Полівалентна вакцина проти грипу на основі гібридного білка

Реферат: Винахід належить до вакцини на основі злитого білка, що складається з антигенних детермінант гемаглютинінів вірусів грипу А і В і фрагментів флагеліну, що діють як безпечний ад'ювант (SEQ ID NO: 1), з'єднаних гнучкими містками, яка може бути використана для профілактики грипу, що викликається відомими штамами вірусів грипу А і В, а також можливими реасортантами. UA 115895 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до молекулярної біології, біотехнології, препаративної біохімії, медицини та може бути використаний в якості засобу для профілактики грипу, який викликається існуючими штамами грипу, а також можливими реасортантами. Термін "гібридний білок" у даному тексті означає білок, що отримали в результаті експресії рекомбінантної молекули ДНК, в якій з'єднані один з одним в одній рамці зчитування кодуючі ділянки декількох різних генів. Щорічно вірус грипу вражає від 5 до 15 відсотків населення, викликаючи гостре захворювання дихальних шляхів. Щорічно розробляються і широко застосовуються вакцини проти сезонного грипу. Однак існує небезпека пандемічного поширення окремих штамів вірусу грипу, комбінація генів яких раніше не зустрічалася. Такі віруси можуть бути більш агресивними і можуть характеризуватися високою часткою ускладнень і смертельних випадків. У 2009 році у світі склалася несприятлива ситуація, пов'язана з поширенням високопатогенного вірусу грипу А(H1N1)pdm/09. Захворювання були викликані вірусом грипу з новими антигенними детермінантами. Особливе занепокоєння у фахівців викликав той факт, що новий вірус був реасортантом вірусів, що циркулюють серед тварин (свиней) і серед людей. За даними ВООЗ, у порівнянні з коефіцієнтом інфікування сезонним грипом серед осіб, що мали контакти з хворими людьми (від 5 % до 15 %), аналогічний коефіцієнт відносно А(H1N1) pdm/09 оцінювався в межах від 22 % до 33 %. Поверхневий білок вірусу грипу гемаглютинін (HA) представляє особливу цікавість для розробки вакцин. HA відповідає за зв'язування вірусу з рецепторами клітини і таким чином визначає чутливість організму до захворювання. Мутації в HA зазвичай ведуть до появи вірусів з високими епідемічними, іноді пандемічними потенціями. В-клітинна і Т-клітинна імунна відповідь розвивається на антигенні детермінанти білків вірусу - епітопи. Підхід до імунізації проти вірусних інфекцій, а конкретно вірусу грипу, з використанням амінокислотних послідовностей, що складаються з сукупності епітопів вірусу, перспективний для розвитку полівалентної імунної відповіді на вірус, і дозволяє створити універсальну вакцину для запобігання як сезонних спалахів, так і пандемії. Використання антигенних детермінант різних субтипів вірусу грипу в одній конструкції полегшує отримання полівалентної вакцини і дозволяє створювати ефективні вакцини проти нових штамів вірусів. Рівень техніки Створення універсальної вакцини, здатної забезпечити захист від існуючих і можливих реасортантних штамів вірусу грипу, є необхідністю. Використання вакцин на основі рекомбінантних білків дозволяє уникнути ризиків, пов'язаних з введенням вірусу в організм, нехай і інактивованого. В даний час робляться спроби створення такої універсальної безпечної вакцини. Відомий винахід, за яким ген, який кодує мультиепітопний гемаглютинін вірусу грипу птахів, у складі векторної конструкції використовується для продукування в рослинах рекомбінантної мультиепітопної вакцини (RU 2008139004 A, 01.10.2008). У патенті US 2009106864 (2009) і RU 2008139004 автори використовували консенсусну послідовність гемаглютиніну пташиного грипу субтипу А, оптимізовану по кодонам для експресії в рослинах. У патенті JP2009102416 (2009) для експресії гемаглютиніну вірусів грипу А і B автори використовували бакуловірусні конструкції у клітинах комах. Недоліками подібних підходів є використання послідовності білка (гемаглютиніну) тільки одного субтипу вірусу грипу (H5N1), що обмежує спектр активностей вакцини. Також експресія в рослинах і в клітинах комах забезпечує низький вихід білка в порівнянні з експресією в E. coli. Відомі гібридні поліпептиди, що включають послідовність, яка має великий відсоток відповідності поверхневому протеїну НA вірусу грипу А з п'ятьма імунодомінантними антигенними ділянками (RU 92004487, 10.12.1992). Одне із запропонованих застосувань таких поліпептидів - для виробництва вакцин проти відповідних антигенів, для лікування і профілактики (включаючи імунотерапевтичні методи) у разі зараження такими антигенами. Однак не вказано, гемаглютинін якого/яких субтипів використовується. При розробці універсальної вакцини слід враховувати антигенні детермінанти гемаглютиніну і також вірусу грипу В, тому імуногенність вакцини обмежена тими штамами, послідовності яких використані. Відома полівалентна вакцина від грипу, яка містить полівалентний протигрипозний антиген, ад'ювант, агент, що забезпечує проникнення вакцини і прийнятний ексципієнт (CN101450209, 31.12.2008). В якості антигенної компоненти заявлені будь-які з H1-H16 і N1-N9. Також відома полівалентна вакцина проти грипу, антигенною компонентою якої є поверхневі білки вірусів А/H1N1, А/H3N2, гемаглютинін B-типу (CN101524538, 26.03.2009), ад'ювант - гліцерин або гідроксид алюмінію. Використання і прийнятного ад'юванта, і антигенних детермінант в гібридній конструкції і тільки одного типу білка - гемаглютиніну - дозволить спростити і здешевити процес 1 UA 115895 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виробництва вакцини, оскільки відпадає необхідність додаткового підбору умов та контролю якості виробництва компонента. Відома