Застосування інтерферону-бета для лікування тяжкого гострого респіраторного синдрому (sars)

1. Застосування інтерферону-бета (IFN-β) або його ізоформи, мутеїну, злитого білка, функціонального похідного, активної фракції або солі для виробництва лікарського засобу, призначеного для лікування або профілактики тяжкого гострого респіраторного синдрому (SARS). 2. Застосування за п. 1, де вказаний IFN-β є рекомбінантним інтерфероном людини. 3. Застосування за п. 1 або 2, де вказаний IFN-β є консенсусним інтерфероном. 4. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де вказаний IFN-β є злитим білком, що містить принаймні домен імуноглобуліну. 5. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де вказаний IFN-β призначається в дозі 1-50 мкг на людину на день або 10-30 мкг на людину на день, або 10-20 мкг на людину на день. 6. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де вказаний IFN-β призначається щодня або через день. 7. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де вказаний IFN-β призначається два або три рази на тиждень. 8. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де вказаний IFN-β призначається підшкірно. 9. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де вказаний IFN-β призначається внутрішньом'язово. C2 2 (19) 1 3 81481 Пневмонія (пневмоніт) при гострій інфекції паренхіми легені охоплює альвеолярний простір і інтерстиціальну тканину. Вона може вражати цілу частину легені (лобарна пневмонія), сегмент частини (сегментарна або лобулярна пневмонія), альвеоли, що прилягають до бронхів (бронхопневмонія), або інтерстиціальну тканину (інтерстиціальна пневмонія). Ці відмінності, загалом, основані на даних рентгенографії. Пневмонію у дорослих суб'єктів старши х 30 років звичайно викликають бактерії. З них найбільш поширеною є Streptococcus pneumoniae. До інших патогенів відносяться анаеробні бактерії Staphylococcus aureus, Haemophilias influenzae, Chlamydia pneumoniae, С psittaci, C. trachomatis, Moraxella (Branhamella) catarrhalis, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae і інші грамнегативні бацили. Бактеріеподібний організм Mycoplasma pneumoniae найчастіше вражає дітей старшого віку і молодь, особливо навесні. Головними легеневими патогенами у немовлят і дітей є віруси: респіраторний синцитіальний вірус, вірус парагрипу, віруси грипу А і В. Ці агенти можуть також викликати пневмонію у дорослих, однак найбільш типовим вірусом, що вражає практично здорових суб'єктів є вірус грипу А, рідше - вірус грипу В і рідко - вірус вітряної віспи. До інших агентів відносяться вищі бактерії, в тому числі, Nocardia і Actinomyces sp; мікобактерії MycobacterMEm tuberculosis і їх атипічні штами (в основному, М. kansasii і М. a vMEm-intracellulare); гриби, в тому числі, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus і Pneumocystis carinii; рикетсії, в основному, Coxiella burnetii (лихоманка Q). До типових симптомів відносяться кашель, гарячковий стан і відділення мокроти, що звичайно розвивається через декілька днів після зараження і іноді супроводжується плевритом. Фізикальне обстеження може виявити тахипное і симптоми консолідації, такі, як крепітацію в поєднанні з шумом бронхіального дихання. Цей синдром звичайно викликається бактеріями, наприклад, S. pneumoniae і Н. influenzae. Діагноз ставлять на основі характеристичних симптомів і наявності інфільтрату, виявленого при рентгенографії грудної клітини. У 30-50% хворих не ідентифікується патоген, незважаючи на клінічний вияв ознак бактерійної пневмонії. Хоча для виявлення бактерійних патогенів при культивуванні виділеної мокроти використовують спосіб часових відмінностей, аналіз цих зразків часто дає помилкові результати, оскільки нормальна флора ротової частини глотки може забруднюватися патогенами в процесі їх проходження через верхні дихальні шляхи. Найбільш надійні в цьому відношенні зразки, отримані з стерильних в нормі ділянок, наприклад, крові хворих з бактеріемічною пневмонією або плевральної рідини хворих емпіємою. Для ідентифікації таких патогенів, як мікобактерії, мікоплазми, анаеробні бактерії, хламідії, віруси, гриби, легіонели, рикетсії і паразити, використовують спеціальні методи культивування, 4 спеціальні штами, серологічний аналіз, біопсію легені. Лікування основане на допоміжній штучній вентиляції легенів, в тому числі О 2 по показаннях, і призначенні антибіотиків, підібраних на основі даних аналізу фарбування по Граму. Якщо аналіз фарбування по Граму не здійснений або не встановлений діагноз, антибіотики підбирають з урахуванням віку хворого, епідеміології, факторів ризику хазяїна і тяжкості захворювання. Тяжка атипічна пневмонія або тяжкий гострий респіраторний синдром (SARS) є станом невідомої етіології, недавно описаним у хворих в Азії, Північній Америці і Європі. Більшість хворих у віці 25-70 років, у яких діагностований SARS, раніше були практично здорові. Є повідомлення про декілька випадків SARS у ді тей у віці менше 15 років. Інкубаційний період SARS складає звичайно 27 днів, однак в окремих повідомленнях вказують інкубаційний період до 10 днів. Захворювання звичайно починається з передвісника хвороби у вигляді лихоманки (>100,4°F [>38,0°C]). Лихоманка часто супроводжується високою температурою, ознобом, тремтінням, а