Інфекційні клони вірусу ньюкаслської хвороби, вакцини і діагностичний набір

1. кДНК параміксовірусу птахів, що включає принаймні послідовність нуклеїнової кислоти, що відповідає 5'-кінцевій ділянці геному параміксовірусу птахів серотипу 1, що дозволяє одержувати інфекційну копію параміксовірусу птахів, де вказана кДНК включає послідовність ACCAAACAAAGATTT. 2. кДНК за п.1, яка включає повнорозмірну кДНК. 3. кДНК, яка включає принаймні послідовність нуклеїнової кислоти, що відповідає 5'-кінцевій ділянці геному параміксовірусу птахів серотипу 1, що дозволяє утворювати реплікований мінігеном парамі 2 (19) 1 3 77146 4 18. Спосіб одержання інфекційної копії параміксо27. Вакцина за пп.25 або 26, де вказана інфекційна вірусу птахів, що включає трансфекцію принаймі копія параміксовірусу птахів принаймні частково однієї клітини кДНК за будь-яким з пп.1-16 і інокупоходить від вірусу ньюкаслської хвороби (NDV). ляцію речовини, одержаної із вказаної клітини в 28. Спосіб ідентифікації зразків біологічних рідин алантоїдну порожнину ембріонального яйця, і невакцинованих тварин або тварин, вакцинованих одержання інфекційного параміксовірусу із вказаNDV-вакциною за п.27, від зразків біологічних ріної алантоїдної порожнини. дин тварин, інфікованих NDV дикого типу або вак19. Спосіб за п.18, де вказана клітина принаймні цинованих немодифікованим або стрічкогенним здатна експресувати вірусний нуклеокапсидний штамом NDV, що передбачає визначення у вказабілок (NP), фосфопротеїн (Р) або великий поліменому зразку присутності антитіл, специфічних по разний білок (L). відношенню до імунодомінантного епітопу або 20. Спосіб за пп.18 або 19, що додатково допускає маркера, експресованого згаданим NDV дикого розщеплення химерного білка вказаного вірусу. типу або немодифікованим NDV, але не згаданою 21. Спосіб за будь-яким з пп.18-20, що додатково вакциною. включає інкубацію вказаної клітини в середовищі 29. Спосіб за п.28, де вказані антитіла специфічні для росту, що має протеолітичну активність. відносно білка HN або F NDV. 22. Спосіб за п.21, де вказане середовище для 30. Спосіб за пп.28 або 29, де вказану тварину росту містить алантоїсну рідину, що має вказану вибирають з групи, яка включає домашю птицю, протеолітичну активність. переважно домашніх курей. 23. Спосіб за будь-яким з пп.18-22, де вказана клі31. Діагностичний набір для розрізнення вакцинотина є клітиною курки. ваних тварин та інфікованих тварин, що містить 24. Інфекційна копія параміксовірусу птахів, одерімунодомінантний епітоп або маркер, експресоважана способом за будь-яким з пп.18-23. ний NDV вірионом маркерної вакцини, але не NDV 25. Вакцина, що містить вірус за п.24. вірионом дикого типу, і засоби визначення aнтитіл 26. Вакцина за п.25, що містить живий вірус. NDV віриону, і засоби визначення антитіл. Даний винахід стосується інфекцій вірусу ньюкаслської хвороби домашнього птиці. Вірус ньюкаслської хвороби (NDV) є одним з найбільш різноманітних і смертельно небезпечних патогенів птахів. Майже одночасне поширення ньюкаслської хвороби, як явно нового типу захворювання в різних географічних регіонах і велике число типів різновиду і небезпеки захворювання викликало деякі проблеми в номенклатурі. Цю хворобу називають pseudo fowl pest, pseudo poultry plague, avian pest, avian distemper і avian pneumoencephalitis. Значення цієї хвороби визначається, головним чином, тим, що в XX сторіччі птахівництво перетворилося в міжнародну галузь господарства, що інтенсивно розвивається, яке супроводжується активними торговими зв'язками між країнами. Загалом, вважається, що перші спалахи ньюкаслської хвороби були зареєстровані в 1926 році на острові Ява (Індонезія), а також в м. Ньюкасліна-Тайні в Англії (Kraneveld, 1926; Doyle, 1927). Назва «ньюкаслська хвороба» була дана Дойлом як тимчасова для того, щоб при описі уникнути плутанини по відношенню до інших хвороб. Пізніше стало ясно, що інші менш важкі хвороби зумовлювалися вірусами, які не відрізнялися від NDV. У США респіраторне захворювання, що відносно легко протікало було названо пневмоенцефалітом птахів і як було показано, воно викликалося вірусом NDV (Beach, 1944). Протягом декількох років численні ізоляти NDV, які у домашніх курей викликали дуже слабі симптоми або взагалі були безсимптомними, були описані для різних районів світу. Був встановлений вплив наступних механізмів на поширення даної хвороби: 1) переміщення птахів взагалі, диких птахів, дичини, поштових голубів і одомашнених птахів; 2) переміщення людей і вантажів; 3) переміщення продуктів птахівництва; 4) поширення частинок, зважених в повітрі; 5) забруднення кормів для птахівництва; 6) забруднення води; 7) не повністю убиті або гетерогенні вакцини. У відповідності з ΟΙΕ, ньюкаслська хвороба представляє захворювання домашньої птиці, що викликається вірусом серотипу-1 параміксовірусів птахів (APMV-1), який характеризується індексом інтрацеребральної патогенності (ІСРІ) у добових курчат на рівні 0,7 або вище. Вірулентність вірусу також може бути підтверджена на основі наявності множинних основних амінокислот на С-кінці білка F2 і присутності F (фенілаланіну) в 117-му положенні, що є N-кінцем білка F1. Відсутність ознак такої амінокислотної послідовності може вимагати застосування тестів ІСРІ. Термін «домашній птах» означає домашніх курей, індичок, фазанів, качок, гусей, перепелиць, голубів, цесарок, куріпок і птахів, що не літають (страусів і ін.), яких вирощують або утримують в неволі для розмноження, виробництва м'яса і яєць для споживання або для штучного відтворювання природних популяцій дичини. У відповідності до Alexander, 1988, три панзоотії ньюкаслської хвороби були ідентифіковані після першого опису даної хвороби. Перша з них викликала перші спалахи захворювання і, як вважається, виникла в Південно-Східній Азії. Окремі спалахи, такі як спалах захворювання в Англії в 1926 році, відображали випадкові проникнення, що випереджали інфекції, які повільно насувалися через Азію на Європу. Друга панзоотія, як вважається, з'явилася в Середній Азії в кінці 60-х років XX сторіччя і досягла більшості країн до 1973 року. Найбільш швидке поширення другої панзоотії, мабуть, пояснюється справжньою революцією в птахівництві, що супроводжувалася інтенсивною міжнародною торгівлею. 5 77146 6 Третя панзоотія в основному вразила одоМ, а також білків F і HN, які нагромаджуються на машнених птахів, таких як голуби (Vindevogel & клітинній плазматичній мембрані. Новоутворені Duchatel, 1988). Цей спалах захворювання, як вірусні частинки вивільняються з інфікованої клівважають, виник на Середньому Сході в кінці 70-х тини за механізмом «брунькування». Більш доклароків. До 1981 року воно досягло Європи і потім дний опис процесів реплікації NDV можна знайти у швидко розповсюдилося в інші райони світу, в осPeoples, 1988. Як більш пізні огляди з молекулярновному внаслідок контакту між птахами під час ної біології параміксовірусів [див. Lamb & виставок і змагань, а також внаслідок міжнародної Kolakofsky, 1996]. торгівлі такими птахами. Крім промислових домашніх птахів (тобто куУ цей час ньюкаслська хвороба вельми широрей, цесарок, фазанів, індичок, качок, гусей, голуко поширена в багатьох країнах Азії, Африки, обох бів), дуже широке коло частково одомашнених Америк і Європи. Тільки країни Океанії відносно видів, що утримуються в неволі, і диких («свобовільні від цієї хвороби (Spradbrow, 1988). доживучих») птахів, включаючи мігруючих водопВірус NDV відноситься до ряду лавних птахів, сприйнятливі до NDV і можуть бути Mononegavirales, сімейства параміксовірусів первинними джерелами інфекції (Kaleta & Baldauf, Paramyxoviridae, підродини Paramyxovirinae, роду 1988). Rubulavirus. Крім NDV, який звичайно називається Патогенність штамів NDV значною мірою запараміксовірусом 1-го типу птахів, вісім інших сележить від вигляду організму, що уражається. ротипів, позначених як параміксовіруси типів від 2 Найбільш стійкими видами, мабуть, є водоплавні до 9 птахів, можуть бути ідентифіковані на основі птахи, в той час як найбільш сприйнятливими є параметрів їх антигенної спорідненості, що визнастайні птахи, що інколи створюють стабільні скупчаються в тестах на інгібування гемаглютинації і в чення. Домашні кури характеризуються високим тестах на нейтралізацію сироватки (Alexander, рівнем сприйнятливості, але качки і гуси також 1993). можуть заражатися, виявляючи при цьому слабі Незважаючи на стабільність серологічного симптоми хвороби або не виявляючи їх зовсім, диференціювання, є ряд перехресних родинних навіть при зараженні штамами, летальними для відносин між вірусами, що відносяться до різних курей. серотипів. Ньюкаслська хвороба ускладнена тим, що різГеном NDV представлений молекулою одноні ізоляти і штами цього вірусу можуть індукувати ланцюговою РНК з негативною полярністю, комсаму широку мінливість тяжкості хвороби. Штами і плементарною інформаційною мРНК, яка кодує ізоляти NDV були класифіковані (Beard & Hanson, вірусні білки. РНК-геном складається приблизно з 1984) в різні патотипи, що характеризуються симп15200 нуклеотидів і кодує наступні генні продукти томами хвороби, які можна виявити у повністю (перераховані від 3'-кінця до 5'-кінця послідовності сприйнятливих курей: геномної РНК): нуклеокапсидний білок (NP), фос1) вісцеротропний велогенний NDV, що виклифопротеїн (Р), матричний білок (М), білок злиття кає гостру летальну інфекцію, при якій в кишечни(F), гемаглютинін-нейрамінідаза (HN) і великий ку відбуваються крововиливи; і нейротропний вебілок з полімеразною активністю (L) [Chambers et логенний NDV, який викликає високу смертність, al., 1986]. що зумовлюється респіраторними і нейрологічниРНК формує комплекс з білками NP, P і L з ми симптомами, але без ураження кишечнику; утворенням рибонуклеокапсидної частинки (RNP), 2) мезогенний NDV, який зумовлює низький ріяка оточена оболонкою, вистеленою з внутрішньої вень смертності, гостру респіраторну інфекцію і сторони білком М. В склад оболонки входять білки симптоми в нервовій системі у окремих птахів; F і HN, які беруть участь в процесах приєднання 3) лентогенний NDV, який викликає слабу ресдо клітини-хазяїна і проникнення в неї. піраторну інфекцію або не викликає її зовсім, або Реплікація NDV схожа за своїми основними навіть безсимптомний кишковий NDV, авірулентпараметрами з такою ж у інших параміксовірусів. ний вірус, який в основному відтворюється в клітиПочатковим етапом є прикріплення вірусу до ренах травного тракту. цепторів клітини-хазяїна, в якому бере участь віПовідомлялося про деяке перекриття симпторусний білок HN. Злиття вірусної оболонки з меммів у різних груп. браною клітини-хазяїна визначається дією як білка Вірус попадає в організм через дихальні шляHN, так і білка F, внаслідок чого RNP вивільняєтьхи або травний тракт, або через очі. У трахеї вірус ся безпосередньо в цитоплазму, де відбувається розподіляється з участю війчастого епітелію і за реплікація вірусу. механізмом «від клітини до клітини». Після початВірусна РНК-залежна РНК-полімераза (що кового розмноження в місці проникнення вірус входить в склад RNP) бере участь в утворенні внаслідок періодів віремії переноситься в селезінкомплементарних транскриптів, які виконують ку, печінку, нирки і легені. Віруси деяких штамів роль мРНК і використовуються трансляційною досягають життєво важливих органів, таких як песистемою клітини-хазяїна для синтезу вірусних чінка і нирки, дуже швидко, тому птахи можуть білків. Завдяки накопиченню білка NP, комплекс гинути ще до того, як у них виявляться візуальні РНК-полімерази перемикає транскрипцію на реплісимптоми хвороби. кацію, внаслідок чого відбувається синтез повноБільшість вірусів досягає центральної нерворозмірних геномних і антигеномних (комплементавої системи через кров до того моменту, як почирних) молекул РНК. нає вироблятися достатня кількість антитіл. ПотеНовосинтезовані RNP упаковуються в капсиди нційну загрозу для птахівництва представляє на клітинній мембрані внаслідок активності білка статус тривалого безсимптомного носійства, при 7 77146 8 близно характерного для папуг. Довготривале ноЦе підкреслює важливість живих вакцин, здатсійство як лентогенного, так і велогенного вірусу них доводити вірусний антиген до верхніх відділів також може мати місце у курей (Heuschele & дихального тракту з точки зору індукції як місцевоEasterday, 1970). го, так і системного імунітету. Невеликі краплі проУ процесі реплікації NDV для того, щоб він никають в нижні відділи дихальної системи, тим став інфекційним, необхідно, щоб глікопротеїн самим сприяючи в основному виробленню гумопопередник Fo був розщеплений з утворенням F1 і ральної імунної відповіді, в той час як більш великі F2 (Rott & Klenk, 1988). Таке посттрансляційне краплі стимулюють місцевий імунітет у верхніх розщеплення відбувається з участю протеаз клітивідділах дихального тракту. Отже, аерозолі, що ни-хазяїна. Якщо таке розщеплення відсутнє, то утримують різні за розміром частинки, обумовлять утворяться інфекційні вірусні частинки, а реплікації найбільш ефективний як місцевий, так і гуморальвірусів не відбувається. Білок Fo вірулентних віруний імунітет. сів може бути розщеплений з участю широкого Однак необхідно зазначити, що, незважаючи кола протеаз, однак білки Fo вірусів, що характена інтенсивну вакцинацію вже існуючими в цей час ризуються слабкою вірулентністю, обмежені за вакцинами, що забезпечують вироблення високих своєю сприйнятливістю до протеаз, тому такі вірутитрів антитіл, проте, вірус може бути виділений зі си можуть in vivo рости тільки в деяких типах кліслизових поверхонь. тин-хазяїв і в принципі не здатні рости in vitro. Ідентифікація ньюкаслської хвороби в США Лентогенні віруси реплікуються тільки в ділянпривела до застосування інактивованих вакцин ках, що мають трипсино-подібні ферменти, такі як (Hofstad, 1953). Спостереження за тим, що деякі дихальний і травний тракти, в той час як вірулентензоотичні віруси викликають тільки слабкі симпний віруси можуть реплікуватися в значному числі томи хвороби, спочатку привели до розробки метканин і органів, внаслідок чого розвивається фазогенної живої вакцини Roakin (Beaudette et al., тальна системна інфекція. 1949), а після цього, до одержання ослаблених Амінокислотне секвенування попередника Fo штамів Hitchner B1 (Hitchner & Johnson, 1948) і показало, що слабовірулентні віруси включають LaSota (Goldhaft, 1980), які в цей час найбільш єдиний залишок аргініну (R), який сполучає компошироко застосовуються як живі вакцини. ненти F1 і F2, в той час як у вірулентних вірусів є Живі NDV-вакцини можуть бути поділені на дві додаткові основні амінокислоти, які в сайті розщегрупи, лентогенні і мезогенні. Мезогенні штами плення утворять дві пари, такі як K/R-X-K/R-R-F. придатні тільки для повторної вакцинації птахів Крім того, пептид F2 вірулентних штамів звичайно через їх досить істотну вірулентність. Імунна відпочинається залишком фенілаланіну, в той час як повідь посилюється нарівні з підвищенням патоу невірулентних штамів він звичайно починається генності живої вакцини. Отже, для досягнення баз лейцину. жаного рівня захисту без істотного вияву хвороби У деяких штамів NDV білок HN також виробляв існуючих програмах вакцинації застосовується ється у вигляді попередника, для біологічної актипослідовне використання вакцин з поступово зросвації якого потрібне розщеплення [Garten et al., таючою вірулентністю або використання живих 1980; Millar et al., 1988]. вакцин після інактивованих вакцин. Крім розщеплення білків F і ΗΝ, інші вірусні Одна з переваг живих вакцин пов'язана з тим, фактори можуть брати участь в патогенності. Було що вони можуть бути введені за допомогою низьпоказано [Madansky & Bratt, 1978, 1981а, 1981b], козатратних масових методів. Звичайний метод що зміни в транскрипції і трансляції можуть модутакого введення заснований на використанні питлювати ріст і поширення вірусу від клітини до кліної води. Однак, використання питної води повинтини, а також цитопатогенність. не ретельно контролюватися, тому що вірус може Початкова імунна відповідь на зараження вівтратити активність внаслідок нагрівання або освірусом NDV є клітинною і може бути виявлена, тлення, або дії вірицидних домішок самої води. принаймні, через 2-3 дні після інфікування живими Масове застосування живих вакцин з допомовірусними штамами. Приблизно це пояснює ранній гою розпилювачів або аерозолів також вельми захист від зараження, який був описаний у вакципопулярне через простоту можливої вакцинації нованих птахів перед тим, як виявляється вимірна великого числа птахів за короткий період часу. кількість антитіл [Gough & Alexander, 1973]. Важливим є забезпечення точного розміру частиПриблизно через тиждень після ін'єкції циркунок, для чого застосовується контроль умов, при люючі антитіла можуть захищати організм від пояких ці частинки утворяться. вторної інфекції. На ранніх етапах бере участь У живих вакцин, що застосовуються в цей час IgM, а після цього, IgG. Титри антитіл і піки захиє деякі недоліки. Вакцина може викликати симптощеності приблизно через З тижні різко йдуть на ми хвороби, що залежить від умов зовнішнього спад, якщо відсутня повторна імунізація («буссередовища і присутності ускладнюючих інфекцій. тинг»). Це означає необхідність повторних вакциОтже, важливо для первинної вакцинації викориснацій більш старих птахів. тати максимально ослаблений вірус, і, відповідно, Тільки живі вакцини, що вводяться через дипотрібне проведення неодноразових вакцинацій. хальну систему, стимулюють появу антитіл на всіх Більш того материнські антитіла можуть запобігати слизових поверхнях, а також в сироватці. Інактиуспіху первинної вакцинації з використанням ленвована вакцина, навіть при її внутрішньом'язовому тогенних живих вакцин. введенні, не зумовлює локальної респіраторної Інактивовані вакцини звичайно одержують на резистентності, навіть незважаючи на високий матеріалі інфікованої алантоїсної рідини, яку обвміст антитіл в сироватці. робляють формаліном або β-пропіолактоном для 9 77146 10 того, щоб убити вірус, і змішують з відповідним рулентний вірусів, які, заражають курей, що місад'ювантом. Інактивовані вакцини вводять шляхом тяться у відкритих умовах. ін'єкції, або внутрішньом'язово, або підшкірно. ІнАнтитіла до NDV, які здатні захищати організмактивовані вакцини в зв'язку з їх одержанням і захазяїн, можуть бути кількісно оцінені в тестах на стосуванням вельми дорогі. нейтралізацію вірусів. Однак, оскільки відповідь на Однак, інактивовані масляно-емульсійні вакнейтралізацію розвивається паралельно відповіді цини не в такій мірі схильні до негативного впливу на пригнічення гемаглютинації (НІ-реакція), останматеринського імунітету, як це відбувається у разі ній з вказаних тестів часто застосовують для оцінживих вакцин, тому їх можна застосовувати для ки захисної відповіді, особливо після проведення добових курчат. Перевагами інактивованих вакцин вакцинації. є низький рівень несприятливих реакцій у вакциАнтитіла, специфічні відносно обох білків F і нованих птахів, високий рівень захисних антитіл і HN, можуть нейтралізувати NDV. Однак, антитіла значна тривалість захисту. Жодна з вказаних вище до білка F, мабуть, зумовлюють більш значну нейвакцин не диференціюється серологічно від вірусу тралізацію в порівнянні з такою у випадку з антитіNDV дикого типу. лами до білка HN в тестах in vivo і in vitro Розробка рекомбінантних вірусних вакцин (Meulemans et al., 1986). представляла інтерес для промислового птахівниПрисутність специфічних антитіл до NDV в сицтва протягом ряду років. Суттю такого підходу є роватці птиці дає недостатню інформацію про інвнесення генів, що кодують ключові імуногенні фекційний штам NDV, а, отже, має обмежене діагепітопи збудника хвороби, який представляє інтеностичне значення. рес в неістотні ділянки геному вірусу, що служить Поширеність лентогенних штамів NDV у птахів вектором. Отже, вакцинація рекомбінантним віруу більшості країн і практично повсюдне застосусом приводить до імунізації як проти вірусування живих вакцин, які неможливо відрізняти, вектора, так і проти хвороботворного агента, що принаймні, при серологічному порівнянні штамів аналізується. NDV дикого типу, означає, що просте виявлення Деякі типи вірусів були оцінені як можливі живі інфекції рідко виявляється адекватним обґрунтувірусні вакцини для птахівництва. Два віруси птаванням для застосування заходів для боротьби з хів, які привернули найбільшу увагу, представлянею. Оскільки хвороба в природних умовах може ють вірус курячої віспи (FPV) і герпесвірус індичок бути неінформативним маркером реальної віруле(HVT). Вірус курячої віспи є ДНК-вірусом, що харантності даного вірусу, то необхідно додатково охактеризується великим геномом: отже, він вельми рактеризувати виявлений вірус. місткий з точки зору включення чужорідних генів. У цей час єдиним способом діагностики ньюПісля ослаблення вірус FPV не викликає клінікаслської хвороби, який би дозволяв характеризучної картини хвороби і звичайно використовується вати інфекційний штам, є виділення вірусу з подаяк вакцина для домашніх курей. Вірус HVT також є льшим його патогенетичним аналізом. У цей час ДНК-вірусом і класифікується як серотип III сімейсіснують три таких тести, що проводяться in vivo: тва вірусів хвороби Марека (MDV). HVT непато1) середній час загибелі яєць (тест MDT); генний для курей, забезпечує перехресний захист 2) індекс інтрацеребральної патогенності (ІСвід MDV і звичайно використовується для вакциРІ) у добових курчат; нації курей проти хвороби Марека. 