полівалентна вакцина на основі вбитих вірусів, діючою речовиною якої є антигени А/H1N1, H3N2, B, H5N1 і A(H1N1)pdm/09 (CN101732711, 31.12.2009). Зазначені антигени отримують виділенням із вбитих вірусів, що говорить про можливі проблеми при масштабному виробництві вакцини, пов'язані з використанням вірусів як таких, особливо вірусів грипу (наприклад, необхідним є створення умов роботи з високо патогенними штамами вірусу, що легко передаються). Крім того, зазначені антигени є окремими білками, переваги використання гібридної конструкції наведені вище. Прототипом винаходу є суміш флагел, що містять, як мінімум, 4 епітопи білків вірусу грипу, що взаємодіють з людськими клітинами, причому кожен експресований індивідуально у флагеліні Salmonella (WO0032228, 30.11.1998). Зазначені епітопи - із групи, що складається з: (i) одного епітопу гемаглютиніну, що взаємодіє з B-клітинами, (ii) одного епітопу гемаглютиніну (HA) або нуклеопротеїну (NP), які можуть зв'язуватися з молекулами MHC для представлення рецепторам на Т-хелперах і (iii) хоча б двох епітопів нуклеопротеїну (NP) або матриксного білка (M), які рестриктуюються MHC антигенами, що превалюють у представників білої європеоїдної раси і зв'язуються з цитотоксичними лімфоцитами (CTL). Флагелін (FliC) Salmonella typhimurium, взаємодіючи з Toll-подібним рецептором-5 (TLR-5), стимулює дозрівання макрофагів і дендритних клітин - антиген-презентуючих клітин, що призводить до виникнення імунної відповіді (Mc Dermott P.F…High-affinity interaction between Gram-negative flagellin and a cell surface polypeptide results in human monocyte activation. Infect. Immun. - 2000. – V. 68. – p.:5525–5529; Means T.K. et al. The Toll-like receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cells. J.Immunol. - 2003. – V.170. – p.:5165–5175). На даний момент флагелін є одним з найбільш перспективних і добре вивчених ад'ювантів нового покоління. Результати досліджень показують, що рекомбінантні білки, які вводяться з флагеліном, мають підвищені імуногенні і антигенні характеристики. Відповіді на них реєструються в більш короткі терміни і викликають більш сильну клітинну і гуморальну імунну відповідь (Balaram, 2008). Недолік даної розробки в багатокомпонентності імунізуючої суміші. Використання злитого білка, що містить В-, Т-клітинні епітопи різних субтипів вірусів грипу А і В і флагеліну, дозволить забезпечити сильну імунну відповідь при менших витратах на виробництво. Крім того, доцільним є використання також лише компонентів флагеліну. У флагеліні виявлено дві рецептор-активуючі ділянки в термінальних областях (а.о. 79-117 і а.о. 408-439) (Tonyia, 2001). TLR-5 експресований на клітинах вродженого імунітету, на епітеліальних та ендотеліальних клітинах (Sebastiani G. et al. Cloning and characterization of the murine Toll-like receptor 5 (Tlr5) gene: sequence and mRNA expression studies in Salmonella-susceptibleMOLF / Eimice. Genomics. 2000. - V. 64. - p.230-240; Zarember KA and Godowski PJ Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines. J.Immunol. - 2002. - V.168. - p.554-561; Delneste, 2007). Зважаючи на це, доцільним є використання для імунізації поверхні слизової, що значно полегшує доставку імуногена. Розкриття винаходу Запропонована вакцина на основі високоочищеного гібридного білка (SEQ ID NO: 1), що включає фрагменти білків H1 (281-461 а.о.), H3 (466-505 а.о.), H5 (510-549 а.о.) вірусу грипу А, а також фрагмент гемаглютиніну вірусу грипу B (554-593 а.о.), а також компоненти флагеліну FliC1 (1-169 а.о.) і FliC2 (182-276 а.о.) в якості ад'юванта, компоненти з'єднані гнучкими містками. Представлені фрагменти білків представляють собою консервативні частини гемаглютининів H1, H3, H5 і В, до яких у процесі природної інфекції утворюються специфічні антитіла, які перехресно реагують з гомологічними епітопами серед різних штамів вірусів грипу А і В. Використання епітопів декількох білків дозволяє збільшити ефективність вакцини, а використання гнучких містків між епітопами дозволяє зберегти правильне просторове укладання білка і, відповідно, забезпечує повноцінне функціонування кожного епітопу. На підставі обраної амінокислотної послідовності були розраховані нуклеотидні послідовності відповідних генів з урахуванням частоти зустрічаємості кодонів в білок-кодуючих генах E. coli, при цьому кодони вибиралися з урахуванням зменшення dG відповідних мРНК. Технічний результат від використання винаходу головним чином полягає у збільшенні валентності вакцини проти грипу: після щеплення вакциною, заявленою у винаході, у людини виробляється імунітет до різних субтипів вірусів грипу і А, і В, існуючих, а також тих, які можуть з'явитися в результаті реасортації будь-яких штамів вірусів грипу. Після вакцинації в організмі 2 UA 115895 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виробляються антитіла на епітопи гемаглютиніну від різних штамів вірусу грипу. Таким чином формується здатність виробляти антитіла у відповідь на потрапляння в організм вірусу грипу. Надалі при потраплянні в організм будь-якого вірусу грипу, імунна відповідь буде швидко вироблятися, що виразиться в тому, що вдасться уникнути зараження, або захворювання пройде в легкій формі. Такий підхід до вакцинації дозволить елімінувати дане захворювання. Технічний результат від кодонної оптимізації нуклеотидної послідовності виражається у збільшенні виходу білка в процесі виробництва. Крім того, використання в якості ад'юванта компонентів флагеліну - нетоксичного агента дозволить посилити імунну відповідь, що виробляється на вакцину. Технічний результат виражається у здешевленні і скороченні термінів виробництва