Місцева антимікробна дерматологічна композиція

Реферат: Винахід стосується застосування місцевої антимікробної дерматологічної композиції у виробництві лікарського засобу офтальмологічного призначення, яка містить в комбінації щонайменше один катіонний антимікробний пептид, зв'язаний з ліпідом, та гіалуронову кислоту з молекулярною масою від 200 кДа до 600 кДа або її сіль, де антимікробний пептид є гексапептидом, зв'язаним з пальмітиновою кислотою, що містить дисульфідні містки, та де композиція знаходиться у формі для зовнішнього місцевого застосування. UA 115894 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Представлений винахід стосується нової композиції, використовуваної в терапії, яка має антимікробні властивості, і, точніше, нової композиції на основі гіалуронової кислоти та катіонного антимікробного пептиду, використовуваної в медицині і ветеринарії, зокрема в дерматології та офтальмології для лікування мікробних інфекцій. Шкіра формує разом живий анатомічний бар'єр і зону обміну між тілом і його навколишнім середовищем, ефективність якої обумовлює підтримання гарної гомеостазної рівноваги. Шкіра є справжнім органом, який містить ряд об'єднаних шарів, починаючи із зовнішнього шару – епідермісу – до більш глибоких шарів - дерми та гіподерми - де кожен з цих шарів виконує функції, які дозволяють разом реагувати і адаптуватися до свого зовнішнього середовища. Епідерміс головним чином складається з кератиноцитів, меланоцитів і клітин Лангерганса, має змінну товщину в різних частинах тіла і утворює зовнішній шар шкіри для забезпечення захисту тіла від його зовнішнього середовища. Дерма є найтовщим шаром, який пронизують нервові волокна і кровоносні судини, який складається головним чином з колагену, еластину, протеогліканів і глікозаміногліканів, головних чином синтезованих шкірними фібробластами. Волокна колагену забезпечують механічну міцність і текстуру шкіри, еластин відповідає за її еластичність, глікозаміноглікани та протеоглікани відіграють головну роль в структурі та зволоженні шкіри. Найглибший шар шкіри формує гіподерму, яка містить адіпоцити, які виробляють ліпіди, які забезпечують формування жирового шару, який захищає м'язи, кістки та внутрішні органи від ударів. Зміни в структурі епідермісу, такі як підвищення вологості або присутність подразнення, або шкірні рани різного походження, або розвиток дерматозу, сприяють поширенню і зараженню шкіри патогенними мікроорганізмами. Швидке розмноження мікробів, що є наслідком зміни умов загоєння, уповільнює або блокує його та сприяє поширенню інфекції, починаючи з первинної рани. Таким чином, шкіра постійно атакується патогенними мікроорганізмами, але шар, названий епідермісом, з огляду на його pH, на його відносно малий відсотковий вміст води і на присутність антибактеріальних пептидів, які мають бактерицидну дію, відіграє роль основного антимікробного захисту від цих патогенних мікроорганізмів. Більшість бактеріальних колоній перетворюється на біоплівки, мембранну структуру виживання мікробів, відхиляючи фактори росту і загоєння, створюючи запалення, яке перешкоджає ефективному процесу антимікробного захисту. В силу дуже широкого і, інколи, надмірного використання антибіотиків, бактерії виробляють стійкість до антибіотиків, що обмежує і також анулює їх антибактеріальні дії. Бактерії біоплівок стійкі до більшості антибіотиків і антисептиків, і, таким чином, необхідно розробити композиції, придатні до ефективної боротьби проти патогенних мікроорганізмів, беручи до уваги найбільш можливий шкірний гомеостаз, і не сприяючи розвитку стійких штамів, небезпечних для людини і її середовища. Відомо, що катіонні антимікробні пептиди впливають на оболонку бактерій завдяки електростатичному зв'язку між катіонним пептидом та негативно зарядженими фосфоліпідами, присутніми в зовнішній структурі оболонки грамнегативних бактерій, тоді як у грампозитивних бактерій зв'язок утворюється між пептидом і компонентами муреїна навколо плазматичної оболонки бактерій. Катіонна властивість антимікробних пептидів пояснює їх близькість до аніонної оболонки бактерій і фіксація є настільки легшою, наскільки є сильним заряд. Після фіксації, пептиди змінюють проникність оболонки, формуючи пори, які провокують осмоліз після смерті бактерії. Таким чином, антимікробні пептиди, зокрема, катіонні пептиди, діють на шкірному рівні, захищаючи шкіру від бактеріальних інфекцій і запалення. Дефензини утворюють сім'ю природних антимікробних пептидів, які задіяні в неспецифічному або вродженому імунітеті. Це