Діагностичний набір “трихінела-скрін” для ідентифікації личинкової стадії trichinella spiralis в м’язовій тканині тварини

Винахід відноситься до ветеринарної медицини, а саме до ідентифікації личинкової стадії Trichinella spiralis в м'язовій тканині тварини способом перетравлення проб м'язів у штучному шлунковому соку (ШШС). Біохімічний спосіб (спосіб перетравлення) являє собою достатньо поширений спосіб. Для його реалізації використовується обладнання стандартної ветеринарної лабораторії. Необхідний ШШС готують безпосередньо перед проведенням дослідження проб м'язів тварини. При цьому кожний раз проводять відмірування необхідної кількості компонентів для ШШС (пепсин, соляна кислота необхідної концентрації) [1]. В залежності від якості пепсину та соляної кислоти, суб'єктивного бажання дослідників прискорити процес перетравлення м'язів, співвідношення складових частин ШШС може непрограмовано змінюватися, що впливає на відтворюваність результатів діагностичних досліджень. В основу винаходу поставлено задачу розробити діагностичний набір ідентифікації личинкової Trichinella spiralis в м'язовій тканині тварини шляхом використання речовин з контрольованими параметрами, що дозволило б підвищити надійність виявлення личинки Trichinella spiralis. Поставлена задача вирішується у діагностичному наборі "Трихінела-скрін" ідентифікації личинкової стадії Trichinella spiralis в м'язовій тканині тварини, відповідно до винаходу, має першу та другу комплектацію, при цьому до першої комплектації входять фасований у пакет або в ампулу, або у флакон пепсин таблетований або в порошку вагою (П1), в грамах, розрахованою за формулою: П1 = 2500/Ап ± 10%, де Ап - значення активності використованого пепсину в U/мг, фасовану в ампулу або у флакон соляну кислоту об'ємом (K1 HCl), в мл, розрахованим за формулою: V1 НСl = 73000/(К2 HCl + 200К HCl) ± 10%, де К HCl - концентрація соляної кислоти в %, та специфічний барвник об'ємом 0,2 - 10,0мл в ампулі або у флаконі, а до другої комплектації входять фасований у пакет або в ампулу, або у флакон пепсин таблетований або в порошку вагою (П10), в грамах, розрахованою за формулою: П10 = 25000/Ап ± 10%, де Ап - значення активності використованого пепсину в U/мг, фасовану в ампулу або у флакон соляну кислоту об'ємом (К 10HCl), в мл, розрахованим за формулою: V 10HCl = 730000/(K2 HCl + 200К HCl) ± 10%, де К HCl - концентрація соляної кислоти в %, та специфічний барвник об'ємом 2,0 - 100,0мл в ампулі або у флаконі. Набір "Трихінела - скрін" дозволяє підвищити діагностичну ефективність методу перетравлення м'язів в ШШС з метою виявлення личинкової стадії Trichinella spiralis. Перевагами запропонованого набору є: контроль активності та якості пепсину, контроль оптимальної концентрації соляної кислоти, та забезпечення контрольованого використання, при проведені досліджень, співвідношення між собою пепсину, соляної кислоти, специфічного барвника, що призводить до покращення якості перетравлення проб м'язів та проведення діагностики. Специфічний барвник вибірково фарбує личинкову стадію Trichinella spiralis і дозволяє диференціювати останню від інших паразитів та морфологічних утворень, які мають зовнішню схожість з личинкою паразита. Це дозволяє суттєво знизити кількість помилок та хибнопозитивних результатів дослідження. Як специфічний барвник застосовані розчини сафроніна, або метиленового синього, або амідо чорного, або генціанвіолета, або фуксина. Пепсин це фермент тваринного походження. В залежності від виду тварини, з якої його виробляють та способу його отримання пепсин може мати різноманітний вид (колір, розмір часток порошку та активність). Пепсин може поставлятися з активністю 20 - 4000U/мг. Знайдена залежність кількості пепсину П1 = 2500/Ап ± 10% (для приготування 1л загального об'єму) та П10 = 48000/Ап ± 10% (для приготування 10л загального об'єму) від активності пепсину Ап. Також знайдена залежність кількості соляної кислоти V 1HCl = 73000/(К2 HCl + 200К HCl) ± 10% (для