3) індекс внутрішньовенної патогенності (IVPI) Було показано, що захист проти ньюкаслської у 6-тижневих птахів. хвороби може бути викликаний шляхом викорисЦим тестам властивий ряд недоліків, таких як тання рекомбінантних вакцин HVT або FPV доступність об'єктів, погана відтворюваність ре[Morgan et al., 1992, 1993; Heckert et al., 1996; зультатів і відносно тривалий час аналізу. НарешBoursnell et al., 1990; Taylor et al., 1990]. ті, хоч це не менш важливо, вказані тести не доОднак, вияв захисту проти ньюкаслської хвозволяють досить просто розмежовувати птахів, роби після вакцинації такими рекомбінантними вакцинованих вакциною або інфікованими штамом вакцинами, які експресують або білок F вірусу дикого типу, за серологічними параметрами. NDV, або обидва білки F і HN, значною мірою заЯк альтернатива тестам in vivo полімеразна тримувався в порівнянні з ситуацією при вакциналанцюгова реакція (ПЛР) була успішно застосовації стандартною живою або інактивованою вакцина для розпізнавання вірулентних і невірулентних ною NDV, що, мабуть, пояснюється тим, що ізолятів [Stauber et al., 1995; Kant et al., 1997], одрекомбінантні вакцини або не забезпечують доснак, з іншого боку, серологічне диференціювання татньої широти спектра антигенно активних епітобуло неможливе. пів NDV, крім тих, які знаходяться в складі білка Розвиток птахівництва і торгівлі продуктами NDV, експресованого рекомбінантною вакциною, птахівництва в цей час вийшов на міжнародний або не зазнають точного презентування імунній рівень і часто контролюється транснаціональними системі. корпораціями. Загроза ньюкаслської хвороби є Більш того внаслідок вакцинації птахів рекомістотним фактором, що обмежує розвиток такої бінантими вакцинами не відбувалося ефективної торгівлі. індукції місцевого захисту (для слизових, дихальУспішний контроль ньюкаслської хвороби буде ної системи і травного тракту). Це є серйозним досягнутий тільки тоді, коли всі країни будуть повінедоліком, оскільки вакцини, що використовуються домляти про її спалахи. Однак, досягнення міжнадля початкової вакцинації проти респіраторних родних угод не так просто через значне варіюванзахворювань, повинні забезпечувати місцевий ня міри контролю над захворюваністю в різних імунітет для запобігання інфекції і поширення вікраїнах. Деякі країни не проводять вакцинацію і 11 77146 12 відмовляються від якого б те не було внесення ознаками відрізнятися від NDV дикого типу, які NDV в популяції домашніх птахів, оскільки вакцидосі не були доступні. нованих птахів не вдається відрізнити від тих, які Даний винахід представляє спосіб модифікації були заражені вірусом NDV дикого типу. геному параміксовірусу птахів за допомогою генеУ інших країнах допускається використання тичної модифікації, представляє генетично модитільки конкретних живих вакцин, а інші вакцини фікований параміксовірус птахів і маркерну за парозглядаються як неприйнятні і вірулентні. У ряді раміксовірусом птахів вакцину. країн ще зберігається присутність циркулюючого Розвиток сучасних молекулярно-генетичних високовірулентного вірусу, що, однак, не вдається методів дозволяє провести генетичну модифікацію розпізнати через маскування справжньої хвороби багатьох РНК-вірусів, включаючи віруси з некодунаслідками вакцинації. ючими одноланцюговими РНК. Таку стратегію часУ багатьох країнах існують законодавчі акти, то називають «зворотною генетикою». Спочатку що дозволяють контролювати спалахи ньюкаслсьстворюють кДНК-копію (повнорозмірну) вірусної кої хвороби, які можуть відбуватися. Державні заРНК, після чого транскрибують цю ДНК у відповідходи спрямовані на запобігання попадання і пошиних клітинах з одержанням інфекційної РНК, яка рення збудника. У більшості країн існують знову може реплікуватися з утворенням інфекційобмеження в торгівлі продукцією птахівництва, них вірусних частинок. яйцями і живими птахами. У більшості країн існуЗагалом, шляхом попередньої модифікації ють карантинні процедури для імпортної продукції, кДНК із застосуванням стандартних молекулярноособливо для папуг. біологічних методів можливим виявляється одерУ деяких країнах проводиться політика викоріжати генетично модифікований РНК-вірус. Однак, нювання інфекції з примусовим знищенням заратакий підхід ні разу раніше не застосовували у жених птахів, птахів, що контактували з ними і відношенні NDV або інших параміксовірусів і напродуктів. У інших потрібна профілактична вакцивіть ще не було можливим створити мінігеномні нація птахів навіть при відсутності спалахів, хоч в фрагменти або плазміди на матеріалі фрагментів ряді країн існує політика «кільцевої вакцинації», геному параміксовірусу птахів з метою вивчення що проводиться з метою формування навколо процесів реплікації параміксовірусів птахів, тим району спалаху буферної зони. самим приходячи до розуміння того, як сконструюОчевидно, що існує насущна потреба у вдосвати інфекційну вірусну копію. коналених вакцинах і у вдосконалених методах Хоча в даному описі тепер повністю встановдіагностики, яку можна застосовувати для контролено, що геном параміксовірусу птахів є самим лю ньюкаслської хвороби. Зумовлені як значними маленьким серед всіх секвенованих до теперішвідмінностями в тій дозі, яку одержують окремі нього часу геномів, параміксовірусів, особливо 5'птахи у разі проведення масової вакцинації живикінцева ділянка послідовності геному NDV неспоми вакцинами, так і мінливістю в рівнях материндівано виявилася істотно довшою, ніж це раніше ського імунітету у молодих курчат, реакції після було встановлено і чого можна було чекати виховакцинації живими вакцинами виявляються немидячи з порівняльного аналізу інших представників нучими. Це є однією з основних причин для невдоParamyxoviridae. Даний винахід уперше представволення фермерів в тих країнах, в яких вакцинація ляє повну послідовність геному параміксовірусу є обов'язковою. Більш того багато які вакцини птахів і представляє повнорозмірну або мінігеномпредставлені сумішами субпопуляцій. Після клону кДНК такого вірусу. нування ці субпопуляції можуть значною мірою Даний винахід представляє тут кДНК параміквідрізнятися одна від одної за параметрами імуносовірусу птахів, принаймні, включаючи нуклеотидгенності і патогенності (Hanson, 1988). ну послідовність, відповідну 5'-кінцевій ділянці геОднак, самим істотним недоліком живих вакному параміксовірусу птахів, що дозволяє цин, що застосовуються в цей час і інактивованих створювати інфекційну копію параміксовірусу птавакцин є той факт, що вакцинованих тварин не хів, при тому, що переважно кДНК включає повноможна відрізнити від заражених тварин, викорисрозмірну кДНК. Однак, даний винахід також предтовуючи сучасні методи скринінгу, такі як тест на ставляє кДНК, принаймні, включаючи нуклеотидну пригнічення гемаглютинації або тест на нейтраліпослідовність, відповідну 5'-кінцевій ділянці геному зацію вірусу. параміксовірусу птахів, дозволяючи тим самим Відповідно, як і раніше вірулентний польовий утворювати мінігеном параміксовірусу птахів, що вірус може розповсюджуватися серед вакциновареплікується. Такі мінігеноми переважно можна них популяцій, оскільки симптоми хвороби маскувикористати для транскрипції РНК і/або експресії ються вакцинацією. Оскільки виділення вірусу і білка з нуклеїнових кислот з модифікованою посхарактеристика вірулентності методами in vivo у лідовністю. Даний винахід представляє кДНК відвеликому масштабі скрутна, є істотна потреба в повідно до винаходу, яка, принаймні, частково є нових живих і ефективно ослаблених вакцинах, які похідною від вірусу ньюкаслської хвороби, наприможна було б відрізняти від польових вірусів за клад, при тому, що вказаний вірус ньюкаслської серологічними параметрами. хвороби представляє лентогенний вірус, що переТакі вакцини, названі NDV-маркерними вакциважно є похідним від вакцинного штаму, такого як нами (і супроводжуючі їх способи діагностики і штам Ласота (LaSota), ATCC VR-699. набори реактивів), які повинні представляти найКрім того, даний винахід представляє кДНК вібільш повний можливий імунологічний спектр епідповідно винаходу, що додатково містить модифітопів NDV з відповідними антигенними властивоскацію, таку як делеція, вставка, мутація, реверсія тями і, крім того, повинні за серологічними або інша зміна в нуклеїновій кислоті. Наприклад, 13 77146 14 представляється кДНК, в складі якої вказана моний для використання як вакцини, оскільки одердифікація включає нуклеїнову кислоту, що кодує жаний таким чином інфекційний вірус «за умовмодифікований сайт розщеплення протеазою, начанням» дуже вірулентний, щоб використовуватиприклад, коли вказаний сайт розщеплення є сайся як вакцина; той факт, що він може бути том розщеплення протеазою, характерним для утворений і реплікований після трансфекції кДНК злиття білка(Р). клітинної лінії, відображає його легку розщеплюЩе в одному варіанті даний винахід представваність за білком Fo на F1 і F2, що обговорювалоляє кДНК відповідно винаходу, в складі якої згадася вище в зв'язку з критеріями вірулентності NDV. на модифікація включає нуклеїнову кислоту, що Використовуючи вакцинний штам як початкокодує химерний вірусний білок, такий як химерний вий матеріал для одержання кДНК, неможливо білок гемаглютинін-нейрамінідази (HN), як описано вирішити дану проблему; вакцинний штам, особв експериментальному розділі даного винаходу. ливо лентогенного типу, не містить білка Fo, що Також даний винахід представляє кДНК відповідно легко розщеплюється, внаслідок чого неможливо винаходу, в складі якої згадана модифікація є деодержати вірус першого покоління, який міг би лецією в нуклеїновій кислоті, що кодує вірусний реплікуватися. Клітина, що використовується для білок, такий як матричний білок М. трансфекції, не повинна бути здатною до підтримКрім того, даний винахід представляє кДНК віки одного або декількох циклів реплікації вірусу дповідно винаходу, додатково включаючи нуклеївакцинного типу, що включає нерозщеплений бінову кислоту, що кодує гетерологічний антиген, лок Fo. переважно при тому, що вказаний антигенний є Даний винахід тепер пропонує витончене розпохідним від патогена птахів, як, наприклад, опив'язання даної проблеми і тим самим представляє сано далі. Також представляються РНК і похідний інфекційну копію NDV, наприклад, для викорисвід неї білок, одержані з кДНК відповідно до даного тання у вакцині. винаходу. Даний винахід представляє спосіб створення Недавно деякі віруси з несегментованим некоінфекційної копії вірусу ньюкаслської хвороби, що дуючим РНК-ланцюгом були повністю охарактеривключає трансфекцію клітин, здатних експресувазовані, а фундаментальні дослідження з реплікації ти вірусні білки ΝΡ, Ρ і L для утворення комплексу і експресії їх геномів забезпечили можливість з вірусної РНК, з використанням клонованої повстворення інфекційного вірусу повністю за допонорозмірної кДНК або кДНК, відповідної за розмімогою клітин, трансфікованих клонованою кДНК ром геному згаданого вірусу, і додатково, включазгаданого вірусу (огляд Conzelmann, 1996). ючий інкубацію згаданих клітин в поживному До теперішнього часу інфекційні частинки вісередовищі, що виявляє протеолітичну активність, русів з несегментованим некодуючим РНКщо забезпечує розщеплення білка Fo згаданого ланцюгом були одержані з використанням клоновірусу. ваної кДНК, наприклад, вірусу сказу [Schnell et al., У системі, використаній заявниками, котранс1994; Conzelmann, європейська патентна заявка фекцією плазміди, експресуючої NP, можна нехтуЕР0702085А1], вірусу везикулярного стоматиту вати. Мабуть, NP експресується з повнорозмірної [Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995], вірусу кДНК, оскільки ген NP є першим за розташуванням Сендай [Garcin et al., 1995], вірусу кору [Radecke et геном після 5'-кінцевої ділянки антигеномної посal., 1995; Schneider et al., 1997; європейська патенлідовності РНК Оскільки еукаріотичні мРНК звитна заявка ЕР0780475А1], респіраторночайно є моноцистронними, експресії дистально синцитіального вірусу людини [Collins et al., 1995], розташованих генів не передбачається. Однак, вірусу чуми рогатої худоби [Baron & Barrett, 1997] і можливим є створення повнорозмірної кДНК, в вірусу парагрипу людини 3-го типу [Hoffman & якій відносне розташування генів NDV змінене. Banerjee, 1997; Conzelmann, європейська патентна Якщо спочатку в кДНК розташований такий ген, як заявка ЕР0702085А1], [Schnell et al., 1994; євроген Ρ і L, то немає необхідності в експресії відповіпейська патентна заявка ЕР0702085А1]. дного генного продукту з котрансфікованої плазОднак, всі вказані вище інфекційні копії вірусів міди. здатні рости як in vivo, так і in vitro в організмахЯк альтернатива використанню повнорозмірхазяїнах, тканинах або клітинах різного походженної кДНК можливим є використання двох або біня, що забезпечує просту трансфекцію кДНК, її льшого числа субгеномних (за розміром) кДНК, на реплікацію і утворення інфекційних вірусних часматриці яких утворяться компетентні за реплікацітинок у відповідній лінії клітин. єю субгеномні РНК і які разом одна з іншою ексТака можливість відсутня у випадку з NDV, а, пресують повний комплект білків параміксовірусу значить, і для лентогенних штамів NDV, що викоптахів. Навіть якщо ці РНК упаковані окремо, так ристовуються у вакцинах. Вірулентність такого що утворені, в результаті вірусоподобні частинки штаму NDV опосередкована його здатністю репліможна використати для послідовних циклів реплікуватися в широкому колі клітин, а це виявляється кації шляхом спільної інфекції і комплементації в тому, що вірулентні штами можуть легко репліфункцій різних генів. куватися in vitro і in vivo, в той час як вакцинні У переважному варіанті даний винахід предштами можуть реплікуватися винятково in vivo. ставляє спосіб, в якому вказана протеолітична Таким чином, для NDV характерна парадоксаактивність забезпечується ферментом, таким як льна ситуація. Хоча спроби створити інфекційну трипсино-подібний фермент, або забезпечується копію вірусу, наприклад, з використанням інфеккомпозицією, що містить вказану протеолітичну ційної кДНК, мабуть, можуть дати в результаті інактивність. У найбільш переважному варіанті вкафекційний вірус, такий вірус в принципі непридатзане поживне середовище містить алантоїсну рі 15 77146 16 дину, що має протеолітичну активність. Розщепі інокуляції матеріалу, одержаного від вказаних лення білка Fo необхідне, для утворення інфекційклітин, що культивуються, в алантоїсну порожнину ного вірусу. Можливим є утворення інфекційного яйця, що розвивається. Вказаний матеріал, напривірусу на матеріалі лентогенного штаму без доклад, містить клітини (зібрані або заморожені або дання зовнішньої протеолітичної активності. При які розтали) або клітинний дебрис, або надосадоінокуляції надосадовим шаром трансфікованих вий шар, одержаний від вказаної клітинної кульклітин в порожнину алантоїсу яйця, що розвиватури. ється протеолітична активність, характерна для Наприклад, в даному тексті описується спосіб алантоїсної рідини, буде здатна розщеплювати виділення інфекційного вірусу, в якому надосадобілок Fo з утворенням компетентного за злиттям вий шар трансфікованих моношарових культур комплексу F1/F2. Віріони з таким активованим білклітин CEF був інокульований в алантоїсну порожком F здатні інфікувати сприйнятливі клітини і репнину яєць, що розвиваються. Через 4 дні збирали лікуватися в клітинах, що виявляють бажану проалантоїсну рідину, аналізували її в гемаглюнатитеолітичну активність, з одержанням інфекційного наційному тесті і далі переприщеплювали в яйця. потомства. Як альтернатива внесення бажаної Крім того, даний винахід представляє спосіб, протеолітичної активності в надосадовий шар тращо додатково включає переприщеплювання вкансфікованих клітин можна, наприклад, використазаної інфекційної копії вірусу ньюкаслської хвороти клітину, яка пермісивна за NDV і яка вже виявби шляхом збору алантоїсної рідини і повторної ляє вказану протеолітичну активність. Таку інокуляції яєць, що розвиваються. клітинну лінію використовують для одержання інУ переважному варіанті даного винаходу фекційного лентогенного NDV без додання зовніпредставляється спосіб, в якому вказаний вірус є шньої протеолітичної активності. Також така клілентогенним вірусом, наприклад, похідним від тинна лінія може бути утворена за допомогою авірулентного польового вірусу NDV або від вакстабільної трансфекції клітинної лінії геном, який цинного штаму NDV, такого як штам NDV LaSota. забезпечує згадану активність. Більш того можлиБільш того представляється спосіб модифікації вим є створення стабільної трансфікованої клітингеному параміксовірусу птахів шляхом генетичного ної лінії, яка експресує білок F дикого типу до модифікування, що дозволяє вносити одну або складу вірусної оболонки, тим самим утворюючи декілька мутацій, делецій і/або вставок