також іншими симптомами, наприклад, головним болем, нездужанням і міальгією. На початку хвороби у деяких хворих спостерігають легкі респіраторні симптоми. Звичайно дані по спінальних, неврологічних або шлунково-кишкових змінах відсутні, але у деяких хворих розвивається діарея в процесі гарячкового продрому. Через 3-7 днів наступає фаза погіршення дихання з початком сухого, непродуктивного кашлю або задишки, які можуть супроводжуватися гіпоксемією або після вияву яких розвивається гіпоксемія. У 10-20% випадків респіраторне захворювання є настільки тяжким, що викликає необхідність проведення інтубації і штучної вентиляції легенів. Рівень летальності у хворих із захворюванням, відповідним визначенню, що дається в цей час Всесвітньою Організацією Охорони Здоров'я для SARS, становить приблизно 3%. Рентгенограма грудної клітини може бути нормальною в період фебрильного продрому і протягом всього періоду хвороби. Однак у досить великої частини хворих респіраторна фаза характеризується появою ранніх фокальних інтерстиціальних інфільтратів. На більш пізніх стадіях SARS рентгенографія грудної клітини виявляє ділянки консолідації. На початку захворювання абсолютне число лімфоцитів часто знижене. Загальне число лейкоцитів звичайно знаходиться в нормі або знижене. На піку респіраторного захворювання у приблизно 50% хворих реєстр ують лейкопению і тромбоцитопенію або низьке-нормальне число тромбоцитів (50000-150000/мкл). Встановлено, що початок респіраторної фази супроводжується підвищенням рівня креатинфосфокінази (до 3000МО/л) і трансаміназ печінки (у 2-6 разів вище нормального значення). У більшості хворих функція нирок залишається в нормі. Тяжкість захворювання може варіювати у 5 81481 великому діапазоні - від легкої форми до летального виходу. Лише у небагато суб'єктів, що тісно контактували з хворими SARS, виявляють схоже захворювання, більшість залишається здоровими. Згідно з повідомленнями деякі тісні контакти приводять до розвитку слабого фебрильного захворювання без респіраторних ознак або симптомів. Це свідчить про те, що захворювання не завжди прогресує в респіраторну фазу. Первинним шляхом поширення SARS є шля х від суб'єкта до суб'єкта через тісний контакт. У більшості випадків SARS розвивається у персоналу, обслуговуючого хворих SARS, або у суб'єктів, що спільно проживають з хворим SARS, або у тих, хто прямо контактує з інфекційним матеріалом (наприклад, респіраторними виділеннями), отриманими від хворих SARS. Потенційними шляхами поширення SARS можуть бути дотик до шкіри іншої людини або об'єктів, забруднених повітряно-краплинною інфекцією, з подальшим торканням своїх ока (очей), носа або рота. Зараження може статися при кашлі або чханні хворого SARS, коли капельки з носа і рота попадають на інших суб'єктів або на сусідні поверхні. Можливі також шляхи поширення SARS повітрям або інші, в цей час невідомі шляхи. Згідно з отриманою на даний момент інформацією такі симптоми, як лихоманка і кашель, найбільш ймовірно свідчать про інфікування людей. Однак дані про те, як довго до або після появи таких симптомів хворий на SARS може передавати захворювання іншим суб'єктам, відсутні. Вчені Центрів профілактики і контролю захворювань (CDC) і інших лабораторій виявили невідомий раніше коронавірус у хворих SARS. У цей час отримані тільки попередні дані по причинному агенту цього стану. Висунена гіпотеза, згідно з якою SARS викликає новий коронавірус [Ksiazek і інш., Новий коронавірус, асоційований з тяжким гострим респіраторним синдромом. The New England Journal of Medicine, www.nejm.org 16 April 2003]. Однак як потенційні причинні агенти SARS також досліджують інші віруси. Коронавіруси являють собою групу вірусів, які при спостереженні в мікроскоп мають гало або короно-подібний зовнішній вигляд. Ці віруси спричиняють у людини захворювання верхніх дихальних шляхів слабої або середньої тяжкості. Вони асоційовані з респіраторними, шлунковокишковими, печінковими і неврологічними захворюваннями тварин. Коронавіруси зберігають життєздатність в навколишньому середовищі не більше 3год. Вчені CDC виділили вірус з тканин двох хворих SARS і о характеризували його за допомогою різних лабораторних методів. Дослідження за допомогою електронного мікроскопа показало, що вірус має форму і зовнішній вигляд, характерні для коронавірусів. За допомогою генетичного аналізу встановили, що цей новий вірус належить до сімейства коронавірусів, але відрізняється від раніше ідентифікованих членів сімейства. Тестування 6 зразків сироватки хворих SARS показало, що вони недавно інфіковані цим вірусом. В інших тестах встановлено, що цей, раніше не вивчений, коронавірус присутній в різних клінічних зразках (в тому числі, в зразках, отриманих з носа і за допомогою мазка зі слизової оболонки горла) інших хворих SARS, прямо або непрямо пов'язаних зі спалахом захворювання. Ці результати і інші дані, отримані з лабораторій, що входять в мережу Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я (ВООЗ), свідчать на користь гіпотези, згідно з якою цей новий коронавірус є причинним агентом SARS. У цей час проводиться додаткове вивчення зв'язку цього коронавірусу з SARS. Коронавіруси періодично викликають пневмонію у людини, особливо у суб'єктів з ослабленою імунною