є малі катіонні антимікробні пептиди, сформовані ланцюгами з 36-42 амінокислот, які містять внутіршньомолекулярні дисульфідні містки. У людини вони мають великий спектр дуже ефективних антимікробних та протигрибкових активностей і діляться на дві групи, які відомі як α-дефензини і β-дефензини. Останні присутні у всіх епітеліях, шкірний епітелій яких, слизова оболонка очей та роту і всередині багатьох органів відіграють важливу роль в реакціях на інфекції. β-дефензини вивільняються у відповідь на активування специфічних рецепторів, таких як Толл-Подібні Рецептори (TLR). Досліди показують, що коменсальна бактеріальна флора і патогенна флора використовують різні способи індукування β-дефензинів. Таким чином, шкіра має молекулярні засоби для розрізнення і боротьби проти бактерій. "Толл-Подібні Рецептори" (TLR) є мембранними рецепторами, які виділяються сім'єю генів TLR, які відіграють фундаментальну роль в розпізнаванні патогенних мікробів і у активуванні 1 UA 115894 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вродженого імунітету. Вони модулюють вироблення цитокінів, необхідних для ефективного імунітету. TLR4 і TLR2 є активними під час розпізнавання ліпополісахаридів (LPS), присутніх на грамнегативних бактеріях. LPS є прозапальним бактеріальним ендотоксином. TLR2 точніше впізнає пептидоглікан грампозитивних бактерій і TLR4 впізнає LPS грамнегативних бактерій. В шкірі TLR2 і TLR4 протеїни одержуються на кератиноцитах і TLR2 – на сальних залозах. Дефензини відіграють первинну роль елісіторів, тобто молекул, придатних до запускання механізму захисту організму. Таким чином, будучи природно присутніми в шкірі, вони стимулюються для підсилення захисту ділянок крихкої шкіри. В середовищі, яке часто є ворожим, важливо допомагати біологічним функціям для підтримання гарної якості і здорового стану шкіри. Поняття елісітор, означає те, що призводить до стимулювання біологічних засобів, присутніх в шкірі, для кращої реакції на зовнішні агресії. Антимікробні властивості людського β-дефензину (HBD-3) описуються в заявці на патент WO 0192309. Гіалуронова кислота є природним полімером на основі дисахариду, який містить одиниці Dглюкуронової кислоти та N-ацетилглюкозаміну, зв'язані глюкозидним зв'язком. Її властивості є дуже нестійкими згідно з її молекулярною масою. Гіалуронові кислоти з великою молекулярною масою, яка перевищує 1000 кДа, по суті використовуються для сприяння зволоженню шкіри завдяки гідрофільній вуглеводній сітці, яку вони утворюють. Гіалуронові кислоти з незначною молекулярною масою, яка менша за приблизно 50 кДа, можуть долати бар'єр рогового шару і подразнювати рецептори CD44, які відповідають за неосинтез гіалуронової кислоти в дермі. Гіалуронова кислота як колаген є головною складовою зовнішньоклітинного матриксу дерми і вона відіграє важливу роль в рості клітин і в підтриманні рівня вологи. В процесі старіння шкіри спостерігається зменшення її концентрації в дермі. Гіалуронова кислота є глікозаміногліканом, часто використовуваним в косметичних і дерматологічних композиціях головним чином у формі гіалуронату натрію, зокрема для сприяння зволоженню, і для стимулювання загоєння і природного захисту шкіри. Вона однаково використовується в пластичній хірургії для заповнення зморшок, в процедурах медичного лікування артрозу і в офтальмології. Різні поперечнозшиті або непоперечнозшиті похідні гіалуронової кислоти, які здатні до забезпечення гарної стійкості до ензиматичної деградації і, зокрема, використовуються в косметичних композиціях, описуються, наприклад, в заявці WO 2011080450. Різні форми гіалуронової кислоти добре відомі і доступні на ринку. Пропонується об'єднати гіалуронову кислоту або її похідні з сульфатом хондроїтину, як в заявці WO 2009073437, або з ретиноїдом та олігосахаридом як в заявці FR 2894827. В антимікробних композиціях також запропоновані солі важких металів гіалуронової кислоти, як описується в заявці WO 8705517. Патент US 6180601 описує фармацевтичну композицію, яка використовує гіалуронову кислоту з незначною молекулярною масою, тобто 50 – 200 кДа, яка формує матрикс, який містить пептид або протеїн, наприклад гормон росту. Заявка WO 2006130974 стосується пептидів, які містять переважно 15-40 амінокислот, які можуть зв'язуватися, з одного боку, з гіалуроновою кислотою, і, з іншого боку - з бактеріальною оболонкою, яка містить гіалуронову кислоту, і можуть використовуватися в присутності ліпіду для формування ліпосом. Фармацевтична композиція, яка містить пептид, виділений з лактоферину