або інших інфекційні частинки (самі вони позбавлені геноммодифікацій. Наприклад, представляється спосіб ної інформації, що кодує білок F дикого типу), здаослаблення або модифікування вірулентності патні проникати в клітину. Порятунок інфекційного раміксовірусу птахів шляхом модифікування кДНК, лентогенного вірусу також можливий за допомонаприклад, що кодує вірусний білок, такий як білок гою інфікування трансфікованих клітин вірусомV, клонування вказаної модифікованої кДНК в помічником NDV. Важливою вимогою, що пред'явсклад повнорозмірної кДНК і створення інфекційляється до такого вірусу-помічника, повинно бути ної копії вірусу з вказаної повнорозмірної кДНК, те, щоб він підлягав відбору, наприклад, з викоривнаслідок чого одержують нові штами NDV або станням нейтралізуючих антитіл, які видаляють нові ослаблені живі вакцини, що мають поліпшені вірус-помічник, але які не взаємодіють з самим властивості. лентогенним вірусом. Нарешті, можна сконструюКрім ослаблення внаслідок модифікації генних вати стабільно трансфіковану клітинну лінію, яка б продуктів також можливим с ослаблення парамікекспресувала один, два або всі три ключові білки совірусу птахів за допомогою модифікування нукNDV, ΝΡ, Ρ і L. З точки зору підтримки утворення леотидних послідовностей, які залучені до транскінфекційних піків вірусу для таких клітинних ліній рипції і/або реплікації. Такі модифікації необхідна коекспресія тільки набору з трьох клюзумовлюють одержання ослаблених штамів, які чових білків або коекспресія взагалі не потрібна. У експресують близькі до дикого типу білки F, що переважному варіанті даний винахід представляє розщеплюються як in vitro, так і in vivo в широкому спосіб, в якому вказані клітини, що використовуколі клітин, а в результаті що зумовлюють більш ються для трансфекції, є похідними від первинних високий рівень імуногенності в порівнянні з класиабо повторних клітин або клітинних ліній курчати. чними вакцинними штамами. Як приклад в описі приводяться клітини CER або У переважному варіанті даний винахід предCEF, які, як і більшість клітин in vitro, в принципі ставляє спосіб ослаблення або модифікування, позбавлені відповідних протеаз, необхідних для вірулентності параміксовірусу птахів, такого як розщеплення білка Fo вірусу NDV, наприклад, вірус ньюкаслської хвороби, що включає модифіштаму LaSota. Однак, також можна використати кацію сайта розщеплення протеазою у вірусному клітини, похідні, наприклад, від інших птахів. білку шляхом модифікування кДНК, що кодує вкаДалі даний винахід представляє спосіб ствозаний сайт розщеплення, що додатково включає рення інфекційної копії вірусу ньюкаслської хвороклонування вказаної кДНК до складу кДНК геномби, що включає трансфекцію клітин з використанного розміру, наприклад, вірусу ньюкаслської хвоням клонованої повнорозмірної кДНК або кДНК роби, з утворенням інфекційної копії вірусу ньюкагеномного розміру вказаного вірусу, наприклад, слської хвороби. Наприклад, вказаний сайт відповідно до показаного на Фіг.3, і додатково, що розщеплення є сайтом протеазного розщеплення включає інкубацію вказаних клітин у поживному в послідовності білка F або HN вірусу ньюкаслсьсередовищі, що містить протеолітичну активність, кої хвороби. Загалом, ослаблення обмежується що забезпечує розщеплення білка Fo вказаного зниженням вірулентності, однак, зараз також можвірусу, що додатково включає виділення інфекційливо використати відносно авірулентний штам ного вірусу шляхом культивування вказаних клітин NDV і одержувати потомство такого штаму, що 17 77146 18 характеризується підвищеною вірулентністю, на[HN] або інші), вірус інфекційного бронхіту (IBV) приклад, шляхом внесення їх для реплікації в клі(пепломірний або антирецепторний білок, нуклеотини специфічного типу. Так, в цей час можливо протеїн), реовіруси (σ-білок), аденовіруси, пневмонадати вірусу NDV різні рівні вірулентності. віруси, сальмонелу Salmonella enteritidis, Даний винахід представляє спосіб антигенної Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Bordatella модифікації параміксовірусу птахів, такого як вірус avium (раніше звана Alcaligenes faecalis), ньюкаслської хвороби, що включає модифікування Haemophilias paragallinarum, Pasteurella multocida, кДНК, що кодує, принаймні, частину вірусного білOrnithobacterium rhinotracheale, Riemerella (раніше ка, несучого, принаймні, один імунодомінантний Pasteurella) anatipestifer, мікоплазми-слизовики епітоп, що додатково включає клонування вказаної (Mycoplasma gallisepticum, M. synoviae, M. кДНК до складу кДНК геномного розміру вірусу mereagridis, M. iowae) або аспергіли (Aspergillus ньюкаслської хвороби і створення інфекційної копії flavus, A. fumigatus). вірусу ньюкаслської хвороби. Даний винахід представляє тут параміксовірус Наприклад, даний винахід представляє спосіб птахів або похідні від нього штами, які можна ви(додаткового) модифікування NDV, наприклад, з користати як вакцинний вектор для експресії антивикористанням вже передбаченого способу ствогенів інших патогенів домашніх птахів. Деякі власрення інфекційної копії NDV (вакцини), тобто тивості наділяють вірус NDV ідеальним вакцинним представляється спосіб одержання рекомбінантної вектором для вакцинації проти респіраторних або NDV-маркерною вакцини, причому маркерна ваккишкових захворювань. 1) NDV можна легко кульцина містить найбільш повний з можливих або тивувати до дуже високих титрів в яйцях, що рознеобхідних імунологічний спектр відповідних антививаються. 2) Масова культура NDV в яйцях, що генних епітопів NDV, а також серологічно відрізнярозвиваються відносно дешева. 3) NDV-вакцини ється від NDV дикого типу за рахунок того, що за відносно стабільні і можуть бути легко введені медопомогою рекомбінантних методів був видалений тодами масової вакцинації, наприклад, з питною серологічно розпізнаваний епітоп або маркер. Даводою або шляхом розпилення або утворення ний винахід представляє спосіб модифікування аерозолю. 4) Природним шляхом зараження NDV антигенного складу параміксовірусу птахів, такого є респіраторний і/або через травний тракт, що відяк NDV, тим самим дозволяючи одержати, наприповідає природним шляхам зараження багатьма клад, живу NDV-маркерну вакцину, яку серологічно іншими патогенами домашніх птахів. 5) NDV може можна відрізнити від польових штамів параміксоіндукувати місцевий імунітет незалежно від присувірусів птахів. тності циркулюючого материнського антитіла. У одному з варіантів даний винахід представБуло показано, що NDV виявляє як сильні ляє інфекційну копію NDV, в якій білок HN вірусу протипухлинні, так і імуностимуляторні властивості NDV був модифікований шляхом рекомбінування [як огляд див. Schirrmacher et al., 1998: кДНК, що кодує частину вказаного білка HN, з Schirrmacher V., Ahlert Т., Steiner H.-H., HeroldкДНК, що кодує частину білка HN, похідного від Mende C, Gerhards R. & Hagmuller E., 1998, параміксовірусу птахів, наприклад, 2-го типу або 4"Immunization with virus-modified tumor cells". го типу. Вказаний гібридний білок HN виконує роль Seminars in Oncology., 25, 677-696]. Хоча вірус серологічного маркера для інфекційної копії штаму NDV, мабуть, не здатний продуктивно реплікуваNDV, одержаного таким чином, або може служити тися в нормальних клітинах людини, проте було для зміни тропності параміксовірусу птахів відносвідмічено виборче NDV-опосередковане знищення но інших клітин і (або) тканин. Ці так звані «маркеракових клітин людини. Після місцевої NDV-терапії рні штами», що представляються даним винахоу безтимусних мишей лінії "nude" було відмічено дом, дозволяють створювати вакцини, які є дуже розсмоктування пухлини вірусної природи і повна цінним інструментом оцінки поширення вірусу NDV ремісія ксенотрансплантатів людської пухлини. Це в комерційних популяціях птахів в світі. Крім того, обумовило використання NDV для терапії пухлин. крупномасштабне застосування таких маркерних Однак, проблема полягає в тому, що таке застосувакцин буде забезпечувати повне викорінювання вання може бути обмежене місцевим застосуванNDV за рахунок проведення інтенсивного скринінгу ням. і вилучення заражених популяцій. Зараження NDV індукує вироблення інтерфеДалі, представляється спосіб створення інферонів, цитокінів і інших потенційно важливих генкційної копії штаму NDV, який експресує один або них продуктів і додає плейотропні імуностимулябільше число антигенів інших патогенів і який моторні властивості пухлинним клітинам. Дана жна використати для вакцинації проти декількох концепція була використана для вироблення аутозахворювань. Така інфекційна копія вірусу NDV, логічних вакцин з пухлинними клітинами, що манаприклад, включає гетерологічну кДНК, що кодує ють свіжі функціональні зразки, які були інфіковані гетерологічний білок, що представляє, наприклад, NDV. Вакцину такого типу називають аутологічною вірус грипу птахів (AIV) (гемаглютинін Н5 і Н7 і пухлинною NDV-вакциною або ATV-NDV нейрамінідаза), вірус лейкозу птахів (ALV) (білок (Schirrmacher et al., 1998). Клітини, інфіковані NDV, env (gp85)), вірус недокрів'я курей (CAV) інактивують γ-опроміненням, що запобігає клітин(VP1+VP2), вірус хвороби Марека (MDV) (глікопроному розподілу, але зберігає можливість реплікації теїн-В (gB), gH), вірус інфекційного ларинготрахеїNDV в цитоплазмі інфікованих клітин. Після ввету (ILT) (gB, gH, gD), вірус інфекційного синовіїту дення пацієнтам вакцини ATV-NDV з участю NDV(IBDV) (VP2 і VP3), вірус ринотрахеїту індичок індукованих цитокінів відбувається рекрутування (TRT) (білок злиття F), параміксовіруси-2, -3 і -6 Т-клітин. Деякі з цих Т-клітин можуть експресувати птахів (PMV) (білок F, гемаглютиніннейрамінідаза Т-клітинний рецептор, який може взаємодіяти з 19 77146 20 пептидами з групи асоційованих з пухлинами антиТакож представляється спосіб створення умогенів, утворюючих комплекс з молекулами класу І вно-летального делеційного мутанта NDV, який головного комплексу гістосумісності, що знахоможна використати як самообмежену нетрансмідиться на поверхні клітин. Ця взаємодія зумовлює сивну вакцину-«носій». Делеційний мутант NDV індукцію цитотоксичної Т-клітинної відповіді, яка створюють таким чином, щоб він не був здатний зумовлює специфічне знищення аутологічних пухекспресувати матричний білок М, що бере участь в линних клітин. «брунькуванні» NDV на внутрішній поверхні кліДаний винахід представляє модулювання ретинної мембрани. Наприклад, даний винахід предпертуару і кількості цитокінів і імуностимуляторних ставляє фенотипічно комплементований штам білків, що індукуються зараженням NDV. Даний NDV, який не здатний експресувати білок М, але винахід представляє спосіб створення рекомбінаякий проте здатний інфікувати клітини і розповсюнтного NDV, який модифікований так, щоб включаджуватися за механізмом передавання «від клітити і експресувати гетерологічний(і) ген(и). Такий ни до клітини». Однак, мутантний вірус не здатний рекомбінантний NDV можна використати для мостворювати інфекційне потомство в некомплемендифікування репертуару і кількості імуностимулятованих клітинах. Це показує, що фенотипічно торних білків в інфікованих клітинах. У одному з комплементовані делеційні мутанти NDV можна варіантів даний винахід представляє рекомбінантвикористати як безпечні самообмежені вакцини, ний вірус NDV, який включає і експресує гени, що які не здатні розповсюджуватися в довкілля. Така кодують інтерферони, цитокіни або інші імуностинетрансмісивна вакцина об'єднує найбільш важмуляторні білки людини. Згаданий рекомбінантний ливу властивість живих вакцин, а саме ефективNDV використовують для вироблення вакцини ність, і найбільш важливу перевагу убитих вакцин, ATV-NDV, яка є більш сильною в порівнянні з стаа саме, безпеку. ндартною ATV-NDV. Наприклад, цитокіни IFN-α, Даний винахід представляє вірус ньюкаслської IFN-β, TNF-α, IL-1, IL-6; цитокіни (хемокіни) хвороби або похідні від нього штами, наприклад, RANTES, IP-10; інші гени, такі як HSP/ АСТН, енщо одержують шляхом пасирування або додаткодорфін, iNOS, EPA/TIMP, nfkb. Плейотропні імунового культивування яєць, що розвиваються або стимуляторні властивості NDV також можуть бути відповідних клітин, які є похідними від інфекційної використані як властивості ад'юванту для вакцикопії вірусу, що одержують за допомогою способу, нації тварин і людини проти інфекційних захворющо представляється даним винаходом. вань. У одному з варіантів даного винаходу чужоНаприклад, представляється NDV, який був рідні гени, що кодують відповідний(і) антиген(и) модифікований, принаймні, яким-небудь одним інфекційного(их) агента(ів), вносять в геном NDV, шляхом з метою створення інфекційної копії вірусу а одночасна експресія в інфікованих клітинах анньюкаслської хвороби, який ослаблений, модифітигену(ів) і імуностимуляторних білків може індукукований за рівнем вірулентності, модифікований вати могутню імунну відповідь проти інфекційного за антигенними властивостями, експресує гетероагента. У іншому варіанті даного винаходу імунослогічний антиген або є нетрансмісивним, або їх тимуляторні властивості NDV можуть бути додатпоєднання. ково посилені шляхом використання рекомбінантДаний винахід представляє тут NDV-вакцини, них NDV, які одночасно експресують антигенні і наприклад, що характеризуються наявністю факконкретні імуностимуляторні білки. У переважному торів вірулентності, які відрізняються або антигенваріанті даний винахід представляє створення ними параметрами, які відрізняються, призначені вакцин проти СНІД (синдром придбаного імунодедля цілей одержання маркерних вакцин і/або для фіциту) з використанням рекомбінантних NDV, які експресії гетерологічних антигенів, похідних від експресують відповідні антигени вірусу імунодефіінших патогенів, що знаходяться в трансмісивній циту людини (ВІЛ) як самі по собі, так і в поєднанні і/або нетрансмісивній формі. з імуностимуляторними білками. Така вакцина може бути убитою або живою Вірус NDV також використовують як ад'ювант вакциною. Переважно така вакцина є живою вакпри вакцинації тварин і людини проти інфекційних циною, однак убиті вакцини, що представляються захворювань. У одному варіанті даного винаходу даним винаходом, мають переваги в тих варіангетерологічні або чужорідні гени, що кодують відтах, в яких живі вакцини непридатні або застосовні повідний(і) антиген(и) інфекційного(их) агента(ів), лише в слабкій мірі, наприклад, при обмеженнях в вбудовують в геном вірусу NDV, а одночасна ексторгівлі або при інших умовах, що визначаються пресія інфікованими клітинами антигену(ів) і імупідходами в боротьбі з відповідним захворюностимуляторних білків може індукувати могутню ванням. імунну відповідь проти інфекційного агента. У інТакож даний винахід представляє спосіб діагшому варіанті даного винаходу імуностимуляторні ностики і відповідний тест-набір, призначений для властивості NDV додатково посилюють, викорисвиявлення антитіл, специфічних у відношенні вкатовуючи рекомбінантні NDV, які одночасно експрезаних відповідних імунодомінантних епітопу або сують антигенні і конкретні імуностимуляторні білмаркера, тим самим передбачаючи способи і підки. У переважному варіанті даний винахід ходи в здійсненні способу контролю і/або викоріпредставляє створення вакцин проти СНІД (синднювання NDV і/або інших захворювань домашніх ром придбаного імунодефіциту) з використанням птахів. Даний винахід представляє нові ефективні рекомбінантних NDV, які експресують відповідні вакцини, які за серологічними критеріями можна антигени вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) як відрізнити від польових вірусів і вже існуючих ваксамі по собі, так і в поєднанні з імуностимуляторцин. Такі нові вакцини, звані маркерними NDVними білками. вакцинами, забезпечують найбільш повний, з мо 21 77146 22 жливого імунологічний спектр відповідних антиМатеріали і методи генних епітопів NDV, а також серологічно відрізСтандартні процедури клонування були здійсняються від NDV дикого типу при застосуванні нені відповідно до посібника [Sambrook et al. діагностичних способів, що додаються і наборів. (1989)], за винятком випадків, що спеціально огоДаний винахід представляє спосіб ідентифікаворюються. Всі конструкції, що включають фрагції ревакцинованих тварин або тварин, вакциноваменти ДНК, одержані за допомогою полімеразної них NDV-вакциною за даним винаходом, в порівланцюгової реакції (ПЛР), перевіряли шляхом нянні з тваринами, інфікованими NDV дикого типу прямого секвенування. У послідовностях праймеабо вакцинованих немодифікованим мезогенним рів, що приводяться нижче, підкреслені нуклеотиабо лентогенним вакцинним штамом NDV, що ди, відповідні послідовностям NDV, а також визнавключає взяття у вказаної тварини, принаймні, чені положення в геномі NDV. Нуклеотидна одного мінімального зразка (такого як сироватка, послідовність рестрикційних сайтів, які використакров, яйця або очна рідина) і визначення у вказали для клонування, виділена напівжирним шрифному зразку присутності антитіл, специфічних у том. відношенні імунодомінантного епітопу або маркеКлітини і віруси ра, експресованого вказаним дикого типу або не Клітини CER [Smith et al., 1976] культивували в модифікованим вірусом NDV, але не вакциною за середовищі GMEM/EMEM (1:1), що містить 5% даним винаходом. фетальної телячої сироватки (FCS) і 2% суміші Даний винахід представляє спосіб, в якому антибіотиків, включаючи 1000од./мл пеніциліну, вказані антитіла специфічні відносно білка HN або 1000мкг/мл стрептоміцину, 20мкг/мл фунгізону, білка F вірусу NDV, наприклад, химерного білка, як 500мкг/мл поліміксину-В і 10 мг/мл канаміцину. описано в експериментальному розділі даної заявКлітини QT35 [Moscovici et al., 1977; Cho, 1982] ки. Наприклад, даний винахід представляє спосіб культивували в середовищі, одержаному у відподіагностики, в якому вказану тварину вибирають з відності з GibcoBRL/Life Technologies [№ за катагрупи, яка включає домашніх птахів, переважно логом 041-91536, композиція, запатентована Fort домашніх курей. Dodge], доповненої 5% FCS і 2% суміші антибіотиТакож даний винахід представляє діагностичків. Клітини QM5 [Antin & Ordahl, 1991] культивуваний набір для використання в способі серологічної ли в середовищі Μ199, доповненому 10% триптоідентифікації тварин. У одному варіанті даного во-фосфатного бульйону, 10% FCS і 2% суміші винаходу простий і швидкий тест на пригнічення антибіотиків. гемаглютинації (НІ) використовують для розмежуШтам Ласота (LaSota) вірусу NDV отримували вання вакцинованих тварин і інфікованих тварин. з Американської колекції типових культур (АТСС Тварини, вакциновані маркерною вакциною, в якій VR-699) і пасирували двічі через курячі ембріони, глобулярна «голівка» білка HN вірусу NDV повнісщо розвиваються. Перед початком конструювання тю замінена відповідною частиною білка HN вірусу і клонування кДНК вірус очищали в бляшках в іншого серотипу, не виробляють антитіла до HN трьох циклах очищення в бляшках в лінії первинNDV, а, отже, не пригнічують аглютинацію еритроних фібробластів курячого ембріона (CEF). З цією цитів з участю віріонів NDV. метою вірус титрували на клітинах CEF, що кульЗ використанням віріонів маркерної вакцини в тивуються в середовищі GMEM/EMEM (1:1), що