Олігонуклеотидні кон’югати, виготовлені з комплексів металів та олігонуклеотидів, спосіб виявлення структури-мішені, спосіб неінвазивної діагностики захворювань, діагностичний набір

1 Олигонуклеотидный конъюгат, состоящий из олигонуклеотидного радикала N и п заместителей (В-К), в которых В обозначает непосредственную связь или связующий компонент с олигонуклеотидным радикалом, и К обозначает комплексообразующий агент или комплекс изотопов радиоактивного металла или стабильных изотопов, которые - становятся радиоактивными под воздействием внешнего облучения, - превращают внешнее облучение в облучение различной природы, различной энергии и/или различной длины волны элементов с атомными номерами 5, 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 или 85, отличающийся тем, что олигонуклеотидный радикал N содержит модификацию, которая препятствует или, по крайней мере, ингибирует деградацию встречающимися в природе нуклеазами, и в которых олигонуклеотид связывается специфически с высоким связывающим сродством со структурой-мишенью 2 Конъюгат по п 1, отличающийся тем, что имеет общую формулу (I) N- (В-К)п (I) в которой N представляет собой олигонуклеотид, который связывается специфически с высоким МЕТАЛІВ ТА НЕІНВАЗИВНОЇ связывающим сродством с другими структурамимишенями и имеет модификации, которые существенно понижают деградацию встречающимися в природе нуклеазами, В представляет собой химическую связь или связующий компонент, который образует связь между N и К, и К представляет собой комплексообразующий лиганд, который может проявлять себя как сигналпередающий или терапевтический активный элемент, и п является числом от 1 до 10 3 Конъюгат по пп 1 или 2, отличающийся тем, что N представляет собой олигонуклеотид с 5-200 нуклеотидами, где а) 2'-положение сахаридного звена, независимо друг от друга, занято следующими группами группой -OR, в которой R представляет алкильный радикал с 1-20 углеродными атомами, который произвольно содержит до 2 гидроксильных групп и который произвольно прерывается 1-5 атомами кислорода, атом водорода, гидроксильную группу, атом фтора, аминный радикал, аминогруппу и гидроксильные группы, расположенные в концевых положениях 3' и 5, независимо друг от друга, произвольно этерифицированы радикалом R и/или b) фосфодиэфиры, которые необязательно используются в качестве межнуклеотидной связи, независимо друг от друга, замещены фосфортиоатами, фосфордитиоатами и/или алкилфосфонатами, предпочтительно метилфосфонатом, и/или c) концевые радикалы в 3'- и 5-положениях связаны внутримолекулярным способом один с другим при помощи межнуклеотидной связи, как описано в Ь), и/или d) он содержит межнуклеотидную связь, как описано в Ь), которая связывает З'-З'- или 5'-5'положения, и/или e) он содержит фосфодиэфирную связь, описанную в Ь), которая соединяет, подобно сложноэфирной, два тимидина, соответственно, при по q О 00 48140 мощи С2-С10 гидроксиалкильного радикала в 3положении или соединяет аналогично замещенный тимидиновый радикал, подобно сложноэфирной, с гидроксильной группой другого сахара в 2'-, или 3-, или 5'-положении, и/или f) концевые радикалы в 3'- и 5'-положениях содержат межнуклеотидные связи, произвольно модифицированные, как описано в Ь) 4 Конъюгат по п 3, отличающийся тем, что олигонуклеотид N включает от 15 до 100 нуклеотидов 5 Конъюгат по одному из пп 1-4,отличающийся тем, что N представляет олигонуклеотид, который связан специфически с высоким связывающим сродством с другими структурами-мишенями и который может быть получен тем, что смесь олигонуклеотидов, содержащую случайные последовательности, вводят вместе со структуроймишенью, и некоторые олигонуклеотиды проявляют повышенное сродство со структуроймишенью относительно смеси олигонуклеотидов, последние отделяют от остатка смеси олигонуклеотидов, затем олигонуклеотиды с повышенным сродством к структуре-мишени амплифицируют с получением смеси олигонуклеотидов, которая содержит повышенную часть олигонуклеотидов, которые связаны со структурами-мишенями 6 Конъюгат по одному из пп 1-5, отличающийся тем, что N представляет собой олигонуклеотид, который связан специфически с высоким связывающим сродством с другими структурамимишенями и который получают следующим образом a) сначала получают ДНК-цепь путем химического синтеза так, что ДНК-цепь содержит определенную последовательность на 3' -конце, которая комплементарна промотору для РНК-полимеразы и в то же время комплементарна праймеру полимеразной цепной реакции (PCR) так, что эта ДНКцепь содержит определенную ДНК последовательность на 5'-конце, которая комплементарна праймерной последовательности для полимеразной цепной реакции, и эта последовательность между определенными последовательностями содержит случайную последовательность, b) эту ДНК-цепь транскрибируют в комплементарную РНК-цепь с помощью РНК-полимеразы, при этом полимеразе предлагаются нуклеотиды, которые модифицированы в 2-положении рибозного звена, c) РНК-олигонуклеотиды, полученные таким путем, вводят вместе со структурой-мишенью, с которой олигонуклеотид должен быть специфически связан, d) те олигонуклеотиды, которые связаны со структурой-мишенью, отделяют сначала вместе со структурой-мишенью от несвязавшихся нуклеотидов, и затем связанные нуклеотиды снова отделяют от структуры-мишени, e) эти структура-мишень-специфические РНКолигонуклеотиды транскрибируют с помощью обратной транскриптазы в комплементарную ДНКцепь, f) эти ДНК-цепи амплифицируют полимеразноцепной реакцией с использованием определенных праймерных последовательностей, д) ДНК-олигонуклеотиды, амплифицированные таким путем, затем подвергают транскрибированию снова с помощью РНК-полимеразы и модифицированных нуклеотидов в РНК- олигонуклеотиды, п) вышеупомянутые стадии отбора с)-д) произвольно повторяют до тех пор, пока олигонуклеотиды, которые отличаются высоким связывающим сродством к структуре-мишени, не будут достаточно отобраны, и тогда последовательности полученных таким образом олигонуклеотидов произвольно могут быть определены 7 Конъюгат по п 6, отличающийся тем, что структуру-мишень выбирают среди макромолекул, тканевых структур высших организмов, таких как животные или люди, органы или части органов животного или человека, клетки, опухолевые клетки или опухоли 8 Конъюгат по одному из пп 1-7, отличающийся тем, что соединяющий(е) компонент(ы) В связан (ы) a) с 4'-концом олигонуклеотидного радикала N, урезанным в 4-положении на СН -ОН группу, и/или b) с З'-концом олигонуклеотидного радикала N, уменьшенным в 3-положении на атом водорода, и/или c) с фосфодиэфирным мостиком(ами), уменьшенным^) на ОН группу(ы), каждый между двумя нуклеотидами, и/или d) с 1-10 основанием (ями) нуклеиновой кислоты, которое(ые) уменьшены на атом водорода, соответственно, в 5-, 8-положении (ях) и/или на аминогруппу(ы) в 2-, 4- и 6-положении (ях) 9 Конъюгат по п 8, отличающийся тем, что В, который связан с 4-концом олигонуклеотидного радикала N, урезанным в 4-положении на СН -ОН группу или с З'-концом олигонуклеотидного радикала N, уменьшенным в 3-положении на атом водорода, в котором В имеет общую формулу X-YZ1, который соединен со стороны X с комплексообразующим агентом или комплексом и со стороны Z - с олигонуклеотидом, в котором X представляет собой простую связь, -NH или -S группу, Y представляет собой неразветвленную цепь, разветвленную цепь, насыщенную или ненасыщенную Сі -С20 алкиленовую цепь, которая произвольно содержит 1-2 циклогексилена, 1-5 имино, 1-3 фенилена, 1-3 фениленимино, 1-3 фениленокси, 1-3 гидроксифенилена, 1-5 амидо, 1-2 гидразидо, 1-5 карбонила, 1-5 этиленокси, уреидо, тиоуреидо, 1 -2 карбоксиалкилимино, 1 -2 сложноэфирные группы, 1-3 группы Аг, где Аг обозначает насыщенное или ненасыщенное 5- или 6членное кольцо, которое произвольно содержит 12 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы и/или 1-2 карбонильные группы, 1-10 кислородов, 1-5 азотов и/или 1-5 атомов серы, и/или произвольно замещена 1-5 гидрокси, 1-2 меркапто, 1 -5 оксо, 1 -5 тиоксо, 1 -3 карбокси, 1 -5 карбоксиСгС4-алкильными, 1-5 сложноэфирными, 1-3 амино, 1-3 гидрокси-СгС4-алкильными, 1-3 Сі -С7 алкокси группами и Z1 представляет собой -CONH-CH2-4', -NH-CO-4', O-P(O)R1-NH-CH2-4', -O-P(O)R1-O-CH2-4, -ОP(S)R -О-З' или -O-P(O)R1 -О-З', в котором 4' или 3' указывает связь с концевым сахаридным зве 48140 ном(ями) и R1 представляет собой О, S, C1-C4 алкильную или NR R3 группу, причем R2 и R3 означают водород или С1-С4 алкильные радикалы 10 Конъюгат по п 8, отличающийся тем, что В, который связан с фосфодиэфирным мостиком (ами), уменьшенным на ОН группу (ы), каждый между двумя нуклеотидами, имеет обычную формулу X-Y-Z2, который соединен со стороной X с комплексообразующим агентом или комплексом и со стороны Z с олигонуклеотидом, в котором Z2 в мостике, связывающем два соседних сахаридных звена, О 2 2 -P-O-S' О и/или Z2-Р-О-5' I О 3' представляют собой группу -NR2-, -О- или -S-, X представляет собой непосредственную связь, NH или -S группу, Y представляет собой неразветвленную цепь, разветвленную цепь, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкиленовую цепь, которая произвольно содержит 1-2 циклогексилена, 1-5 имино, 1-3 фенилена, 1-3 фениленимино, 1-3 фениленокси, 1-3 гидроксифенилена, 1-5 амидо, 1-2 гидразидо, 1-5 карбонилов, 1-5 этиленокси, уреидо, тиоуреидо, 1 -2 карбоксиалкилимино, 1 -2 сложноэфирные группы, 1-3 группы Аг, где Аг обозначает насыщенное или ненасыщенное 5- или 6членное кольцо, которое произвольно содержит 12 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы и/или 1-2 карбонильные группы, 1-10 кислородов, 1-5 азотов и/или 1-5 атомов серы, и/или произвольно замещена 1-5 гидрокси, 1-2 меркапто, 1 -5 оксо, 1 -5 тиоксо, 1 -3 карбокси, 1 -5 карбоксиСгС4-алкильными, 1-5 сложноэфирными, 1-3 амино, 1 -3 гидрокси-Сі-С4-алкильной, 1 -3 С1-С7алкокси группами, и R2 представляет собой водород или С1-С4 алкильные радикалы 11 Конъюгат по п 8, отличающийся тем, что В, который связан с 1-10 основанием(ями) нуклеиновой кислоты, которое(ые) уменьшено на атом водорода, соответственно, в 5-, 8-положении (ях) и/или на амино группу(ы) в 2-, 4- и 6положении(ях), имеет общую формулу X-Y-Z3, в которой Z 3 обозначает -NH группу или непосредственную связь с нуклеоснованием, X представляет собой непосредственную связь, NH или -S группу, Y представляет собой неразветвленную цепь, разветвленную цепь, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 