приготування 1л загального об'єму) та V 10HCl = 730000/(К2 HCl + 200К HCl) ± 10% (для приготування 10л загального об'єму ) від концентрації соляної кислоти К HCl. Заявлений набір реалізується слідуючим чином. Набір випускається в двох варіантах: Варіант № 1 (на 1л загального об'єму) складається з: Пепсину таблетованого або в порошку фасованого у пакет або в ампулу, або у флакон вагою (П1 ), в грамах, розрахованою за формулою: П1 = 2500/Ап ± 10%, де Ап - значення активності використованого пепсину в U/мг - 1 шт; Соляної кислоти об'ємом (V 1HCl), в мл, розрахованим за формулою: V 1НСІ = 73000/(К2 HCl + 200К HCl) ± 10%, де К HCl - концентрація соляної кислоти в %, фасована в ампулу або у флакон - 1 шт; Специфічний барвник об'ємом 0,2 - 10,0мл в ампулі або у флаконі - 1 шт. Варіант 2 (на 10л загального об'єму) складається з: Пепсину таблетованого або в порошку фасованого у пакет або в ампулу, або у флакон вагою (П10), в грамах, розрахованою за формулою: П10 = 25000/Ап ± 10%, де Ап - значення активності використованого пепсину в U/мг - 1 шт; Соляної кислоти об'ємом (V 10HCl), в мл, розрахованим за формулою: V 10HCl = 730000/(К2 HCl + 200К HCl) і 10%, де К HCl - концентрація соляної кислоти в %, фасована в ампулу або у флакон - 1 шт; Специфічний барвник об'ємом 2,0 - 100,0мл в ампулі або у флаконі - 1шт. Набори пакують в картонні коробки за ГОСТ 12301 з розподільними перегородками, щоб забезпечити нерухомість та збереження флаконів. В кожну коробку вкладають настанову по застосуванню. Коробки з наборами пакують у ящики за ГОСТ 10131. У кожну коробку (ящик), вкладають пакувальний аркуш, на якому вказують: найменування підприємства-виготовлювача, найменування системи, її кількість у коробці (ящику), номер серії, номер контролю, термін придатності (придатний до: (місяць, рік)), умови зберігання, дату пакування, прізвище або номер пакувальника. Не допускається заморожування набору. Необхідне обладнання та реактиви що не поставляються у наборі: мікроскоп; магнітна мішалка з підігрівачем; капронове сито з діаметром вічок 400мкм; чашки Петрі або предметні скельця; тепла водопровідна вода (37 - 62°С); м'ясорубка; хімічний стакан з плоским дном ємкісною 2 літри; мірна лійка з краником; скляні піпетки; Перед початком роботи компоненти набору необхідно витримати при температурі від 18 до 22°С протягом 30 хвилин. Проведення аналізу при використані варіанту набору № 1. Від 50 свинячих туш відбирають 50 проб м'язів ніжок діафрагми, від кожної із проб беруть по 1г м'язів, звільнених від жиру, фасцій, крові, роблять фарш, який поміщають у 2-літровий хімічний стакан з плоским дном. В стакан з 1л теплої водопровідної води (37 - 62°С), при перемішуванні висипають, наприклад, з пакета 4,2г пепсину з активністю 600U/мг та додають розчин соляної кислоти, наприклад з ампули, що містить її, наприклад, 9,8мл з концентрацією 32%. Отриманий штучний шлунковий сік виливають в стакан із фаршем та ставлять на магнітну мішалку з підігрівом. Перетравлення проводять при температурі 37 - 62°С протягом 0,3 - 1,0 год. Одержаний перевар фільтрують через капронове сито, яке зафіксоване у лійці з краником. Фільтрат в лійці відстоюють 30 хв., відбирають 40мл осаду у мірний стаканчик, який знову відстоюють 10 хв., 30мл надосадової рідини обережно зливають або відбирають піпеткою, а в решту фільтрату додають, наприклад. З ампули специфічний барвник, наприклад розчин сапрофіну або розчин метиленового синього, або розчин амидо чорного, або розчин генціанвіолета, або розчин фуксина, наприклад, 0,2 - 10,0мл в залежності від використуючого специфічного барвника, витримують 5 хвилин і виливають у бактеріологічну чашку і досліджують під малим збільшенням мікроскопа. Якщо личинки мають місце в збірній пробі, то вони фарбуються від специфічного барвника у відповідний до використованого барвника колір. Джерела інформації: 1. Методические указания по лабораторной диагностики трихинеллеза животных, Утв. Департаментом ветеринарии РФ, № 13-7-2/1428 от 28.10.98г.