тесті НІ детектують антитіла, специфічні відносно містить 5% фетальної телячої сироватки, 2% сухимерного білка HN, які можна використати як міру міші антибіотиків, 5% алантоїсної рідини, 30мМ ефективності вакцинації. Як альтернатива, для MgCI2, 200мкг/мл DEAE-декстрана (Sigma) і 0,8% визначення ефективності вакцинації використовуагару Nobel (Difco). Вірус з третього циклу очиють метод ELISA, в якому детектують антитіла до щення в бляшках (позначений як клон Ε13-1) кульбілка F вірусу NDV. тивували в яйцях, що розвиваються і через 4 дні Крім тесту НІ метод ELISA може бути викориспісля інокуляції алантоїсну рідину збирали і зберітаний для визначення присутності антитіл до HN гали при -70°С у вигляді аліквот. Рекомбінантний NDV. Антигеном, призначеним для використання в вірус курячої віспи fpEFLT7pol (Britton et al., 1996; такому тесті, є, наприклад, білок HN вірусу NDV, тут і FPV-T7, що далі позначається), який експреякий експресований за допомогою методів рекомсує РНК-полімеразу фага Т7, був люб'язно надабінантної ДНК, або консервативний пептид з HN ний Д-ром Міхаелем Скінером (М. Skinner) і цей NDV. вірус культивували на клітинах QT35. Також може бути використаний метод блокуюВиділення вірусної РНК чий ELISA. У цьому випадку одне або більше чисВсі маніпуляції здійснювали у вільному від ло моноклональних антитіл, специфічних по відРНКаз скляному або пластиковому посуді, а всі ношенню до консервативних епітопів HN NDV, розчини приготовляли з використанням вільної від використовують для визначення присутності в зраРНКаз води, яку обробляли 1%-вим діетилпіроказку, взятому у вакцинованої тварини, конкуруючих рбонатом (DEPC) і стерилізували автоклавуванантитіл. Тести ELISA переважно можуть бути виням. Вірус осаджали центрифугуванням з алантоїкористані в тому випадку, коли маркерна вакцина сної рідини при 21000об./хв. протягом 70 хвилин в містить тільки химерний білок HN або коли декільбекманівській центрифузі SW40 при 4°С. Осад ка епітопів в послідовності HN NDV замінені. ресуспендували в гомогенізаторному буфері Далі даний винахід пояснюється в експериме(50мМ Трис-НСl, рН=7,5, 50мМ Nad, 5мМ ЕДТА, нтальному розділі даного опису, який нічим не 0,5% SDS) і обробляли протеїназою-К (200мкг/мл) обмежує даний винахід. протягом 90 хвилин при 37°С при постійному пеЕкспериментальний розділ ремішуванні. Одержаний лізат двічі екстрагували 23 77146 24 рівними об'ємами суміші фенол/хлороформи (1:1), Нуклеотидну послідовність 3'- і 5'-кінців геному рН=5,4 і один раз рівним об'ємом хлороформу. NDV визначали з використанням процедур RACE Вірусну РНК осаджали з водної фракції доданням (метод швидкої ампліфікації кінців кДНК). РНК 0,1 об'єму 3Μ NaOAc (рН=5,3) і 2,5 об'ємів 100%NDV використали в реакції зворотної транскрипції вого етанолу. Преципітат збирали центрифугуванв кінцевому об'ємі 20мкл з праймером р360 (5'ням, 1 раз промивали 70%-вим етанолом, ресусGGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT-3': нуклеотиди пендували у воді і зберігали в аліквотах при -70°С. 14756-14779), який є похідним від опублікованої Зворотна транскрипція послідовності гена L вірусу NDV (Yusoff et al., Вірусну РНК (1,5мкг) змішували з 500нг прай1987). Одноланцюгову кДНК (2,5мкл зворотнотрамера в об'ємі 12мкл і інкубували протягом 10 хвинскриптазної суміші) додавали до 8пкмоль «якірлин при 70°С. Додавали 4мкл зворотнотранскрипного» праймера ALG3 (5'CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC-3') і тазного буфера 5 (250мМ Трис-НСІ, рН=8,3, лігували протягом ночі при кімнатній температурі в 375мМ KСl, 15мМ MgCl2; GibcoBRL/Life 20мкл реакційній суміші, що містить 50мМ ТрисTechnologies), 2мкл 0,1Μ дитіотреітолу (DTT) і НСІ, рН=8Д 10мМ MgCl2, 10мкг/мл бичачого сиро2мкл 10мМ dNTP (2,5мМ кожного дезоксирибонуквоточного альбуміну (БСА), 25% поліетиленгліколеотиду) і одержану суміш інкубували протягом 2 лю 1мМ НСС, 20мкМ АТФ і 10од. РНК-лігази фага хвилин при 42°С. Зворотну транскрипцію здійснюТ4 (New England Biolabs), як описано у Tessier et вали в кінцевому об'ємі 20мкл доданням 200од. al., 1986. По 1мкл лігаційної реакції використали як зворотної транскриптази (Superscript II; матрицю в реакції ПЛР з праймерами р375 (5'GibcoBRL/Life Technologies) з подальшою інкубаціCAATGAATTCAAAGGATATTACAGTAACT- 3'; нукєю протягом 60 хвилин при 42°С. Полімеразна леотиди 14964-14983) і ALG4 (5'ланцюгова реакція (ПЛР) GAAGGATCCAGAATCGATAG-37). Останній з цих Всі реакції ПЛР, які використали для визнапраймерів комплементарний «якірному» праймеру чення 3'- і 5'-кінців геному вірусу NDV (див. нижче), ALG3. Умови ПЛР (40 циклів) були наступними: 1 проводили з використанням ДНК-полімерази Taq хвилина при 94°С, 1 хвилина при 55°С і 2 хвилини (Perkin Elmer). Для клонування окремих генів NDV при 72°С. Одержані ПЛР-продукти очищали і клоабо великих субгеномних кДНК використали або нували в Т-вектор pBluescriptll-TSK (Ichihara & коректуючу ДНК-полімеразу Pwo, або суміші поліKurosawa, 1993). З іншого боку, обчищені ПЛРмераз Taq і Pwo (Expand High Fidelity Kit або продукти обробляли фрагментом Кленова ДНКExpand Long Template Kit) відповідно до інструкцій полімерази І з одержанням тупих кінців і клонувапостачальника (Boehringer Mannheim). Всі зразки ли за HincII-сайтом в плазміду pGEM4Z (Promega). інкубували протягом 2 хвилин при 94°С перед поТринадцять незалежних клонів (8 в pBluescriptllчатком вказаного числа циклів ПЛР. Після провеTSK і 5 в pGEM4Z) секвенували для встановлення дення вказаного числа циклів ПЛР зразки інкубунуклеотидної послідовності 5'-кінця геному NDV вали при температурі добудови ланцюга протягом штаму LaSota. Нуклеотидну послідовність 3'-кінця часу, принаймні, утроє більший за тривалий в повизначали двома незалежними методами. У меторівнянні з часом добудування в самому циклі ПЛР. ді І праймер ALG3 лігували на 3'-кінець вірусної ПЛР-фрагменти очищали безпосередньо з викоРНК з використанням РНК-лігази Т4, як описано [у ристанням набору High Pure PCR Product Schutze et al., 1995]. Реакційна суміш (при кінцеPurification Kit (Boehringer Mannheim) або після вому об'ємі 10мкл) містила 2,5мкг РНК NDV, проведення електрофорезу в агарозному гелі з 100пкмоль ALG3, 1мкл 10 РНК-лігазного Т4 бувикористанням набору для екстракції QiaexII (Qiagen) по суті, як описано у постачальників. фера (500мМ Трис-НСІ, рН=7,8, 100мМ MgCl2, Секвенування 100мМ DTT, 10мМ АТФ), 1мкл ДМСО, 1мкл 10мкМ Всі послідовності були визначені з викорисгексамінкобальтхлориду, 1мкл RNasin (Promega) і танням набору реактивів PRISM Ready Reaction 10од. РНК-лігази Т4 (New England Biolabs). Суміш Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin інкубували протягом ночі при кімнатній температуElmer). Реакційні суміші (5мкл) включали в 25 цикрі і 5мкл реакційної суміші літування використали лів лінійної ампліфікації (10 секунд при 94°С, 5 як матрицю в зворотнотранскриптазній (ЗТ) реаксекунд при 50°С і 4 хвилини при 60°С) з викорисції, в якій ALG4 використали як праймер. По 1мкл танням ампліфікатора GeneAmp 2400. Після цього зворотнотранскриптазної реакції використали в реакційні суміші осаджали етанолом, 1 разів прореакції ПЛР з праймерами ALG4 і р376 (5'мивали 70%-вим етанолом, ресуспендували в GAGCCTTAAGGAGCTGCTCGTACTGATC-3'; нук15мкл буфера TSR (Perkin Elmer) і нагрівали пролеотиди 137-164), які є похідними від опубліковатягом 2 хвилин при 94°С перед завантаженням в ної послідовності 3'-кінця NDV [Ishida et al., 1986]. автоматичний секвенатор моделі АВ310 (Applied Умови ПЛР були такими ж, як описано вище для Biosystems). 5'-RACE. У методі II 3'- і 5'-кінці РНК вірусу NDV Нуклеотидні послідовності праймерів, які були лігували один на інший з використанням РНКвикористані для секвенування повнорозмірного лігази Т4 в тих же умовах, які були описані вище геному вірусу NDV штаму LaSota, були або похіддля методу І. По 5мкл лігаційної суміші використаними від опублікованих послідовностей, або від ли як матрицю для реакції зворотної транскрипції з послідовностей, встановлених в ході здійснення праймером р360. По 1мкл зворотнотранскриптазсеквенування, що описується тут. Праймери поканої реакції використали в реакції ПЛР з праймеразані в таблиці 1. ми р375 і р376 і в умовах ПЛР, описаних вище для Клонування і секвенування 3' - і 5'-кінців гено5'-RACE. Одержані ПЛР-продукти обробляли фраму NDV штаму LaSota гментом Кленова ДНК-полімерази І з одержанням 25 77146 26 тупих кінців і клонували за HincII-сайтом плазміди ми, фосфорилували шляхом обробки полінуклеоpGEM4Z (Promega). Десять незалежних клонів (4, тидкіназою Т4 і клонували в обох орієнтаціях до за способом І і 6 за способом II) секвенували для складу транскрипційної плазміди pOLTV5 (фіг. 1), визначення нуклеотидної послідовності 3'-кінця яку розщеплювали рестриктазами StuI і Smal і дегеному NDV штаму LaSota. фосфорилували з використанням кишкової фосКонструювання транскрипційного вектора фатази теляти (Boehringer Mannheim). Нарешті, Низькокопійний транскрипційний вектор консген SEAP (кодує секретовану лужну фосфатазу) труювали, використовуючи плазміду рОК12 (Vieira виділяли з складу плазміди, pSEAP-Basic & Messing, 1991) як початковий реплікон. Плазміду (Clontech) шляхом розщеплення рестриктазами рОК12 розщеплювали рестриктазою PvuII і видіSphI і СlаІ і клонували між SphI і Clal-сайтами, що ляли ДНК-фрагмент, що містить джерело репліказнаходяться між 3'- і 5'-кінцями NDV. Одержані в ції і ген резистентності до канаміцину. Цей ДНКрезультаті плазміди визначили pOLTV535 і фрагмент лігували на Eco47III/Af lll-фрагмент (сайт pOLTV553, відповідно. Внаслідок транскрипції in розщеплення Aflll затупляли по кінцях фрагментом vivo або in vitro з використанням РНК-полімерази Кленова ДНК-полімерази І) з складу транскрипційТ7 з плазміди pOLTV535 одержують антигеномну ного вектора 2.0 (люб'язно наданий Д-ром Ендрю РНК ([+]- РНК), в той час як внаслідок транскрипції Боллом; Pattnaik et al., 1992). З складу одержаної в плазміди pOLTV553 одержують геномну РНК [-](результаті плазміди видаляли XbaI/NheI-фрагмент РНК). Плазміди pOLTV535NO до pOLTV535N5 і з метою видалення як можна більшого числа уніплазміди pOLTV553NO до pOLTV553N5 одержукальних рестрикційних сайтів. Одержану в резульвали шляхом вбудування самокомплементарних таті плазміду визначили pOLTV5 (Фіг.1). Транскриолігонуклеотидів в Clal-сайті, що знаходиться між пційний вектор pOLTV5 включає промотор ДНКгеном SEAP і 5і-кінцем геному вірусу NDV в складі залежної РНК-полімерази фага Т7, після якого pOLTV535 і pOLTV553, відповідно (див. Фіг.2). Бузнаходяться унікальні рестрикційні StuI- і Smalли використані такі олігонуклеотиди: сайти, автокаталітичний рибозим вірусу DN0, 5'-CGCGAGCTCG-3'; гепатиту (HDV) і сигнал термінації транскрипції N1, 5'-CGCGAGSCTCG-3'; непарного фага Т7. ДНК-фрагменти, клоновані між N2, 5'-CGCGAGCGCTCG-3'; рестрикційними StuI- і Smal-сайтами, можуть бути N3, 5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; транскрибовані або in vitro, або in vivo з викорисN4, CGCGAGCATGCTCG-3'; танням РНК-полімерази Т7. Після транскрипції 5'N5, 5'-CGCGAGCASTGCTCG-3' кінець, що одержують в результаті транскриптів (W=А або Τ; S=С або G). включає два залишки G, що кодуються плазмідою. Модифікація промотору Т7 в плазмідах Завдяки автокаталітичній активності рибозиму pOLTV535 і pOLTV553 HDV, 3'-кінець цих транскриптів відповідає точноДля одержання транскриптів in vitro або in vivo, му кінцевому нуклеотиду клонованого ДНКтих, що включають аутентичні 5'- і 3'-кінцеві ділянфрагмента (Pattnaik et al., 1992). Конструювання ки NDV, промотор Т7 плазмід pOLTV535 і мінігеномних плазмід pOLTV553 модифікували таким чином, щоб трансЗ метою встановлення факторів, необхідних крипція починалася з першого нуклеотиду 3'- і 5'для реплікації і транскрипції NDV, були сконструкінцевих ділянок NDV. йовані мінігеномні плазміди, які включають 3'- і 5'Праймери конструювали так, щоб вони вклюкінцеві ділянки геному NDV, фланкуючі генчали 1) рестрикційний Bgll-сайт, 2) послідовність репортер, яким заміняли всі гени самого NDV промотору Т7 (показана, курсивом), який модифі(Фіг.2). ДНК-фрагменти, відповідні 3'- і 5'-кінцевим кували таким чином, щоб два нуклеотиду G на ділянкам геному NDV, формували за допомогою кінці промотору Т7 були замінені нуклеотидами А, і ПЛР з використанням ДНК-полімерази Pwo (30 3) 3'-(нуклеотиди 1-21) або 5'-кінець (нуклеотиди циклів: 15 секунд при 94°С, 30 секунд при 50°С і 30 15164-15186) вірусу NDV. Праймери BGL3F2 (5'секунд при 72°С) і з використанням як матриць GATATGGCCАТТСAGGCТТААТАCGAСТСАСТАТА плазмід, що включають фрагментиЗ'-RACE і 5'АССАААСAGAGAATCCGTGAG-3') і SEAP3 (див. RACE (див. вище). 3'- Ділянка (нуклеотиди 1-119)вище) використали для одержання ДНКбула утворена з використанням праймерів 3UIT фрагмента, що включає модифікований промотор (5'-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3'; нукТ7 і повнорозмірну 3'-кінцеву ділянку NDV аж до леотиди 1-27) і SEAP З (5'початку гена SEAP в складі pOLTV535. АналогічATCGAТАCTGGTCAGCA7UCTGGC ним чином одержували ДНК-фрагмент, який вклюAGAAGGCTTTCTCG- 3': нуклеотиди 102-119). 5'чав модифікований промотор Т7 і повнорозмірну Ділянку (нуклеотиди 14973-15186) утворювали з 3'-кінцеву ділянку NDV аж до початку гена SEAP в використанням, праймерів SEAP5 (5'складі pOLTV553 з використанням праймерів GCATGCTGACCAGTATCGA7АТТАСAGTAACTGT BGL5F2 (5'GАСТ-3'; нуклеотиди 14973-14990) і 5NDV (5'GATATGGCCATTCAGGCТТААТАCGAСТСАСТАТА ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGACGA-3'; нуклеоACCAAACAAAGATTTGGTGAATG-3') і SEAP5. тиди 15158-15186). Два ДНК-фрагменти з'єднуваОдержані в результаті фрагменти розщеплювали ли методом ПЛР з праймерами (ділянки перекритрестриктазами Bgll і SphI (3'-кінець) або рестриктатя показані курсивом в приведених вище зами Bgll і Clal (5'-кінець), відповідно, і використапослідовностях праймерів), що перекриваються з ли для заміщення BglI/SphI-фрагмента в складі використанням праймерів 3UIT і 5NDV. Одержаний pOLTV535 або BglI/ClaI-фрагмента в складі в результаті ДНК-фрагмент, що являє собою хиpOLTV553. Одержані в результаті плазміди визнамеру 3'- і 5'-кінців NDV, розділену 20 нуклеотидачили POLTV735 і pOLTV753, відповідно. Плазміди 27 77146 28 pOLTV735N3 і pOLTV753N3 одержували шляхом виявлення секретованої лужної фосфатази вбудування самокомплементарного олігонуклео(Тrоріх), по суті як описано у виробника. Кількісний тиду (5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; W=А або Т) за аналіз хемолюмінесценції проводили з викорисClal-сайтом, що знаходиться між геном SEAP і 5'танням лічильника сцинтиляцій в рідині (Wallac кінцем геному NDV в складі плазмід pOLTV735 і 1450 microbeta PLUS). pOLTV753, відповідно. Клонування і секвенування кДНК, що охоплюКонструювання SEAP-репортерних плазмід ють повний геном NDV штаму LaSota Плазміду pCIneoSEAP конструювали шляхом Для клонування і секвенування повнорозмірклонування XhoI/ClaI-фрагмента (СlаІ-сайт затупного геному NDV штаму LaSota великі субгеномні ляли з використанням фрагмента Кленова ДНКклони кДНК утворювали з допомогою ПЛР з ревеполімерази І), що включає ген SEAP, похідний від ртуванням і клонували в склад плазміди pGEM-T. плазміди pSEAP-Basic (Clontech), між Xhol- і SmalСинтез першого ланцюга кДНК здійснювали з висайтами еукаріотичного експресійного вектора користанням праймера 3UIT, як описано вище, і pCIneo (Promega). Остання з вказаних плазмід 1мкл зворотнотранскриптазної реакції використали включає промотор цитомегаловірусу людини в реакції ПЛР з набором Expand Long Template (hCMV) в доповнення до промотору фага Т7. З PCR kit (Boehringer Mannheim). ПЛР включала 5 метою оцінки і кількісного визначення SEAP за циклів по 10 секунд при 94°С, 30 секунд при 58°С і транскриптами, що контролюються тільки промо6 хвилин при 68°С з подальшими 10 циклами по 10 тором Т7, була сконструйована інша плазміда, в секунд при 94°С, 30 секунд при 58°С і 6 хвилин при якої промотор hCMV був відсутній. Для цієї мети 68°С, в яких час добудування ланцюга при 68°С промотор hCMV делегували з складу pCIneo шлязбільшувався на 20 секунд в кожному подальшому хом часткового розщеплення рестриктазою Hindi II циклі. Одержані ПЛР-фрагменти клонували в з подальшим повним розщепленням рестриктазою склад pGEM-T з використанням набору pGEM-T BgHI. ДНК-фрагменг (нуклеотиди 756-5469 відпоCloning kit (Promega), no суті як описано у виробвідно до нумерації Clontech), з складу якого деленика. Лігаційні суміші використали для трансфоргували промотор hCMV, був виділений і оброблемації клітин Е. соlі штаму SURE II (Stratagene). ний ДНК-полімеразою Т4 з метою затуплення Проводили дві незалежні ПЛР з ревертуванням (А кінців і знову був замкнений в кільце з допомогою і В) і в кожній з них одержували аналогічний набір ДНК-лігази -Т4. Одержану в результаті плазміду клонів кДНК. Нуклеотидну послідовність субгеномвизначили pCIneoD. Нарешті, ген SEAP виділяли з них клонів кДНК визначали з використанням NDVскладу плазміди pSEAP-Basic у вигляді MluI/AccIспецифічних праймерів (таблиця 1) і праймерів, фрагмента і клонували в склад pCIneoD між Mlul- і фланкуючих дані вставки. Після порівняння нуклеClal-сайтами. Одержану в результаті плазміду виотидних послідовностей груп А і В одержаних клозначили pCIneoD-SEAP. нів, невизначеність, що залишилася розділяли Трансфекція шляхом секвенування відповідних ділянок в третій Клітини висівали в 24-луночні планшети для незалежній групі кДНК (серія С). Нуклеотидна поскультивування, вирощували протягом ночі до сталідовність вірусу NDV штаму LaSota показана на дії 60-80%-вого злиття і інфікували при МОІ=1 з Фіг.3. FPV-T7 протягом 1 години при 37°С. Клітини транКонструювання повнорозмірного геномного сфікували 0,5мкг мінігеномної ДНК-плазміди з виклону кДНК вірусу NDV користанням 3мкл ліпофектаміну і OptiMem, по Полнорозмірну кДНК NDV вбудовували в суті, як описано у виробника (GibcoBRL/Life склад транскрипційної плазміди pOLTV5, викорисTechnologies). Після інкубації протягом 4 годин товуючи як початкову плазміду pOLTV535. ДНК(клітини CER) або 16 годин (клітини QM5) при 37°С фрагменти з'єднували по ділянках перекриття з клітини або інфікували NDV (голландський вірулевикористанням звичайних рестриктаз, що детальнтний ізолят, близький до 152608; 200мкл на 1 но відображено на Фіг.4В. Серед етапів клонуванлунку) протягом 1 години при МОІ=5, або залишаня конструювали плазміду (позначену p535-DI), що ли неінфікованими. Інокулят відсмоктували і замівключає нуклеотиди 1-3521 і 12355-15186, роздінювали 1мл повного культурального середовища, лені рестрикційним Clal-сайтом, яка була утворена після чого клітини далі інкубували при 37°С. Для шляхом з'єднання Clal-сайтів за положеннями котрансфекції клітини культивували в 6-луночних 3521-го і 12355-го нуклеотидів. У іншому ряді етакультуральних чашках і інфікували FPV-T7, як пів клонування була сконструйована плазміда (поописано вище. Клітини котрансфікували 0,25мкг значена pGEM-B), яка охоплює частину геному мінігеномної ДНК-плазміди, 0,4мкг pCIneoNP, NDV, включаючи нуклеотиди 3521-12355 (Clal0,2мкг рСІnеоР і 0,2мкг pCIneoL(c) або pCIneo фрагмент). Для полегшення клонування останній з шляхом використання або 8мкл ліпофектаміну або названих Clal-фрагмент позначали геном резисте9мкл FuGene™6 (Boehringer Mannheim). 