алкиленовую цепь, которая произвольно содержит 1-2 циклогексилена, 1-5 имино, 1-3 фенилена, 1-3 фениленимино, 1-3 фениленокси, 1-3 гидроксифенилена, 1-5 амидо, 1-2 гидрозидо, 1-5 карбонила, 1-5 этиленокси, уреидо, тиоуреидо, 1 -2 карбоксиалкилимино, 1 -2 сложноэфирные группы, 1-3 группы Аг, где Аг обозначает насыщенное или ненасыщенное 5- или 6членное кольцо, которое произвольно содержит 12 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы и/или 1-2 карбонильные группы, 1-10 кислородов, 1-5 азотов и/или 1-5 атомов серы, и/или произвольно замещена 1-5 гидрокси, 1-2 меркапто, 1 -5 оксо, 1 -5 тиоксо, 1 -3 карбокси, 1 -5 карбоксиСі С4-алкильными, 1-5 сложноэфирными, 1-3 амино, 1-3 гидрокси-СгС4-алкильными, 1-3 С1-С7алкоксигруппами 12 Конъюгат по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что комплекс металла, в качестве визуализирующего элемента, содержит радиоактивный изотоп, выбранный из элементов медь, висмут, технеций, рений или индий 13 Конъюгат по одному из пп 1-12, отличающийся тем, что предназначен для использования в радиодиагностике и/или в радиотерапии 14 Конъюгат по одному из пп 1-4, отличающийся тем, что N представляет собой не встречающийся в природе олигонуклеотидный лиганд, имеющий специфическое связывающее сродство к молекуле-мишени, причем такая молекула-мишень имеет трехмерную химическую структуру, другую, чем полинуклеотид, которая связывается с указанным олигонуклеотидным лигандом по механизму, который преимущественно зависит от спаривания оснований Уотсон/Крика или тройного спирального связывания, где указанный олигонуклеотидный лиганд не является нуклеиновой кислотой, имеющей известную физиологическую функцию, будучи связанным молекулой мишенью 15 Способ обнаружения структуры-мишени, в котором одно или более из соединений по любому из пп 1-12 вводят вместе с образцом, подлежащим исследованию in vivo или in vitro, и основанный на сигнале, с помощью которого определяют, присутствует ли в образце структура-мишень, с которой олигонуклеотид N связывается специфически с высоким связывающим сродством 16 Способ неинвазивной диагностики заболеваний, в котором одно или более из соединений по одному из пп 1-12 вводят вместе со структуроймишенью, подлежащей изучению in vivo, и основанный на сигнале, с помощью которого определяют, присутствует ли структура-мишень, с которой олигонуклеотид N связывается специфически и с высоким связывающим сродством, в организме, подлежащем изучению 17 Диагностический набор для in vivo и/или in vitro определения структур-мишеней, отличающийся тем, что диагностический набор содержит, по крайней мере, одно соединение по одному из пп 1-12 48140 Это изобретение относится к конъюгатам олигонуклеотидов, которые содержат комплексообразующий агент или комплекс Эти конъюгаты используют в областях диагностики и лечения Визуальная диагностика достигла большого прогресса за последние десятилетия и продолжает непрерывно развиваться Сегодня возможно сделать видимой сосудистую систему, большинство органов и многие ткани в живом организме без особого вмешательства Во многих случаях диагностику заболевания проводят по изменениям формы, размера и положения анатомических структур в теле Такие анатомические данные о состоянии внутренних органов тела можно получить с помощью рентгеновской техники, ультразвуковой диагностики и магнитной резонансной томографии Эффективность каждой из упомянутых техник может быть повышена путем использования фармацевтических средств для повышения естественного контраста тканей и жидкостей тела на получающейся картине Фармацевтические средства, о которых идет речь, вводят в полости тела или инъецируют в кровеносные сосуды с целью контрастного изменения полостей или сосудов Кроме того, они распространяются с помощью кровотока в организме и могут изменять видимость органов и тканей В исключительных случаях, такие вещества связываются с определенными структурами в теле и/или активно транспортируются и/или экскретируются (выделяются) последними Таким путем, в индивидуальных случаях функции могут быть также сделаны видимыми и могут быть использованы для диагностики заболеваний В противоположность этому, ядерная диагностика основана на веществах, которые могут сами по себе делаться видимыми В этом случае радиоактивные изотопы, которые излучают радиацию в большом диапазоне, вводят в организм Распространение этих веществ в организме можно проследить с помощью подходящих детекторов Преимущество ядерного медицинского способа заключается в высокой эффективности при низкой дозе посылающих сигнал радиоактивных веществ, обозначаемых как радиофармацевтические средства Если используют изотопы, которые выделяют а- или [3-излучение или другие токсичные продукты разложения, эффективные в ткани, то радиофармацевтические средства могут быть также использованы для терапевтических целей, например, для деструкции опухолей Такого же эффекта можно достигнуть тем, что неопасные изотопы или вещества вводят в организм и превращают только там путем, например, облучения нейтронами или рентгеновскими лучами, ультразвуком или радиоволнами, в терапевтически эффективную форму Общая проблема заключается в диагностике и локализации патологических изменений за имеющееся в распоряжении время, при котором нет ясных изменений формы, строения и кровообращения в органах и тканях, о которых идет речь Такая диагностика и постоянное наблюдение имеет важное значение, например, в случае опухолевых заболеваний, включая поиск метастаз, оценку дефицита снабжения тканей кислородом, и в случае некоторых инфекций, и также метаболических заболеваний В настоящее время имеющиеся терапевтические и визуализирующие диагностические методы значительно зависят от доступности фармацевтических препаратов, которые аккумулируются в местах патологических нарушений, которые невозможно определить другим путем Контрастными средами, коммерчески доступными в данное время, преимущественно являются так называемые неспецифические препараты Они пассивно распространяются в пространствах, в которые их вводят, например, путем инъекции В прошлом были идентифицированы многие вещества и классы веществ, которые могут проявлять специфичность или, как можно предположить, имеют специфичность в отношении их распространения в живом организме Таким примерами, помимо антител, пектинов, являются все типы рецептор-связанных веществ, клетки, мембраны и компоненты мембран, нуклеиновые кислоты, природные метаболиты и их производные, а также большое количество фармацевтических веществ Пептиды изучались и также подлежат исследованию с особым вниманием В Пат США №4707352 рассматривается специальный способ маркировки комплексообразующих молекул радиоактивными изотопами, но не описаны приемлемые комплексообразующие агенты для связывания ионов металла В ЕР-А-0285057 раскрываются конъюгатынуклеотидкомплексообразующий агент, которые не пригодны из-за in vivo нестабильности используемых нуклеотидов в качестве in vivo диагностических или терапевтических средств и которые, кроме того, с трудом удовлетворяют другим требованиям совместимости и фармакокинетики Во многих патентах США, таких как, например, Пат США 4707440, речь идет о модифицированных полимерах, которые имеют определенную химическую группу Полимеры могут представлять собой полинуклеотиды и олигонуклеотиды, но они ни стабилизированы против деградации встречающимися в природе нуклеазами, ни отобраны специальным способом, для этого их специфически связывают с высоким связующим сродством со структурами-мишенями Конкретные варианты воплощения этих детектируемых молекул упоминаются в Пат США №2843122 и 4943523 Индивидуальный нуклеотид, модифицированный таким путем, заявлен в Пат США №4952685 Использование этих средств в способах визуализации раскрывается в Пат США 4849208 Целью данного изобретения является получение специфически связывающихся диагностических средств для обнаружения структур-мишеней, с помощью которых, например, становится возможным визуализация органов, тканей и их пато 48140 10 логических изменений in vitro и in vivo b) фосфодизфиры, которые необязательно используются в качестве межнуклеотидной связи, Найдено, что эта цель может быть достигнута независимо друг от друга, замешены фосфортиопри помощи конъюгатов нуклеотидов, которые атами, фосфордитиоатами, и/или алкилфосфонапомимо олигонуклеотид ного радикала, имеют тами, предпочтительно метил фосфонатом, и/или комплексообразующий агент, связанный непосредственно или с помощью связующего компоc) концевые радикалы в 3'- и 5'-положениях нента, и чей олиго-нуклеотидный радикал модисвязаны внутримолекулярно один с другим при фицирован так, чтобы предотвратить или, по помощи межнуклеотидной связи, как описано в Ь) крайней мере, значительно ингибировать деграи/или дацию встречающимися в природе нуклеазами d) он содержит межнуклеотидную связь, как описано в Ь), которая связывает З'-З'- или 5'-5'Целью изобретения являются положение и/или 1 Конъюгаты олигонуклеотидов, состоящие из олигонуклеотидного радикала N и п заместителей e) он содержит фосфодиэфирную связь, опи(В-К), в которых В обозначает непосредственную санную в Ь), которая соединяет, подобно сложносвязь или соединяющий компонент с олигонуклеоэфирной, два тимидина при помощи С2-С20 гидротидным радикалом, и К означает комплексообраксиалкильного радикала соответственно в 3зующий агент или комплекс радиоактивных изотоположении или соединяет аналогично замещенпов металла, или стабильных изотопов, которые ный тимидиновый радикал, подобно сложноэфирной, с гидроксильной группой другого сахара в 2' - превращаются в радиоактивные изотопы при или 3'- или 5'-положении и/или помощи внешнего облучения, - превращают внешнее облучение в облучеf) концевые радикалы в 3'- и 5'-положениях ние различного качества, различного энергетичесодержат межнуклеотидные связи, произвольно ского содержания и/или различной длины волны, модифицированные как описано в Ь) элементов под атомными номерами 5, 21 - 29, 31, 4 Соединение по п 3, в котором олигонуклео39, 42 - 44, 49, 57 - 33 или 85, при этом олигонуктид N включает от 15 до 100 нуклеотидов леотид ный радикал N представляет модифика5 Соединение по п п 1 - 4, в котором N являцию, которая предотвращает или, по крайней меется олигонуклеотидом с высоким связующим ре, значительно ингибирует деградацию сродством, который специфически связывается со имеющимися в природе нуклеазами структурами-мишенями с высоким связующим сродством, и который может