і гіалуронової кислоти, описується в заявці WO 2010081800. Дослідження, проведені заявником, дозволяють зазначити, що можна одержувати ефективну антимікробну дію, еквівалентну дії антисептиків та антибіотиків місцевої дії, об'єднуючи антимікробний катіонний пептид з гіалуроновою кислотою з середньою молекулярною масою, і що антимікробна дія катіонного пептиду має силу завдяки зв'язку з гіалуроновою кислотою, яка стимулює одержання β-дефензинів. Під антимікробною дією розуміють антибактеріальну дію і/або антивірусну, і/або антифунгіцидну дію. Задачею представленого винаходу є надання нової композиції місцевого застосування, яка має антимікробні властивості, які дозволяють ефективно лікувати шкірні мікробні інфекції і підсилювати природний захист шкіри без застосування антибіотиків або хімічних антисептиків. Задачею представленого винаходу, таким чином, є надання дерматологічної композиції, яка містить комбінацію принаймні антимікробного катіонного пептиду та гіалуронової кислоти з середньою молекулярною масою або її солей. Задачею представленого винаходу є також надання антимікробної дерматологічної композиції місцевого застосування, яка містить комбінацію принаймні антимікробного катіонного пептиду, зв'язаного з ліпідом, та гіалуронової кислоти або її солей з молекулярною масою 100 кДа - 800 кДа. Нарешті, задачею представленого винаходу є надання композиції, яка містить принаймні суміш антимікробного катіонного пептиду, зв'язаного з ліпідом, і гіалуронової кислоти з 2 UA 115894 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 середньою молекулярною масою або її солей, для застосування в лікуванні шкірних мікробних інфекцій, шкірних придатків або слизових оболонок. Така композиція використовується в людській дерматології для лікування шкірних ран завдяки своїм антимікробним властивостям. Вона також використовується в дерматології і в офтальмології, точніше для лікування інфекцій, пов'язаних з гострими хронічними виразками, фолікулітом, суперінфекціями дерматологічних запалювальних хвороб, блефаритами, мейбонітами та кон'юнктивітами. Згідно з винаходом катіонний антимікробний пептид є переважно пептидом, який містить принаймні 50 амінокислот, більш переважно 3-30 амінокислот, і має великий спектр антимікробної дії проти грампозитивних та грамнегативних бактерій. Наприклад, можна використовувати катіонний антимікробний пептид, вибраний серед лінійних пептидів з спіральною структурою, пептидів, які містять один або більшу кількість дисульфідних містків, і лінійних пептидів, які багаті на певні амінокислоти. Катіонний антимікробний пептид винаходу, який містить принаймні 50, переважно принаймні 30 амінокислот, може вибиратися, наприклад, серед похідних магеніну, протегріну, індоліцидину і гістатину. Можна також використовувати синтетичний катіонний пептид як пентахлоргідрат оміганану, аналог індоліцидину, хлоргідрат ізеганану, синтетичний протегрін і ацетат пексіганану, аналог магеніну. Ці пептиди зв'язуються ковалентним зв'язком з ліпідом і переважно з жирною кислотою, такою як пальмітинова кислота. Точніше, цей ковалентний зв'язок не є ліпосомальним. Також можна використовувати пептид, який доступний на ринку як Олігопептид-10 (Grant Industries) або як Shield Bact Peptide (Infinitec), який є гексапептидом, зв'язаним з пальмітиновою кислотою, яка містить дисульфідні містки. Антимікробна активність композицій згідно з винаходом була продемонстрована дослідами in vitro і ex vivo, як вказано далі, які демонструють потрійну дію, яка полягає в нейтралізації мікробних ендотоксинів для мінімізації впливу толл-подібних рецепторів, для імітації дії βдефензинів для досягання швидкого антиінфекційного ефекту і для модуляції запальної реакції. Антимікробний пептид повинен переважно бути амфіфільним. Ця характерна амфіфільність підсилюється зв'язуванням катіонного пептиду з ліпідом і, зокрема, жирною кислотою з прямим або розгалуженим ланцюгом, насиченою або ненасиченою, яка містить переважно 6-22 атомів вуглецю, такою як олеїнова кислота, лінолева кислота, лауринова кислота, сапієнова кислота, стеаринова кислота і пальмітинова кислота. Зв'язок жирної кислоти з пептидом переважно досягається ковалентним зв'язком з принаймні однією з амінокислот, які утворюють пептид. Ковалентний зв'язок може, наприклад, бути амідним зв'язком на N-кінці пептиду. Виконані досліди показують, що також підсилений амфіфільний характер сприяє фіксації катіонного пептиду на поверхні бактерій і має як наслідок. - структурне порушення зовнішнього шару бактеріальної