системою. Ці віруси також служать причиною розвитку тяжких захворювань у тварин, в тому числі, кішок, собак, свиней, мишей і птахів. Дослідники з декількох лабораторій мережі ВООЗ повідомили про ідентифікацію параміксовірусу в клінічних зразках хворих SARS. У цих лабораторіях проводять вивчення можливості розвитку SARS внаслідок впливу параміксовірусу. У цей час найбільш ефективна схема лікування, якщо вона взагалі є, не відома. У деяких випадках терапія основана на застосуванні антивірусних засобів, таких, як оселтамівір або рибавірин. Хворим призначають стероїди перорально або внутрішньовенно в комбінації з рибавірином і іншими антимікробними засобами. Однак за відсутності клінічного дослідження в умовах, що контролюються, ефективність цих схем лікування залишається невідомою. Ранні дані по лабораторному вивченню одного ізоляту нового коронавірусу показали, що рибавірин не інгібує ріст вірусу або його поширення від клітини до клітини. Необхідне додаткове лабораторне тестування рибавірину і інших противірусних засобів, щоб пересвідчитися в ефективності лікування за їх допомогою. Інтерферони являють собою цитокіни, тобто розчинні білки, які передають сигнали між клітинами і грають важливу роль в імунній системі, сприяючи руйнуванню мікроорганізмів, що викликають інфекцію, і репарації отриманих пошкоджень. Інтерферони природним чином секретуються інфікованими клітинами. Уперше вони були ідентифіковані в 1957р. Їх назва зумовлена тим, що вони перешкоджають реплікації і розмноженню вірусів. Інтерферони виявляють як антивірусну, так і антипроліферативну активність. На основі біохімічних і імунологічних властивостей природні Інтерферони людини згруповані у 3 великих класи: інтерферон-альфа (лейкоцитарний), інтерферонбета (фібробластний) і інтерферон-гамма (імунний). У цей час альфа-інтерферон затверджений в США і інших країнах як засіб лікування волохатоклітинного лейкозу, загострених кондилом, саркоми Капоші (рак, що звичайно вражає хворих синдромом набутого імунодефіциту, СНІДу) і хронічного гепатиту типу 7 81481 ні-А, ні-В. Інтерферони (IFN) є глікопротеїнами, що виробляються організмом у відповідь на вірусну інфекцію. Вони інгібують розмноження вірусів в захисних клітинах. Відповідно до низької молекулярної маси білка IFN володіють дивною неспецифічністю своєї дії, наприклад, IFN, індукований одним вірусом, ефективно протидіє широкому колу інших вірусів. Однак вони є видоспецифічними, тобто, IFN, що продукується одним видом клітин, стимулює антивірусну активність в клітинах того ж типу або близькоспоріднених типів. IFNs являють собою першу гр упу цитокінів, які знайшли застосування завдяки їх потенційній протипухлинній і антивірусній активності. Три головних IFN позначені як IFN-a, IFN-b і IFN-g. Ці основні типи IFN спочатку класифікували відповідно до природи клітин (лейкоцитарний, фібробластний або Т-клітинний). Однак стало ясно, що декілька типів IFN можуть продукуватися однією клітиною. Тому лейкоцитарний IFN зараз називається IFN-a, фібробластний IFN - IFN-b, Тклітинний IFN -IFN-g. Існує також четвертий тип IFN - лімфобластоїдний IFN, що виробляється клітинною лінією "Namalwa" (похідної від лімфоми Беркіта), яка продукує суміш лейкоцитарного і фібробластного IFN. Раніше повідомлене про введення одиниці інтерферону або міжнародної одиниці інтерферону (Од, або МО для міжнародної одиниці) як міри активності IFN, визначеної як кількість, необхідна для захисту 50% клітин від вірусного пошкодження. Аналіз, який можна використати для вимірювання біоактивності, являє собою аналіз інгібування цитопатичного ефекту, як описаний [Rubinstein і інш., 1981; Familletti, P.С. і інш., 1981]. Згідно з цим способом оцінки антивірусної активності інтерферону близько 1од/мл інтерферону необхідно для продукування цитопатичного ефекту в 50% клітин. Одиниці визначають по відношенню до міжнародного еталонного стандарту Hu-IFN-бета, представленому Національним інститутом здоров'я [Pestka, S. 1986]. Кожний клас IFN містить декілька різних типів. Кожний з IFN-b і IFN-g є продуктом окремого гена. Білки, класифіковані як IFN-a, являють собою найбільш різнорідну групу, що містить близько 15 типів. Існує кластер генів IFN-a, локалізованих на хромосомі 9, що містить не менше 23 послідовностей, з яких 15 виявляють активність і транскрибуються. Зрілі IFN-a не глікозильовані. IFN-a і IFN-b мають однакову довжину (165 або 166 амінокислот) і схожу біологічну активність. IFN-g містять 146 амінокислот і виявляють меншу схожість з класами a і b. Тільки IFN-g можуть активувати макрофаги або індукувати дозрівання кілерних Т-клітин. Ці нові типи терапевтичних агентів іноді називають модифікаторами біологічної відповіді (BRM), оскільки вони впливають на відповідь організму на пухлину шляхом впливу на розпізнавання через імуномодуляцію. 