быть получен тем, 2 В предпочтительном варианте воплощения, что смесь олиго-нуклеотидов, содержащую статиконъюгаты олигонуклеотидов данного изобретестические последовательности, вводят вместе со ния имеют общую формулу (1) структурой-мишенью, и некоторые олигонуклеотиN-(B-K)n(1) ды проявляют повышенное сродство к структурев которой N представляет олигонуклеотид мишени относительно смеси олигонуклеотидов, с высоким связующим сродством, который специпоследний отделяют от остатка олигонуклеотидфически связывается со структурами-мишенями, и ной смеси, затем олигонуклеотиды с повышенным имеет модификации, которые значительно понисродством к структуре-мишени амплифицируют, жают деградацию встречающимися в природе чтобы получить смесь олигонуклеотидов, которая нуклеазами, имеет большое количество олигонуклеотидов, В есть химическая связь или соединяющий которые связываются на структурах-мишенях компонент, который обеспечивает связь между N и К, и 6 Соединения, описанные в п п 1 - 5, в которых N есть олигонуклеотид с высоким связующим К есть комплексообразуюший лиганд, который сродством, который специфически связывается со может содержать посылающий-сигнал или тераструктурами-мишенями, и которые могут быть попевтически активный элемент, и лучены тем, что п - целое число от 1 до 10 3 Соединение по п п 1 или 2, в котором N a) сначала путем химического синтеза полупредставляет олигонуклеотид с от 5 до 200 нукчают ДНК цепь, так что на З'-конце эта ДНК цепь леотидами, в котором содержит определенную последовательность, которая комплементарна промотору для РНКа) 2'-положение сахаридного звена, независиполимеразы и в то же самое время комплеменмо одно от другого, занято следующими группами тарна праймеру по-лимеразно-цепьевой реакции группа OR, в которой (PCR), и так что эта ДНК цепь содержит опредеR означает алкильный радикал с 1 до 20 углеленную последовательность на 5'-конце, которая родными атомами, который произвольно содержит комплементарна праймерной последовательности вплоть до 2 гидроксильных групп, и который продля полимеразно-цепьевой реакции, и последоваизвольно прерывается 1 - 5 кислородными атомательность между данными определенными послеми довательностями содержит статистическую поатом водорода, следовательность, гидроксильная группа, атом фтора, b) ДНК цепь транскрибируют в комплементарную РНК цепь с помощью РНК-полимеразы, и нукаминовый радикал, леотиды предлагаются полимеразе, которые моаминовая группа, дифицированы в 2-положении рибозного звена, и гидроксильные группы, присутствующие в концевых положениях 3' и 5', независимо одна от c) РНК олигонуклеотиды, полученные таким другой, произвольно этерифицированы радикалом путем, вводят вместе со структурой-мишенью, с R и/или которой олигонуклеотид должен быть специфиче 48140 12 11 ски связан, и тем, что и/или 1 - 2 карбонильные группы, 1 - 1 0 атомов кислорода, 1 - 5 атомов азота и/или 1 - 5 атомов d) те олигонуклеотиды, которые связаны со серы, и/или произвольно замещена 1 - 5 гидрокси, структурой-мишенью, отделяют сначала вместе со 1 - 2 меркапто, 1 - 5 оксо, 1 - 5тиоксо, 1 - 3 карбокструктурой-мишенью от несвязывающихся нукси, 1 - 5 карбокси-Сі-С4 алкильными, 1 - 5 сложнолеотидов, и затем связанные нуклеотиды снова эфирными, 1 - 3 амино, 1 - 3 гидрокси-Сі-С4 алотделяют от структуры-мишени, и тем, что кильными, 1 - З С1-С7 алкокси группами, и e) эти структура-мишень-специфические РНК 1 1 олигонуклеотиды подвергают транскрибированию Z обозначает -CONH-CH2-4', -NH-CO-4 , -Ос помощью обратной транскриптазы в комплеменP(O)R'-NH-CH2-4', -O-P(O)R'-O-CH2-4', -O-P(S)R'-Oтарную ДНК цепь, и тем, что 3', или -O-P(O)R'-O-3', где 4' или 3' указывают на связь с концевым сахарид-ным звеном(ями) и R' f) эти ДНК цепи амплифицирую полимеразно2 3 обозначает О-, S-, Сі-Сє алкильную или NR R цепной реакцией с использованием определенных 2 3 группу, причем R и R обозначают водород и d праймерных последовательностей, и тем, что С4 алкильные радикалы д) ДНК олигонуклеотиды, амплифированные таким путем, затем подвергают транскрибироваВ качестве циклических структур (Аг), особеннию снова с помощью РНК-полимеразы и модино пригодными являются циклические насыщенфицированных нуклеотидов в РНКные или ненасыщенные алкилены с 3 до 6, осоолигонуклеотиды, и тем, что бенно 5 или 6 с атомами, которые произвольно содержат гетероатоми, такие как N, S или О В п) вышеупомянутые стадии отбора с) - д) прокачестве примеров могут быть упомянуты циклоизвольно повторяют до тех пор, пока олигонуклеопентилен-, пирролилен-, фуранилен-, тиофенитиды, которые отличаются высоким связывающим лен-, имидазолилен-, тиазолилен-, пиразолилен-, сродством к структуре-мишени, не будут достапиррол ид илен-, пиридилен-, пиримидилен-, маточно отобраны, и тогда последовательности полеинимидилен- и фталимидиленовые группы лученного таким путем олигонуклеотида произвольно могут быть способными к определению 10 Соединение по п 8с), в котором В имеет общую формулу X-Y-Z2, который связан по X сто7 Соединение по п 6, в котором структуруроне с комплексообразующим агентом или коммишень выбирают среди макромолекул, тканевых плексом и по Z стороне с олигонуклеотидом, в структур высших организмов, таких как животные котором или люди, органы или части органов животного или человека, клетки, опухолевые клетки или опуZ2, в мостике, связывающем два соседних сахоли харидных звена, 8 Соединение по п п 1 - 7 , в котором соединяющий компонент(ы) В связан (связаны) a) с 4'-концом олигонуклеотидного радикала N, и/ ил и уменьшенном в 4'-положении на СНг-ОН группу и/или b) с З'-концом олигонуклеотидного радикала N, уменьшенном в З'-положении на атом водорода и/или обозначает группу -NH2-, -О- или -S-, и X, Y и c) с фосфодиэфирным мостиком(ами), R2 имеют значения, указанные в пункте 9 уменьшенным на ОН группу(ы), каждый между В качестве радикала Y, соединяющего комподвумя нуклеотидами и/или нента Z1-Y-X (согласно п 9) или Z2-Y-X (согласно d) с 1 до 10 нуклеоснованием(ями), котоп 10), можно упомянуть в качестве примеров рарое(ые) уменьшено на атом водорода, соответстдикалы венно, в 5-, 3-положении(ях) и/или на амино группу(ы) в 2-, 4- и 6-положении(ях) -CH -, 9 Соединение по п п 8а) или 8Ь), в котором В -iCHj) -EiH-CS-HK-C H,-CH,-, -(СКііг-Ш-СО-СН,-, -tCK^-b-H-CO-OVCHj-, -tCHj),-, -98% радиоактивности взято конъюгатом Пример 6 a) Конъюгат 5'-(6-амино-1 -гексил-фосфорная кислота сложный эфир) 35-мерного олигонуклеотида 51CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3' и S-6eH3OHn-MAG3-2,3,5,6тетрафторфенилового эфира Зг 5-бензоил-МАСз-2,3,5,6тетрафторфенилового эфира (полученного согласно Пат США 4965392), растворенного в 0,2мл диметилформамида, добавляют к 8мг названного соединения примера 1а), растворенного в 0,5мл 0,1 М фосфатного буфера (рН7), и перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре Разбавляют водой, и раствор подвергают ультрафильтрации (Amicon YM3, предел эксклюзии 3000) После лиофильной сушки получают 5мг конъюгата 6а) b) 99т Технеций комплекс конъюгата 5'-(6амино-1-гексил-фосфорная кислота сложный эфир) 35-мерного олигонуклеотида 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* ТТТ-31 и S-6eH3OHn-MAG3-2,3,5,6тетрафторфенилового эфира 1мг названного соединения примера 6а) растворяют в 200мкл воды и смешивают с 1мл 0,1 М фосфатного буфера рН8,5 К этой смеси добавляют 200мкл раствора 99ггТехнеций-(У)-глюконат (прибл 15мКи) и оставляют стоять в течение 15 минут при комнатной температуре Выход по изотопу (определено с помощью ЖХВР) составляет около 95% 40 Пример 7 а) Конъюгат 5'-(6-амино-1 -гексил-фосфорная кислота сложный эфир) 35-мерного олигонуклеотида 51CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* ТТТ-31 и ""Технеций комплекса 2,3,5,6тетрафторфенил-4,5-бис(меркаптоацетамидо)пентановая кислота сложного эфира Змг названного соединения примера 1а), растворенного в 0,6мл фосфатного буфера, добав99т ляют к Технеций комплексу 2,3,5,6тетрафторфенил-4,5-бис(меркаптоацетамидо)пентановая кислота сложного эфира (полученного согласно J Nucl Med 32, 1445 (1991)) прибл ЮОмКи, растворенного в 2мл фосфатного буфера, рН7,2 Раствор доводят до рНЮ с помощью 1,0М калий карбонатного буфера и перемешивают в течение 20 минут при комнатной температуре Для финальной очистки раствор вводят в Сефадекс (Sephadex) колонку (Pharmacia) и элюируют раствором с 75ммоль хлорида натрия Основные фракции объединяют, разбавляют обычным физиологическим раствором и фильтруют Таким образом, полученный раствор может быть использован для радиодиагностических исследований Пример 8 a) Конъюгат 5'-(6-Меркапто-1-гексилфосфорная кислота сложный эфир) 35-мерного олигонуклеотида 5'TTTTTAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGA GAUU-3' и 5'(г\І-малеимидо)-3-оксапентил-{2-[3карбоксибензоил)-тио]-ацетил}глицилглицилглицината 5мг тио-содержащего олигонуклеотида, полученного согласно примеру 5а), смешивают в атмосфере N2 в 2мл фосфатного буфера (рН7,4) с 1мг 5-(1\1-малеимидо)-3-оксапентил-{2-[3-карбоксибензоил)-тио]-ацетил}-глицилглицилглицината (полученного согласно Bioconj Chem 1, 431 (1990)), растворенного в 0,2мл диметилформамида Оставляют перемешиваться в течение 2 часов при комнатной температуре, и раствор подвергают ультрафильтрации через мембрану (Amicon YM3) и затем сушат вымораживанием Получают 5,5мг требуемого конъюгата b) Технеций-99т комплекс конъюгата 5'-(6Меркапто-1-гексил-фосфорная кислота сложный эфир) 35-мерного олигонуклеотида 5'TTTTTAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGA GAUU-3' и 5'(N- малеимидо)-3-оксапентил-{2-[3карбоксибензоил)-тио]-ацетил}глицилглицилглицината 1мл раствора калий-О-глюкарата (12мг/мл) и хлорида олова (II) (100мкг/мл) в 0,2М ЫаНСОз сушат вымораживанием в ампуле и затем смешивают с раствором [Гс-99т]-натрий пертехнетата (1 мл, 1 мКи [mCi]) из Мо-99Л~с-99т генератора После стояния при комнатной температуре в течение 15 минут аликвоту удаляют и смешивают с таким же объемом конъюгата примера 8а) (1мг/мл), растворенного в 0,2М растворе NaHCO3Вещество можно выделить с помощью сушки вымораживанием Выход по изотопу, определенный с помощью ЖХВР, составлял >96% Пример 9 48140 42 41 a) Конъюгат 5'-(6-Меркапто-1-гексил2-илметокси)-ацетамида фосфоновая кислота сложный эфир) 35-мерного 1мг конъюгата, полученного согласно 10а), инолигонуклеотида кубируют в 1 мл фосфатного буфера (рН8) с 6 СиСЬ (0,2мКи) Выход по изотопу, определенный 5'через 1 час с помощью ЖХВР, составлял >98% T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGA Продукт выделяют путем сушки вымораживанием GAUU-3' и 1-[6-(2-винил-6-гексилоксиметил)Пример 11 пиридин]-1,4,8,11-тетраазациклотет-радекана Раствор 4мг тио-содержащего олигонуклеотиa) Конъюгат 5'-(6-меркапто-1-гексилда, полученного согласно примеру 5а), в 2мл фосфорная кислота сложный эфир) 35-мерного фосфатного буфера (рН7,4) смешивают в атмоолигонуклеотида сфере N2 с 1мг 1-[6-(2-винил-6-гексил-оксиметил)5'пиридин]-1,4,8,11-тетраазациклотетрадекана (поT*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGA лученного согласно ЕР 0588229), растворенного в GAUU-3' и 1,4,7,10-тетраазациклододекан-2-[(50,5мл диметилформамида Оставляют перемешиаза-8-малеимидо-6-оксо)-октан]-1,4,7,10ваться в течение 4 часов при 35°С, смешивают с тетрауксусной кислоты 10мл этанола, и продукт выделяют с помощью 1мг 1,4,7,10-тетраазациклододекан-2-[(5-аза-8центрифугирования Очистку проводят при помомалеимидо-6-оксо)-октан]-1,4,7,10-тетрауксусной щи хроматографии с обращенной фазой на кислоты (полученного согласно J Chem Soc, 1х25см колонке с градиентом 50ммоль триэтиChem Contmun 796 (1989)), добавляют к раствору ламмоний ацетат (рН7)/ацетонитрил Объединен5мг тиол-содержащего олигонуклеотида, полученные фракции сушат вымораживанием, растворяют ного согласно примеру 5а), в 2мл фосфатного був 1мл воды и обессоливают на Сефадекс G-10 фера (рН8) в атмосфере N2 Перемешивают в теколонке Названное соединение (около 4мг) выдечение 3 часов при 35°С, смешивают с 10мл ляют с помощью сушки вымораживанием изопропилового спирта, и продукт выделяют с помощью центрифугирования Очистку проводят b) Tc-99m комплекс конъюгата 5'-(6-Меркаптопри помощи хроматографии с обращенной фазой 1-гексил-фосфоновая кислота сложный эфир) 35на 1х25см колонке с градиентом 25ммоль триэтимерного олигонуклеотида 5'ламмоний ацетат (рН7)/ацетонитрил ОбъединенT*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGA ные фракции осторожно концентрируют путем GAUU-3' и 1-[6-(2-винил-6-гексилоксиметил)испарения в вакууме, растворяют в небольшом пиридин]-1,4,8,11-тетраазациклотет-радекана количестве воды и обессоливают с помощью СеПроцедуру осуществляют, как описано в прифадекс G-10 колонки Путем сушки вымораживамере 8Ь) Выход по изотопу, определенный с понием получают 4мг названного соединения в виде мощью ЖХВР, составлял 92% белого порошка Пример 10 a) Конъюгат 5'-(6-меркапто-1-гексилb) Иттрий-90 комплекс конъюгата 5'-(бфосфоновая кислота сложный эфир) 35-мерного меркапто-1-гексил-фосфоновая кислота сложный олигонуклеотида эфир) 35-мерного олигонуклеотида 5'T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGA 5'GAUU-3' и 1,4,7,10-тет-раазациклододекан-2-[(5T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGA аза-8-малеимидо-6-оксо)-октан]-1,4,7,10GAUU-31 и 1Ч-[4-гидрокси-3-(1,4,8,11 -тетраазатетрауксусной кислоты циклотетрадек-5-ил)-бензил]-2-(6-винил-пиридин90 2-илметокси)-ацетамида У-ацетат (1мКи), растворенный в 1мл 0.05М раствора ацетата аммония, смешивают с 1мг Раствор 6,5мг тиол-содержащего олигонуклеконъюгата, полученного согласно примеру 11а), и отида, полученного согласно примеру 5а), в 2мл нагревают в течение 1 часа при 85°С Выход по фосфатного буфера (рН8,0), смешивают с 1,2мг изотопу, определенный с помощью ЖХВР, сог\|-[4-гидрокси-3-(1,4,8,11-тетрааза-циклотетрадекставлял >95% Продукт выделяют с помощью 5-ил)-бензил]-2-(6-винил-пиридин-2-илметокси)сушки вымораживанием ацетамида (полученного согласно J Chem Soc , Спет С о т т и п 156 (1988)), растворенного в Пример 12 0,1мл диметилформамида Перемешивают в теа) Конъюгат 5'-(6-меркапто-1-гексилчение 4 часов в атмосфере N z при 35°С, смешифосфоновая кислота сложный эфир) 35-мерного вают с 10мл этанола, и продукт выделяют с поолигонуклеотида мощью центрифугирования Очистку проводят при 5'помощи хроматографии с обращенной фазой на T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGA 1х25см колонке с градиентом 50ммоль триэтиGAUU-3' и 1,4,7,-три-азациклононан-2-[(5-аза-8ламмоний ацетат (рН7)/ацетонитрил Объединенмалеимидо-6-оксо)-октан]-1,4,7,-триуксусной киные фракции обессоливают на Сефадекс G-10 слоты колонке Путем сушки вымораживанием получают 1мг 1,4,7,-триазациклононан-2-[(5-аза-85мг названного соединения в виде белого порошмалеимидо-6-оксо)-октан]-1,4,7,-триуксусной кика слоты (полученного согласно J Chem Soc , Chem Commun 794 (1989)), добавляют к раствору 5мг b) Медь-64 комплекс 5'-(6-меркапто-1-гексилтиол-содержащего олигонуклеотида, полученного фосфоновая кислота сложный эфир) 35-мерного согласно примеру 5а), в 2мл фосфатного буфера олигонуклеотида 5'(рН8) в атмосфере N2 Перемешивают в течение 6 T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGA часов при 35°С, смешивают с 10мл изопропанола, GAUU-31 и 1Ч-[4-гидрокси-3-(1,4,8,11 -тетраазаи продукт выделяют с помощью центрифугировациклотетрадек-5-ил)-бензил]-2-(6-винил-пиридин 43 48140 ния Очистку проводят при помощи хроматографии с обращенной фазой на 1х25см колонке с градиентом 25ммоль триэтиламмоний ацетат (рН7)/ацетонитрил Объединенные фракции осторожно концентрируют путем испарения в вакууме, растворяют в небольшом количестве воды и обессоливают с помощью Сефадекс G-10 колонки Путем сушки вымораживанием получают Змг названного соединения в виде белого порошка Ь) Галлий-67 комплекс конъюгата 5'-(6меркапто-1-гексил-фосфоновая кислота сложный эфир) 35-мерного олигонуклеотида 5'T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGA GAUU-3' и 1,4,7,-три-азациклононан-2-[(5-аза-8малеимидо-6-оксо)-октан]-1,4,7,-триуксусной кислоты 20мг конъюгата, полученного согласно примеру 12а), растворяют в 0,5мл 0,1М нитратного буфера рН4,5 и смешивают с 0,1мл галлий-67цитратного раствора (0,2мКи) Выдерживают в течение 2 часов при комнатной температуре, и продукт обессоливают на Сефадекс-G-IO колонке После лиофильной сушки получают 17мг названного соединения в виде белого порошка Пример 13 Фосфитилирование 5'-О-(4,4'диметокситритил)-5-(проп-2-ен-1-он)-2'дезоксиуридина 50мг 4-диметиламинопиридина, Змл лиизопропилэтиламина и 962мкл (4,31 ммоль) 2цианоэтил-г\1,1\1-диизопропилхлорофосфорамидита добавляют один за другим к перемешиваемому раствору 5'-О-(4,4'-диметокситритил)-5-(проп-2-ен1-он)-2'-дезоксиуридина (полученного согласно Nuclesides & Nucletides 13, 939 - 944) в 50мл тетрагидрофурана После приблизительно ЗОмин образуется белый осадок Его отфильтровывают, раствор концентрируют выпариванием в вакууме, и остаток распределяют между дихлорметаном и 5% раствором бикарбоната натрия Дихлорметановую фазу сушат над сульфатом магния и концентрируют выпариванием в вакууме Остаток очищают быстрой хроматографией на силикагеле и элюируют смесью дихлорметан/гексан/диизопропилэтиламин (8018 2) 1,8г требуемого соединения получают в виде белой пены Элементный анализ Рассч Найд С С 64, 64, 28 02 Н Н 6, 6, 29 60 N N 7, 7, 14 21 Р Р 3,95 4,09 Ь) Конъюгат 36-мерного олигонуклеотида U*T*T*T*T*TCUCAUGGAGCCAAGACGAAUAGCUA CAUA-3' и 10-(4-аза-2-гидрокси-5-имино-8меркапто-октан-1,4,7-трис-(карбоксиметил)1,4,7,10-тетраазациклододекана U* 5-(проп-2-ен1 -он)-2'-дезоксиуридин 30-мерный олигонуклеотид, идентифицированный согласно SELEX способу, получают с модификацией 5'-связанной последовательности 5'Т*Т*Т*Т*Т обычным способом в автоматическом синтезаторе Pharmacia Company (смотри Ohgonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed F Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), и олигонуклеотид также присутствует на колонке твердого носителя Путем 44 реакции с раствором трихлоруксуснои кислоты в дихлорметане открывают 5'-гидрокси группу Нагрузка на колонку составляет около 10мг 35мерного-олигонуклеотида 5'-гидрокси группа взаимодействует в присутствии тетразола с фосфорамиди-том, полученным согласно примеру 13а) Затем фосфит превращают в фосфотриэфир путем обработки раствором иода, и концевой DMT радикал отщепляют путем взаимодействия с раствором трихлоруксуснои кислоты в дихлорметане Для введения тиольной группы в а.р-ненасыщенную карбонильную систему, присутствующую на концевом 2'-дезоксиуридине, проводят взаимодействие с раствором 10-(4-аза2-гидрокси-5-имино-8-меркапто-октан-1,4,7-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекана*) в тетрагидрофуране и промывают последовательно метанолом и водой Чтобы удалить модифицированный олигонуклеотид от твердого носителя, содержимое колонки транспортируют в мультиампулу, смешивают с 5мл 30% раствора аммиака, сосуд герметизируют и встряхивают на протяжении ночи при 55°С Затем охлаждают до 0°С, центрифугируют, носитель промывают 5мл воды, и объединенные водные фазы подвергают лиофильной сушке Для очистки твердое вещество помещают в 2мл воды, смешивают с 2мл 0,5М раствора ацетата аммония и смешивают с 10мл этанола, дают возможность отстояться на протяжении ночи при 20°С, центрифугируют, и остаток промывают 1мл этанола (-20°С) и, наконец, сушат в вакууме при комнатной температуре 6мг названного соединения получают в виде бесцветного порошка *) 10-(4-Аза-2-гидрокси-5-имино-8-меркаптооктан-1,4,7-трис-(карбоксиметил)-1,4,7,10тетраазациклододекан получают, как описано ниже 15,7мл 1N раствора гилроксида натрия и 430мг (3,49ммоль) 2иминотетрагидротиофенгидрохлорида добавляют к раствору 1,46г (3,49ммоль) 10-(3-амино-2гидрокси-пропил)-1,4,7-трис-(карбоксиметил)1,4,7,10-тетраазациклододекана (смотри пример 1с) в смеси 50мл воды и 50мл метанола и перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре, концентрируют выпариванием в вакууме до приблизительно 1/4 начального объема и смешивают при перемешивании с анионобменной смолой (IRA 410) до тех пор, пока не достигнут рН11 Раствор фильтруют и смешивают при перемешивании с малыми порциями катионообменной смолы IRC 50 до тех пор, пока не достигнут рНЗ,5 После фильтрации раствор лиофильно сушат 1,39г требуемого вещества получают в виде белого порошка с содержанием воды 4,9% Элементный анализ (относительно безводного вещества) Рассч Найд С С 48,45 48,30 Н Н 7,74 7,98 N N 16,14 16,05 S S 6,16 6,44 с) Иттрий-90 комплекс конъюгата 36-мерного олигонуклеотида U*T*T*T*T*TCUCAUGGAGCCAAGACGAAUAGCUA 45 Пример 14 а) З-(Трифенилметил-меркаптоацетил)глицил-глицин метиловый эфир 3,34г (Юммоль) S-трифенилметил меркаптоуксусной кислоты и 1,83г (Юммоль) глицилглицин метиловый эфир гидрохлорида суспендируют в 250мл абсолютного дихлорметана После добавления 1,01г (Юммоль) триэтиламина вливают по каплям при