вакцини за рахунок виробництва лише одного компонента - гібридного білка – на заміну виробництва безлічі окремих компонентів вакцинної суміші (прототип). Для отримання відповідно до цього винаходу гібридного білка можуть бути використані стандартні методи молекулярної біології та мікробіології, відомі фахівцям у даній галузі техніки. Такі методи широко представлені в науковій літературі. Опис креслень Фіг. 1. Динаміка виживаності мишей після інфікування 1 LD/50 вірусу A/PR/8/34 (H1N1). На осі абсцис відмічені дні після інфікування, на осі ординат - відсоток тих мишей, що вижили. Фіг. 2. Динаміка виживаності мишей після інфікування 1 LD/50 вірусу A/California/07/09 (H1N1). На осі абсцис відмічені дні після інфікування, на осі ординат - відсоток тих мишей, що вижили. Фіг. 3. Сироваткові IgG до вірусу грипу В/Florida/04/06. По осі абсцис - розведення сироваток (зворотні величини). По осі ординат - оптична густина при довжині хвилі 450 Нм. Вірус сорбували в концентрації 2 мкг/мл. Фіг. 4. Сироваткові IgG до гібридного білку. По осі абсцис - розведення сироваток (зворотні величини). По осі ординат - оптична густина при довжині хвилі 450Нм. Рекомбінантний білок сорбували в концентрації 3 мкг/мл. Здійснення даного винаходу Приклад 1. Моделювання гібридного білка Спланований гібридний поліпептид є складним мультидоменним білком (6 доменів: FliC1, FliC2, H1, H3, H5, B). Для моделювання мультидоменних білків були зроблені наступні дії: 1. Визначення меж доменів 2. Побудова моделі цілого білка для визначення орієнтації доменів 3. Побудова моделей для кожного домену (з використанням зразків 3D структур і ab initio) 4. Докінг моделей з використанням моделі цілого білка. У спланованому гібридному поліпептиді два домени мали зразки, а чотири потребували ab initio моделювання, крім цього, в ab initio моделюванні було потрібно сформувати гнучкі містки між доменами. Для отримання більш наближених до реальності результатів в автоматичному режимі використовували алгоритм I-Tasser, визнаний кращим на останніх трьох CASP (Critical Assessment of protein Structure Prediction) - змаганнях з моделювання білків. Даний аналіз проводився протягом п'яти днів. Однак навіть з використанням даного потужного алгоритму отримання адекватних даних для мультидоменного білка з необхідністю ab initio моделювання доменів і їх меж не повністю достовірне (70 %). Для отримання більш точних даних розбили білок на домени, що використовуються, провели їх моделювання з використанням I-Tasser і далі провели їх докінг. Змодельований гібридний білок складається з 593 а.о., представлена його амінокислотна послідовність - SEQ ID NO: 1. Аналіз амінокислотної послідовності даного білка за допомогою програми ProtParam (http://au.expasy.org/tools/protparam.html) показав, що гібридний білок стабільний і має молекулярну масу 63,6 кДа, pI 6,2. Приклад 2. Створення нуклеотидної послідовності, що кодує гібридний білок. Перевели амінокислотну послідовність гібридного білка, що включає фрагменти FliC1, FliC2, H1, H3, H5, B, в нуклеотидну (1785 п.н.), оптимізувавши останню для експресії в клітинах E. coli (SEQ ID NO: 2). Синтез даної нуклеотидної послідовності здійснювали шляхом видовження олігонуклеотидів, що взаємно перекриваються, згідно описаним методам (Majumder, 1992). Олігонуклеотиди представляли собою фрагменти гібридного гена довжиною близько 70 нуклеотидів з ділянками, що взаємно перекриваються, довжиною близько 20 нуклеотидів. Основні вимоги до праймерів полягали в тому, що їх довжина не повинна була перевищувати 60 нуклеотидів, а ділянки гібридизації повинні були бути не менше 20 нуклеотидів. Крім того, на 3 UA 115895 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кінцях олігонуклеотидів не повинно було бути довгих ділянок G або С, що повторюються. У ряді випадків підбір оптимальних праймерів здійснювали емпірично шляхом зсуву праймера по відношенню до матриці або зміни довжини праймера на 3-6 нуклеотидів. В цілому, для синтезу гібридного гена довжиною 1785 п.н. було використано 65 праймерів. Синтезовані фрагменти по 300 п.н. виділяли за допомогою гель-електрофорезу і клонували в плазмідному векторі pGEM-T Easy. Клонування здійснювали з використанням рестрикційних сайтів Kpnl, SacII, EcoRV, BamHI або за допомогою "тупих" кінців. Після секвенування фрагменти ампліфікували, після чого з'єднували в нуклеотидну послідовність гібридного білка шляхом їх сплавлення методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Після заключного етапу синтезу гібридного гена шляхом лігування фрагментів штучний ген клонували у вектор pGEM-T за рестрикційними сайтами КрnI і SacI. Отриманий ген був фланкований додатковими рестрикційними сайтами EcoRI на 5'-кінці і XhoI на 3'-кінці. Далі штучний ген переклонували в експресійний вектор pET24a за рестрикційними сайтами EcoRI і XhoI. Приклад 3. Створення плазмідної ДНК, що кодує гібридний білок За методикою, описаною в прикладі 2, отримували нуклеотидну послідовність гібридного білка для створення вакцини від грипу. Отриманий ген клонували в плазміді pET24a для подальшої експресії. Для цього проводили реакцію лігування гена і вектора pET24a, з використанням відповідного буфера і лігази, при + 20С протягом 2 годин. Суміш прогрівали при +95С протягом 10 хв. і очищали від солей діалізом на нітроцелюлозних фільтрах з діаметром пор 0,025 мкм (Millipore, США). Діаліз проводили проти розчину, що містить 0,5 мМ ЕДТА в 10 % гліцерині, протягом 10 хв. Приклад 4. Створення штаму E.coli для ампліфікації плазмідної ДНК, що містить гібридний ген За методикою, описаною в прикладі 3, отримували нуклеотидну послідовність білка для створення