8 Фібробластний інтерферон людини (IFN-b) виявляє антивірусну активність і може також стимулювати природні кілерні клітини проти неопластичних клітин. Він являє собою поліпептид близько 20000 Да, що індукується вірусами і двонитковими РНК. Виходячи з нуклеотидної послідовності гена фібробластного інтерферону, клонованого за допомогою технології рекомбінантної ДНК [Derynk et аі., 1980], виведена повна амінокислотна послідовність білка, довжиною 166 амінокислот. Shepard і інш., (1981) описав мутацію основи 842 (Cys->Туr в положенні 141), яка відміняє антивірусну активність, і варіантний клон з делецією нуклеотидів 1119-1121. Mark і інш., (1984) ввів штучн у мутацію шля хом заміщення основи 469 (Т) на (А), що привело до амінокислотного перемикання Cys->Ser в положенні 17. У результаті IFN-b придбав активність нативного IFN-b і стабільність в процесі тривалого зберігання (-70°С). Rebif® (рекомбінантний інтерферон-b людини) - остання розробка в інтерфероновій терапії розсіяного склерозу (MS), являє собою інтерферон (IFN)-бета 1а, що виробляється клітинними лініями ссавців. У літературі поки не повідомлялося про лікування SARS інтерферонами окремо або в комбінації з іншими антивірусними агентами. Основним предметом даного винаходу є використання інтерферону (IFN), нарізно або в комбінації з антивірусним агентом, для виробництва лікарського засобу для лікування і/або профілактики тяжкого гострого респіраторного синдрому (SARS). Антивір усна дія інтерферонів проти двох клінічних ізолятів SARS-CoV (коронавірус, асоційований з тяжким гострим респіраторним синдромом) виявлена рядом вчених Франкфуртського університету [див. J. Cintal et al., The Lancet, 362, 293-294, 2003]. У цій роботі вчені показали, що інтерферони інгібують in vitro реплікацію SARS-CoV. Зокрема, вони оцінили антивірусний потенціал рекомбінантних інтерферонів (IFN-альфа, IFN-бета і IFN-гамма) проти двох клінічних ізолятів: SARS-CoV FFM-1, виділеного від хворих з Франкфурта, і Hong Kong, який реплікується в клітинах Vero і Сасо2. Після введення в обидва ізоляти найбільший захисний і антивірусний потенціал показав інтерферон-бета. Крім того, вчені провели аналіз значущості інгібування вірусної реплікації для придушення вірус-індукованого цитопатогенного ефекту в к ультура х, оброблених інтерферономбета за 24год. до зараження вірусом і відразу після інфікування. Показано, що інтерферон-бета дозозалежним чином інгібує продукування інфекційного вірусу в культурі. Термін «лікування» в контексті цього винаходу відноситься до будь-якої сприятливої дії на розвиток хвороби, в тому числі, атенуацію, ослаблення або зменшення вияву патологічних симптомів після початку захворювання. Термін «інтерферон» або "IFN", що використовується тут, являє собою будь-яку 9 81481 молекулу, визначену, як таку, в літературі і що містить будь-які типи IFN, згадані в розділі «Рівень техніки». Зокрема, в згадане визначення входять IFN-a, IFN-b і IFN-g. Відповідно до даного винаходу IFN-b являє собою IFN. Відповідно до даного винаходу IFN-b являє собою комерційно придатний препарат, такий, як Rebif® (Serono), Avonex® (Biogen) або Betaferon® (Schering). Використання інтерферонів людини також переважне відповідно до даного винаходу. Термін «інтерферон» або "IFN", що використовується тут, означає солі, функціональні похідні, варіанти, мутеїни, злиті білки, аналоги і активні фрагменти. Термін «інтерферон-бета (IFN-b)», що використовується тут, означає, зокрема, фібробластний інтерферон людини, отриманий шляхом виділення з біологічних рідин або за допомогою технології рекомбінантної ДНК з прокаріотичних і еукаріотичних клітин-хазяїв, а також його солі, функціональні похідні, варіанти, аналоги і активні фрагменти. Термін «мутеїни», використаний тут, відноситься до аналогів IFN, в яких один або більше число амінокислотних залишків природного IFN замінені на інші амінокислотні залишки або делетовані, або додані до нативної послідовності IFN без істотної зміни активності отриманих продуктів в порівнянні з IFN дикого типу. Ці мутеїни приготовані за допомогою відомих методів синтезу і/або сайт-направленого мутагенезу, або інших відповідних методів. До представлених мутеїнів відносяться мутеїни, описані Shepard і інш., (1981) або Mark і інш., (1984). Переважно, будь-який з мутеїнів має амінокислотну послідовність, в достатній мірі дублюючу послідовність IFN і виявляючу істотну гомологію або навіть посилену IFN-активність. Біологічна функція інтерферону добре вивчена кваліфікованими фахівцями, біологічні стандарти визначені і представлені Національним інститутом біологічних стандартів і контролю [http ://immunology .org/links/NIBSC]. Описаний біологічний аналіз визначення активності IFN. Аналіз IFN можна виконувати по методу Rubinstein і інш., 1981, який дозволяє визначити за допомогою засобів рутинного експеримента, чи дійсно даний мутеїн має істотну гомологію і виявляє активність, характерну для IFN. Відповідно до даного винаходу можуть бути використані мутеїни IFN і кодуючі їх н уклеїнові кислоти, в тому числі, обмежений набір відповідних послідовностей заміщених пептидів або полінуклеотидів, отриманих за допомогою звичайних методів і звичайними фахівцями на основі представлених тут протоколів і керівництва. Відповідно до даного винаходу, представлені зміни мутеїнів відомі як «консервативні» заміни. Консервативні амінокислотні заміни поліпептидів або білків винаходу являють собою групу синонімічних амінокислот, які виявляють значущу гомологію фізико-хімічних властивостей, так що заміщення між членами групи зберігає біологічну функцію молекули. Ясно, що у вищезазначені послідовності можна вводити інсерції і делеції 10 амінокислот без зміни функції