охлаждении льдом 2,06г (Юммоль) дициклогексилкарбодиимида, растворенного в 50мл абсолютного дихлорметана Перемешивают в течение 1 часа при 0°С и в течение 18 часов при комнатной температуре Фильтруют, концентрируют путем выпаривания и хроматографируют на силикагеле (элюент СН2СІ2/Ме0Н 10% -50%) Выход 3,56г (77,0% оттеор ), белый порошок Элементный анализ Рассч Найд С С 67,51 67,37 Н Н 5,67 6,02 N N 6,06 5,91 013,84 S S 11,20 6,73 b) [3-(Трифенилметилмеркаптоацетил)глицил-глицинамидил]-6-гексанол 4,63г (Юммоль) 3-(трифенилметилмеркаптоацетил)глицилглицин метилового эфира, полученного в примере 14а), нагревают до Ю0°С в 11,72г (ЮОммоль) 6-амино-гексанол/50мл 1,4диоксана в атмосфере аргона в течение 2 часов Затем реакционную загрузку выливают на смесь 100мл дихлорметана и 100мл воды При перемешивании и охлаждении льдом до рН6 доводят с помощью ЮМ хлористоводородной кислоты, органическую фазу отделяют и сушат над сульфатом натрия После испарения растворителя сырой продукт очищают на силикагеле (элюент СН2СІ2/Ме0Н 10%-50%) Выход 2,97г (54,2% оттеор ), белый порошок Элементный анализ Рассч Найд С С 67,98 67,72 Н Н 6,81 6,93 46 растворяют в 100мл абсолютного дихлорметана, 5,17г (40ммоль) диизопропилэтиламина добавляют в атмосфере аргона и вливают по каплям при 0°С 3,95г (20ммоль) фосфористая кислота монометиловый эфир диизопропиламид хлорида, растворенного в 50мл абсолютного дихлорметана Перемешивают в течение 0,5 часа при 0°С и затем в течение 2 часов при комнатной температуре Для завершения обработки смешивают при охлаждении льдом с 320мг (Юммоль) абсолютного метанола, и после концентрирования, хроматографируют на силикагеле (элюент СН2СІ2/Ме0Н 95% 5/5% триэтиламин) 48140 CAUA-3' и 10-(4-аза-2-гидрокси-5-имино-8меркапто-октан-1,4,7-трис-(карбоксиметил)1,4,7,10-тетраазациклододекана U* 5-(проп-2-ен1 -он)-2'-дезоксиуридин К раствору °Иттрия, растворенного в 0.05М растворе ацетата аммония (прибл 380мКи), добавляют 1мг тио производного примера 13Ь) в 0,5мл 0.05М раствора ацетата аммония с рН6, доводят до рН5,2 с помощью ЗМ уксусной кислоты и перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре Доводят до рН7,0 0,01 М раствором гидроксида натрия, и конъюгат очищают с помощью ЖХВР (TSK-400/MES-6yqbep) Основные фракции объединяют, разбавляют обычным физиологическим раствором и доводят до рН7,2 с помощью 0,01 М раствора гидроксида натрия После фильтрации получают препарат, пригодный для радиотерапии N N 7,67 7,93 011,68 S 5,85 S 5,64 c) О-{[3-(Трифенилметилмеркаптоацетил)глицил-глицинамидил]-6-гекс-1ил}-диизопропиламид-О'-метил-фосфористая кислота диэфир 5,48г (Юммоль) [3-(трифенилметилмеркаптоацетил)глицил-глицинамидил]-6гексанола, полученного согласно примеру 14Ь), Выход 1,98г (27,9% от теор), бесцветное масло d) 5'-[(Меркаптоацетил-глицил-глициламидил)-6-гекс-1-ил]-фосфорная кислота эфир 35мерного олигонуклеотила 5'T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUA CAUA-31 30-мерный олигонуклеотид, идентифицированный согласно SELEX способу, получают модификацией 5'-связанной последовательности 5'Т*Т*Т*Т*т с помощью автоматического синтезатора Pharmacia Company (смотри Ohgonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed, F Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nev York, Tokyo, 1991), и олигонуклеотид в защищенной форме также присутствует из колонке твердого носителя Нагрузка на колонку составляет около 15мг 35-мерного олигонуклеотида После отщепления 5'-ОМТ-защитной группы (трихлоруксусная кислота/дихлорметан), его соединяют согласно стандартным методам с фосфорамидитом, описанным в примере 14с) После окисления и йодом в тетрагидрофуране, конъюгат отщепляется от носителя В этом случае вещество смешивают с 10мл 30% раствора аммиака, сосуд герметизируют и встряхивают на протяжении ночи при 55°С Содержимое охлаждают до 0°С, центрифугируют, носитель промывают 10мл воды, и соединенные водные фазы подвергают сушке замораживанием Для очистки твердое вещество помещают в 5мл воды, смешивают с 4мл 0,5М раствора ацетата аммония и смешивают с 20мл этанола Для завершения осаждения смесь охлаждают на протяжении ночи (-20°С), центрифугируют, и остаток промывают 1мл этанола (-20°С) и сушат в вакууме Получают 9мг белого порошка Для отщепления S-тритил защитной группы вещество помещают в 5мл раствора (рН7,0) с 50ммоль триэтиламмоний ацетата и инкубируют с 500мкл 0,1 М раствора нитрата серебра в течение 30 минут Затем добавляют 500мкл 0.14М дитиотреитольного раствора и инкубируют последующие 30 минут После центрифугирования прозрачный супернатант обессоливают на Сефадексе G-10 Фракции, содержащие продукт, лиофилизируют Получают 4мг конъюгата в виде белого порошка e) Технеций-99т комплекс конъюгата 5'[(меркаптоацетил-глицил-глицил-амидил)-6-гекс1-ил]-фосфорная кислота эфир 35-мерного олигонуклеотида 5'T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUA 1 CAUA-3 1мг конъюгата 14d) растворяют в 1мл 0,1М 47 48140 динатриевого кислого фосфатного буфера (рН=9,5) После добавления 10мг динатрий тартрата смешивают с раствором пертехнетата (ІмКи) и затем с 10мл раствора хлорида олова (II) (5мг SnCb/імл 0,01 М HCI) Выход по изотопу (прибл 93%) определяют с помощью ЖХВР Пример 15 а) О-{[5-(Трифенилметилмеркаптоацетил)глицил-глицинами-дил]-6-гекс-1ил}-толуолсульфоновая кислота сложный эфир 5,48г (Юммоль) [3-(трифенилметилмеркаптоацетил)-глицил-глицинамидил]-6гексанола, полученного в примере 14Ь), растворяют в 100мл абсолютного дихлорметана Добавляют 1,01 г (1 Оммоль) триэтиламина и 1,91 г (Юммоль) хлорангидрида п-толуолсульфоновой кислоты и перемешивают в течение 24 часов при комнатной температуре Затем концентрируют и хроматографируют на силикагеле (элюент СН2СІ2/Ме0Н 95 5) Выход 4,32г (61,5% от теор), бесцветное масло Элементный анализ Рассч Найд С С 65, 03 64, 93 Н Н 6,18 6,32 N N 5,99 5,78 01,68 S S 9,14 8,87 Ь) 5'[(Меркаптоацетил-глицил-глицинамидил)6-гекс-1-ил]-фосфорная кислота сложный эфир 35-мерного олигонуклеотида 5'T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUA CAUA-31 30-мерный олигонуклеотид, идентифицированный согласно SELEX способу, получают модификацией 5'-связанной последовательности 5'Т*Т*Т*Т*Т с помощью автоматического синтезатора Pharmacia Company (смотри Ohgonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed F Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), и олигонуклеотид в защищенной форме также присутствует на колонке твердого носителя Нагрузка на колонку составляет около 15мг 35-мерного олиго-нуклеотида После отщепления 5'-ОМТ-защитной группы (трихлоруксусная кислота/дихлорметан), его соединяют согласно стандартным способам с З-тритил-6-меркаптогексил-фосфорамидитом После окисления йодом в тетрагидрофуране, тритил-защищенное соединение отщепляют от носителя, изолируют и очищают (смотри пример 14d) Отщепление S-тритил защитной группы, изоляцию SH-группу-несущего олигонуклеотида и очистку проводят, как описано в примере 14d) (6 мг) Для связывания, SH-группу-несуший 35мерный олигонуклеотид (6мг) в 500мкл 0,1 М раствора карбоната натрия смешивают в атмосфере аргона со 100мг сложного эфира толуолсульфокислоты 15а), растворенной в 500мкл диметилформамида Через 30 минут нейтрализуют и разбавляют водой до объема 5мл После центрифугирования прозрачный супернатант лиофильно сушат Для отщепления S-тритил защитных групп процедуру проводят, как описано в 14d) После очистки получают 4мг конъюгата 48 с) Технеций-99т комплекс конъюгата 5'[(меркаптоацетил-глицил-глицинамидил)-6-гекс1-ил]-фосфорная кислота сложный эфир 35мерного олигонуклеотида 5'T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUA CAUA-31 1мг конъюгата, описанного в примере 15Ь), растворяют в 1 мл 0,1 М динатриевого кислого фосфатного буфера (рН9,5) После добавления 10мг динатрий тартрата смешивают с раствором пертехнетата (1мКи) и затем с Юмкл раствора хлорида олова (II) (5мг SnCb/імл 0,01 М HCI) Выход по изотопу (прибл 95%) определяют с помощью ЖХВР Пример 16 а) І\І-[3-Тиа-5-(трифенил метил меркапто)-1оксо-пент-1 -nn]-S- трифенилметил-цистеин метиловый эфир 2,69г (Юммоль) 1Ч-[3-тиа-5(трифенилметилмеркапто)-1-оксо-пент-1-ил]-5трифенилметил-цистеин метилового эфира (получение согласно DE 4310999) растворяют вместе с 5,58г (20ммоль) трифенилметил хлорида в 100мл абсолютного дихлорметана После добавления 2,02г (20ммоль) триэтиламина смесь выдерживают при перемешивании на протяжении ночи в атмосфере аргона при комнатной температуре Для завершения обработки органическую фазу промывают три раза, в каждом случае 1% раствором лимонной кислоты, насыщенным раствором бикарбоната натрия и водой После высушивания над сульфатом натрия концентрируют путем выпаривания и очищают на силикагеле (элюент СН2СІ2/Ме0Н 95 5) Выход 4,53г (60,1% от теор), бесцветное масло Элементный анализ Рассч Найд С С 73, 73, 27 31 Н Н 5,75 5,48 N N 1,86 1,63 06,37 S S 12,76 12,49 Ь) І\І-[3-Тиа-5-(трифенил метил меркапто)-1оксо-пент-1-ил]-3-трифенилметил-г\Г-(6-гидроксигекс-1 -ил)цистеинамид 7,54г (Юммоль) ІЧ-[3-тиа-5(трифенилметилмеркапто)-1-оксо-пент-1-ил]-5цистеин метилового эфира, описанного в примере 16а), нагревают до Ю0°С в 11,72г (ЮОммоль) 6аминогексанол/50мл 1,4-диоксана в атмосфере аргона в течение 2 часов Затем реакционную смесь выливают на смесь 100мл дихлорметана и 100мл воды При перемешивании и охлаждении льдом доводят рН до 6 с помощью ЮМ хлористоводородной кислоты, органическую фазу отделяют и сушат над сульфатом натрия После выпаривания растворителя сырой продукт очищают на силикагеле (элюент СН2СІ2/Ме0Н 5% - 50%) Элементный анализ Рассч Найд С С 72,99 72,73 Н Н 6,49 6,62 N N 3,34 3,11 05,72 S S 11,46 11,17 с) 0-{{[І\І-[3-Тиа-5-(трифенил метил меркапто)1 -оксо-пент-1 -ил]-5-трифенилметил-цистеинил}-2амино-эт-1-ил}-диизопропиламид-О'м етил фосфор и стая кислота сложный эфир 8,39г (Юммоль) 1Ч-[3-тиа-5 49 48140 (трифенилметилмеркапто)-і-оксо-пент-1-ил]-5трифенилметил-І\Г-(6-гидрокси-гекс-1ил)цистеинамида, полученного в примере 16Ь), растворяют в 200мл абсолютного дихлорметана В атмосфере аргона добавляют 5,17г (40ммоль) диизопропилэтиламина и по каплям при 0°С вливают 3,95г (20ммоль) фосфористая кислота монометилэфир-диизопропиламид-хлорида, растворенного в 50мл абсолютного дихлорметана Перемешивают в течение 0,5 часа при 0°С и затем перемешивают в течение 1,5 часов при комнатной температуре Для завершения обработки смешивают при охлаждении льдом с 320мг (Юммоль) абсолютного метанола и после концентрирования