3 метою нтності до хлорамфеніколу (Cm), похідним від одержання інфекційного вірусу мінігеномну плазплазміди pACYC184 (Chang & Cohen, 1978). Для міду замінювали транскрипційною плазмідою, яка цієї мети ген Cm виділяли з плазміди pACYC184 з включала повнорозмірну кДНК вірусу NDV. допомогою ПЛР, з використанням праймера CAT-F Кількісний аналіз активності SEAP (5'-GCGTACGTCTAGACTGGTGTC Кількість SEAP, яке секретувалося в культураCCTGTTGATACCGG-3') і CAT-R (5'льне середовище трансфікованими клітинами, GCTCTAGACGTACGACCCTGCCCTGAACCGACGвимірювали на вільних 96-луночних планшетах з 3'). ПЛР проводили з використанням ДНКвикористанням тесту на хемолюмінесценцію репополімерази Pwo протягом 30 циклів по 30 секунд ртерів Phospha-Light™ з набором реактивів для при 94°С, 45 секунд 60°С і 60 секунд при 72°С. 29 77146 30 Одержаний ПЛР-фрагмент розщеплювали рестрикожний цикл. Одержаний в результаті ДНКктазою BsiWI і клонували за унікальним BsiWIфрагмент обробляли ДНК-полімеразою Т4 для сайтом в склад pGEM-B з одержанням плазміди затуплення кінців, розщеплювали рестриктазою pGEM-B(cat). Clal-фрагмент з складу pGEMNhel і клонували в склад рСІnео між Nhel- і SmalB(CAT) клонували за унікальним Clal-сайтом h535сайтами. Експресію білка Μ перевіряли в тесті DI з одержанням плазміди pNDFL(CAT). Нарешті, ІРМА з використанням моноклонального антитіла ген Cm видаляли з цієї плазміди шляхом розщеп424 [Russell et al., 1983]. лення рестриктазою BsiWI з подальшим релігуДля гена F: праймер 3UIT (див. вище) викориванням і трансформуванням клітин Е. соІі штаму стали для зворотної транскрипції. Праймери DH5a. Одержану в результаті плазміду позначили NDV5F (5'pNDFL+: вона включала повнорозмірну послідовACGGGCTAGCGATTCTGGATCCCGGTTGG-3': ність кДНК нуклеотиди 4508-4526) і NDV3F (5'NDV, клоновану між промотором Т7 і рибозиACTACCCGGGAAACCTTCGTTCCTCAT-3': нуклеомом HDV в складі транскрипційної плазміни тиди 6212-6231) використали для ПЛР з набором pOLTV5. реактивів Expand High Fidelity kit з використанням Клонування і експресія окремих генів NDV тих же умов, які описані вище для гена М. ОдерДНК-фрагменти, що включають кожний з генів жаний в результаті ДНК-фрагмент обробляли NDV штаму LaSota, були одержані з допомогою ДНК-полімеразою Т4 для затуплення кінців, розПЛР з ревертуванням і клоновані в склад рСІnео. щеплювали рестриктазою Nhel і клонували в склад Після клонування всі фрагменти секвенували з рСІnео між Nhel- і Smal-сайтами. Експресію білка F використанням праймерів, фланкуючих вставки, і перевіряли в тесті ІРМА з використанням монокген-специфічних праймерів. Для гена NP: праймер лонального антитіла 8Е12А8СЗ (ID-DLO, Dept. 386 (5'Avian Virol.). GAGCAATCGAAGTCGTACGGGTAGAAGGTG-3': Для гена ΗΝ: праймер 3UIT використали для нуклеотиди 40-69) використали для зворотної тразворотної транскрипції. Праймери NDV5HN (5'нскрипції. Праймери 365 (5'-GTGTGAATTCCG GTAGGCTAGCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3': AGTGCGAGCCCGAAG-3': нуклеотиди 77-94) і 892 нуклеотиди 6335-6354) і NDV3HN (5'(5'-TTGCATGCCTGCAGGTCAGTACCCCCAGTC-3': CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3'; нуклеотиди 1577-1593) використали для ПЛР з нуклеотиди 8205-8227) використали для ПЛР з ДНК-полімеразою Pwo. Були використані наступні набором реактивів Expand High Fidelity kit при тих умови ПЛР (30 циклів): 30 секунд при 95°С, 40 сеже умовах, які описані вище для гена М. Одержакунд при 65°С і 45 секунд при 72°С. Одержаний в ний в результаті фрагмент ДНК обробляли ДНКрезультаті ДНК-фрагмент розщеплювали рестрикполімеразою Т4 для затуплення кінців і після розтазою EcoRI і клонували в склад рСІnео між EcoRIщеплення рестриктазою Xmal його клонували в і Smal-сайтами. Експресію NP перевіряли за допосклад рСІnео між затупленим (за допомогою фрамогою тесту імунопероксидазного моношару (ІРгмента Кленова) Nhel-сайтом і Xmal-сайтом. ЕксМА), [як описано у Peeters et al., 1992] з викориспресію білка HN перевіряли в тесті ІРМА з викоританням моноклонального антитіла 38 [Russell et станням моноклонального антитіла 86 [Russell et al., 1983]. al., 1983]. Для гена Р: праймер pRTI (5'Для гена L: ген L був виділений з кДНК клону CAAAGAATTCAGAAAAAAGTACGGGTAGAA-3': pGEM-L7a (Фіг.4А) шляхом розщеплення рестрикнуклеотиди 1794-1814) використали для зворотної тазами SacII і Sail. Перед розщепленням рестриктранскрипції. Праймери pRTI і р2 (5'тазою Sail SacII-сайт затупляли шляхом обробки GCAGTCTAGATTAGCCATTCACTGCAAGGCGC-3': ДНК-полімеразою Т4. Одержаний в результаті нуклеотиди 3053-3071) використали для ПЛР з фрагмент клонували в рСІnео між затупленим (за ДНК-полімеразою Pwo. Використали наступні умодопомогою фрагмента Кленова) Nhel-сайтом і Sailви ПЛР (30 циклів): 30 секунд при 95°С, 40 секунд сайтом. 5і-Нетрансльована ділянка між промотопри 65°С і 60 секунд при 72°С. Одержаний в рером Т7 і старт-кодоном ATG в послідовності гена L зультаті ДНК-фрагмент розщеплювали рестриктавключає два позарамкових кодона ATG, які можуть зами EcoRI і ХbаІ і клонували в склад pGIneo між заважати нормальній експресії білка L. Тому, була EcoRI- і ХbаІ-сайтами. Експресію Ρ перевіряли за сконструйована нова плазміда, в якій перший кодопомогою тесту ІРМА з використанням моноклодон ATG був пропущений і в якій другий кодон нального антитіла 688 [Russell et al., 1983]. ATG був змінений на AAG шляхом ПЛР-мутагенезу Для гена Μ: праймер 3UIT (5'в відповідності з наступним. Праймери 5LE(E) (5'ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3'. нуклеCAATGGAATTCAAGGCAAAACAGCTCAAGGTAAA отиди 1-27) використали для зворотної транскрипTAATACGGG-3'; нуклеотиди 8332-8374) і 3LE(E) ції. Праймери NDV5M (5'(5'GGGTGCTAGCGGAGTGCCCCAATTGTGCCAA-3', GTGAATCTAGAATGCCGGATCCGTACGAATGC-3'; нуклеотиди 3268-3288) і NDV3M (5'нуклеотиди 8847-8870) використовували в реакції TCTCCCCGGGGCAGCTTATTTCTTAAAAGGAT-3', ПЛР, в якій плазміда pGEM-L7a (Фіг.4) використонуклеотиди 4368-4389) використали для ПЛР з вувалася як матриця. ПЛР проводили с викориснабором реактивів Expand High Fidelity kit. ПЛР танням ДНК-полімерази Pwo в режимі 30 циклів по проводили протягом 10 циклів по 15 секунд при 30 секунд при 94°С, 45 секунд при 60°С і 60 секунд 95°С, 30 секунд при 55°С і 2 хвилини при 68°С з при 72°С. Одержаний в результаті ДНК-фрагмент подальшими 15 циклами, в яких час добудування розщепляли рестриктазами EcoRI і ХbаІ і клонуваланцюга при 68°С збільшували на 20 секунд за ли в склад рСІnео між EcoRI- і Xbal-сайтами, фор 31 77146 32 муючи плазміду pCIneoL(N). Після цього нетично помічену повнорозмірну кДНК NDV, виBsiWI/SalI-фрагмент з складу pGEM-L7a, який значили pNDFL+[FWT]. включає частину гена L, яка залишилася (нуклеоУтворення ліній стабільно трансформованих тиди 8852-15046), клонували в pCIneoL(N) між клітин, які експресують окремі гени NDV BsiWI- і Sail-сайтами, одержуючи в результаті плаПлазміди pCIneoNP, pCIneoP, pCIneoM, WT зміду pCIneoL(c). Оскільки, антитіла, специфічні по pCIneoF, pCIneoF і pCIneoHN використали для відношенню до білка L поки недоступні, перевірити утворення ліній стабільно трансформованих кліекспресію L імуноцитохімічними методами не мотин, які експресують ці білки окремо. За день до жливо. проведення трансфекції клітини CER висівали на Внесення генетичної мітки в ген F 6-см культуральні чашки і інкубували протягом Для того щоб недвозначно показати, що інфеночі до досягнення рівня злиття 60-80%. Клітини кційний вірус може бути одержаний з клонованої трансфікували 2мкг плазмідною ДНК з викорисповнорозмірної кДНК, генетичну мітку вносили в танням 12мкл ліпофектаміну і OptiMem, по суті як склад гена F шляхом ПЛР-опосередкованого мутаописано у виробника (GibcoBRL/Life Technologies). генезу. Для цієї мети ген F клонували з викорисЧерез 48 годин клітини обробляли трипсином і танням двох ПЛР-фрагментів, що перекриваються. розведення висівали на 10-см культуральні чашки Перший ПЛР-фрагмент одержували з використанв середовище, що містить 500мкг/мл антибіотику ням праймера NDV5F (див. вище) і праймера F5R G418 (Boehringer Mannheim). Кожні 3 дні культура(5'льне середовище замінювали свіжим середовиAAAGCGCCGCTGTCTCCTCCCTCCAGATGTAGTC щем, що містить зростаючу кількість (при кроці в AC-3': нуклеотиди 4859-4894). Виділені напівжир100мкг/мл) G418 до досягнення концентрації ним шрифтом нуклеотиди відповідають змінам, які 800мкг/мл. Клітини витримували в середовищі, що були внесені в цей праймер з метою зміни аміномістить 800мкг/мл G418, і через 3 тижні після тракислотної послідовності сайта протеолітичного нсфекції окремі колонії вирізали і переносили на розщеплення між послідовностями F1 і F2, щоб 96-луночні культуральні чашки. Клоновані клітинні лінії тестували за експресією відповідного гена «перейти» від NDV штаму. LaSota (GGRQGR L) NDV з використанням тесту ІРМА, як описано видо консенсусного сайта розщеплення, характерноще для аналізу непостійної експресії. го для вірулентних штамів NDV (GRRQRR F). Клітинні лінії, які постійно експресували білок Другий ПЛР-фрагмент був одержаний з викорисΝΡ, Ρ, Μ або F, були ідентифіковані і виділені. Одтанням праймерів F3F нак, не вдалося утворити клітинні лінії, які б екс(5'GGAGGAGACAGCGGCGCTTTATAGGCGCCATT пресували білок ΗΝ. Приблизно конститутивна ATTGG-3': нуклеотиди 4875-4911) і IV09 (5'експресія ΗΝ є токсичною для клітин. Утворення CTCTGTCGACACAGACTACCAGAACTTTCAC-3'1; ліній стабільно трансформованих клітин, які екснуклеотиди 6246-6266). ПЛР проводили з ДНКпресують РНК-полімеразу Т7 полімеразою Pwo в 25 циклах по 15 секунд при Ген, кодуючи РНК-полімеразу Т7, був виділе94°С, 30 секунд при 55°С і 2 хвилин при 72°С. Два ний з плазміди pRT7NT (Rene van Gennip, ID-DLO, ПЛР-фрагменти, що перекриваються (перекриття Department of Mammalian Virology) шляхом обробв послідовностях праймерів виділене курсивом) ки рестриктазами EcoRI і Sail. Одержаний в рез'єднували в другій реакції ПЛР з використанням зультаті фрагмент включає ген РНК-полімерази праймерів NDV5F і IV09 і в тих же умовах провеТ7, що знаходиться позаду бакуловірусного продення реакції. Одержаний в результаті фрагмент, мотору ρ 10. ДНК-фрагмент клонували в склад який включає повну кодуючу рамку гена F і який плазміди рСІnеоО між EcoRI- і Sail-сайтами, одеркодує вірулентний консенсусний сайт розщепленжавши плазміду рСІnеоЮ7. Плазміда рСІnеоО ня, обробляли рестриктазами Nhel і Sail і клонувапозбавлена промотору Т7 і була одержана з ли в склад рСІnео між Nhel- і Sail-сайтами, одеррСІnео шляхом розщеплення рестриктазою Nhel з жуючи плазміду pCIneoFWT. StuI-NotI-фрагмент подальшим частковим розщепленням Seal, запов(нуклеотиди 4646-4952) з складу pCIneoFWT виконенням «липких кінців» за допомогою фрагмента ристали для заміщення відповідного фрагмента в Кленова ДНК-полімерази і відновлення кільцевої плазміді р535-3, яка була сконструйована шляхом структури з допомогою ДНК-лігази Т4. Бакуловірувбудування ClaI/ScaI-фрагмента (нуклеотиди сні послідовності видаляли з рСІnео107 шляхом 35211-10311) з складу pGEM-B в p535-DI між Clal- і обробки рестриктазами EcoRI і Расі з подальшим Seal-сайтами (див. Фіг.4С). Одержану в результаті затупленням кінців за допомогою обробки ДНКплазміду визначили р535-S[FWTc]. ПЛР-фрагмент, полімеразою Т4 і відновленням кільцевої структущо включає ген резистентності Cm з складу ри. Одержану в результаті плазміду визначили pACYC184 (див. вище), клонували у вигляді XbalрСІnео007. Експресію РНК-полімерази Т7 перевіфрагмента за унікальним Xbal-сайтом (6172-й нукряли шляхом котрансфекції клітин плазмідами леотид послідовності геному NDV) плазміди p535рСІnео007 і pPRh01. Остання з них включає ген S [FWTc], одержавши плазміду p535-S[FWTc]Cm. білка Е2 вірусу класичної лихоманки свиней, клоПісля цього Cm-помічений ApaI-SpeI-фрагмент нований за промотором Т7 і включаючий внутріш(нуклеотиди 2285-8094) з цієї плазміди використаній сайт зв'язування на рибосомі (Rene van Gennip, ли для заміщення відповідного фрагмента повноперсональне повідомлення). Експресію Е2 тестурозмірної кДНК в плазміді pNDFL+. Нарешті, ген вали в ІРМА з використанням моноклонального Cm видаляли з цієї плазміди шляхом розщеплення антитіла V4 [Wensvoort et al., 1986]. Лінії стабільно рестриктазою ХbаІ з подальшим відновленням трансформованих клітин CER, експресуючих РНКкільцевої структури за допомогою ДНК-лігази Т4. полімеразу Т7, утворювали і виділяли, як описано Одержану в результаті плазміду, яка включає ге 33 77146 34 вище, за винятком того, що використали 10-см кислоти 1-141 NDV і амінокислоти 142-580 APMV2, культуральні чашки і клітини трансфікували 5мкг визначили pCIneoHN1/2141. плазміди рСІnео007 і 25мкл ліпофектаміну. Для С-кінцеву частину гена HN APMV4 (кодує аміаналізу окремих клітинних ліній на експресію РНКнокислоти 143-569) ампліфікували з використанполімерази Т7 їх трансфікували плазмідою ням праймерів IV14В (5'pPRhOl, і експресію Е2 (яка залежить від РНКGGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATGATG полімерази Т7) визначали в тесті ІРМА з викорисCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') і IV08. Цей фратанням моноклонального антитіла V4. Було іденгмент з'єднували з N-кінцевою частиною гена HN тифіковано декілька клітинних ліній, які експресуNDV (див. вище) методом ПЛР з праймерами, що вали РНК-полімеразу Т4. Для подальших перекриваються з використанням праймерів IV01B експериментів використали одну з цих клітинних і IV08. Одержаний в результаті ПЛР-фрагмент роліній, позначену CER-C9. Клонування і експресія зщеплювали (або відразу, або після субклонувангенів HN і химерних генів HN ня в pGEM-T) рестриктазами EcoRI і Xmal і клонуПраймер 3UIT використали для синтезу одновали в склад рСІnео між EcoRI- і ХmаІ-сайтами. ланцюгової кДНК NDV і серотипів 2 і 4 параміксоОдержану плазміду, що включає химерний ген HN, вірусу птахів (APMV2 і APMV4), як описано вище. що кодує амінокислоти 1-141 NDV і амінокислоти Всі подальші ПЛР проводили в 25 циклах по 15 143-569 APMV4, визначили pCIneoHN1/4141. секунд при 94°С, 30 секунд при 55°С і 2 хвилини Аналогічно конструкціям, описаним вище, були при 72°С. утворені химерні гени HN, що кодують амінокислоПовнорозмірну кодуючу ділянку гена HN сероти 1-143 NDV і амінокислоти 144-580 APMV2 або типу APMV2 виділяли з допомогою ПЛР з викорискодуючі амінокислоти 1-143 NDV і амінокислоти танням праймерів IV03 (5'145-569 APMV4. Для одержання цих конструкцій GGGGGAATTCCCCATTCAATGAAGGGTCTAC-3') і ПЛР-фрагменти одержували з використанням наIV05 (5'ступних пар праймерів: амінокислоти 1-143 NDV, GATCCCCGGGTCTTAAACCAGGCTTCGCAATGпраймери IV01B і IV13 (5'3'). які є похідними від послідовності гена HN ATCTACAATGAGTTCTTTGCCTATC-3; нуклеотиди AMPV2 (GenBank, депозитарний №D14030). Пов6816-6840); амінокислоти 144-580 APMV2, прайнорозмірну кодуючу ділянку гена HN серотипу мери IV14B (5'APMV4 виділяли з допомогою ПЛР з використанGGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATGATG ням праймерів IV06 (5'CATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') і IV05; амінокисGGGGGAATTCTGGTAGGGTGGGGAAGGTAGC-3') лоти 145-569 APMV4, праймери IV15В (5'і IV08 (5'GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTGATCAAAC ATTGCCCGGGGGGTAACTAATCAGGATCTCAGAGCTGACTACACAGCAG-3') і IV08. Одержані ПЛР3'), які є похідними від послідовності гена HN фрагменти розщеплювали (або відразу, або після AMPV4 (GenBank, депозитарний №D14031). Одесубклонування в pGEM-T) рестриктазами EcoRI і ржані в результаті ПЛР-фрагменти розщеплювали Xmal і клонували в склад рСІnео між EcoRI- і ХmаІ(або відразу, або після клонування в pGEM-T) рессайтами. Одержані в результаті плазміди визначитриктазами EcoRI і Xmal і клонували в рСІnео між ли рСІnеоl/2143 і рСІnеоl/4143, відповідно. Для анаEcoRI- і ХтаІ-сайтами. Одержані в результаті плалізу експресії білків HN клітини CER або клітини зміди визначили pCIneoHN2 і pCIneoHN4, відповіQM5 інфікували FPV-T7 протягом 1 години при дно. МОІ=1, трансфікували плазмідами pCIneoHN, Химери між геном HN NDV штаму LaSota і геpCIneoHN2, pCIneoHN4, pCIneoHN1/2141, 143 141 нами HN штамів APMV2 і APMV4 були сконструйоpCIneoHN1/2 , pCIneoHN1/4 і pCIneoHN1/4143 і вані з допомогою ПЛР з праймерами, що перекричерез 24 години після трансфекції моношарові ваються таким чином. N-кінцева ділянка (що кодує культури покривали 1%-вою суспензією курячих амінокислоти 1-141) гена HN NDV штаму LaSota еритроцитів в ФСБ протягом 45 хвилин при кімнаампліфікували з використанням ДНК-полімерази тній температурі. Після цього моношари ретельно Pwo з праймерами IV01B (5'промивали 3 рази ФСБ і прилипання еритроцитів GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3'; до трансфікованих клітин аналізували під мікроснуклеотиди 6325-6354) і IV10 (5'копом. Для аналізу індукції злиття клітин після одAATGAGTTCTTTGCCTATCCCCCC-3',·нуклеотиди ночасної експресії білків HN і F клітини CER або 6811-6834). С-кінцеву частину гена HN APMV2 клітини QM5 котрансфікували плазмідою (кодує амінокислоти 142-580) ампліфікували з виpCIneoFWT разом з однією з плазмід pCIneoHNI, користанням ДНК-полімерази Pwo з праймерами pCIneoHN2, pCIneoHN4, pCIneoHN1/2141, 141 143 IV11B (5'pCIneoHN1/4 , pCIneoHN1/2 і pCIneoHN1/4143. GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTCAAGGAGAT Після інкубації протягом 2-3 днів моношарові кульGCATCTGCAGGC-3') і IV05. Одержані ПЛРтури промивали в ФСБ, забарвлювали протягом фрагменти з'єднували методом ПЛР з праймерами 15 хвилин розчином Гімза (1:30 розведення у воді) (ділянки перекриття виділені курсивом), що перекі аналізували під мікроскопом. риваються з використанням праймерів IV01B і IV05 Клонування химерних генів HN в повнорозмірі набору ферментів Expand High Fidelity kit. Одерну кДНК геному NDV жаний в результаті ПЛР-фрагмент розщеплювали Синтетичний лінкер, позначений HN12, був (або відразу, або після субклонування в pGEM-T) вбудований між NotI- і Spel-сайтами плазміди рестриктазами EcoRI і Xmal і клонували в склад pGEM-T (Promega) з використанням олігонуклеорСІnео між EcoRI- і ХmаІ-сайтами. Одержану платидних праймерів HN12a (5'зміду, що включає химерний ген HN, і кодує аміноGGCCGCATATTCTAGAGTTAACGACTTA-3') і 35 77146 36 HN12b (5'AGTCTTCG-3') і NDV3-HN (5'CTAGTAAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3'). СинCGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTGтетичний лінкер, позначений HN14, був вбудова3'). Одержані в результаті фрагменти об'єднували і ний між Notl-i Spel-сайтами плазміди pGEM-T з використали як матриці для третьої ПЛР з прайвикористанням олігонуклеотидних праймерів мерами IV01B (5'HN14a (5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGA-3') і GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3') і ΗΝ 14b (5'-CTAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3'). NDV3-HN. Для послідовності APMV4 перший ПЛРОдержані в результаті плазміди визначили pGEMфрагмент одержували з використанням праймера HN12 і pGEM-HN14, відповідно. Ці плазміди розIV01 і праймера 3HN4 (5'щеплювали рестриктазами NotI і ХbаІ і використаТААСАТСТСАТСТТССАСССССТСАСССли для клонування