послідовностей, особливо, якщо в інсерції або делеції бере участь декілька амінокислот, наприклад, менше 30, переважно, менше 10, і не відбувається видалення або заміщення амінокислот, що має критичне значення для функціональної конформації, наприклад, залишків цистеїну. До галузі даного винаходу відносяться білки і мутеїни, отримані шляхом введення цих делецій і/або інсерцій. У таблиці І представлені переважні синонімічні амінокислотні групи. Більш переважні синонімічні амінокислотні групи представлені в таблиці II, а найбільш переважні синонімічні амінокислотні групи представлені в таблиці III. 11 81481 Приклади отримання амінокислотних замін в білках, які можуть бути використані для продукування мутеїнів IFN, що застосовуються в даному винаході, основані на використанні будьяких загальноприйнятих методичних етапів, представлених в [патентах США 4959314, 4588585 і 4737462, Mark і інш.; 5116943, Koths і інш.; 4965195, Namen і інш.; 4879111, Chong і інш.; 5017691, Lee і інш.; білки із заміною лізину представлені в патенті США No. 4904584 (Shaw і інш.). Специфічні мутеїни IFN-бета описані Mark і інш., 1984]. Термін «злитий білок» відноситься до поліпептиду, що містить IFN або мутеїн, злитий з іншим білком, який, наприклад, має збільшений резидентний час в рідинах організму. IFN може бути злитий з іншим білком або поліпептидом, наприклад, з імуноглобуліном або його фрагментом. Термін «функціональні похідні», що застосовується тут, відноситься до похідних IFN, їх мутеїнів і злитих білків, які отримують з використанням функціональних груп бічних ланцюгів залишків, а також N- або С-кінцевих гр уп за допомогою відомих методів з урахуванням їх фармацевтичної придатності. Так, функціональні похідні не повинні порушувати активність білка, що виявляє високу гомологію з активністю IFN, і виявляти токсичну дію на склади, що містять такий білок. Ці похідні можуть містити бічні ланцюги поліетиленгліколю, які можуть маскувати антигенні сайти і підвищувати резидентність IFN в рідинах організму. До інших похідних відносяться аліфатичні ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп, отримані шляхом реакції з амонієм або з первинними або вторинними амінами, N-ацил-похідні вільних аміногруп амінокислотних залишків, утворених з частинами ацилу (наприклад, групою алканоїлу або карбоциклічною ароїльною групою), або О-ацилпохідні вільних гідроксильних груп (наприклад, таких серильного або треонїльного залишків), утворених з частинами ацилу. 12 До «активних фракцій» IFN, мутеїнів або злитих білків даного винаходу відносяться будь-які фрагменти або попередники поліпептидного ланцюга молекули білка, одного або спільно з асоційованими молекулами або залишками, наприклад, залишками цукру або фосфату, або агрегатами білкової молекули, або самими цукровими залишками, які забезпечують отримання фракції, активність якої не є істотно зниженою в порівнянні з відповідним IFN. Термін «солі», що застосовується тут, відноситься як до солей карбоксильних груп, так і до кислих, що містять домішки, солей аміногруп описаних вище білків або їх аналогів. Солі карбоксильної групи можуть бути отримані за допомогою відомих методів. До них відносяться неорганічні солі, наприклад, солі натрію, кальцію, амонію, тривалентного заліза, цинку і т.п., а також солі з органічними основами, утворені, наприклад, з амінами, такими, як триетаноламін, аргінін або лізин, піперидин, прокаїн і т.п. До кислих солей, що містять домішки, відносяться, наприклад, солі мінеральних кислот, таких, як соляної і сірчаної кислот, а також солі органічних кислот, наприклад, оцтової і щавлевої кислот. Будь-яка з цих солей не повинна змінювати біологічну активність білків (IFN), що відносяться до даного винаходу, наприклад, здатність зв'язуватися з відповідним рецептором і ініціювати передачу сигналу рецептором. Відповідно до даного винаходу антивірусний засіб може використовуватися в комбінації з інтерфероном для посилення їх позитивної дії. Відповідно до даного винаходу найбільш переважним як антивірусний засіб є застосування рибавірину (l-b-D-рибофуранозил1Н-1,2,4триазол-3-карбоксамід). Відповідно до даного винаходу, особливо переважним є застосування рекомбінантного IFNбета людини і сполук за винаходом. Недавно описаний особливий тип варіанту інтерферону так звані «консенсусні інтерферони», що являють собою варіанти, які не зустрічаються в природі IFN [US 6013253]. Відповідно до прикладу здійснення винаходу, сполуки за винаходом використовують в комбінації з консенсусним інтерфероном. Як використовується тут, термін «консенсусний інтерферон людини (IFN-соn)» означає неприродний поліпептид, що містить переважно ті амінокислотні залишки, які є спільними для підвиду IFN-альфа, характерного для більшості послідовностей підтипу природного лейкоцитарного інтерферону людини, і які містять в одному або більшому числі цих положень, де відсутні амінокислоти, спільні для всіх підтипів, амінокислоту, яка переважно зустрічається в цьому положенні, і не випадково містить будь-який амінокислотної залишок, який відсутній в цьому положенні у не менш ніж одного природного підтипу. IFN-con включає в себе амінокислотні послідовності, позначені IFN-con1, IFN-con2 і IFNсоn3, і не тільки, які представлені в [патентах США 