вакцини від грипу та клонували її в плазміді pET24a. Отриманою плазмідою трансформували клітини E. coli штаму DH10B/R (Gibko BRL, США) з генотипом F-mcrA Δ (mrrhsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM 15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139 Δ (ara, leu) 769 galU galKλrpsL nupG методом електропорації. Після трансформації клітини інкубували в SОС-cередовищі (2 % бакто-триптон, 0.5 % дріжджовий екстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза) протягом 40 хв при + 37С. За допомогою скринінгу клітин E.coli на наявність плазмід на селективному середовищі, що містить LB-агар, 100 мкг/мл канаміцину, відібрали колонії клітин E. coli - штам E. coli для ампліфікації плазмідної ДНК, що містить гібридний ген. З клонів, що виросли, виділяли плазмідну ДНК з використанням набору Wizard Minipreps DNA Purification System (Promega, США). Очищену плазмідну ДНК перевіряли за допомогою рестрикційного аналізу і секвенування. В ході роботи були відібрані клони, що містять фрагменти ДНК необхідного розміру в складі плазміди, з яких такі плазміди були виділені для подальшої індукції експресії гена. Приклад 5. Створення штаму E. coli - продуцента гібридного білка За методикою, описаною в прикладі 4, отримували нуклеотидну послідовність білка для створення вакцини від грипу та клонували її в плазміді pET24a, ампліфікували отриману плазміду в клітинах E. coli штаму DH10B/R з подальшим її виділенням. Для експресії білка використовували клітини E.coli штаму BL21 Star (DE3) (Invitrogen, USA), з генотипом F-ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3), що містять в геномі λDe3 лізоген і мутацію rne131. Мутований ген rne (rne131) кодує усічену форму РНКази Е, що зменшує внутрішньоклітинне руйнування мРНК, приводячи до збільшення її ферментативної стабільності. lon- і оmpТ-мутації по генам протеаз дозволяють отримувати непротеолізовані рекомбінантні білки у великих кількостях. Готували клітини Е. coli штаму BL 21 з генотипом F-ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 (DE3) наступним чином. Інкубували клітини при +37 °C протягом ночі в 5 мл L-бульйону, що містить 1 % триптон, 1 % дріжджовий екстракт і 1 % натрій хлористий. Розводили культуру свіжим L-бульйоном в 50-100 разів і вирощували на качалці при + 37 °C до оптичної густини 0,20,3 при довжині хвилі 590 нм. При досягненні оптичної густини більше 0,3 культуру розводили свіжим L-бульйоном до оптичної густини 0,1 і ростили 30 хв. Переносили 100 мл культури в стерильну центрифужну пробірку і осаджували клітини при + 4 °C на 5000g протягом 10 хв. Супернатант зливали, клітини ресуспендували в деіонізованій воді у вихідному об'ємі з наступним центрифугуванням. Процедуру відмивання повторювали тричі. Після відмивання осад клітин ресуспендували в малому об'ємі деіонізованої води і центрифугували 30 сек. при 4 UA 115895 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5000 об/хв. на мікроцентрифузі. Трансформацію компетентних клітин здійснювали методом електропорації. Для цього 1 мкл плазмідної ДНК додавали до 12 мкл компетентних клітин, перемішували і проводили електропорацію на генераторі високовольтних імпульсів ГВІ-1 (СПбГТУ, Санкт-Петербург) в стерильних комірках при електричному імпульсі напруженістю 10 кВ/см тривалістю 4 мсек. Після трансформації клітини інкубували в SОС-cередовищі (2 % бакто-триптон, 0,5 % дріжджовий екстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза) протягом 40 хв. при + 37 °C. 10-100 мкл клітинної суспензії висівали на селективне LBсередовище (Gibko BRL, США), що містить канаміцин (100 мкг/мл), для відбору клонів, що містять плазміди (штамів-продуцентів). Плазміда, отримана після трансформації компетентних клітин штамів Е. coli, забезпечувала високий рівень біосинтезу рекомбінантного білка, закодованого в ній. Приклад 6. Отримання гібридного білка для створення вакцини від грипу в клітинах E. coli індукцією синтезу білка 0,2 % лактозою за методом Штудіера За методикою, описаною в прикладі 5, отримували нуклеотидну послідовність гібридного білка для створення вакцини від грипу та клонували її в плазміді pET24a, ампліфікували отриману плазміду в клітинах E. coli штаму DH10B/R з подальшим її виділенням, трансформували нею клітини E. coli штаму BL21 для подальшої індукції експресії цільового гена. Для культивування отриманих штамів-продуцентів використовували стандартне агаризоване LB-середовище, що містить канаміцин в концентрації 100 мкг/мл і глюкозу в концентрації 1 % для блокування неспецифічної експресії. Індукцію експресії проводили при досягненні культурою клітин оптичної густини 0,6-0,8 оптичних одиниць при довжині хвилі 600 нм. В якості індуктора використовували 0,2 % лактозу (Studier, 2005). Для автоіндукції експресії за методом Штудіера (Studier, 2005) використовували середовище PYP-5052, що складається з 1 % пептону (Gibco, США), 0,5 % дріжджового екстракту (Gibco, США), 50 мМ Na2HPO4, 50 мМ K2HPO4, 25 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgSO4, 0,5 % гліцеролу, 0,05 % глюкози і 0,2 % лактози. У середовище PYP-5052, що містить канаміцин в концентрації 100 мкг/мл, інокулювали одиничну колонію штаму-продуцента. Ферментацію проводили при +37 °C в термостатованому шейкері роторного типу при 250 об. хв. протягом 20 годин до відсутності істотної зміни ОГ 600 за 1 годину. Відбирали аліквоту клітин на аналіз експресії гена, що кодує вакцинний білок, методом електрофорезу в ПААГ, а решту біомаси осаджували центрифугуванням при 9000 g. Білок виділяли з клітин E. coli за допомогою лізису клітин. Клітини ресуспендували в лізувальному буфері, що містить 20 мМ тріс-НСl