хроматографируют на силикагеле (элюент СН2СІ2/Ме0Н 95 5/5% (триэтиламин)) Выход 5,37г (53,7% от теор) желтоватого масла d) 5'-[1\1-(3-Тиа-5-меркапто-1 -оксо-пент-1 -ил]цистеин-г\Г-(6-гидрокси-гекс-1-ил)-амид]фосфорная кислота эфир 35-мерного олигонуклеотида 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3' 30-мерный олигонуклеотид, идентифицированный согласно SELEX способу, получают модификацией последовательности Т*Т*Т*Т*Т-3", расположенной против хода транскрипции, с помощью автоматического синтезатора Pharmacia Company (смотри Ohgonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed F Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), и олигонуклеотид в защищенной форме также присутствует на колонке твердого носителя Нагрузка на колонку составляет около 15мг 35-мерного олигонуклеотида После отщепления 5'-ОМТ-защитной группы (трихлоруксусная кислота/дихлорметан), его соединяют согласно стандартным способам с фосфорамидитом (16с) и затем окисляют Отщепление от носителя основных защитных групп и очистку бис-Б-тритил-защищенного конъюгата проводят, как описано в 14d) (около 12мг) Для отщепления S-тритил защитных групп вещество помещают в 5мл 50ммоль раствора (рН7,0) триэтиламмоний ацетата и инкубируют с 500мкл 0,1 М раствора нитрата серебра в течение 30 минут Затем добавляют 500мкл 0.14М дитиотреитольного раствора и инкубируют в течение последующих 30 минут После центрифугирования прозрачный супернатант обессоливают на Сефадексе G 10 Фракции, содержащие продукт, лиофилизируют Получают 5мг конъюгата в виде белого порошка e) Технеций-99т комплекс конъюгата 5'-[N-(3тиа-5-мер-капто-1 -оксо-пент-1 -ил]-цистеин-г\Г-(6гидрокси-гекс-1-ил)-амид]-фосфорная кислота эфир 35-мерного олигонуклеотида 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3' 1мг конъюгата, описанного в примере 16d), растворяют в 1 мл 0,1 М динатриевого кислого фосфатного буфера (рН9,5) После добавления 10мг динатрий тартрата смешивают с раствором пертехнетата натрия (1мКи) и затем с 10мл раствора хлорида олова (II) (5мг SnCb/імл 0,01 М HCI) Выход по изотопу (прибл 96%) определяют с 50 помощью ЖХВР Пример 17 а) 0-{І\І-[3-Тиа-5-(трифенилметилмеркапто)-1оксо-пент-1-ил]-5-трифенилметил-М'-(6-гидроксигекс-1-ил)цистеинимидил}-п-толуолсульфокислота сложный эфир 8,39г (Юммоль) ІЧ-[3-тиа-5(трифенилметилмеркапто)-1-оксо-пент-1-ил]-5трифенилметил-1\Г-(6-гидрокси-гекс-1-ил) цистеинамида, полученного согласно примеру 16Ь, растворяют в 200мл абсолютного дихлорметана Добавляют 1,01 г (1 Оммоль) триэтиламина, 1,91 г (Юммоль) хлорангидрида п-толуолсульфокислоты и перемешивают в течение 20 часов при комнатной температуре Затем концентрируют и хроматографируют на силикагеле (Элюент СН2СІ2/Ме0Н 97 3) Выход 6,44г (67,0% от теор) желтоватого масла Элементный анализ Рассч Найд С С 72, 72, 47 19 Н Н 6,29 6,47 N N 2,91 2,68 0 8,32 S S 10,01 9,83 b) 5'-[(Меркаптоацетил-глицил-гдицинамидил)13-тридек-7-тио-1 -ил]-фосфорная кислота сложный эфир 35-мерного олиго-нуклеотида 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3' 30-мерный олигонуклеотид, идентифицированный согласно SELEX способу, получают модификацией последовательности Т*Т*Т*Т*Т-3", расположенной против хода транскрипции, с помощью автоматического синтезатора Pharmacia Company (смотри Ohgonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed F Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nev York, Tokyo, 1991), и олигонуклеотид в защищенной форме также присутствует на колонке твердого носителя Нагрузка на колонку составляет около 15мг 35-мерного олигонуклеотида После отщепления 5'-ОМТ-защитной группы (трихлоруксусная кислота/дихлорметан), его соединяют согласно стандартным способам с З-тритил-6-меркаптогексил-фосфорамидитом После окисления йодом в тетрагидрофуране тритил-защищенное соединение отщепляют от носителя, изолируют и очищают (смотри пример 14d) Отщепление S-тритил-защищенной группы, изоляцию SH-группу-несущего олигонуклеотида и очистку проводят, как описано в 14d) (7,5мг) Для связывания, SH-группу-несущий 30мерный олигонуклеотид (7мг) в 550мкл 0,1 М раствора карбоната натрия смешивают в атмосфере аргона со 180мг сложного эфира толуолсульфокислоты 17а), растворенного в 500мкл диметилформамида Через 30 минут нейтрализуют и разбавляют водой до объема 5мл После центрифугирования прозрачный супернатант лиофильно сушат Для отщепления S-тритил групп процедуру проводят, как описано в 14d) После очистки получают 4,3мг конъюгата c) Тахнеций-99т комплекс конъюгата 5'[(меркаптоацетил-глицил-гдицинамидил)-13тридека-7-тио-1-ил]-фосфорная кислота сложный эфир 35-мерного олигонуклеотида 5' 52 51 48140 CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-33T*T*T-3' Т-51 1мг конъюгата, описанного в примере 17Ь), растворяют в 1 мл 0,1 М динатриевого кислого фосфатного буфера (рН9,5) После добавления 10мг динатрий тартрата смешивают с раствором пертехнетата натрия (1мКи) и затем с Юмкл раствора хлорида олова (II) (5мг SnCb/імл 0,01 М HCI) Выход по изотопу (прибл 93%) определяют с помощью ЖХВР Пример 18 a) Конъюгат 5'-(6-Амино-1-гексил-фосфорная кислота сложный эфир) 35-мерного олигонуклеотида 51CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3' и моноамида 1Ч-(тетрагидро-2-оксотиофен-3-ил)-тиодигликолевой кислоты 30-мерный олигонуклеотид, идентифицированный согласно SELEX способу, получают модификацией последовательности Т*Т*Т*Т*Т-3", расположенной против хода транскрипции, с помощью автоматического синтезатора Pharmacia Company (смотри Ohgonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed F Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Mev York, Tokyo, 1991), и олигонуклеотид в защищенной форме также присутствует на колонке твердого носителя Нагрузка на колонку составляет около 15мг 35-мерного олигонуклеотида После отщепления 5'-ОМТ-защитной группы (трихлоруксусная кислота/дихлорметан), его соединяют согласно стандартным способам с N-трифтороацетиламиногексилфосфорамидитом После окисления йодом в тетрагидрофуране, амино группу-несущий олигонуклеотид отщепляют от носителя, изолируют и очищают, как описано в 1Ь) (9,3мг) Для связывания с моноамидом ІЧ-(тетрагидро2-оксо-тиофен-3-ил)-тиодигликолевой кислоты (DE 4311023) 5мг амино группу-несущего олигонуклеотида растворяют в 1мл 0,2М раствора карбоната натрия После добавления 100мг производного тиолактона, содержимое инкубируют в течение 4 часов при комнатной температуре Затем нейтрализуют, и обессоливание производят с помощью ультрафильтрации через мембрану с пределом эксклюзии 3000 (Amicon YM3) После лиофилизации его подвергают сушке вымораживанием Получают 6,3мг требуемого конъюгата b) Технеций-99т комплекс конъюгата 5'(6Амино-1-гексил-фосфорная кислота сложный эфир) 35-мерного олигонуклеотида 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3' и моноамида ІЧ-(тетрагидро-2-оксотиофен-3-ил)-тиодигликолевой кислоты 1мг SH-группу-несущего конъюгата, описанного в примере 18а), растворяют в 1мл 0,1 М динатриевого кислого фосфатного буфера (рН9,5) После добавления 10мг динатрий тартрата смешивают с раствором пертехнетата натрия (1мки) и затем с Юмкл раствора хлорида олова (II) (5мг SnCb/імл 0,01 М HCI) Выход по изотопу (94%) определяют с помощью ЖХВР Пример 19 а) 5'(6-Амино-1-гексил-фосфорная кислота сложный эфир 32-мерного олигонуклеотида 5' 30-мерный олигонуклеотид 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-31, идентифицированный по SELEX способу, с модификацией тимидиновой последовательности Т-33Т-5', расположенной против хода транскрипции , которая связана 5'-положением на носителе, получают обычным путем в автоматическом синтезаторе Pharmacia Company (смотри Ohgonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed F Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), и олигонуклеотид также присутствует на колонке твердого носителя Путем реакции с раствором трихлоруксусной кислоты в дихлорметане открывают 5'-гидрокси группу Нагрузка на колонку, составляет около 10мг 32мерного олигонуклеотида Чтобы соединить линкер, колонку подвергают взаимодействию с ацетонитрильным раствором 50мкмоль р-цианоэтил|\1,г\1-диизопропиламино-6-(трифторацетамидо)-1гексил-фосфорамидита (полученного согласно Nucl Acids Res 16, 2659 - 2669 (1988)) в присутствии тетразола Окисление образовавшегося фосфита в полностью защищенный фосфотриэфир проводят с помощью йода в тетрагидрофуране Затем колонку промывают последовательно метанолом и водой Чтобы удалить модифицированный олигонуклеотид от твердого носителя, содержимое колонки транспортируют в мультиампулу, смешивают с 5мл 30% раствора аммиака, сосуд герметизируют и подвергают встряхиванию на протяжении ночи при 55°С Затем охлаждают до 0°С, центрифугируют, носитель промывают 5мл воды, и объединенные водные фазы подвергают лиофильной сушке Для очистки твердое вещество помещают в 2мл воды, смешивают с 2мл 0,5М раствора ацетата аммония и смешивают с 10мл этанола и оставляют стоять на протяжении ночи при -20°С, центрифугируют, и остаток промывают 1мл этанола (20°С) и, наконец, сушат в вакууме при комнатной температуре 8мг названного соединения получают в виде бесцветного порошка Ь) Конъюгат 5'(6-амино-1-гексил-фосфорная кислота сложный эфир 32-мерного олигонуклеотида 51CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-33Т-5' и 10-[7-(4-изо-тиоцианатофенил)-2-гидрокси-5оксо-7-(карбоксиметил)-4-аза-гептил]-1,4,7-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазацикло-додекана 8мг олигонуклеотида, полученного в примере 19а), растворяют в 2,5мл NaHCO3/Na2CO3 буфера (рН8,0) и смешивают с 1мг 10-[7-(4изотиоцианатофенил)-2-гидрокси-5-оксо-7(карбок-симетил-4-азагептил]-1,4,7-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекана (названное соединение примера 1f) Перемешивают в течение 5 часов при комнатной температуре, затем доводят рН до 7,2 с помощью 0,1М хлористоводородной кислоты, и раствор подвергают ультрафильтрации через мембрану с пределом эксклюзии 3000 (Anticon YM3) и затем лиофильно сушат Получают 7мг требуемого конъюгата 53 48140 с) Индий комплекс конъюгата 5'(6-амино-1гексил-фос-форная кислота сложный эфир) 32мерного олигонуклеотида 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-33Т-5' и 10-[7-(4-изо-тиоцианатофенил)-2-гидрокси-5оксо-7-(карбоксиметил)-4-аза-гептил]-1,4,7-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклодо-декана 15мкл 111Индий (III) ацетатного раствора (350мКи), (полученного из 111Индий (III) хлорида в 2М растворе ацетата