4695623, 4897471 і 5541293]. Послідовності ДНК, що кодують IFN-con, можуть бути отримані, як 13 81481 описано у вищезгаданих патентах або за допомогою інших стандартних методів. В іншому прикладі здійснення винаходу злитий білок містить злиття з Ig. Злиття може бути прямим або через короткий лінкерний пептид, довжиною 1-3 амінокислотних залишки або більше, наприклад, довжиною 13 амінокислотних залишків. Цей лінкер може бути трипептидом послідовності E-F-M (Glu-Phe-Met), або послідовністю з 13 амінокислот, що містить GluPhe-Gly-Ala-Gl y-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln, вбудовані між послідовністю IFN і послідовністю імуноглобуліну. Отриманий злитий білок володіє поліпшеними властивостями, такими, як підвищений резидентний час в рідинах організму (період напіввиведення), збільшена специфічна активність, підвищений рівень експресії і більш легке очищення злитого білка. В іншому прикладі здійснення винаходу IFN злитий з константною областю молекули Ig, переважно, з областями важкого ланцюга, наприклад, з областями, гомологічними, наприклад, доменам СН2 і СН3 IgG1 людини. Відповідно до даного винаходу для генерації злитих білків також придатні інші ізоформи молекул Ig, такі, як ізоформи IgG2, IgG3 або IgG4, або інші класи Ig, подібні, наприклад, IgM або IgA. Злиті білки можуть бути мономерними або мультимерними, гетеро- або гомомультимерними. В іншому прикладі здійснення винаходу функціональні похідні містять не менше одної частини, прикріпленої до однієї або більшого числа функціональних груп у вигляді одного або більшого числа бічних ланцюгів на амінокислотних залишках. Переважно, частина являє собою частину поліетилену (ПЕГ). ПЕГілювання проводять за допомогою загальноприйнятих методів, таких, як метод, описаний, наприклад, в публікації W099/55377. Призначення доз у вигляді однієї або декількох доз, що вводяться хворому, варіює в залежності від різних факторів, в тому числі, фармакокінетичних властивостей і способу застосування лікарського засобу, стану хворого і його характерних ознак (статі, віку, маси тіла, стану здоров'я), рівня вияву симптомів, курсів лікування, що проводяться спільно, частоти прийому лікарських засобів і вияву бажаного ефекту. Стандартні дози IFN-бета людини варіюють в межах 80000-200000МО/кг на день або 6-12 ММО (млн. міжнародних одиниць) на людину на день, або 22-44мкг (мікрограм) на людину. Відповідно до даного винаходу IFN переважно призначати в дозі приблизно 1-50 мкг, більш переважно - 10-30мкг або 10-20мкг на людину на день. Відповідно до даного винаходу шлях введення активних інгредієнтів може бути внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, або підшкірним. Переважний підшкірний шлях введення IFN. IFN також можуть призначати щодня, через день або рідше. Переважно IFN застосовують 1, 2 або 3 рази на тиждень. Переважним способом застосування є 14 підшкірне введення, наприклад, 3 рази на тиждень. Надалі переважне внутрішньом'язове введення 1 раз на тиждень. Переважно застосування 22-44мкг або 6-12 ММО IFN-бета 3 рази на тиждень шляхом підшкірної ін'єкції. IFN-бета можуть призначати підшкірно в дозі 25-30мкг або 8-9,6 ММО через день. Надалі можуть застосовувати 30мкг або 9,6 ММО IFN-бета внутрішньом'язово 1 раз на тиждень. У прикладі здійснення винаходу рибавірин призначають в комбінації з IFN-бета в дозі 1002000мг на людину на день, переважно, 400-1200мг на людину на день, більш переважно, 800-1000мг на людину на день або близько 1000-1200 мг на людину на день. Для хворих з масою тіла менше 65 кг загальноприйнятою дозою є 800 мг/кг на день, хворим з масою тіла 65-85кг звичайно призначають 1000мг/кг на день, хворим з масою тіла більше 85кг - 1200мг/кг на день. Діюча доза може варіювати в залежності від потреб хворого і тяжкості стану до лікування. Визначення необхідної схеми прийому лікарського засобу в конкретній ситуації залежить від рівня кваліфікації лікаря. Для зручності загальну щоденну дозу можна розділити на частині і вводити, за необхідності, хворому протягом дня. У прикладі здійснення винаходи рибавірин застосовують перорально. Рибавірин призначають у вигляді ін'єкції або, переважно, перорально. В залежності від способу застосування сполука може бути розчинена у відповідних розчинниках і носіях з утворенням мазей, кремів, піни і розчинів, що містять 0,0115мас.%, переважно, 1-10мас.% сполуки. Для ін'єкції рибавірин призначають в формі розчину або суспензії, які готують шляхом розчинення або суспендування в фізіологічно сумісному розчині в концентрації приблизно від 10 до 1500мг/мл. Ін'єкція може бути внутрішньовенною, внутрішньом'язовою, інтрацеребральною, підшкірною або внутрішньочеревинною. Для перорального застосування рибавірин може бути в формі капсули, таблетки, пероральної суспензії або сиропу. Таблетка або капсула може містити 10-500мг рибавірину, переважно, близько 300мг рибавірину. Капсули звичайно являють собою желатинові капсули, які можуть містити додатково до необхідної кількості рибавірину, вказаної вище, невелику кількість, наприклад, менше 5мас.