NotI/SpeI-фрагмента (нуклеоСАТСТСТСАТТС-3'). Другий ПЛР-фрагмент одертиди 3390-7488) з складу плазміди p535-S[FWTc] жали з використанням праймерів 5HN4 (5'Cm. Одержані в результаті плазміди визначили CCTGACCGCTGCAAGATCAGATCTTAATGGCCAA pGEM-HN1/2NS і pGEM-HN1/4NS, відповідно. Гени GTCTTCGT-3') і NDV3-HN. Одержані в результаті HN з цих плазмід замінювали химерними генами фрагменти об'єднували і використали як матрицю HN з плазмід pCIneoHN1/2143 і pCIneoHN1/4143, для третьої ПЛР з використанням праймерів IV01B відповідно (див. розділ «Клонування і експресія і NDV3-HN. Праймери 3HN2/5HN2 і 3HN4/5HN4 генів HN і химерних генів HN»). Для цієї мети плачастково комплементарні і включають генетичні зміди pCIneoHN1/2143 і pCIneoHN1/4143 розщеплюкоди для послідовності HN2 (NRTDIQQTI) і для вали рестриктазами Nhel і Smal і одержані фрагпослідовності HN4 (PDPLQDQIL), відповідно. Реаменти (включаючи химерні гени HN1/2143 і кції ПЛР проводили з використанням набору реакHN1/4143), клонували між Nhel- і НраІ-сайтами плативів Expand Long Template PCR kit (Boehringer змід pGEM-HN1/2NS і pGEM-HN1/4NS з одержанMannheim). ПЛР включала 30 циклів по 10 секунд ням плазмід pGEM+HN12 і pGEM+HN14, відповідпри 94°С, 30 секунд при 58°С і 2 хвилини при 68°С но. Останні плазміди використали для внесення з подальшим 1 циклом протягом 4 хвилин при химерних генів HN в повнорозмірну геномну кДНК 68°С. ПЛР-фрагменти розщеплювали рестриктавірусу NDV. Для цього плазміди pGEM+HN12 і зами EcoRI і Bsu361 і клонували між EcoRI- і pGEM+HN14 розщеплювали рестриктазами NotI і Bsu361-сайтами в плазміду pCIneoHN. Одержані в Spel, і одержаний фрагмент, що включає або ген результаті плазміди визначили pCIneoHN1(HN2e) і HN12, або ген HN14, використовували для заміpCIneoHN1(HN4e), відповідно. Аналіз експресії, що щення відповідного фрагмента в складі pNDFL+, перемежається показав, що модифіковані білки одержуючи тим самим pNDFL+HN1/2143 Cm і HN точно експресуються і переносяться на повер143 pNDFL+NH1/4 Cm, відповідно. Ген Cm видаляли хню клітини, на що вказує аналіз гемоадсорбції на з складу цих плазмід шляхом обробки рестриктаматеріалі курячих еритроцитів. Більш того монокзою ХbаІ з подальшим відновленням кільцевої лональне антитіло 6D4, яке специфічне по відноструктури з допомогою ДНК-лігази Т4. З метою шенню до лінійного епітопу HN NDV, який складавідповідності «правилу шести» лінкер вбудовували ється з амінокислот 346-354 (або принаймні за унікальним Spel-сайтом в складі цих плазмід з включає їх), не реагує з модифікованими білками використанням саме комплементарних олігонукHN. леотидів. Лінкер Н2 (5'-CTAGCGAGCGCTCG-3') Плазміди pCIneoHN1(HN2e) і був вбудований в плазміду pNDFL+HN1/2143, а pCIneoHN1(HN4e) розщеплювали рестриктазами лінкер Н3 (5'-CTAGCGAGCWGCTCG-3') був вбуNarl і Spel, і фрагменти, що включають модифікодований в плазміду pNDFL+NH1/4143, внаслідок вані гени HN, клонували між Narl- і Spel-сайтами чого одержували плазміди pNDFL+HN1/2143(H2) і плазмід pGEM-HN1/2NS і pGEM-HN1/4NS, відповіpNDFL+NH1/4143 (Н3), відповідно. дно. Одержані в результаті плазміди, позначені Видалення специфічного епітопу з білка HN pGEM-HN1(HN2e) і pGEM-HN1(HN4e), розщеплюNDV штаму LaSota вали рестриктазами NotI і Spel і використали для Специфічний епітоп, тобто амінокислоти 346заміщення NotI/SpeI-фрагмента в складі pNDFL+. 354 (PDEQDYQIR) в послідовності білка HN вірусу Одержані в результаті плазміди визначили pNDFLNDV штаму LaSota, який розпізнається моноклоHN(HN2e)Cm і pNDFL-HN(HN4e)Cm, відповідно. нальним антитілом 4D6 [Long et al., 1986; Ген Cm видаляли з цих плазмід розщепленням Meulemans et al., 1986], видаляли шляхом замірестриктазою ХbаІ з подальшим релігуванням. щення цієї послідовності на відповідну послідовОдержані в результаті плазміди визначили pNDFLність білків HN або APMV2 (NRTDIQQTI), або HN(HN2e) і pNDFL-HN(HN4e), відповідно. APMV4 (PDPLQDQIL). Для цього плазміду Результати pCIneoHN [див. розділ «Клонування і експресія Нуклеотидна послідовність 3'-і 5'-кінцевих діокремих генів NDV»] використали як матрицю для лянок геному NDV штаму LaSota створення ПЛР-фрагментів, що перекриваються. Нуклеотидна послідовність передбачуваного Для послідовності APMV2 перший ПЛР-фрагмент 3'-кінця геному NDV опублікована [Ishida et al., одержували з використанням праймера IV01 (5'1986], хоча і на матеріалі іншого штаму NDV (D26), GTAGACGCGTAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3') і ніж, який використовувався в даній роботі (LaSota). праймера 2HN2 (5'Опублікована [Yusoff et al., 1987] послідовність GATAGTTTGCTGTATATCAGTCCGATTGCATGTGT гена L і відносно великої некодуючої ділянки за CATTG-3'). Другий ПЛР-фрагмент одержували з геном L вірусу NDV штаму Beaudette-C. Однак, як використанням праймерів 5HN2 (5'тут показано, дана послідовність не включає повну AATCGGACTGATATACAGCAAACTATCATGGCCA 5'-кінцеву частину вірусного геному, що робить 37 77146 38 неможливлим створення інфекційної копії NDV. 3'нижчерозташованими унікальними рестрикційними і 5'-кінцеві ділянки геному вірусів з некодуючими StuI- і Smal-сайтами, автокаталітичний рибозим одноланцюговими РНК відіграють ключову роль в вірусу гепатиту-D (HDV) і сигнал термінації транскреплікації і транскрипції [Lamb & Kolakofsky, 1996]. рипції непарного фага Т7 [Pattnaik et al., 1992]. Таким чином, з метою одержання повнорозмірної Внаслідок транскрипції in vivo або in vitro плазміди кДНК геному NDV, яку можна було б використати pOLTV535 з використанням РНК-полімерази Т7 для одержання інфекційного вірусу методами звоутвориться антигеномна РНК (тобто [+]-РНК), в той ротної генетики [Conzelmann, 1996], абсолютно час як при транскрипції плазміди pOLTV553 утвонеобхідно включити у вірусний геном точні 3'- і 5'риться геномна РНК (тобто [-]-PHK) (Фіг.5). кінцеві ділянки. Отже, авторами була визначена Для аналізу того, чи може мінігеномна РНК, точна нуклеотидна послідовність обох 3'- і 5'-кінців утворена плазмідами pOLTV535 і pOLTV553, репгеномного РНК вірусу NDV штаму LaSota з викорилікуватися і експресуватися з участю NDV, що вистанням методу 3'- і 5' -RACE (швидка ампліфікаконує роль вірусу-помічника, автори використали ція кінців кДНК). 5'- Кінцева ділянка була виділена клітини CER, які експресують РНК-полімеразу Т7 з допомогою ПЛР після літування одноланцюговоабо за конститутивним типом [клітини CER-C9: го якірного праймера (ALG3) на одноланцюгову див. «Матеріали і методи»], або після інфікування кДНК, яку одержували шляхом зворотної транскрекомбінантним вірусом курячої віспи fpEFLT7pol рипції 5'-кінцевого сегмента геномної РНК. З вико([Britton et al., 1995]; тут і далі означається як FPVристанням праймера ALG4, комплементарного T7), який експресує РНК-полімеразу Т7. Клітини якірного праймера, і NDV-специфічного праймера CER-C9 і клітини CER, інфіковані FPV-T7, трансфібули одержані ПЛР-продукти, які включали 5'кували мінігеномними плазмідами pOLTV535 або кінцеву ділянку. pOLTV553 і після інкубації протягом 3 годин при Для клонування 3'-ділянки NDV одноланцюго37°С клітини або інфікували NDV протягом 1 годивий якірний прайм ер ALG3 лігували на 3'-кінець ни, або залишали неінфікованими. Приблизно чевірусної РНК з використанням РНК-лігази Т4 і ампрез 24 години після трансфекції зразок відбирали з ліфікували методом ПЛР з праймером ALG4 і культурального середовища і оцінювали активNDV-специфічним праймером (спосіб І). З іншого ність SEAP. Одержані результати показали, що боку, 3'- і 5'-кінцеві ділянки РНК NDV лігували одна експресія SEAP була дуже високою в клітинах, на одну з використанням РНК-лігази Τ4 і одержаінфікованих FPV-T7 і трансфікованих плазмідою ний в результаті РНК-конкатенат використали в pOLTV535. Це недивно тому, що транскрипція під ПЛР з ревертуванням з NDV-специфічними прайконтролем РНК-полімерази Т7 утворить антигеномерами, які фланкують точку лігування (спосіб II). мну [+]-PHK, кеповану ферментами курячої віспи, Продукти реакцій 3'- і 5'-RACE клонували в Тяка ефективно транслюється в клітині-хазяїні. У вектор pBluescriptll-TSK [Ichihara & Kurosawa, 1993] клітинах, трансфікованих pOLTV553, транскрипція або в pGEM4Z з подальшим виділенням і секвенуз участю РНК-полімерази Т7 утворить геномну [-]ванням декількох незалежних клонів. Одержані PHK, яка, для того, щоб транслювати білок SEAP, результати узагальнені в табл. 2. Для проведення повинна заздалегідь конвертуватися в [+]-PHK з прямого порівняння 3'- і 5'-кінцевих ділянок нуклеучастю вірусу-помічника (порів. з Фіг.5). У обох отидні послідовності показані у вигляді ДНК, а 3'випадках в клітинах, інфікованих NDV, в порівнянні кінець геномного ланцюга представлений як 5'з неінфікованими клітинами, не виявляється збікінець антигеномного ланцюга. На рівні геномної льшення експресії SEAP. З іншого боку, експресія РНК послідовність 3'-кінця читається як 3'SEAP в NDV-інфікованих клітинах була стабільно UGGUUUGUCUCUUAG-5', в той час як послідовприблизно вдвічі нижчою в порівнянні з неінфіконість 5'-кінця читається як 3'ваними клітинами (дані не включені). У випадку з UUUAGAAACAAACCA-5'. Послідовність 3'-кінця клітинами, трансфікованими pOLTV535, це можна майже повністю співпадає з опублікованою 3'пояснити дуже високим рівнем експресії, що вже є кінцевою послідовністю NDV штаму D26 [Ishida et SEAP з транскриптів, утворених з участю РНКal., 1986]. Однак, послідовність 5'-кінця вказує на полімерази Т7. Однак, в клітинах, трансфікованих те, що NDV штаму LaSota включає 64 додаткових pOLTV553, в яких ефективна експресія залежить нуклеотидів в порівнянні з опублікованою послідовід конверсії геномної [-]-PHK в антигеномну [+]вністю гена LNDV штаму Beaudette-C [Yusoff et al., PHK або мРНК з участю полімеразного комплексу, 1987] (Фіг.6). можна було б чекати збільшення експресії SEAP Реплікація мінігеномів NDV з участю вірусупісля інфікування NDV. помічника Автори передбачили існування двох причин, Для встановлення того, чи функціональні 3'- і за якими мінігеноми не здатні експресувати і реп5'-кінцеві ділянки NDV за реплікацією і транскриплікуватися з участю NDV. По-перше, розмір мінігецією, були сконструйовані мінігеноми, які включаномних РНК не задовольняє так званому «правилу ли 3'-ділянку NDV (нуклеотиди 1-119), геншести» [Calain & Roux, 1993; Kolakofsky et al., репортер, що кодує секретовану лужну фосфатазу 1998]. Згідно з цим правилом, геноми параміксові(SEAP), і 5'-кінець NDV (нуклеотиди 14973-15186) русів ефективно реплікуються тільки тоді, коли їх (Фіг.2). Вказані мінігеноми клонували в обох орієндовжина кратна 6 нуклеотидам. По-друге, два дотаціях в транскрипційний вектор pOLTV5, одержудаткових нуклеотиди G, які розташовуються на 5'ючи в результаті плазміди pOLTV535 і pOLTV553, кінці мінігеномних РНК, можуть заважати точній відповідно [детальніше про конструювання див. реплікації і/або транскрипції з участю вірусного розділ «Матеріал і методи»]. Плазміда pOLTV5 полімеразного комплексу. Для оцінки того, чи дійсвключає (Фіг.1) промотор РНК-полімерази Т7 з но реплікація геномів залежить від «правила шес 39 77146 40 ти», автори внесли за унікальним Clal-сайтом плаексперименти по котрансфекції клітин, інфікованих змід pOLTV535 і pOLTV553 серію коротких, самоFPV-T7. Клітини трансфікували шляхом поєднання комплементарних олігонуклеотидів, які збільшуваплазмід, що включають мінігеномну плазміду і ли довжину на 1 нуклеотид (Фіг.2). Одержані в плазміди pCIneoNP, pCIneoP і pCIneoL(c), відповірезультаті плазміди (pOLTV535 від N0 до N5 і дно. Як негативний контроль плазміду pCIneoL(c), pOLTV553 від N0 до N5) розрізнюються за розміяка кодує ключовий білок L, замінювали векторною ром на 1-6 нуклеотидів, отже, один з них повинен плазмідою рСІnео. Одержані результати (табл. 5) утворити мінігеномну РНК, яка задовольнить показали, що дійсно плазміди, що кодують білки «правилу шести». Ці плазміди використали для ΝΡ, Ρ і L, здатні забезпечувати реплікацію мінігетрансфекції клітин CER або клітин CER-C9, інфіномних РНК. Також ці результати показують, що кованих FPV-T7, як описано вище. Одержані реаналогічним чином з реплікацією мінігеномів з учазультати показали, що тільки плазміди стю вірусу-помічника, реплікація з участю білків pOLTV535N3 і pOLTV553N3 зумовлювали посиΝΡ, Ρ і L також є залежною від «правила шести». лення активності SEAP після NDV-інфікування. Нуклеотидна послідовність повного геному Довжина мінігеномних РНК, одержаних з цих плаNDV штаму LaSota змід з участю РНК-полімерази Т7, була визначена Субгеномні фрагменти кДНК, що охоплюють як 6n+2. Оскільки на 5'-кінці вказаних мінігеномних повний геном NDV, були сконструйовані із застоРНК присутні два «зайвих» нуклеотиди G, то ці суванням ПЛР з ревертуванням (Фіг.4). Для мінімідані підтверджують, що тільки розмір послідовносзації помилок при ПЛР суміш ферментів, що маті РНК, розташованої між аутентичними 3'- і 5'ють коректуючу активністю (Expand Long Template кінцями мінігеномних РНК, є істотним для «правиkit: Boehringer Mannheim), використали в поєднанні ла шести». Це перевіряли шляхом конструювання з обмеженим числом циклів ПЛР (15 циклів). мінігеномних плазмід, в складі яких старт-сайт Праймер 3UIT, комплементарний 3'-кінцю РНК транскрипції РНК-полімерази Т7 змінювали так, NDV, використали для зворотної транскрипції, а що перший нуклеотид, який вбудовується в РНК, ген-специфічні праймери використали для ПЛР. був першим нуклеотидом 3'- або 5'-кінця NDV (див. Для ідентифікації можливих помилок при ПЛР бу«Матеріали і методи»). Трансфекція цими плазміли проведені три незалежні реакції ПЛР, внаслідок дами показала, що тільки ті мінігеномні РНК, які яких одержували три незалежні набори субгеномпоходили від плазмід pOLTV535N3 і pOLTV553N3, них кДНК. Ці кДНК, розмір яких варіювався від 4 до реплікуються з участю вірусу-помічника (дані не 7 тисяч пар нуклеотидів, клонували в pGEM-T. включені). Встановлення даного факту додатково Нуклеотидну послідовність двох наборів кДНК вивказує на те, що реплікація NDV жорстко обмежезначали з використанням праймерів, які були або на «правилом шести». Більш того ці дані вказують встановлені за параметрами опублікованих посліна те, що присутність двох «зайвих» нуклеотидів G довностей NDV, або є похідними від послідовності на 5'-кінці мінігеномних РНК не заважає точній NDV, визначеної в ході даного дослідження (табреплікації. Аналогічні результати були одержані на лиця 1). Невизначеність, що залишалася дозволяматеріалі мінігеномних плазмід (або плазмід DI) ла шляхом секвенування відповідних ділянок на інших параміксовірусів [Pattnaik et al., 1992; Harty & матеріалі третього набору клонів кДНК. Геном Palese, 1995]. NDV штаму LaSota складається з 15186 пар нукУпакування мінігеномів NDV з участю вірусулеотидів (Фіг.3), що робить його найменшим серед помічника геномів всіх параміксовірусів, для яких до теперіДля встановлення того, чи можуть мінігеномні шнього часу встановлена повна геномна послідоРНК бути упаковані з участю вірусу-помічника вність [Kolakofsky et al., 1998]. NDV, культуральне середовище трансфікованих Конструювання клону повнорозмірної кДНК клітин переносили на свіжі моношари і після 1NDV в транскрипційній плазміді pOLTV5 годинної адсорбції моношарові культури тричі Для конструювання повнорозмірного клону промивали ФСБ і додатково інкубували в повному кДНК вірусу NDV штаму LaSota клони кДНК, що середовищі. Після інкубації протягом 24 годин виперекриваються, і охоплюють повний геном NDV, мірювали активність SEAP в культуральному сез'єднували один з одним за загальними рестрикредовищі. Одержані результати показали, що акційними сайтами відповідно до підходу, відобративність SEAP була присутньою тільки в клітинах, женого на Фіг.4. Повну кДНК NDV збирали в мініякі були оброблені культуральним середовищем, геномній плазміді pOLTV535 (див. вище), яка є взятим від клітин, трансфікованих мінігеномною похідною від транскрипційної плазміди pOLTV5. плазмідою pOLTV553N3 (таблиця 4). Ці дані вкаЯк можна бачити на Фіг.4В, останнім етапом зують на те, що мінігеномні РНК можуть бути упаданого збирання повної кДНК NDV було клонуванковані в оболонки NDV і що одержані вірусні часня Clal-фрагмента довжиною приблизно 8,8 тисяч тинки здатні інфікувати клітини. Більше того ці дані пар нуклеотидів (нуклеотиди 3521-12355) з складу показують, що упакування залежить від реплікації, pGEM-B в плазміду p535-DI, яка включає послідоа це говорить про те, що тільки ті молекули РНК, вності NDV, фланкуючі Clal-сайт за двома стороякі утворять комплекс з вірусними білками ΝΡ, Ρ і нами від нього (тобто нуклеотиди 1-3521 і 12355L, упаковуються у вірусоподобні частинки. 