рН 7,5, 5 мМ ЕДТА і 1 мМ феноксиметилсульфонілфторид, з розрахунку на 1 г клітин 5-7 мл буферу. Суспензію клітин обробляли ультразвуком 7 разів по 30 сек з інтервалом в 30 сек (частота ультразвуку становить 22 кГц). Лізат центрифугували 10 хв при +4 °C, 5000 g. Надосадову рідину зливали, до осаду додавали розчин 1 М сечовини з розрахунку 10 мл на 1 г клітин, інтенсивно перемішували. Повторювали центрифугування. Супернатант зливали, осад ресуспендували в розчині 2М сечовини того ж об'єму. Повторювали центрифугування. Супернатант зливали. Отриманий препарат містив за даними SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis with Sodium dodecyl sulfate) близько 98 % гібридного білка в концентрації 1 мг/мл. Умови виділення і очищення підбиралися експериментальним шляхом і можуть варіювати у відомих середньому фахівцю в цій галузі значеннях. Приклад 7. Отримання очищеного препарату гібридного білка До розчину гібридного білка додавали MgCl 2 до концентрації 6 мМ і проводили очистку гібридного білка з використанням методу імобілізованої металоафінної хроматографії (ІМАХ) з використанням сорбенту Ni-НТУ сефарози. Зв'язування з даним сорбентом відбувається за рахунок 6 залишків гістидину, наявних на N-кінці отриманого рекомбінантного білка. Білковий розчин фільтрували через ПВДФ фільтр з діаметром пор 0,22 мкн, до отриманого фільтрату додавали сорбент Ni-НТУ сефарозу, врівноважену буфером для рефолдингу, з розрахунку, що 1 мл сорбенту зв'язує не більше 40 мг білка, і проводили зв'язування при постійному перемішуванні протягом 2 годин. Сорбент осаджували центрифугуванням і в мінімальному об'ємі наносили на гравітаційну хроматографічну колонку, що містить 2 мл сорбенту. Елюцію проводили ступінчастим градієнтом імідазолу від 20 до 300 з кроком в 50 % від попереднього, при цьому на кожний крок припадав об'єм розчину, яким елюють, рівний 5-20 об'ємам колонки. Вихід і чистоту білка контролювали методом диск-електрофорезу і вимірюванням концентрації білка за методом Бредфорд. 5 UA 115895 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для визначення вмісту ендотоксинів готували стандартний стоковий розчин ендотоксину з концентрацією 4000 EU на мл, отриманий розчин був стабільний при зберіганні при +4 °C протягом, принаймні, 2-х тижнів. Серію розведень стокового розчину ендотоксину з кроком в 2 рази готували з використанням вільної від ендотоксинів води в стерильних полістиренових пробірках, що заклеювались вільним від ендотоксину парафільмом. Готували серію розведень зразка субстанції з кроком концентрації 5, а після попереднього визначення вмісту ендотоксину - з кроком концентрації 2. На дно кожного Еппендорфа додавали зразок, воду або ендотоксин в 100 мкл, після чого додавали 100 мкл лізату ЛАЛ-реактиву і інкубували протягом 1 години при 37 °C на водяній бані. Результати оцінювали за наявністю або відсутністю щільного тромба на дні пробірки шляхом перевертання пробірки. Було показано, що в досліджуваному зразку відсутні чинники, які інгібують утворення тромбу. Гель-тромб утворився при 1/8 розведенні зразка, тобто при чутливості методу 0,03 EU/мл, у зразку з концентрацією 50 мкг/мл міститься менше 100EU. Конформацію рекомбінантного гібридного білка при його синтезі в клітинах E. coli визначали методом диск-електрофорезу в ПААГ клітин E. coli, зруйнованих з використанням ультразвуку після проведення індукції експресії, при цьому аналізували осад і супернатант, що утворилися після осадження клітинних уламків. В результаті денситометричного аналізу було показано, що рекомбінантний білок, синтезований в клітинах E. coli штамів-продуцентів при індукції експресії 0,2 % лактозою, на 100 % знаходиться в супернатанті, тобто розчинній фракції. 0 0 0 Культивування бактерій при різних температурах: 20 С, 30 С і 37 С, не викликало зміни розчинності білка. Після проведення диск-електрофорезу в ПААГ лізатів клітин E. coli після автоіндукції експресії 0,2 % лактозою здійснювали аналіз рівня експресії цільового білка в клітинах E. coli методом денситометрування. В результаті денситометричного аналізу було показано, що в клітинах E. coli гібридний білок накопичується в кількості 43 % від загального клітинного білка. Отриманий рівень експресії змінювався в штамі-продуценті протягом 6 пасажів, що свідчить про стабільний характер експресії гена, що аналізується. Приклад 8. Отримання рекомбінантного гібридного білка з використанням культивування клітин E. coli c безперервним додаванням поживних субстратів, переважно глюкози і дріжджового екстракту При культивуванні штаму Escherichia coli для отримання гібридного білка використовували метод періодичних культур з підживленням. Даний метод застосовується для запобігання негативних наслідків ліміту субстрату, при цьому субстрат або інші необхідні компоненти додаються або безперервно, або по сигналу від якого-небудь датчика. Для оптимізації виходу продуктів, що виділяються в середовище, важливо посилити біосинтетичну здатність клітин бактерій, а метод культивування з підживленням дозволяє продовжити другу фазу росту і підвищити вихід позаклітинних метаболітів. Даний метод можна використовувати у разі потенційно токсичного субстрату (рекомбінантні білки токсичні для клітин E. coli), так як при цьому його концентрація в середовищі буде підтримуватися на низькому рівні. Обмеження швидкості поглинання субстрату швидкістю його доставки виявляється способом подолання "катаболітної репресії" утворення продукту. Культура з підживленням виявилася найбільш ефективним шляхом для досягнення високої щільності клітин і високої продуктивності. Штам E. coli стерильно пересівали на скошені косяки