% стеарату магнію або іншого наповнювача. Таблетки можуть містити вищенаведену кількість сполуки і зв'язуючу речовину, наприклад, розчин желатину, розчинену у воді крохмальну пасту, полівінілпіролідон і полівініловий спирт у воді і звичайне покриття у вигляді цукру. Сполуки винаходу і IFN можуть бути приготовані у вигляді фармацевтичного складу. Термін «фармацевтично придатний» включає в себе будь-який носій, який не впливає на ефективність вияву біологічної активності активного інгредієнта і не володіє токсичною дією відносно хазяїна, якому його вводять. Наприклад, 15 81481 для парентерального застосування активний білок (білки) може бути приготований в формі одиничної дози для ін'єкції в носії, такому, як фізіологічний розчин, розчин декстрози, сироватковий альбумін і розчин Рінгера. Відповідно до винаходу активні інгредієнти фармацевтичної композиції можуть вводитися суб'єкту різними шляхами. До способів введення відносяться внутрішньошкірний, черезшкірний (наприклад, при повільному виділенні ліків), внутрішньом'язовий, внутрішньочеревинний, внутрішньовенний, підшкірний, пероральний, епідуральний, місцевий і внутрішньоназальний. Може бути використаний будь-який інший терапевтично ефективний шлях надходження ліків, наприклад, за допомогою абсорбції через епітеліальні або ендотеліальні тканини або за допомогою генотерапії, коли молекула ДНК, що кодує активний агент, вводиться хворому (наприклад, за допомогою вектора), який стимулює експресію і секрецію in vivo активного агента. Крім того, відповідно до винаходу білок (білки) застосовують спільно з іншими компонентами біологічно активних агентів, такими, як фармацевтично прийнятні сурфактанти, наповнювачі, переносники, розчинники і носії. Відповідно до даного винаходу переважний підшкірний спосіб введення. Іншою можливістю виконання даного винаходу є активація ендогенних генів IFN. У цьому випадку для терапії SARS використовують вектор з метою індукції і/або посилення ендогенного вироблення IFN в клітині, в якій в нормі спостерігають придушення експресії IFN, або яка експресує недостатню кількість IFN. Вектор може містити регуляторні послідовності, функціональні в бажаних для експресії IFN клітинах, наприклад, промотори або енхансери. Такі регуляторні послідовності потім вводять в локус генома з 5'сторони за допомогою гомологічної рекомбінації, зв'язуючи регуляторну послідовність з геном, експресію якого необхідно індукувати або посилити. Метод, який звичайно називають «активація ендогенного гена» (EGA), описаний в [публікації WO 91/09955]. Винахід також відноситься до застосування клітини, генетично модифікованої для продукування IFN для виробництва лікарського засобу для лікування і/або профілактики SARS. Для парентерального введення (наприклад, внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язового) IFN може бути приготований у вигляді розчину, суспензії, емульсії або ліофілізованого порошку, пов'язаного з фармацевтично придатним для парентерального введення носієм (наприклад, водою, фізіологічним розчином, розчином декстрози) і домішками, що підтримують ізотонічність (наприклад, маніт) або хімічну стабільність (наприклад, консерванти і буфери). Лікарський засіб стерилізують за допомогою загальноприйнятих методів. Відповідно до винаходу, сполуки інтерферону і IFN можуть застосовуватися індивідуально профілактично або терапевтично до, одночасно або після застосування інших схем лікування або 16 агентів (наприклад, при складній схемі лікарського лікування), в терапевтично ефективній кількості. Активні агенти, які застосовують одночасно з іншими терапевтичними засобами, можна вводити в тій самій або в інших композиціях. Всі процитовані тут посилання на журнальні статті або реферати, опубліковані або неопубліковані патентні заявки США і іноземні патентні заявки, патенти, видані в США, а також іноземні патенти, або будь-які інші посилання, повністю представлені тут за допомогою посилання і включають в себе всі дані, таблиці, фігури і текст, представлені в цитованих посиланнях. Крім того, вміст документів, згаданих в розділі «посилання», включений в даний опис за допомогою посилання. Для представлення, розробки або пропозицій на відповідному рівні кваліфікації будь-якого аспекту, опису або прикладу здійснення даного винаходу посилання на загальноприйняті методичні етапи, стандартні методичні етапи, загальноприйняті методи або стандартні методи не є необхідним. Попередній опис специфічних прикладів здійснення винаходу повністю розкриває основну суть винаходу і дозволяє за наявності необхідних знань і кваліфікації (з урахуванням вмісту цитованих тут посилань) легко його модифікувати і/або адаптува ти для різного застосування, а також виключити помилкові експерименти і відхилення від загальної концепції даного винаходу. Тому такі варіанти і модифікації, які еквівалентні по значенню розглянутим прикладам здійснення винаходу, основані на запропонованих тут методах і протоколі. Потрібно розуміти, що запропонована тут термінологія і фразеологія використовується не тільки для даного опису і повинна бути доступна кваліфікованому фахівцеві, що опанував представлені тут методи і протоколи і володіє стандартними професійними навичками. Приклади Клінічні випробування Клінічні випробування проводили з використанням 2 різних доз IFN-бета. Ме тою випробування було визначення клінічного виходу хворих, інфікованих SARS CoV. Клінічний вихід визначали шляхом кількісного вимірювання вірусних титрів