15186, відповідно). Цей етап, як виявилося, є веРеплікація мінігеномів NDV з участю плазмід, льми важким, так як заявникам протягом декількох експресуючих білки ΝΡ, Ρ і L разів не вдавалося утворити точні клони. Отже, Для визначення того, чи можуть мінігеномні Clal-фрагмент плазміди pGEM-B був помічений РНК також реплікуватися з участю плазмід, що геном резистентності до хлорамфениколу (Cm) з кодують ключові білки ΝΡ, Ρ і L, були проведені плазміди pACYC184. Включаючий ген Cm Clal 41 77146 42 фрагмент був виділений і клонований за Clalз інокульованих яєць, характеризувався тим же сайтом p535-DI, а одержані трансформанти відбирівнем реактивності, що і початковий штам LaSota. рали за резистентністю до Cm. Оскільки трансфоВірус, який виділили з інокульованих яєць, визнарманти характеризувалися слабим ростом, відбір з чили NDFL, щоб відособити його від початкового антибіотиками проводили при зниженні концентштаму LaSota. рації до 15мкг/мл Cm і 10мкг/мл канаміцину, а темСтворення генетично модифікованого NDV на пературу інкубації знижували з 37°С до 32°С. Наматеріалі повнорозмірної кДНК решті, ген Cm видаляли з даної плазміди шляхом Для того щоб недвозначно показати, що котобробки рестриктазою BsiWI з подальшим відноврансфекцію можна використати для виділення ленням кільцевої структури з допомогою ДНКінфекційного вірусу на матеріалі клонованої повлігази Т4. Після трансформації клітин Е. соlі клітинорозмірної кДНК NDV, в плазміду pNDFL(+) внони, несучі бажану плазміду, ідентифікували за їх сили генетичну мітку. Для цієї мети амінокислотну фенотипом з допомогою скринінгу на резистентпослідовність сайта розщеплення протеазою в ність до Km і на чутливість до Cm. Одержану в послідовності білка Fo змінювали від такої, штаму результаті плазміду, яка включає повнорозмірну LaSota (GGRQGR L) на консенсусну послідовність кДНК NDV, клоновану між Smal- і Stul-сайтами вірулентних штамів NDV (GRRQRR F) із застосутранскрипційної плазміди, визначили pNDFL+. ванням ПЛР-мутагенезу [детально див. розділ Створення інфекційного NDV на матеріалі по«Матеріал і методи»]. Одержану в результаті плавнорозмірної кДНК зміду, pNDFL+[FWT], використали для створення Для створення інфекційного NDV повністю з вірусу з використанням котрансфекційної системи, клонованої кДНК плазміду pNDFL+ використали в описаної вище. Інфекційний вірус, позначений експериментах з котрансфекції з плазмідами NDFL [FWT], виділяли з алантоїсної рідини яєць, що pCIneoNP, pCIneoP і pCIneoL(c), як описано вище розвиваються, які були інокульовані культуральдля мінігеномних плазмід. Трансфекцію клітин ним середовищем від котрансфікованих клітин CER і CEF контролювали з використанням мінігеCEF. У тесті на пригнічення гемаглютинації всі номної плазміди pOLTV553N3 і шляхом вимірюмоноклональні антитіла, включаючи 7D4, яке спевання рівня експресії SEAP. Як негативний контцифічне для штаму LaSota, виявляли таку ж реакроль використали заміну pCIneoL(c) на рСІnео. тивність відносно новоутвореного вірусу, як і у Після котрансфекції клітини інкубували протягом відношенні початкового штаму LaSota. Нуклеотид3-6 днів в середовищі, що містить 5% алантоїсної ну послідовність ділянки, що кодує сайт розщепрідини. Додання алантоїсної рідини необхідне толення протеазою білка F, визначали з допомогою му, що клітини CER або CEF позбавлені відповідПЛР з ревертуванням. Одержані результати, поканих протеаз, які забезпечують розщеплення білка зали, що нуклеотидна послідовність включає точні F вірусу NDV штаму LaSota. Розщеплення білка F нуклеотидні зміни, які були внесені в мутагенний є абсолютно необхідним для поширення від клітипраймер, що використовувався для модифікуванни до клітини генерації інфекційного вірусу. Після ня початкової послідовності LaSota. Ці дані покаінкубації протягом 3 днів проводили імунологічне зують, що вірус походив від плазміди pNDFL+[FWT], фарбування фіксованих моношарових культур з і показують, що генетично модифікований NDV використанням моноклонального антитіла, специможе бути створений повністю на матеріалі клонофічного відносно білка F. Одержані результати ваної повнорозмірної кДНК NDV. показали, що клітини, які забарвлювалися цим Сайт розщеплення протеазою білка Fo вірусу антитілом, присутні тільки в тих моношарах, які NDV є ключовим детермінантом вірулентності були котрансфіковані плазмідами pNDFL(+), Загалом, вважається, що амінокислотна посpCIneoNP, pCIneoP і pCIneoL(c). Ці результати лідовність сайта розщеплення протеазою в білку вказують на те, що в цих клітинах відбувається Fo є ключовим детермінантом вірулентності у різреплікація геному і експресія. Не було виявлено них штамів NDV. Створення генетично модифікозабарвлених клітин тоді, коли в експериментах з ваного штаму LaSota, у якого амінокислотна поскотрансфекції pCIneoL(c) замінювали плазмідою лідовність сайта розщеплення протеазою була рСІnео. замінена з лентогенної (невірулентної) на таку від Для виділення інфекційного вірусу надосадовелогенного (вірулентного) штаму NDV, надає унівий шар трансфікованих моношарів CEF ін'єкувакальну можливість перевірити дане припущення. ли в алантоїсну порожнину курячих яєць, що розОтже, визначали індекс інтрацеребральної патовиваються. Через 4 дні алантоїсну рідину збирали, генності (ІСРІ) новоутвореного вірусу NDFL[FWT] і аналізували в гемаглютинаційному тесті і знову порівнювали його з індексами штаму NDFL і почапасирували в яйця,. Одержані результати показатковим штамом LaSota (клон Ε13-1). Одержані ли, що тільки надосадовий шар клітин, трансфікорезультати показали, що ІСРІ штаму NDFL[FWT] ваних поєднанням плазмід pNDFL(+), pCIneoNP, становив 1,3, що істотно перевершує значення для pCIneoP і pCIneoL(c), зумовлював позитивну реакштамів NDFL (ІСРІ=0,0) і клону Е13-1 (ІСРІ=0,3). Ці цію в тесті на гемаглютинацію. Алантоїсну рідину, дані показують, що, як і очікувалося, вірулентність яка характеризувалася позитивною реакцією гемаNDV значною мірою визначається амінокислотною глютинації, після цього аналізували в тесті на припослідовністю сайта розщеплення протеазою в гнічення гемаглютинації з використанням монокбілку Fo. лональних антитіл 7В7, 8С11, 5А1, 7D4 і 4D6 [Long Внесення серологічного маркера et al., 1986], які можна використати для диференОболонкові глікопротеїни F і HN NDV є найціювання різних штамів NDV. Результати даного більш сильними імуногенними білками даного вітесту показали, що штам NDV, який був виділений русу. Після зараження як білок F, так і білок HN 43 77146 44 викликають могутню відповідь у вигляді виробленгенетично модифіковані штами NDV об'єднують в ня нейтралізуючих антитіл. Індукція такої відповіді собі дві ключові властивості маркерної вакцини, а за нейтралізуючими антитілами є основою для саме захист від захворювання і серологічне дифеуспішної вакцинації з використанням невірулентренціювання. ний штамів NDV (таких як штам LaSota, що широко Були сконструйовані гібридні гени HN, складезастосовується ). Однак, відповідь на вироблення ні злиттям або амінокислот 1-141 NDV і амінокисантитіл на вакцинні штами NDV не може бути розлот 142-580 параміксовірусу птахів 2-го типу пізнана в порівнянні з відповіддю на вироблення (APMV2) (позначена HN1/2141), або амінокислот 1антитіл на вірулентні польові штами NDV. Отже, 143 NDV і амінокислот 144-580 APMV2 (позначена інфекції вірулентним польовим вірусом не можуть HN1/2143). Аналогічним чином були сконструйовані дослідитися за допомогою серологічнох методів. гібридні гени HN, складені злиттям або амінокисТака ситуація небажана тому, що зараження лот 1-141 NDV і амінокислот 143-569 APMV4 (позпольовим вірусом маскується вакцинацією, а клініначена HN1/4141), або амінокислот 1-143 NDV і чні ознаки, що викликаються польовими штамами, амінокислот 145-569 APMV4 (позначені HN1/4143). можуть переглядатися або навіть приписуватися Ці гібридні гени були клоновані в еукаріотичний даній вакцині. Оскільки успішне диференціювання експресруючий вектор рСІnео і їх використали в між вакцинацією і інфекцією істотне для викорінюекспериментах з котрансфекції поряд з плазмідою, вання NDV, автори мали намір розробити генетичнесучої білок F NDV. Для цього білок F модифікуно модифіковані штами NDV, які можна було виковали таким чином, щоб амінокислотна послідовристати для вакцинації і які б серологічно ність сайта розщеплення протеазою між F2 і F1 відрізнялися від польових штамів NDV (так звані змінювалася з послідовності, характерної для «маркерні вакцини»). З метою розробки маркерних LaSota, на ту, яка є консенсусною послідовністю NDV-вакцин вірус повинен бути генетично модифівірулентних штамів NDV [FWT: див. розділ «Матекований таким чином, щоб один або декілька імуріали і методи»]. Експерименти з котрансфекції нодомінантних епітопів одного з (основних) антиклітин CER і клітин QM5 показали, що як HN1/2141, генів був або делетований, або модифікований. і HN1/2143, так і HN1/4141, і HN1/4143 індукували Делеція частини(ин) ключового білка може привозлиття клітин у варіанті коекспрессії з білком FWT. дити до втрати біологічної функції даного білка. Одержані дані показали, що комплекси між гібридОтже, один з імунодомінантних білків оболонки ними білками HN і білком F біологічно активні. ГібNDV заявники вибрали для модифікування таким ридні білки HN1/2143 і HN1/4143 використали для чином, щоб біологічна функція цього білка зберізаміщення початкового гена HN в складі повнорогалася, в той час як репертуар антитіл, специфічзмірного клону кДНК pNDFL+, одержуючи тим са143 143 них відносно модифікованого білка, відрізнявся від мим плазміди pNDFL-HN1/2 і pNDFL-HN1/4 . такого, специфічного відносно початкового білка. З Останні дві плазміди були після цього використані точки зору резонів, про які говориться нижче, в для одержання інфекційних вірусів з використанодному варіанті даного винаходу заявники вибраням описаної вище котрансфекційної системи. ли для модифікування білок HN вірусу NDV. ІнфеЖиттєздатні рекомбінантні віруси (позначені кція NDV ініціюється злиттям оболонки віріону з NDFL-HN1/2143 і NDFL-HN1/4143) можуть бути видіплазматичною мембраною клітини-хазяїна. Для лені з алантоїсної рідини яєць, що розвиваються, цієї мети необхідні як білок F, так і білок HN. Було які були інокульовані надосадовою фракцією транпоказано, що білки F і HN фізично взаємодіють, і сфікованих моношарів. ця взаємодія необхідна для злиття мембран [Deng Присутність гібридного гена HN в кожному з et al., 1995]. Більш того було показано, що така двох рекомбінантів перевіряли з допомогою ПЛР з взаємодія є типоспецифічною, тобто білки F і HN ревертуванням. Тести на пригнічення гемаглютиповинні походити від одного і того ж вірусу для нації показали, що моноклональні антитіла і політого, щоб виявити активність за злиттям. Взаємовалентні антисироватки проти NDV були нездатні діючий домен білка HN вірусу NDV був картировапригнічувати аглютинацію курячих еритроцитів ний в так званому «стебловому» або «стовбурорекомбінантними вірусами NDFL-HN1/2143 і NDFLвому» сегменті даного білка, що складається з HN1/4143. Ці дані показують, що штами NDFLперших 92 амінокислотних залишків в складі ектоHN1/2143 і NDFL-HN1/4143 можна використати як домену білка HN [Deng et al., 1995]. Гібридні білки вакцини, які за серологічними ознаками відрізняΗΝ, що включають амінокислоти 1-141 NDV і аміються від стандартних вакцин проти NDV. нокислоти 141-572 вірусу парагрипу людини 3-го Експресія гетерологічного білка рекомбінанттипу (hPIV3), як було показано, зберігають активним NDV ність за злиттям у випадку коекспрессії з білком F Для аналізу того, чи можуть чужорідні гени NDV. Ці дані підтверджують, що життєздатними вбудовуватися в геном NDV, заявники сконструюможуть бути генетично модифіковані штами NDV, вали рекомбінантний вірус, який несе репортерний несучі гібридний білок HN, що включає «стеблову» ген SEAP. Ген SEAP плходить від плазміди ділянку NDV з подальшим глобулярним сегментом pOLTV535 і його модифікували так, щоб він вклю(«голівкою») білка ΗΝ, який відрізняється від серочав типові сайти ініціації і зупинки транскрипції з типу параміксовірусу птахів. Такі штами будуть NDV. ДНК-фрагмент, що включає ген SEAP з повикликати відповідь у вигляді антитіл до HN, яка дальшими транскрипційними стоп- і стартвідрізняється від таких, специфічних для NDV. сайтами, вбудовували за Xmnl-сайтом (109-й нукОскільки відповідь за нейтралізуючими антитілами леотид) плазміди pNDFL+[FWT]. Інфекційний вірус, на білок F достатня для досягнення ефективного позначений NDFL-AP, був одержаний з викорисзахисту проти початкової вірусної інфекції, то такі танням котрансфекційної системи, а присутність 45 77146 46 гена SEAP перевіряли з допомогою ПЛР з ревервники одержали доказ того, що розщеплюваність туванням. Клітини, інфіковані штамом NDFL-AP, білка F є ключовим детермінантом (хоча і не єдиекспресували дуже високі рівні білка SEAP. Виконим детермінантом) вірулентності NDV. Шляхом ристовуючи специфічну активність білка SEAP, використання того ж зворотно-генетичного підходу заявники підрахували, що Х% білків, експресовасайт розщеплення може бути модифікований за них клітинами, інфікованими NDFL-AP, припадає бажанням в будь-яку іншу амінокислотну послідона білок SEAP. Ці дані показують, що гетерологічні вність. У результаті може бути створена серія гени можуть бути експресовані рекомбінантними штамів NDV, яка утворить діапазон рівнів віруленNDV на дуже високих рівнях. тності. Утворення делеційного мутанта NDV в трансIn vivo комплементуючій клітинній лінії Як вже відмічалося вище, було показано, що, З метою виключення експресії білка Μ NDV крім расщеплюваності білків F і HN, в патогенності велику частину гена Μ делегували шляхом розщеможуть грати роль і інші вірусні фактори. Зміни в плення плазміди pNDFL+[FWT] рестриктазою BsaAI транскрипції і трансляції можуть модулювати ріст і (3087-й нуклеотид) з подальшим частковим розпоширення за механізмом від клітини до клітини щепленням рестриктазою Hindlll (4252-й нуклеовірусу і/або цитопатогенністі. Доступність інфектид). Після заповнення Hindlll-утворених кінців за ційної кДНК NDV дозволяє провести систематичну допомогою фрагмента Кленова ДНК-полімерази модифікацію послідовностей, які залучені до транодержаний фрагмент рециркулювали з викорисскрипції і реплікації. Це може приводити до ствотанням ДНК-лігази Т4 і використали для трансфорення нових NDV-вакцин, які додають оптимальрмації клітин Е. соlі. Одержану в результаті плазний рівень імуногенності віртуально неіснуючої міду, позначену pNDFL+[FWT] dM, використали для вірулентності. одержання вірусу із застосуванням котрансфекБезпека є однією з найбільш важливих власційної системи в транс-комплементуючих клітинах тивостей живих вакцин. Однак, для багатьох жиCER-M, які експресують білок Μ NDV. Надосадову вих вакцин, включаючи NDV, імуногенність часто фракцію трансфікованих моношарів тричі пасирунегативно корелує з вірулентністю. Отже, подальвали через клітини CER-M і аналізували на присуше ослаблення живих вакцин без втрат в імунотність вірусу. Одержання вірусу підтверджується генності є одним з найбільш бажаних змін, для тим фактом, що культуральна надосдкова фракція досягнення яких може бути застосована генетична після третього пересівання давала позитивні ремодифікація. У зв'язку з цим варто зазначити, що, зультати в тестах на гемаглютинацію (НА) і на прияк було показано, виключення експресії білка V гнічення гемаглютинації (НІ). Вірус визначили вірусу Сендай зумовлювало істотно знижену патоNDFL-dM. Коли NDFL-dM використали для інфікугенність in vivo відносно мишей [Kato et al., 1997]. вання моношарів клітин CEF, вірус був здатний до Як і у випадку з вірусом Сендай, NDV також утвопоширення за механізмом від клітини до клітини, рить білок V за механізмом, відомим як «редагуна що вказують дані тесту ІРМА при використанні вання РНК» [Steward et al., 1993]. Можна передбамоноклонального антитіла до білка F. Як очікувачити, що результатом виключення експресії білка лося, експресія білка Μ не може бути виявлена в V NDV також може бути ослаблений фенотип in тесті ІРМА при використанні моноклональних анvivo. титіл, специфічних відносно білка М. Коли надосаКрім зміни вірулентності NDV, заявниками подову фракцію використали для інфікування або казано, що можливою є модифікація антигенної клітин CEF, або клітин CER-M, в тесті ІРМА не системи NDV таким чином, що можуть бути утвовдавалося продемонструвати присутність реплікорені штами, які будуть відрізнятися від польових ваного вірусу в цих моношарових культурах. Ці штамів NDV за серологічними ознаками. Ці так дані вказують на те, що інфекційний вірус не може звані маркерні вакцини є дуже цінним інструменбути одержаний в некомплементуючих клітинах том для оцінки стрівальності NDV в промислових CEF. Ці результати були підтверджені виявленням популяціях в світі. Більш того крупномасштабне того, що інокуляція яєць, що розвиваються надозастосування таких маркерних вакцин може зрешсадовою фракцією від інфікованих клітин CEF не тою привести до повного викорінювання NDV шляприводить до утворення вірусного потомства при хом інтенсивного скринінгу і вилучення заражених аналізі в тестах НА і НІ. популяцій. У даній заявці показано, що чужорідні Необхідність в поліпшених NDV-вакцинах і гени можуть бути вбудовані в геном NDV. Ці чужоособливо потреба в маркерних вакцинах проти рідні гени можна експресувати в інфікованих кліNDV спонукали заявників розробити зворотнотинах на дуже високих рівнях. Це показує, що NDV генетичну систему, яка б дозволила генетично можна використати як вакцинний вектор для ексмодифікувати NDV. У даній заявці описане ствопресії антигенів інших патогенів (домашніх птахів). рення інфекційного NDV повністю з клонованою Деякі властивості роблять NDV ідеальним вакцинповнорозмірною кДНК. Заявники показали, що ним вектором для вакцинації проти респіраторних вірулентність NDV може бути різко змінена шляабо кишкових захворювань. 1) NDV можна легко хом модифікування тільки трьох нуклеотидів, які культивувати до дуже високих титрів в яйцях, що визначають специфічність сайта розщеплення розвиваються. 2) Масова культура NDV в яйцях, протеазою білка F. В цьому випадку сайт розщепщо розвиваються є відносно дешевою. 3) NDVлення протеазою змінювали з характерного для вакцини відносно стабільні і можуть бути просто штаму LaSota на консенсусний сайт розщеплення введені методами масового застосування, такими у вірулентних штамів NDV. Шляхом створення як додання в питну воду або шляхом розпилення такого генетично модифікованого штаму NDV заяабо утворення аерозолю. 4) Природне зараження 47 77146 48 NDV відбувається через дихальний і /або травний LaSota і розшифрована амінокислотна послідовтракт, що також представляє основні природні ність генів NDV. Показана послідовність відповідає шляхи зараження багатьма іншими патогенами антигеномному ланцюгу і показана в напрямі від 5' домашніх птахів. 5) NDV може індукувати місцевий до 3' у вигляді одноланцюгової ДНК. Послідовімунітет, незалежно від присутності циркулюючих ність, показана на даній фігурі, є консенсусною материнських антитіл. послідовністю, яка була визначена шляхом прямоНарешті, заявниками показано, що життєздатго секвенування двох незалежних наборів субгені делеційні мутанти NDV можуть бути утворені з номних кДНК, що перекриваються, які охоплюють використанням транс-комплементуючих клітинних весь геном вірусу NDV. Невизначеність (мабуть, ліній. Делеційний мутант NDV був утворений так, що є результатом помилок при ПЛР), що залишащоб він не міг, експресувати матричний білок (М), ється розділяла шляхом секвенування відповідні який бере участь в брунькуванні NDV на внутрішділянки в третьому незалежному наборі клонів. ній поверхні клітинної мембрани. Заявниками поПослідовність повнорозмірного кДНК-клону казано, що фенотипічно комплемейтований штам pNDFL+, яка була одержана з субгеномних клонів NDV, який не здатний експресувати білок М, проте кДНК, що перекриваються (див. Фіг.4), відрізняєтьздатний інфікувати клітини і розповсюджуватися за ся від консенсусної послідовності NDV за наступмеханізмом передавання від клітини до клітини. ними положеннями (нуклеотиди консенсусної посОднак, мутантний вірус не здатний утворювати лідовності в дужках): нуклеотид 1755, G (А); інфекційне потомство в некомплементуючих клітинуклеотид 3766, A (G); нуклеотид 5109, G (А); нукнах. Ці дані показують, що фенотипічно комплемелеотид 6999, Τ (С); нуклеотид 7056, G (А); нуклеонтовані делеційні мутанти NDV можуть бути викотид 9337, G (А); нуклеотид 9486, А (Т); нуклеотид ристані як безпечні самообмежуючі вакцини, які не 10195, Τ (С); нуклеотид 13075, A (G). Ці відмінності можуть розповсюджуватися в довкілля. Така непезумовлюють три амінокислотні заміни (амінокисредавана вакцина об'єднує саму важливу перевагу лоти консенсусної послідовності в дужках): білок F, живих вакцин, а саме ефективність, і саме важлиR189 (Q); білок ΗΝ, S200 (Р); білок L, N369 (І). ве достоїнство убитих вакцин, а саме безпеку. Фіг.4. Опис фігур (A) Базова стратегія, що використовувалася Фіг.1. для одержання повнорозмірної кДНК NDV на маТранскрипційний вектор pOLTVS є похідним теріалі клонів, що перекриваються кДНК. кДНК від транскрипційного вектора, [описаного у Pattnaik формували в плазміді pOLTV535, яка вже включаet al., 1992: див. докладний опис конструкції в текла 3'- і 5'-кінці NDV штаму LaSota (порів. з Фіг.2). сті]. Ця плазміда включає промотор ДНК-залежної Одержану в результаті плазміду, позначену РНК-полімерази Т7 (показаний напівжирним шриpNDFL+, використали для одержання інфекційного фтом), за яким знаходяться унікальні рестрикційні NDV. StuI- і Smal-сайти і автокаталітичний рибозим віру(B) Докладна процедура клонування в процесі су гепатиту-D (HDV). ДНК-фрагменти можуть бути одержання повнорозмірної кДНК NDV на матеріалі клоновані між StuI- і Sinai-сайтами і можуть бути субгеномних клонів кДНК, що перекриваються. Cm транскрибовані або in vitro, або in vivo з викорисозначає ген резистентності до хлорамфеніколу, танням ДНК-полімерази Т7. 