ЕДТА-вмісного агару і витримували в термостаті 5 діб. Для отримання інокуляту здійснювали змив культури з косяків, засівали в рідке середовищу з ЕДТА і культивували 3-4 доби. Після цього інокулят в кількості 10 мл переносили в стерильні 750-мл колби з 200 мл стерильного рідкого середовища і культивували протягом 10 діб на качалці при 150-200 об/хв при температурі 28 °C - 30 °C. Тверде поживне середовище використовувалось для отримання свіжої культури штаму. Рідке поживне середовище застосовували для отримання посівного матеріалу і для періодичного культивування. Приготування рідкого поживного середовища 1) MgSO4*7 H2О 10 мл/л 2) CaCl2*2 H2O 20 мл/л 3) KH2PO4+NaH2PO4*12 H2O 10 мл/л 4) ЕДТА 10 мл/л 5) Мікроелементи 1 мл/л (доводили до рН = 4,2) + 5,6 г/л ЕДТА: FeCl2*4 H2O 1,5 г/л H3BO3 0,06 г/л 6 UA 115895 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 MnCl2*6 H2O 0,1 г/л CaCl2*6 H2О 0,12 г/л ZnCl2 0,07 г/л NiCl2*6 H20 0,025 г/л CuCl2*2 H2O 0,015г/л Na2MoCl4 0,025 г/л 6) Вітаміни Піридоксин 20 мг Тіамін 10 мг Рибофлавін 10 мг Нікотинова кислота 10 мг Р - амінобензойна кислота 10 мг Ліпоєва кислота 10 мг Нікотинамід 10 мг Вітамін В12 10 мг Біотин 4 мг Фолієва кислота 4 мг Всі компоненти розчиняли в 200 мл води, стерилізували при 0,5 атм. 30 хвилин і додавали в рідке поживне середовище в кількості 1 мл/л. Компоненти поживних середовищ зважували на технічних та аналітичних електронних вагах і розчиняли у дистильованій воді. Досвід з приготування поживних середовищ показав, що їх зручно готувати із заздалегідь стерилізованих концентрованих розчинів. Тверде поживне середовище готували як рідке, з додаванням 3 % агару. Оптична густина (ОГ600) культур клітин E. coli склала 9 В.О. Клітини осаджували центрифугуванням при 13000 g протягом 6 хв. при температурі 10 °C. Осад клітин зважували, він склав 2.1 гр. Клітини ресуспендували в 30 мл буферу (50 мМ ТрісНCl, pH, 50 мМ ЕДТА, 20 мМ L-цистеїн, pH 8,6) і руйнували з використанням ультразвуку (час озвучування - 10 хв., час імпульсу - 30 сек., час паузи між імпульсами - 30 сек., амплітуда - 70 %). Після руйнування клітин тільця включення осаджували з використанням центрифугування при 30000g протягом 20 хв. при 0 температурі 10 С, вага сирого залишку тілець включення з клітин склала 1,45 г. Осаджені тільця включення відмивали з використанням послідовної зміни декількох буферів за наступною схемою: 1. Осад тілець включення ресуспендували в 10 мл (останнє відмивання 15 мл) буферу для відмивання 2. Ресуспендовані тільця включення перемішували на горизонтальному шейкері протягом 1 години при кімнатній температурі 3. Тільця включення осаджували центрифугуванням при 30000 g протягом 20 хв. при температурі 10 °C Після п'яти відмивок сира вага тілець включення склала 0,7 г. Для солюбілізації білка з відмитих тілець включення використовували 18 мл розчину (9 М сечовина, 2 мМ ЕДТА, 50 мМ ТрісНCl, pH 8,6). Солюбілізовані тільця включення 0 центрифугували при 30000 g протягом 20 хв. при температурі 10 С. Супернатант, що утворився, переносили в нові фалькони і використовували для рефолдингу. Рефолдинг проводили методом 10-кратного розведення солюбілізованих тілець включення 0 в буфері для рефолдингу при температурі +4 С по краплях. До розчину рефолдованого білка додавали MgCl2 до 6 мМ і використовували для очищення білка метод імобілізованої металохелатної хроматографії (ІМАХ) з використанням сорбенту Ni-НТУ сефарози. Білковий розчин фільтрували через ПВДФ фільтр з діаметром пор 0,22 мікрона і до отриманого фільтрату додавали сорбент Ni-НТУ сефарози, урівноважений буфером для рефолдингу, з розрахунку, що 1 мл сорбенту зв'язує не більше 40 мг білка, після чого проводили зв'язування при постійному перемішуванні протягом 2 годин. Сорбент осаджували центрифугуванням і в мінімальному об'ємі наносили на гравітаційну хроматографічну колонку, що містить 2 мл сорбенту. Елюцію проводили ступінчастим градієнтом імідазолу (20, 40, 100, 150, 200 і 300 мМ), при цьому на кожний крок припадав об'єм розчину, яким елюють, рівний 10 об'ємам колонки. З використанням даного методу очищення було отримано 41 мг гібридного білка з чистотою 97 %. Приклад 9. Отримання гібридного білка, очищеного перед розчиненням видаленням розчинних клітинних компонентів, що включають ДНК, РНК, білки, ліпополісахариди за допомогою промивання буферним розчином, що містить детергент гуанідингідрохлорид Після проведення ферментації і руйнування клітин E. coli, відмивання тілець включення 7 UA 115895 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (див. Приклад 8), проводили солюбілізацію білка 18 мл розчину (8 М GuHCl, 2 мМ ЕДТА, 50 мМ ТрісНCl, pH 8,6), що містить гуанідингідрохлорид. Солюбілізовані тільця включення 0 центрифугували при 30000 g протягом 20 хв. при температурі 10 С. Супернатант, що утворився, переносили в нові фалькони і використовували для рефолдингу. Далі проводили рефолдинг рекомбінантного білка та їх очищення (див. Приклад 8). В результаті очищення було отримано 41 мг гібридного білка з чистотою 98 %. Приклад 10. Визначення імуногенності препарату білка Проводили оцінку імуногенності препарату отриманого білка. Імуногенність - це здатність антигену ініціювати імунну систему до формування ефекторів, що нейтралізують антигенну чужорідність. Щоб спровокувати імунну відповідь, антиген повинен володіти імуногенністю. Слід підкреслити, що імуногенність - комплексна характеристика, яка залежить від властивостей самого антигену, шляху його введення і способу імунізації. Імунізацію мишей проводили внутрішньочеревно, вводили 20 мкг гібридного білка. Імунізацію проводили дворазово з інтервалом у 2 тижні. Тварини