натрия и доведенного до рН4,0 с помощью 0,1М хлористоводородной кислоты) добавляют к 135мкл раствора 1мг названного соединения примера 19Ь) в MES буфере, рН6,2 (MES = 2-(1\1-морфолино)-этилсульфоновая кислота) рН доводят до 4,2 добавлением 0,01 М хлористоводородной кислоты Перемешивают в течение 1 часа при 37°С при рН4,2 Доводят до рН6 при помощи 2М раствора ацетата натрия и добавляют Юмкл 0,1 М раствора NC2EDTA (Na2EDTA = динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), чтобы комплексовать избыток 1 1 Индий Конечную очистку полученного таким образом меченого конъюгата (1п) проводят с помощью ЖХВР (вытеснительная хроматография TSK-400/МЕЗ-буфер) Фракции, содержащие меченый конъюгат, разбавляют обычным физиологическим раствором, доводят до рН7,2 с помощью 0,01 М раствора гидроксила натрия и фильтруют Полученный таким образом раствор представляет препарат, пригодный для радиодиагностики Пример 20 а) 5'(6-Амино-1-гексил-фосфорная кислота сложный эфир 35-мерного олигонуклеотида 5'T***T***T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAA AUGAGAUU-31 30-мерный олигонуклеотид 5'TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-31 (послед №13 Пат США №5270163), идентифицированный по SELEX способу, получают обычным путем в автоматическом синтезаторе Pharmacia Company (смотри Ohgonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed F Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), и олигонуклеотид также присутствует на колонке твердого носителя Четыре конечных тимидина связывают фосфородитиоатами с тимидином, присутствующим на 5'-конце согласно технике, описанной G Blaton et al in "Ohgonucleotides and Analogues", pp 109-135 Для этой цели сначала 5'-гидрокси группу открывают путем обработки с трихлоруксусной кислотой Затем З'-гидрокси группу 5'-DMTOтиридина превращают с помощью триспирролидинофосфина и тет-разола в диамидит, который превращают в фосфоротиоамидит путем добавления 2,4-дихлорбензил меркаптана Это соединение активируют тетразолом и подвергают взаимодействию с 5'-гидрокси группой олигонуклеотида в тиофосфаттриэфир Окисление в фосфородитиоат происходит с помощью элементарной серы в растворе дисульфида углерода, пиридина, триэтиламина 95 95 10 Бензильные группы еще не удалены Аналогичным путем также связывают 3 дополнительных тимидина Нагрузка на колонку составляет около 10мг 35мерного олигонуклеотида Затем 5'-гидрокси группу снова открывают 54 Чтобы соединить линкер, колонку подвергают взаимодействию с ацетонитрильным раствором 50мкмоль 2-цианоэтил-г\1,г\Г-диизопропил-амино-6(трифтороацетамидо)-і-гексил фосфорамиди-та (лит в примере а присутствии тетразола Окисление образовавшегося фосфита в фосфотриэфир проводят с помощью иода в тетрагидрофуране Затем колонку промывают последовательно метанолом и водой Затем защитные группы дитионатных связей удаляют раствором тиофеHonfrpHSTHnaMnH/flHOKcaH 1 2 2, что происходит в течение 2 часов После чего колонку промывают, в каждом случае тройным объемом колонки, метанолом, затем эфиром и сушат Чтобы удалить модифицированный олигонуклеотид от твердого носителя, содержимое колонки транспортируют в мультиампулу, смешивают с 5мл 30% раствора аммиака, сосуд герметизируют и подвергают встряхиванию на протяжении ночи при 55°С Затем охлаждают до 0°С, центрифугируют, носитель промывают 5мл воды, и объединенные водные фазы подвергают лиофильной сушке Для очистки твердое вещество помещают в 2мл воды, смешивают с 2мл 0,5М раствора ацетата аммония и смешивают с 10мл этанола, и оставляют на протяжении ночи при -20°С, центрифугируют, и остаток промывают 1мл этанола (-20°С) и, наконец, сушат в вакууме при комнатной температуре 8мг названного соединения получают в виде бесцветного порошка b) Конъюгат 5'(6-Амино-1-гексил-фосфорная кислота сложный эфир) 35-мерного олигонуклеотида 51T***T***T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAA AUGAGAUU-31 и 10-[7-(4-изотиоцианатофенил)-2гидрокси-5-оксо-7-(карбоксиметил)-4-азагептил]1,4,7-трис-(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекана 8мг олигонуклеотида, полученного в примере 20а), растворяют в 2,5мл NaHCO3/Na2CO3 буфера (рН8,0) и смешивают с 1мг 10-[7-(4изотиоцианатофенил)-2-гидрокси-5-оксо-7(карбоксиме-тил-4-азагептил]-1,4,7-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетра-азациклододекана (названное соединение примера 1f) Перемешивают в течение 5 часов при комнатной температуре, затем доводят рН до 7,2 с помощью 0,1М хлористоводородной кислоты, и раствор подвергают ультрафильтрации через мембрану с пределом эксклюзии 3000 (Amicon YM3) и затем лиофильно сушат Получают 7мг требуемого конъюгата c) 111Индий комплекс конъюгата 5'(6-амино-1гексил-фосфор-ная кислота сложный эфир) 35мерного олигонуклеотида 5' T***T***T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAA AUGAGAUU-31 и 10-[7-(4-изотиоцианатофенил)-2гидрокси-5-оксо-7-(карбоксиметил)-4-азагептил]1,4,7-трис-(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекана 15мкл 11 Индий (III) ацетатного раствора (350мкКИ), (полученного из 111Индий (III) хлорида в 2М растворе ацетата натрия и доведенного до рН4,0 с помощью 0,1М хлористоводородной кислоты) добавляют к 135мкл раствора 1мг назван 55 Пример 21 а) 5'-(б-Амино-1-гексил-фосфорная кислота сложный эфир) 35-мерного олигонуклеотида 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT**T* *Т**Т**Т-3' Получают 30-мерный олигонуклеотид 3'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT**T* *Т**Т**Т-3', идентифицированный по SELEX способу, с модификацией последовательности у**у**у**у**у_3^ расположенной против хода транскрипции, причем сначала получают последовательность из 5 тимидинов, соединенных цианоэтилфосфатными группами на носителе при 3' Посредством реакции этого соединения с 0,5М раствором тетраэтилтиурам дисульфида в ацетонитриле, сульфирование в фосфонотиоат происходит в течение 15 минут, что и является затем со свободной 5'-гидроксильной группой исходным веществом для 35-мерного олигонуклеотида Полный синтез происходит обычным путем в автоматическом синтезаторе Pharmacia Company (смотри Ohgonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed F Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), и олигонуклеотид все еще присутствует на колонке твердого носителя Посредством взаимодействия с раствором трихлоруксусной кислоты в дихлорметане, 5'гидрокси открывают Нагрузка на колонку составляет около 10мг 35-мерного олигонуклеотида Чтобы соединить линкер, колонку подвергают взаимодействию с ацетонитрильным раствором 50мкмоль р-цианоэтил-г\1,1\1-диизопропиламино-6(трифтороацетамидо)-1-гексил-фосфорамидита (полученного согласно Nucl Acids Res 16, 2659 2669 (1988)) в присутствии тетразола Окисление полученного таким путем фосфита в полностью защищенный фосфотриэфир проводят с помощью йода в тетрагидрофуране Затем колонку промывают последовательно метанолом и водой Чтобы удалить модифицированный олигонуклеотид от твердого носителя и отщепить цианоэтильные группы, содержимое колонки транспортируют в мультиампулу, смешивают с 5мл 30% раствора аммиака, сосуд герметизируют и подвергают встряхиванию на протяжении ночи при 55°С Затем охлаждают до 0°С, центрифугируют, носитель промывают 5мл воды, и объединенные водные фазы подвергают лиофильной сушке 56 Для очистки твердое вещество помещают в 2мл воды, смешивают с 2мл 0,5М раствора ацетата аммония и смешивают с 10мл этанола, и оставляют стоять на протяжении ночи при -20°С, центрифугируют, и остаток промывают 1мл этанола (-20°С) и, наконец, сушат в вакууме при комнатной температуре 8мг названного соединения получают в виде бесцветного порошка b) Конъюгат 5'-(б-Амино-1-гексил-фосфорная кислота сложный эфир) 35-мерного олигонуклеотида 51 CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT **т**т**у**у_3. и Ю-[7-(4-изотиоцианатофенил)-2гидрокси-5-оксо-7-(карбоксиметил)-4-азагептил]1,4,7-трис-(карбоксиметил)-1,4,7,10тетраазацикло-додекана 8мг олигонуклеотида, полученного в примере 20а), растворяют в 2,5мл NaHCO3/Na2CO3 буфера (рН8,0) и смешивают с 1мг 10-[7-(4изотиоцианатофенил)-2-гидрокси-5-оксо-7(карбоксиме-тил-4-азагептил]-1,4,7-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекана (названное соединение примера 1f) Перемешивают в течение 5 часов при комнатной температуре, затем доводят рН до 7,2 с помощью 0,1М хлористоводородной кислоты, и раствор подвергают ультрафильтрации через мембрану с пределом эксклюзии 3000 (Amicon YM3) и затем лиофильно сушат Получают 7мг требуемого конъюгата c) 111Индий комплекс конъюгата 5'(6-амино-1гексил-фосфорная кислота сложный эфир) 35мерного олигонуклеотида 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT**T* *Т**Т**Т-3' и 10-[7-(4-изотиоцианатофенил)-2гидрокси-5-оксо-7-(карбоксиметил)-4-азагептил]1,4,7-трис-(карбоксиметил)-1,4,7,10тетраазацикло-додекана 15мкл 111Индий (III) ацетатного раствора (350мкКИ), (полученного из 111Индий (III) хлорида в 2М растворе ацетата натрия и доведенного до рН4,0 с помощью 0,1М хлористоводородной кислоты) добавляют к 135мкл раствора 1мг названного соединения примера 21Ь) в MES буфере, рН6,2 (MES = 2-(1\1-морфолино)-этилсульфоновая кислота) рН доводят до 4,2 добавлением 0,01 М хлористоводородной кислоты Перемешивают в течение 1 часа при 37°С при рН4,2 Доводят до рН6 при помощи 2М раствора ацетата натрия и добавляют Юмкл 0,1 М раствора Na2EDTA = динатриевая соль зтилендиаминтетрауксусной кислоты, чтобы комплексовать избыток 111Индия Конечную очистку полученного таким образом конъюгата (1h) проводят с помощью ЖХВР (вытеснительная хроматография TSK-400/ME3буфер) Фракции, содержащие меченый конъюгат, разбавляют обычным физиологическим раствором, доводят до рН7,2 с помощью 0,01 М раствора гидроксида натрия и фильтруют Полученный таким образом раствор представляет препарат, пригодный для радиодиагностики 48140 ного соединения примера 20b) в MES буфере, рН 6,2 (MES = 2-(1Ч-морфолино)-этилсульфоновая кислота) рН доводят до 4,2 добавлением 0,01 М хлористоводородной кислоты Перемешивают в течение 1 часа при 37°С при рН4,2 Доводят до рН6 при помощи 2М раствора ацетата натрия и добавляют Юмкл 0,1 М раствора Na2EDTA = динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, чтобы комплексовать избыток 111Индия Конечную очистку полученного таким образом конъюгата (1п) проводят с помощью ЖХВР (вытеснительная хроматография TSK-400/ME3буфер) Фракции, содержащие меченый конъюгат, разбавляют обычным физиологическим раствором, доводят