SARS-CoV в носоглотковому матеріалі, отриманому шляхом аспірації, і РВМС хворих, а також за допомогою вивчення імунологічних параметрів, які вказують на вихід захворювання. Моделювання клінічного дослідження Перше клінічне дослідження розроблено для дітей. Причиною проведення дослідження дітей є менш тяжка течія захворювання у хворих дітей, серед яких досі не зареєстровано летального виходу, що мінімізує ризик лікування хворих, які через тяжкість захворювання не здатні перенести первинні дози ліків. Крім того, досвід, придбаний при проведенні педіатричного дослідження, може бути успішно застосований для дорослих хворих. Рандомізоване клінічне дослідження в умовах, що контролюються, проведено в групі хворих молодших за 18 років. Хворі відібрані на основі їх 17 81481 клінічного стану і даних рентгенографії легенів по критеріях, встановлених ВООЗ. Хворих розділили на 3 групи по 10 чоловік в кожній групі. Першій, контрольній групі не вводили IFN-бета. Другій, групі вводили IFN-бета в низькій дозі (1млн. од/м 2/д). Третій гр упі вводили IFN-бета в середній дозі (3млн. од/м 2/д). Хворим проводили лікування протягом 1-4 тижнів в залежності від течії хвороби, вірусного навантаження і імунної відповіді. Визначення клінічного виходу інфікованих CoV-SARS хворих Для аналізу течії хвороби збирали наступні дані, що характеризують стан хворого: лихоманка*, озноб або тремтіння, кашель*, задишка або дихальна недостатність*, міалгія, Нездужання, млявість або дратівливість, пригнічений настрій, ринорея, фарингіт, анорексія, діарея або блювання, запаморочення або неврологічні скарги і висипання, де * - симптоми, характерні для хворих SARS. Визначення клінічного виходу основане на даних курсу лікування в стаціонарі, респіраторному статусі хворих (задишка або ціаноз), аналізі газів артеріальної крові, необхідності допоміжної штучної вентиляції легенів і зміни в рентгенограмах легенів. Визначення вірусних титрів SARS-CoV в носоглоткових аспіратах і випорожненнях хворих Серію носоглоткових аспіратів і зразків випорожнень хворих збирали у інфікованих хворих в 3-тижневий період: до лікування і на 3, 6, 9, 12, 15 і 21 день лікування. Для виявлення SARS-CoV зразки культивували в клітинах лінії FRhK-4. Вивчення інфікованих клітин проводили за допомогою непрямого імунофлуоресцентного аналізу. Для виявлення цитопатичного ефекту і визначення вірусного титру/мл середовища клітини досліджували за допомогою світлового мікроскопа. Крім того, із зразків виділяли спільну РНК і проводили зворотну транскрипцію з подальшим виконанням кількісної полімеразної ланцюгової реакції для ідентифікації SARS-CoV за допомогою специфічних олігонуклеотидних праймерів. Для аналізу SARS-CoV антитіл виділяли зразки сироватки. Імунологічні показники, що свідчать про наслідок лікування Вимірювали рівень експресії стимульованих IFN генів, який вказує на вплив in vivo екзогенного IFN. До IFN-стимульованих генів відносяться гени 2-5 синтетази, PKR і Мх. Вони є надійними маркерами активності IFN в клітинах. Крім того, проводили відбір типових хворих, реагуючи х на лікування (на прикладі поліпшення результатів лікування і зниження вірусного навантаження після лікування) і не реагуючі на лікування хворі (поганий клінічний вихід і відсутність змін в рівні вірусного навантаження або незначні зміни після лікування IFN-бета). Профіль експресії генів в моноядерних клітинах периферичної крові хворих досліджували за допомогою систем мікрочипів (наприклад, Affimetrix) і аналізу протеомікса. Отримані дані використали для ідентифікації маркерів 18 терапевтичноївідповіді. Посилання 1. Study Group. The Lancet 1998; 352, 14981504. 2. J. Cintal et al, The Lancet, 362, -293-294, 2003 3. Clegg and Bryant, Exp. Opin. Parmacother 2001; 2(4): 623-639. 4. Derynk R. et al., Nature 1980; 285, 542-547. 5. Familletti, P. C, Rubinstein, S., and Pestka, S. 1981 "A Convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibition Assay for Interferon," in Methods in Enzymology, Vol.78 (S. Pestka, ed.), Academic Press, New York, 387-394; 6. Hultgren C, Milich DR, Weiland О, Sallberg Μ. (1998). The antiviral compound ribavirin modulates the Τ helper (Th) 1/Th2 subset balance in hepatitis В and С virus-specific immune responses. J Gen Virol 1998; 79: 2381-2391. 7. McCormick JB, King IJ, Webb PA, Scribner CL, Craven RB, Johnson KM, Elliott LH, BelmontWilliams R. Lassa fever. Effecti ve therapy with ribavirin. N Engl J Med. 1986Jan2;314(1):20-6. 8. MarkD.F. etal., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81 (18) 5662-5666 (1984). 9. Pestka, S. (1986) "Interferon Standards and General Abbreviations, in Methods in Enzymology (S. Pestka, ed.), Academic Press, New York 119, 14-23. 10. Rubinstein, S., Familletti, P.C., and Pestka, S. Convenient Assay for Interferons. J.Virol 1981; 37, 755-758. 11. Shepard H.M. et al., Nature 1981; 294, 563565. 12. Tarn RC, Pai B, Bard J, Lim С, Averett DR, Phan UT, Milovanovic T. Ribavirin polarizes human Τ cell responses towards a Type 1 cytokine profile. J Hepatol. 1999; 30(3):376-82. 13. Togo Y, McCracken EA., 1976. Double-blind clinical assessment of ribavirin (virazole) in the prevention of induced infection with type В influenza virus. J Infect Dis 1976 Jun; 133 Suppl: A109-13.