були розділені на дослідні і контрольні групи по 5-6 мишей у кожній. Зразки крові отримували від 5-6 мишей кожної групи через 2 тижні після другої імунізації з хвостової вени. Для отримання сироватки кров інкубували протягом 30 хвилин при температурі 37 °C. Після утворення згустків крові зразки поміщали на поверхню льоду і охолоджували протягом 1-ї години з подальшим центрифугуванням протягом 15 хвилин при 400 g. Сироватку крові від мишей кожної групи пулували і заморожували при температурі мінус 20 °C. Титри антитіл у сироватках імунізованих мишей визначали за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). ІФА проводили загальноприйнятим методом. Використовували 96-лункові планшети (Greiner, Німеччина), на яких сорбовано гібридний білок (в карбонатному буфері, pH 0 9,5-9,6), витримували ніч при 4 С. Гібридний білок денатурували наступним чином. До зразку білка додавали детергент Tween20 до кінцевої концентрації 1 % (w/v), інкубували на водяній бані протягом 1 години при 37 °C. Далі зразок центрифугували 1 годину при 200 °C і 2000 g, відбирали супернатант, що містить гібридний білок. Від детергента позбувалися за допомогою Detergent-OUTtmMicro Kit (Millipore), вільний від детергента зразок концентрували на установці SpeedVac до початкового об'єму. Додаткову обробку кінцевого препарату проводили 8 М сечовиною в присутності дитіотриетанолу (0,02М) з наступним діалізом протягом ночі проти карбонатного буферу (рН = 8,5). Планшет обробляли блокувальнім буфером (0,01 М ФСБ, pH=7,2-7,4 з 5 % ЕТС) протягом 1 години при кімнатній температурі, відмивали 3 рази ФБР з Tween-20. В лунки планшета додавали 100 мкл 2-х кратних розведень сироватки (починаючи з 1:200) у блокувальному буфері, інкубували 1 годину при кімнатній температурі. Сироватку досліджували в дублікаті. В якості кон'югату використовували кролячі поліклональні антимишині IgG (Abcam, UK) в розведенні 1:8000, мічені пероксидазою хрону. Як субстрат використовували ТМБ. Облік реакції проводили при довжині хвилі 450 нм. За титр брали найбільше розведення сироватки, яке дає оптичну густину принаймні в 2 рази більше, ніж сироватка неімунізованих мишей в тому ж розведенні. Отримані результати свідчать про високу імуногенність отриманого білка. При імунізації гібридним білком в крові мишей виявлялися антитіла до антигену, титр 51 200. Таким чином, було показано формування у мишей, імунізованих гібридним білком, сильної імунної відповіді на нього. Приклад 11. Протективність імунної відповіді, що викликається гібридним білком, проти різних штамів вірусів грипу У цьому дослідженні були використані миші лінії Balb/c (самки), 7-8 тижнів (масою 16-18 г), отримані з Установи Російської академії наук Інституту біоорганічної хімії ім. академіків М.М. Шемякіна і Ю.А. Овчіннікова РАН (Філія) Розплідник лабораторних тварин "Пущино". Лабораторні тварини були клінічно здорові і вільні від гельмінтів (ветеринарне свідоцтво 250 № 0187942 від 27 листопада 2012 року) Тварин утримували у віварії ФГБУ "НДІ грипу" МОЗ Росії у відповідності з діючими санітарними правилами. Імунізацію мишей проводили внутрішньочеревно, використовуючи 20 мкг гібридного білка. Імунізацію проводили дворазово з інтервалом у 2 тижні. Для вивчення протективності гібридного білка на моделі летальної грипозної інфекції використовували штами вірусу грипу A/California/07/2009 (H1N1) і A/PR/8/34 (H1N1), адаптовані до мишей. Титрування вірусів для визначення однієї дози, що викликає 50 % загибель тварин, проводили на мишах лінії Balb/c (самки, вік 6-7 тижнів). Заморожений вірус розморожували, визначали летальну дозу для мишей (така, що викликає 50 % загибель) шляхом зараження мишей десятикратними розведеннями 8 UA 115895 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 вірусу (по 4 миші на розведення). Спостереження за загибеллю мишей вели протягом 14 діб після зараження. Титр вірусу визначали за методом Ріда і Менча. Для зараження мишей вірус вводили інтраназально в дозі 1 LD/50 (доза, що викликає загибель 50 % мишей) і 5 LD/50 (доза, що викликає загибель 90 % мишей) по 50 мкл/миша під легким ефірним наркозом. Після зараження проводили щоденне спостереження за тваринамипротягом 14 днів. Загибель мишей починалася на 6 день, в контрольній групі виживаність мишей склала 43 %. У дослідній групі спостерігалася стовідсоткова виживаність мишей (Фіг. 1). Загибель мишей починалася на 6 день. У контрольній групі виживаність мишей склала 42 %. У дослідній групі спостерігалася стовідсоткова виживаність мишей (Фіг. 2). Приклад 12. Формування полівалентної імунної відповіді до різних штамів вірусів грипу А і В після імунізації мишей гібридним білком У цьому дослідженні були використані миші лінії Balb/c (самки), 7-8 тижнів (масою 16-18 г), отримані з Установи Російської академії наук Інституту біоорганічної хімії ім. академіків М.М. Шемякіна і Ю.