до рН7,2 с помощью 0,01 М раствора гидроксида натрия и фильтруют Полученный таким образом раствор представляет препарат, пригодный для радиодиагностики Пример 22 а) 1\1-(5-Меркапто-3-тиа-1 -оксо-пент-1 -ил)глицин метиловый эфир 12,56г (0,1 моль) гидрохлорида метилового 57 48140 эфира глицина, 13,42г (0,1 моль) 2,5-дитиациклогексанона и 10,12г (0,1моль) триэтиламина растворяют в атмосфере аргона в 500мл абсолютного дихлорметана Перемешивают в течение 24 часов при комнатной температуре, и затем загрузку выливают на 250мл 5% водной лимонной кислоты Хорошо перемешивают, органическую фазу отделяют и сушат над сульфатом натрия После выпаривания растворителя в вакууме маслянистый остаток хроматографируют на силикагеле (подвижный растворитель дихлорметан/метанол, метанол 0 -10%) Выход 18,9г (84,6%), бесцветное масло Элементный анализ Рассч Найд С С 37,65 37,43 Н Н 5,87 6,02 N N 6,27 6,12 021,49 S S 28,71 28,48 Ь) І\І-[5-(Трифенил метил меркапто)-3-тиа-1оксо-пент-1-ил]-глицин метиловый эфир 11,17г (50ммоль) 1\1-(5-Меркапто-3-тиа-1-оксопент-1-ил)-глицин метилового эфира (пример 22а)), 13,94г (50ммоль) трифенилметил хлорида и 5,06г (50ммоль) триэтиленамина растворяют в атмосфере аргона в 500мл абсолютного дихлорметана Перемешивают в течение 16 часов при комнатной температуре, и загрузку затем выливают в 150мл 5% водной уксусной кислоты Хорошо перемешивают, органическую фазу отделяют и сушат над сульфатом натрия После выпаривания растворителя в вакууме маслянистый остаток хроматографируют на силикагеле (подвижный растворитель дихлорметан/метанол, 95 5) Выход 15,7г (67,4%), бесцветное масло Элементный анализ Рассч Найд С С 67,07 67,01 Н Н 5,85 6,11 N N 3,01 2,93 010,31 S S 13,77 13,49 с) І\І-[5-(Трифенил метил меркапто)-3-тиа-1оксо-пент-1-ил]-глицин-М'-(6-гидроксигексил)-амид 11,64г (25ммоль) N-[5(трифенилметилмеркапто)-3-тиа-1-оксо-пент-1ил]-глицин метилового эфира (пример 22Ь) и 29,Зг (250ммоль) 6-аминогексанола сплавляют вместе в атмосфере аргона в течение 16 часов при 100°С После охлаждения реакционной смеси, ее помещают в 500мл дихлорметана, и затем в 250мл 5% водной лимонной кислоты При охлаждении и перемешивании, рН доводят до 6,5 концентрированной хлористоводородной кислотой Органическую фазу отделяют и сушат над сульфатом натрия После выпаривания растворителя в вакууме маслянистый остаток хроматографируют на силикагеле (подвижный растворитель дихлорметан/метанол, 0 -10% метанол) Выход 7,7г (56,0%), бесцветное масло Элементный анализ Рассч Найд С С 67,60 67,48 Н Н 6,96 7,03 N N 5,09 4,92 08,72 S S 11,64 11,43 d) 1\1-Диизопропил-О-цианоэтил-О'-[7,9-диаза8,11 -диоксо-13-тиа-15-(трифенил-меркапто)пентадек-1-ил]-фосфористая кислота амид 5,51г (Юммоль) N-[5(Трифенилметилмеркапто)-3-тиа-1-оксо-пент-1 58 ил]-глицин-І\Г-(6-гидроксигексил)-амида (пример 22с) растворяют в 50мл абсолютного дихлорметана и 50мл абсолютного пиридина 4,73г (20ммоль) хлорангидрида диизопро-пиламино-О-цианоэтилфосфористой кислоты, растворенного а 50мл абсолютного дихлорметана, вливают по каплям в загрузку при комнатной температуре Через 4 часа содержимое выливают на 250мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия, перемешивают, и органическую фазу сушат над сульфатом магния После испарения растворителя маслянистый остаток хроматографируют на силикагеле (дихлорметан/метанолл'риэтиламин 98 1 1) Выход 4,32г (57,5%), бесцветное вспененное масло Элементный анализ Рассч Найд С С 63,97 Н 7,38 N 1 7,46 63,81 Н 7,41 N 1 7,22 08,52 Р 4,12 S 8,54 Р 3,97 S 8,31 e) 5'-[г\1-(3'-Аза-8'-меркапто-1',4'-диоксо-6'-тиаокт-1'-ил)-6-аминогексил-фосфорная кислота сложный эфир] 5' CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T *Т*Т-3' 30-мерный олигонуклеотид 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3', идентифицированный по SELEX способу, с модификацией последовательности Т*Т*Т*Т*Т3', расположенной против хода транскрипции, получают с помощью автоматического синтезатора Pharmacia Company (смотри Ohgonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed F Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), и олигонуклеотид в защищенной форме все еще присутствует на колонке твердого носителя Нагрузка на колонку составляет около 15мг 35мерного олигонуклеотида После отщепления 5'DMT-защити ой группы, его связывают согласно стандартным методам с фосфорамидитом, описанным в примере 22d) После окисления йодом в тетрагидрофуране, конъюгат отщепляют от носителя Для этой цели вещество смешивают с 10мл 30% раствора аммиака и подвергают встряхиванию на протяжении ночи при 55°С Затем охлаждают до 0°С, центрифугируют, носитель промывают 10мл воды, и объединенные водные фазы лиофилизуют Для очистки вещество помещают а 5мл воды, добавляют 4мл 0,5моль, ацетата аммония и смешивают с 20мл этанола Для полного осаждения охлаждают в течение ночи (-20°С), центрифугируют, и остаток промывают 1мл этанола (-20°С) и сушат в вакууме Получают 9,5мг белого порошка Для отщепления S-тритил-защитной группы вещество помещают в 5мл 50 ммоль раствора ацетата триэтиламмония (рН=7) и инкубируют с 500мкл 0,1 М раствора нитрата серебра в течение 30 минут Затем добавляют 500мкл 0.14М раствора дитиотреитола и инкубируют в течение еще 30 минут После центрифугирования прозрачный супернатант обессоливают на Сефадексе G 10 Фракции, содержащие продукт, сушат вымораживанием Получают 3,5мг белого порошка f) Tc-99m Комплекс 5'-[Ы-(3'-Аза-8'-меркапто1 ',4'-ди-оксо-6'-тиа-окт-1 '-ил)-б-аминогексил 59 60 (рН=8,0) Затем 23,1мг (0,1 ммоль) сложного эфира S-ацетилмеркаптоуксусной кислоты -MHS, растворенного в 500мкл абсолютного ДМФ, добавляют к загрузке и инкубируют в течение 17 часов при комнатной температуре в атмосфере аргона Затем центрифугируют, концентрируют до объема 500мкл и хро-матографируют на Сефадексе G-25 После сушки вымораживанием получают Змг конъюгата в виде белого порошка b) Tc-99m Комплекс 5'-[І\І-(меркаптоацетил)-6аминогексил-фосфорная кислота сложный эфир] 51CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3' 1мг конъюгата, описанного в примере 24а), растворяют в 1мл 0,1 М динатрий кислого фосфатного буфера (рН=8,5) После добавления 10мг динатрий тартрата, его смешивают с раствором пертехнетата натрия (1мКи) и затем с Юмкл раствора хлорида олова (II) (5мг/1мл 0,01 М HCI) Выход по изотопу (прибл 97%) определяют с помощью ЖХВР Пример 25 а) Ы-[2-(Трифенил метил меркапто)-эт-1-ил]тиодигликолевая кислота моноамид 31,9г (0,1 моль) 2-(Трифенилметилмеркапто)этиламина и 10,1 г (0,1моль) триэтиламина вводят в 500мл абсолютного дихлорметана При 0°с вливают по каплям раствор 13,2г (0,1моль) ангидрида тиодигликолевой кислоты, перемешивают в течение 1 часа при 0°С и в течение 16 часов при комнатной температуре Затем выливают на 250мл 5% водной лимонной кислоты, хорошо перемешивают, органическую фазу отделяют и сушат над сульфатом натрия После выпаривания растворителя в вакууме остаток хроматографируют на силикагеле (подвижный растворитель дихлорметан/метанол, 0 - 20% метанола) 48140 фосфорная кислота сложный эфир] 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3' 1мг конъюгата, описанного в примере 22е), растворяют в 1мл 0,1 М динатрий кислого фосфатного буфера (рН=8,5) После добавления 10мг динатрий тартрата, раствор смешивают с раствором пертехнетата натрия (1мКи) и затем с Юмкл раствора хлорида олова (II) (5мг/1мл 0,01 М HCI) Выход по изотопу (прибл 95%) определяют с помощью ЖХВР Пример 23 а) 5'-[М-(6'-Аза-7'-гилроксикарбокси-9'меркапто-1 ',5'-диоксо-3'-тиа-нон-1 '-ил)-6аминогексил-фосфорная кислота сложный эфир] 51CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3' Сначала получают раствор Nгидросукцинимид сложный эфир моноамида N-(2оксо-тетрагилротиофен-3-ил)тиодигликолевой кислоты (DE 4311023) в 500мкл абсолютного ДМФ (DMF) Для этой цели 24,9мг (0,1ммоль) моноамида І\І-(2-оксо-тетрагидротиофен-3-ил)тиодигликолевой кислоты и 11,5мг (0,1ммоль) Nгидросукцинимида растворяют в 500мкл абсолютного ДМФ При 0°С к загрузке добавляют 19,2мг (0,1ммоль) EDC Перемешивают в течение 30 минут при 0°С 10мг 5'-(6-амино гексил-фосфорная кислота сложный эфир) 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3', полученного в примере 1, растворяют в 1мл бикарбонат натрия/карбонат натрия буфера (рН=8,0) Добавляют ДМФ раствор NHS сложного эфира, полученного заранее, и инкубируют в течение 16 часов при комнатной температуре в атмосфере аргона Затем центрифугируют, концентрируют до объема 500мкл и хроматографируют на Софадексе G-25 После сушки вымораживанием получают 2мг конъюгата в виде белого порошка Тс-99т Комплекс 5'-[N-(6'-A3a-7'гидроксикарбокси-9'-меркапто-1',5'-диоксо-3'-тианон-1'-ил)-6-аминогексил-фосфорная кислота сложный эфир] 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T *Т*Т-3' 1мг конъюгата, описанного в примере 23а), растворяют в 1мл 0,1 М динатрий кислого фосфатного буфера После добавления 10мг динатрий тартрата, его смешивают с раствором пертехнетата натрия (1мКи) и затем с Юмкл раствора хлорида олова (II) (5мг/1мл 0,01м HCI) Выход по изотопу (прибл 92%) определяют с помощью ЖХВР Пример 24 а) 5'-[І\І-(Меркаптоацетил)-6аминогексилфосфорная кислота сложный эфир] 51CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3' 10мг 5'-(6-амино-гексил-фосфорная кислота сложный эфир) 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3', полученного в примере 1, растворяют в 1мл бикарбонат натрия/карбонат натрия буфера Выход 20,32г (45,0%), бесцветное масло Элементный анализ Рассч Найд С С 66, 66, 49 21 Н Н 5,58 5,73 N N 3,10 2,98 010,63 S S 14,20 14,02 Ь) 5'-[М-(1',5'-Диоксо-6'-аза-3'-тиа-8'-меркаптоокт-1-ил)-аминогексилфосфорная кислота сложный эфир] 5' CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3' Сначала получают NHS-эфир моноамида N-[2(трифенилметил-меркапто)-эт-1-ил]тиодигликолевой кислоты (пример 25а) Для этой цели 45,2мг (0,1 ммоль) ранее упомянутой кислоты растворяют в 500мкл абсолютного ДМФ (0,1 ммоль) и смешивают с 11,5мг (0,1 ммоль) NHS После охлаждения до 0°С добавляют 19,2мг (0,1 ммоль) EDC и инкубируют в течение 30 минут при 0°С Раствор 10мг 5-(6-аминогексил-фосфорная кислота сложный эфир) 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T* Т*Т*Т-3' в 1мл бикарбонат натрия/карбонат натрия буфера (рН=8,0), описанного в примере 1, смешивают с 500мкл раствора NHS-эфира, полученного заранее Инкубируют в течение 16 часов при комнатной температуре Затем концентрируют путем выпаривания до объема 500мкл и хроматографи