2 хв. Потім суміш, поміщену в побирку типу Еппендорф, піддають дії центрифуги протягом 1 хв. При 6000 об/хв., надосадкову рідину збирають. 200 мкл надосадкової рідини інкубують 15 хв. При 25 °С у присутності 50 мкл реагентів, приготовлених, як описано вище. Потім в одержаний розчин на 15 хв. занурюють вищезгаданий регенераційний елемент, після чого проводяться остаточну оцінку результатів. Результати приведені в Таблиці 6. 25 91359 26 Таблиця 6 Відношення виміряних інтенсивностей концентрація антибіотика (частин на мільйон) Т(*) s 0 0 25 0 50 0 75 0 100 0 200 0 0 0 0 50 0 200 0 150 0 200 100 100 Відношення інтенсивностей Т/С S/C 3.2 2.1 2.5 2.2 1.6 2.2 1.1 2.1 0.5 2 0 1.9 3.2 2.2 3.4 1.6 3.1 1 3.4 0.85 3 0.7 0.4 0.95 (*) Т : тетрациклін; S : сульфамід; С : контроль Приклад 5. Одночасне визначення -лактамів, тетрацикліну і сульфамідів (формат 1 і для лактамів і тетрацикліну, і формату 2 для сульфамідів) Приготування реакційної суміші [0093] Реакційна суміш містить: 5 частин рецептора -лактамів (RSA) в концентрації 360 нМ; 1 частину мишачих моноклональних антитіл проти RSA, розведених буфером NaPi 50 мМ, NаСl 150мМ, рН7,8; 5 частин рецептора тетрацикліну (tetR) в концентрації 4,2 мкМ; 1 частину мишачих моноклональних антитіл проти TetR, розведених буфером NaPi 50 мМ, NaCl 150мМ, рН7,8; 1 частину біотинілованої нуклеїнової кислоти в концентрації 50 мкМ; 1 частину кролячих поліклональних антитіл проти сульфаміду, розведених буфером NaPi 50 мМ, NаСl 150мМ, рН7,8; 5 частин 40 нМ розведення комплексу БСА з сульфадиметоксином і золотом; 13 частин протимишачих антитіл, кон'югованих з 40 нм колоїдним золотом (ОД=10 при 520 нм); 16 частин буферу Hepes 12 0 мМ, рН 8, БСА 2%, декстран 1%, сахароза 5%. Цю суміш або готують перед вживанням, або ліофілізують протягом 20 годин. [0094] У іншому переважному варіанті і моноклональні антитіла проти RSA, і моноклональні антитіла проти TetR безпосередньо кон'югують з колоїдним золотом. Регенераційна система [0095] Регенераційна система аналогічна описаній в прикладі 1, проте в даному випадку першу зону зв'язування, де буде імобілізований рецептор RSA, утворює комплекс лактоглобуліну ампіциліном, в другій зоні зв'язування, де буде імобілізований рецептор TetR, знаходиться авідин, а третю зону зв'язування, де будуть імобілізовані кролячі антитіла проти сульфаміду, складають антитіла курчати проти кролика. 25 Одночасне визначення -лактамів, тетрациклінів і сульфамідів в зразку молока [0096] 200 мкл холодного молока витримують протягом 15 хв. при 30°С у присутності 50 мкл реактивів, приготовлених, як описано вище. Потім в розчин занурюють регенераційний елемент, приготовлений, як описано вище, і витримують 15 хвилин, після чого проводять і остаточну оцінку результатів. Результати приведені в Таблиці 7. 27 91359 28 Таблиця 7 Відношення виміряних інтенсивностей концентрація антибіотика (частини на мільйон) В(*) Т s 0 0 0 2 0 0 4 0 0 10 0 0 0 50 0 0 200 0 0 0 50 0 0 100 0 0 200 4 100 100 Відношення інтенсивностей В/С Т/С S/C 2 3 1.8 1.3 2.7 1.8 0.9 2.7 1.7 0.5 2.8 1.9 1.9 1.4 1.9 2 0.6 2 2.1 2.8 1.3 1.8 2.7 0.9 1.8 3 0.3 0.95 0.7 0.8 (*) В: β-лактамів; Т: тетрациклін; S: сульфамід; С: контроль Література (1) Директива Ради ЄС 96/23/ЕС, від 29 квітня 1996, про заходи з визначення деяких речовин і їхніх залишків в живих тваринах і в продуктах тваринництва, яка відміняє Директиви 85/358/СЕЕ і 86/469/СЕЕ і Рішення 89/187/СЕЕ і 91/664/СЕЕ. (2) Регламент Ради Європейського Економічного Співтовариства №2377/90 від 26 червня 1990, що встановлює для Європейського Економічного Співтовариства порядок визначення максимальних рівнів залишкового вмісту в продуктах ветеринарної медицини і харчових продуктах тваринного походження. (3) Off. J. Eur. Comm. 2002 L221/8 - 2002/657/СЕ. (4) Hisao Oka, Chemical Analysis for Antibiotics Used in Agriculture, by AOAC INTERNATIONAL, 1995, ISBN 0-935584-57-9. (5) Ron Verheijen et al, Analyst 123 (1998), 24372441. (6) Golemi-Kotra, D. et al, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 278 n° 20 (May 2003), pp. 18419-18425. (7) Kachab, E.H. et al, The Journal of Immunology Methods, Vol 147 n°1 (1992), pp. 33-41. (8) Frens, G., Nature (London), Phys. Sci., 241 (1973), 20. (9) Dixon-Holland, D.E. et Katz, S.E, (1988), J. Assoc. Off. Anal. Chem. (1988) 71 (6), 1137-40. 29 Комп’ютерна верстка В. Мацело 91359 Підписне 30 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethod for simultaneous reveal and identification of antibiotics of different classes in vitro and corresponding diagnostic kit
Автори англійськоюGranier Benois
Назва патенту російськоюСпособ одновременного выявления и идентификации антибиотиков разных классов in vitro и соответствующий диагностический набор
Автори російськоюГраниер Бенуа
МПК / Мітки
МПК: G01N 33/558
Мітки: відповідний, різних, діагностичний, ідентифікації, набір, спосіб, vitro, одночасного, виявлення, класів, антибіотиків
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/15-91359-sposib-odnochasnogo-viyavlennya-jj-identifikaci-antibiotikiv-riznikh-klasiv-in-vitro-i-vidpovidnijj-diagnostichnijj-nabir.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб одночасного виявлення й ідентифікації антибіотиків різних класів in vitro і відповідний діагностичний набір</a>
Попередній патент: Контейнер для рослин, що заповнюється водою, і спосіб переробки контейнера на відходи
Наступний патент: Анаеробний очисний пристрій і спосіб його експлуатації
Випадковий патент: Класифікатор для пневморозділення полідисперсних сумішей