5'-кінець одержаних, в який був тимчасово внесений як фенотипічна мітка результаті, транскриптів включає два додаткових (детально див. в тексті). залишки G, які не кодуються даною вставкою. За(C) Докладна процедура клонування при одевдяки активності рибозиму 3'-кінець транскриптів ржанні генетично модифікованої повнорозмірної точно відповідає останньому нуклеотиду даної кДНК NDV. Модифікацією є заміна трьох нуклеовставки. тидів, які були внесені в послідовність гена F і які Фіг.2. приводять до модифікації амінокислотної послідоСтруктура мінігеномних плазмід pOLTV535 вності в сайті розщеплення протеазою білка F (де(Фіг.2А) і pOLTV553 (Фіг.2У). Мінігеномні плазміди тально див. в тексті). засновуються на транскрипційній плазміді pOLTV5 Фіг.5. (порів. з Фіг.1) і включають 3і-ділянку (нуклеотиди (А) Серія рОLТV535 1-119) і 5'-ділянку (нуклеотиди 14970-15186) геноТранскрипція з участю РНК-полімерази Т7 му NDV штаму LaSota, фланкуючі генів, що кодує приводить до утворення антигеномної РНК (або секретовану лужну фосфатазу (SEAP). Транскри[+]-РНК), яка може бути безпосередньо трансльопція pOLTV535 з участю РНК-полімерази Т7 привана клітиною в білок SEAP. Після інфікування водить до утворення антигеномної РНК (або [+]клітин вірусом-помічником (або після котрансфекРНК), в той час як транскрипція pOLTV553 утвоції плазмід, що кодують білки ΝΡ, Ρ і L), антигенорить геномну РНК (або [-]-PHK). Помічені сайти мну РНК використовують для синтезу геномної початку (3) і закінчення (Е) транскрипції, відповідні РНК (або [-]-PHK) з участю вірусного полімеразновірусним сигналам ініціація і термінації транскрипго комплексу. Потім геномну РНК використовують ції. Старт-кодон гена SEAP підкреслений. Також для синтезу і мРНК (з використанням специфічних показані послідовності вставок (N0-N5) за Clalстартового [S] і кінцевого [Е] блоків), і антигеномсайтом, які утворять мінігеномні плазміди, кожна з ної РНК з участю вірусного полімеразного компяких відрізняється в довжину на 1 нуклеотид (відлексу. повідно, POLTV535NO-N5 і pOLTV553NO-N5). (В) Серія pOLTV553 Транскрипція з участю РНК-полімерази Т7 з Фіг.3. одержанням геномної РНК (або [-J-PHK), яка не Нуклеотидна послідовність геному NDV штаму може бути трансльована в білок SEAP. Після інфі 49 77146 50 кування клітин вірусом-помічником (або після котcomplementary DNA to Newcastle disease virus and рансфекції плазмід, що кодують білки ΝΡ, Ρ і L) nucleotide sequence analysis of the junction between геномну РНК використовують для синтезу як мРНК the genes encoding the haemagglutinin(з використанням специфічних стартових [S] і кінneuraminidase and the large protein. J. Gen. Virol.67: цевих [Е] блоків), так і антигеномної РНК з участю 475-486 вірусного полімеразного комплексу. Chang, A.C.Y. and Cohen, S.N. (1978) Фіг.6. Construction and characterization of amplifiable Зіставлення послідовностей нуклеїнових кисmulticopy DNA cloning vehicles derived from the лот 5'-кінцевих ділянок NDV штаму LaSota і інших P15A cryptic miniplasmid. J. Bacterial. 134: 1141параміксовірусів проведене як порівняння послі1156. довностей NDV і чотирьох представників роду Cho. B.R. (1982) Cytopathic effects and focus Rubulavirus, трьох представників роду formation by reticuloendotheliosis viruses in a quail Paramyxovirus і трьох представників роду fibroblast cell line. Avian Diseases 27: 261 Morbillivirus. Послідовності представлені від кінцеCollins, P.I., Hil, M.G., Camargo, E., Grosfeld, H., вого блоку гена L до 5'-кінця (кДНК в напрямі 3'-5'). Chanock, P.M. and Murphy, B.R. (1995) Production NDV представляє вірус ньюкаслської хвороби; of infectious human respiratory syncytial virus from hPIV2 представляє вірус парагрипу людини 2-го cloned cDNA confirms an essential role for типу; MuV представляє вірус свинки; SV5 і SV41 transcription elongation factor from the 5' proximal представляють віруси 5 і 41 мавп, відповідно; SeV open reading frame of the M2 mRNA in gene представляє вірус Сендай; bPIV3 I hPIV3 предстаexpression and provides a capability for vaccine вляють віруси парагрипу бика і людини, відповідdevelopment. - Proc. Natl. Acad. Sd. USA 92: 11563но; CDV представляє вірус собачої чуми; MeV 11567. представляє вірус кору; RPV представляє вірус Conzelmann, K.-K. (1996) Genetic manipulation чуми рогатої худоби. Нуклеотидні послідовності of non-segmented negative-strand RNA viruses. J. повних геномів були одержані з наступних джерел Gen. Virol.77: 381-389. (депозитарні №№): NDV (AF077761); hPIV2 Cowen, B.S. and Braune, M.O. (1988) The (Х57559); MuV (AB000388); SV5 (AF052755); SV41 propagation of avian viruses in a continuous cell line (Х64275); bPIV3 (D84095); hPIV3 (Z11575); CDV (QT35), of Japanese quail origin. Avian Diseases 32: (LI3194); MeV (XI6565); RPV (Z30697). 282-297. Бібліографія Deng, R., Wang, Z., Mirza, A.M. and lorio, R.M. Alexander, D. J. (1993) Paramyxovirus infections. (1995) Localization of a domain on the paramyxovirus In Virus infections of birds. McFerran, J.B. and attachment protein required for the promotion of McNulty, M.S.(eds), pp.321-340, Elsevier Science cellular fusion by its homologous fusion protein spike. Publishers B.V., Amsterdam. Virology 209: 457-496. Antin, P.В and Ordahl, C.P. (1991) Isolation and Doyle, T..M. (1927) A hitherto unrecorded characterization of an avian myogenic cell line. disease of fowls due to a filter-passing virus. J. Сотр. Dev.Blol. 143: 111-121. Pathol. Ther. 40: 144-169. Baron, M.D. and Barrett, T. (1997) Rescue of Garcin, D., Pelet, Т., Calain, P., Roux, L., Curran, rinderpest virus from cloned cDNA. J. Virol. 71; 1265J. and Kolakofsky, D. (1995) A highly recombinogenie 1271. system for the recovery of infectious Sendai Beach, J.R. (1944) The neutralization in vitro of paramyxovirus from cDNA: generation of a novel avian pneumoencephalitis virus by Newcastle disease copy-back non-defective interfering virus. EMBO J. immune serum. 5c- Lence 100: 361-362. 14: 6087-6094. Beard, C.W. and Hanson, R.P. (1984) Newcastle Garten. W., Berk, W., Nagai, Y., Rott, R. and disease. In M.S. Hofstad et al. (eds) Disease of Klenk, H.-D. (1980) Mutational changes of the Poultry, 8th Ed., pp.452-470. Iowa State University protease suceptibility of glycoprotein F of Newcastle Press, Ames. Beaudette, F.R., Bivins, J.A. and Miller, disease virus: Effects on pathogenicity. J. Gen. B.R. (1949) Newcastle disease immunization with live Virol.50; 135-147. virus. Corne-U Vet. 39: 302-334. Goldhaft, T.M. (1980) Historical note on the origin Boursnell, M.E.G., Green, P.F., Samson, A.C.R., of the LaSota strain of Newcastle disease virus. Avian Campbell, J.I.A., Deuter, Α., Peters, R.W., Millar, DIs. 24: 297-301. N.S., Emmerson, P.T. and Binns, M.M. (1990) A Gough, R.E. and Alexander, D-J. (1973) The recombinant fowlpox virus expressing the speed, of resistance to challenge induced in chickens hemagglutinin-neuraminidase gene of Newcastle vaccinated by different routes with a B1 strain of live disease virus (MDV) protects chickens against NOV. Vet. Rec. 92: 563-564. challenge by MDV. Virology 178: 297-300. Hanson, R.P. (1988) Heterogeneity within strains Britton, P., Green, P., Kottier, S., Mawditt, K.L., of Newcastle disease virus: key to survival. In DJ. Penzes, Z., Cavanagh, D. and Skinner, M. (1996) Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 113-130. Expression of bacteriophage T7 RNA polymerase in Kluwer Academic Publ., Boston. avian and mammalian cells by a recombinant fowlpox Harty, R.N. and Palese, P. (1995) Mutations virus. J. Gen. Virol.77: 963-967. within noncoding terminal sequences of model RNA's Calain, P. and Roux, L. (1993) The rule of six, a of Sendai virus: Influence on reporter gene basic feature for efficient replication of Sendai virus expression. J. Virol.69: 5128-5131. defective interfering RNA. J. Virol. 67: 4822-4830. Heckert, R.A., Riva, J., Cook, S., McMillen, J. and Chambers, P., Millar, N.S., Bingham, R.W. and Schwartz, R.D. (1996) Onset of protective immunity in Emmerson, P.T. (1986) Molecular cloning of chicks after vaccination with a recombinant 51 77146 52 herpesvirus of turkeys vaccine expressing Newcastle Relationships among virus spread, cytopathogenicity, disease virus fusion and hemagglutinatininand virulence as revealed by the noncytopathic neuraminidase antigens. Avan Dis. 40: 770-777. mutants of Newcastle disease virus. J. Virol.40; 691Heuschele, W.P. and Easterday, B.C. (1970) 702. Local immunity and persistence of virus in the Meulemans, G., Gonze, M., earlier, M.C., Petit, tracheas of chickens following infection with P., Burny, A. and Long, L. (1986) Protective effects of Newcastle disease virus. II. Immunofluorescent and HN and F glycoprotein-specific monoclonal antibodies histopathological studies. J. Inf. Dis. 121: 497-504. on experimental Newcastle disease. Avian Pathol. Hitchner, S.B. and Johnson, E.P. (1948) A virus 15:761-768. of low virulence for immunizing fowls against Millar, N.S., Chambers, P. and Emmerson, P.T. Newcastle disease (avianpneumo encephalitis). Vet. (1988) Nucleotide sequence of the fusion and Med. 43: 525-530. haemagglutinin-neuraminidase gene of Newcastle Hoffman, M.A. and Banerjee, A.K. (1997) An disease virus, strain Ulster: Molecular basis for infectious clone of human parainfluenza virus type 3. variations in pathogenicity between strains. J. Gen. J". Virol.71: 4272-4277. Virol. 69: 613-620. Hofstad, M.S. (1953) Immunization of chickens Morgan, R.W., Gelb Jr., J., Schreurs, C.S., against newcastle disease by formalin-inactivated Lutticken, D., Rosenberger, J.K. and Sondermeijer, P. vaccine. Am. J". Vet. Res. 14: 586-589. (1992) Protection of chickens from Newcastle and Ichihara, Y., and Kurosawa, Y. (1993) Marek's diseases with a recombinant herpesvirus of Construction of new Τ vectors for direct cloning of turkeys vaccine expressing the Newcastle disease PCR products. Gene 130: 153-154. virus fusion protein. Avian Dis. 36; 858-870. Ishida, N., Taira, H., Omata, Т., Mizumoto, K., Morgan, R.W., Gelb Jr., J., Pope, C.R. and Hattori, S., Iwasaki, K. and Kawakita, M. (1986) Sondermeijer, P. (1993) Efficacy in chickens of a Sequence of 2617 nucleotides from the 3' end of herpesvirus of turkeys recombinant vaccine Newcastle disease virus genome RNA and the containing the fusion gene of Newcastle disease predicted amino acid sequence of the viral NP virus: onset of protection and effect of maternal protein. Nucl. Acids Res. 14: 6551-6564. antibodies. Kaleta, E.F. and Baldauf, C. (1988) Newcastle Moscovici, C, Moscovici, M.G., Jimenez, H., Lai, Disease in free-living and pet birds. In D.J. Alexander M.M., Haymann, M.J. and Vogt, P.K. (1977) (ed.), Newcastle Disease, pp. 197-246. Kluwer Continuous tissue culture cell lines derived from Academic Publ., Boston. chemically induced tumors of Japanese quail. Cell Kant, Α., Koch, G., van Roozelaar, D.J., balk, F. 11:95-103. and Cer Huurne, A. (1997) Differentiation of virulent Pattnaik, A.K., Ball, L.A., LeGrone, A.W. and and non-virulent strains of Newcastle disease virus Wertz, G.W. (1992) Infectious defective interfering within 24 hours by polymerase chain reaction. Avian particles of VSV from transcripts of a cDNA clone. Pathol. 26: 837-849. Cell 69: 1011-1020. Kolakofsky, D., Pelet, Т., Garcin, D., Hausmann, Peoples, M.E. (1988) Newcastle disease virus S., Curran, J. and Roux, L. (1998) Paramyxovirus replication. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle RNA synthesis and the requirement for hexamer Disease, pp.45-78. Kluwer Academic Publ., Boston. genome length: the rule of six revisited. J. Virol.72: Peeters, В., N. de Wind, M. Hooisma, F. 891-899. Wagenaar, A. Gielkens, and R. Moormann. (1992) Kraneveld, F.C. (1926) A poultry disease in the Pseudorabies virus envelope glycoproteins gp50 and Dutch East Indies. Med. Indlsch B1. Diergeneesk. 38: gll are essential for virus penetration, but only gll is 448-450. involved in membrane fusion. J. Virol.66: 894-905. Lamb, R. A. and Lolakofsky, D. (1996) Radecke, F., Spielhofer, P., Schneider, H., Paramyxoviridae: the viruses and their replication, in: Kaelin, K., Huber, M., Dotsch, C, Christiansen, G. and Fundamental Virology (Fields et al., eds). Chapter 20, Billeter, M.A. (1995) Rescue of measles virus from p.577-604, Lipincott-Raven Publishers, Philadelphia. cloned DNA. EMBO J. 14: 5773-5784. Lawson, N.D., Stillman, E.A., Whitt, M.A. and Rott, R. and Klenk, H.-D. (1988) Molecular basis Rose, J.K. (1995) Recombinant vesicular stomatitis of infectivity and pathogenicity of Newcastle disease virus from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477virus. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 4481. 98-112. Kluwer Academic Publ., Boston. Long, L., Portetelle, D, Ghysdael, J., Gonze, M., Russell, P.H., Griffiths, P.C., Goswami, K.K.A., Burny, A. and Meulemans, G. (1986) Monoclonal Alexander, D.J., Cannon, M.J. and Russell, W.C. antibodies to haemagglutinin-neuraminidase and (1983) The characterization of monoclonal antibodies fusion glycoproteins of Newcastle disease virus: to Newcastle disease virus. J. Gen. Virol.64: 2069relationship between glycosylation and reactivity. J. 2072. Virol.57: 1198-1202. Sambrook, J., Fritsch, E, F., and Maniatis, T. Madansky, C.H. and Bratt, M.A. (1978) (1989) Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Noncytopathic mutants of Newcastle disease virus. J. Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY. Virol.26: 724-729. Schneider, H., Spielhofer, P., Kaelin, K., Dotsch, Madansky, C.H. and Bratt, M.A. (1981a) C, Radecke, F., Sutter, G. and Billeter, M.A. (1997) Noncytopathic mutants of Newcastle disease virus Rescue of measles virus using a replication-deficient are defective in virus-specific RNA synthesis. J. vaccinia-T7 vector. J. Virol, meth. 64: 57-64. Virol.37: 317-327. Schnell, M.J., Mebatsion, T. and Conzelmann, K.Madansky, C.H. and Bratt, M.A. (1981b) K. (1994) Infectious rabies viruses from cloned cDNA. 53 77146 54 EMBO J"-. 13: 4195-4203. Tessier, B.C., Brousseau, R., and Vernet, T. Schutze, H., Enzmann, P.-J., Kuchling, R., (1986) Ligation of single-stranded Mundt, E., Niemann, H. and Mettenleiter, T.C. (1995) oligodeoxyribonucleotides by T4 RNA ligase. Anal. Complete genomic sequence of the fish rhabdovirus Biochem. 158: 171-178. infectious haematopoietic necrosis virus. J. Gen. Vieira, J., and Messing, J. (1991) New pUCVirol. 76:2519-2527. derived cloning vectors with different selectable Smith, A.L., Tignor, G.H., Mifune, K., and markers and DNA replication origins. Gene 100: 189Motohashi, T. (1977) Isolation and assay of rabies 194. serogroup viruses in CER cells. Intervirlogy 8: 92-99. Vindevogel, H. and Duchatel, J.P. (1988) Spradbrow, P.B. (1988) Geographical Panzootic Newcastle disease virus in pigeons. In DJ. distribution. In DJ. Alexander (ed.), Newcastle Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 184-196. Disease, pp. 247-255. Kluwer Academic Publ., Kluwer Academic Publ., Boston. Boston. Whelan, S.P.J., Ball, L.A., Barr, J.N. and Wertz, Stauber, N.. Brechtbuhl, K., Bruckner, L. and G.T.W. (1995) Efficient recovery of infectious Hofmann, M.A. (1995) Detection of Newcastle vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. disease virus in poultry vaccines using the Proc. Natl. Acad. Scl. USA 92: 8388-8392. polymerase chain reaction and direct sequencing of Wensvoort, G., Terpstra, C, Bonstra, J., amplified DNA. Vaccine 13: 360-364 Bloemraad, M. and Van Zaane, D. (1986) Production Steward, M., Vipond, I.В., Millar, N.S. and of monoclonal antibodies against swine fever virus Emmerson, P.T. (1993) RNA editing in Newcastle and their use in laboratory diagnosis. Vet. Microblol. disease virus. J. Gen. Virol. 74: 2539-2547. 12: 101-108. Taylor, J., Edbauer, C, Rey-Senelonge, Α., Yusoff, K., Millar, N.S., Chambers, P., and Bouquet, J., Norton, E., Goebel, S., Desmettre, P. Emmerson, P.T. (1987) Nucleotide sequence analysis and Paoletti, E. (1990) Newcastle disease virus fusion of the L gene of Newcastle disease virus: homologies protein expressed in a fowlpox virus recombinant with Sendai and vesicular stomatitis viruses. Nucl. confers protection in chickens. J. Virol. 64: 1441Acids Res. 15: 3961-3976. 1450. 55 77146 56 Таблиця 3 Реплікадія мінігеному з участю вірусу-помічника NDV Таблиця 2 Послідовність 3'- і 5'-кінцевих ділянок геному NDV штаму LaSota А. Послідовність 3'-кінцевої ділянки (показана як 5'-кінцева ділянка антигеномного ланцюга ДНК) Спосіб І Клон Послідовність 04 ACCAAACAGAGAATC 05 ACCAAACAGAGAATC 13 ACCAAACAGAGAATC 21 ACCAAACAGAGAATC Спосіб II Клон Послідовність 26 ACCAAACAGAGAATC 28 ACCAAACAGAGAATC 30 ACCAAACAGAGAATC 31 GCCAAACAGAGAATC 32 ACCAAACAGAGAATC 33 ACCAAACAGAGAATC Консенсусна AC CAAACAGAGAATC В. Послідовність 5'-кінцевої ділянки (показана як ДНК) Клони pBluescriptll-TSK Клон Послідовність r3101-13 ACCAAACAAAGATTT r3101-14 ACCAAACAAAGATTT r3101-15 ACCAAACAAAGATTT r2601-17 ACCAAACAAAGATTT r2601-18 ACCAAACAAAGATTT r2601-19 ACCAAACAAAGATTT r2601-20 AACAAGGTGAAGATA r2601-21 ACCAAACAAAGATTT Клони pGEM4Z Клон Послідовність r3101-16 ACCAAACAAAGATTT r3101-17 AC CAAACAAAGATTT r3101-18 ACCAAACAAAGATTT r3101-19 ACCAAACAAAGATTT r3101-22 ACCAAACAAAGATTT Консенсусна ACCAAACAAAGATTT Таблиця 5 Активність SEAP (імп/с) після котрансфекпії клітин CER плазмідами серії pOLTV553 і плазмідами pCIneoNP, pCIneoP і рСІnеоL/с) (або рСІnео як негативний контроль) Плазміда рOLTV553N0 рOLTV553N1 рOLTV553N2 рOLTV553N3 рOLTV553N4 рOLTV5S3N5 ΝΡ, Ρ і L 3,1 104 4,1 3,1 35,9 1,9 1,0 ΝΡ, Ρ і рСІnео 2,7 103 5,2 3,1 3,6 4,6 4,1 відношення 11,7 7,9 10,0 100,8 4,1 2,5 А. Активність SEAP (імп/с) після трансфекції клітин CER-C9 плазмідами серій POLTV535 і pOLTV553 Плазміда +NDV -NDV Відношення POLTV535N0 0,49 3,5 104 7,1 104 POLTV535N1 5,9 12,1 0,49 POLTV535N2 2,4 6,2 0,39 POLTV535N3 1,6 5,2 1,46 POLTV535N4 1,8 4,1 0,44 POLTV535N5 1,5 3,0 0,50 POLTV553N0 0,57 5,5 103 9,6 103 POLTV553N1 9,6 27,6 0,35 POLTV553N2 2,4 3,5 0,68 POLTV553N3 15,1 9,5 1,59 POLTV553N4 3,4 7,9 0,43 POLTV553N5 2,9 4,8 0,60 В. Активність SEAP (імп/с) після трансфекції клітин CER, інфікованих FPV-T7, плазмідами серії pOLTRV553 Плазміда +NDV -NDV Відношення POLTV553N0 0,86 7,2 104 8,3 104 POLTV553N1 8,4 12,0 0,70 POLTV553N2 8,9 12,6 0,71 POLTV553N3 27,4 8,6 3,19 POLTV553N4 9,7 10,4 0,93 POLTV553N5 8,5 8,1 1,05 Таблиця 4 Перенесення активності SEAP (імп/с) після обробки клітин CER надосадовою фракцією від клітин CER, інфікованих FPV-T7, які буди трансфіковані плазмідами серії POLTV553 і які були додатково інфіковані вірусом NDV (див, таблицю 3) Плазміда pOLTV553N0 pOLTV553N1 pOLTV553N2 POLTV553N3 pOLTV553N4 POLTV553N5 2,4 103 6,2 2,0 20,6 2,0 2,1 57 77146 58 59 77146 60