А. Овчіннікова РАН (Філія) Розплідник лабораторних тварин "Пущино". Лабораторні тварини були клінічно здорові і вільні від гельмінтів (ветеринарне свідоцтво 250 № 0187942 від 27 листопада 2012 року) Тварин утримували у віварії ФГБУ "НДІ грипу" МОЗ Росії у відповідності з діючими санітарними правилами. Імунізацію мишей проводили внутрішньочеревно, використовуючи 20 мкг/200 мкл гібридного білка. Імунізацію проводили дворазово з інтервалом у 2 тижні. Тварини були розділені на дослідні і контрольні групи по 5-6 мишей у кожній. Зразки крові отримували від 5-6 мишей кожної групи через 2 тижні після другої імунізації з хвостової вени. Для отримання сироватки кров інкубували протягом 30 хвилин при температурі 37 °C. Після утворення згустків крові, зразки поміщали на поверхню льоду і охолоджували протягом 1-ї години з подальшим центрифугуванням протягом 15 хвилин при 400 g. Сироватку крові від мишей кожної групи пулували і заморожували при температурі мінус 20 °C. Титри антитіл у сироватках імунізованих мишей визначали за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). ІФА проводили загальноприйнятим методом. Використовували 96-лункові планшети (Greiner, Німеччина), на яких сорбували антигени штамів A/California/07/09 (H1N1), A/PR/8/34 (H1N1), A/Perth/16/09 (H3N2), A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), в концентрації 2 0 мкг/мл (в карбонатному буфері, pH 9,5-9,6), витримували ніч при 4 С. Гібридний білок денатурували наступним чином. До зразку додавали детергент Tween-20 до кінцевої концентрації 1 % (w/v), інкубували на водяній бані протягом 1 години при 37 °C. Далі зразок центрифугували 1 годину при 20 °C і 2000 g, відбирали супернатант, що містить гібридний білок. Від детергента позбувалися за допомогою Detergent-OUTtmMicro Kit (Millipore), вільний від детергента зразок концентрували на установці SpeedVac до початкового об'єму. Додаткову обробку кінцевого препарату проводили 8М сечовиною в присутності дитіотриетанолу (0,02 М) з наступним діалізом протягом ночі проти карбонатного буфера (рН = 8,5). Планшети обробляли блокувальнім буфером (0,01 М ФСБ, pH=7,2-7,4 з 5 % ЕТС) протягом 1 години при кімнатній температурі, відмивали 3 рази ФБР з твіном. В лунки планшета додавали 100 мкл 2-х кратних розведень сироваток (починаючи з 1:200) у блокувальному буфері, інкубували 1 годину при кімнатній температурі. Всі сироватки досліджувалися в дублікатах. В якості кон'югату використовували кролячі поліклональні антимишині IgG (Abcam, UK) в розведенні 1: 8000, мічені пероксидазою хрону. Як субстрат використовували ТМБ. Облік реакції проводили при довжині хвилі 450 нм. За титр брали найбільше розведення сироватки, яке дає оптичну густину принаймні в 2 рази більше, ніж сироватка неімунізованих мишей в тому ж розведенні. Таблиця 1 Титри сироваткових антитіл (IgG) після двократної імунізації мишей гібридним білком Сорбовані антигени (вірус) A/California/07/09 A/PR/8/34 A/Perth/16/09 A/Kurgan/05/2005 В/Florida/04/06 (H1N1) (H1N1) (H3N2) Tw (H5N1) Титри IgG в сироватках крові мишей Balb/с, Гібридний білок 51 200 12 800 9 3 200 6 400 6 400 UA 115895 C2 5 10 15 20 25 При імунізації гібридним білком в крові мишей виявлялися антитіла до всіх дослідженим штамів вірусу грипу субтипу А в діапазоні від 1: 3200 у разі H3N2 A/Perth/16/09 до 1:51200 у разі H1N1 A/California/07/09. Таким чином, було показано формування у мишей, імунізованих гібридним білком, полівалентної імунної відповіді до різних штамів вірусу грипу А і В. Приклад 13. Здатність антитіл, що утворюються після імунізації тварин вбитим вірусом грипу В, зв'язуватися з гібридним білком. У дослідженні використовувалися кролі породи шиншила, вагою 2-2,5 кг, отримані з розплідника лабораторних тварин Російської Академії медичних наук, сел. Рапполово Ленінградської області. Тварин утримували у віварії НДІ грипу СЗО РАМН відповідно до чинних санітарних правил. На кролях проведено вивчення здатності антитіл, що утворюються після імунізації тварин вбитим вірусом грипу В, зв'язуватися з гібридним білком. Кролів імунізували дворазово з інтервалом 1 місяць, підшкірно, вбитим вірусом грипу В/Florida/04/з ад'ювантом Фрейнда в дозі 9 10 БУО. Кров брали з вушної вени через 1,5 місяці після другої імунізації. В ІФА (використовували Аnti Rabbit Ig-HRP conjugate, Sigma-Aldrich, A 6154 в розведенні - 1:5000) оцінювали титри сироваткових антитіл (IgG) до вірусу грипу В/Florida/04/06, гібридному білку, в якості контролю використовували сироватку крові неімунізованих кролів. Результати проведеного дослідження показують, що антитіла до поверхневих білків вірусу грипу В/Florida/04/06 здатні зв'язуватися з гібридним білком, титри антитіл до гібридного білку склали 1: 204 000. В ІФА (використовували Аnti Rabbit Ig-HRP conjugate, Sigma-Aldrich, A 6154 в розведенні 1:5000) оцінювали титри сироваткових антитіл (IgG) до вірусу грипу В/Florida/04/06, рекомбінантних білків, що входять до складу вакцини, в якості контролю використовували сироватку крові неімунізованих кролів. Результати представлені на Фіг. 3 і Фіг. 4. Титри антитіл в ІФА до штаму вірусу грипу В/Florida/04/06 і гібридного білку склали 409 600 і 204 800, відповідно. Таким чином, показана імунологічна полівалентність гібридного білка проти вірусів грипу А і В. 10 UA 115895 C2 11 UA 115895 C2 12 UA 115895 C2 13 UA 115895 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 1. Полівалентна вакцина проти грипу на основі гібридного білка, охарактеризованого SEQ ID NO: 1, що включає фрагменти білків H1, H3, H5 вірусу грипу А, а також фрагмент гемаглютиніну вірусу грипу B, а також компоненти флагеліну - FliC1 і FliC2, як ад'ювант, з'єднані гнучкими містками. 2. Полівалентна вакцина проти грипу за п. 1, яка характеризується тим, що гібридний білок закодований в нуклеотидній послідовності SEQ ID NO: 2, оптимізованій за кодонним складом для експресії в клітинах Escherichia coli. 3. Полівалентна вакцина проти грипу за п. 1, яка характеризується тим, що отримана способом, що включає створення рекомбінантної ДНК, що кодує гібридний білок за п. 1, введення такої ДНК у векторну конструкцію для експресії в клітинах бактерії Escherichia coli, введення даної векторної конструкції в клітини бактерій Escherichia coli, продукцію гібридного білка в зазначеному організмі, його виділення, очищення і змішування з фізіологічно прийнятним носієм. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 14