оболонки; - накопичення жирної кислоти у формі міцел на границі розділу між оболонками; - пробивання цієї подвійної оболонки шляхом створення іонних каналів. Ця потрійна дія має наслідком бактеріальний лізис, пов'язаний з втратою непроникності своєї оболонки і з дією катіонного пептиду на аніонні інтрацитоплазматичні мішені. Більше того, антимікробний катіонний пептид винаходу проявляє: - великий спектр активності, який охоплює грамнегативні і грампозитивні бактерії, грибкові інфекції, віруси і паразити, - велика швидкість дії, пов'язана з багатьма враженими жирною кислотою мішенями всередині бактерії. - дуже малий ризик появи стійкості порівняно з тим, що спостерігається з традиційними антибіотиками. Проведені досліди також показують, що катіонний антибактеріальний пептид, використовуваний у винаході, здатен нейтралізовувати реакцію клітин-хазяїнів на бактеріальні ендотоксини, тип яких відповідає бактеріям (грамнегативні або грампозитивні), які їх виробляють. Він також модулює вроджену імунну реакцію шляхом обмеження активності TLR і одержання TNF α, що пом'якшує запалювальний каскад і цитокінну бурю, яка виникає в результаті цього (IL-6, IL-1b, IL-1a). Він також має інші властивості, пов'язані з вродженим імунітетом, шляхом хемотаксичної дії на моноцити і нейтрофіли, шляхом вивільнення гістаміну за допомогою моноцитів, і шляхом інгібування протеаз, які обмежують руйнування тканини і стимулюють відновлення тканини. Проведені досліди показують, що цей механізм захисту вродженого імунітету при наявності бактеріальної атаки може оптимізуватися шляхом зв'язування антимікробного катіонного пептиду, переважно зв'язаного з жирною кислотою, з гіалуроновою кислотою з середньою 3 UA 115894 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекулярною масою. Безпосередня дія на мікроби завершується нейтралізацією ендотоксинів, які вони секретують. З цього слідує, що вивільнення прозапальних цитокінів послаблюється і, що дія, властива гіалуроновій кислоті, може, в такому випадку, виражатися прискореною фіксацією на толлподібних рецепторах і збільшеною секрецією β-дефензинів, створюючи, таким чином, другу лінію захисту від мікробів. Паралельно стимулюються механізми відновлення для швидкого відновлення бар'єрної дії епідермісу. Згідно з представленим винаходом, під гіалуроновою кислотою розуміють гіалуронову кислоту у вільній формі або у формі її солей лужних металів і лужноземельних металів, наприклад гіалуронату натрію, гіалуронату калію, гіалуронату кальцію або гіалуронату магнію з середньою молекулярною масою, тобто переважно 100-800 кДа, більш переважно 200 – 600 кДа. Гіалуронова кислота, використовувана у винаході, доступна на ринку у різних формах, пристосованих до передбачених застосувань. Вона може одержуватися промисловим чином у важливих кількостях шляхом екстрагування з тканин тварин, таких як гребені півнів, або шляхом бактеріальної ферментації, або знову шляхом біотехнологічного процесу з рослинних субстанцій, наприклад пшениці. Можна використовувати, наприклад, гідролізовану гіалуронову кислоту або натрієву сіль гіалуронової кислоти з молекулярною масою 200 - 600 кДа, як ті, що доступні на ринку під маркою PrimalHyal 300 (Soliance) з молекулярною масою приблизно 300 кДа або PrimalHyal 450 з молекулярною масою приблизно 450 кДа. Композиції згідно з представленим винаходом можуть містити ефективну кількість кожної з вищезгаданих активних речовин, наприклад, 0,05 - 2 мас. % гіалуронової кислоти, 0,001 - 1 мас. % антимікробного катіонного пептиду відносно загальної маси композиції. Композиції згідно з винаходом можуть мати, з іншого боку, одну або більшу кількість взаємодоповнюючих речовин, які підсилюють або переважно доповнюють активність суміші гіалуронової кислоти і антимікробного пептиду, і які сумісні, тобто не придатні до реакції між собою або до маскування, або обмеження своїх відповідних впливів. Наприклад, вони можуть містити хітозан або хітин, який в суміші з гіалуроновою кислотою має ефект захисної дифракційної решітки, яка сприяє ендогенному одержанню кератиноцитарних факторів росту, які індукують фібробластичну активність, яка збільшує одержання колагену і прискорює розрізнення фібробластів в міофібробластах. Вони можуть також містити основний сфінгоїд, такий як сфінганін і фітосфінгозин, який оптимізує антибактеріальну дію і підсилює протизапальну дію пептиду. Різні допоміжні активні речовини можуть вигідно додаватися до композиції і вибиратися серед, наприклад, загоювального агенту, протизапального агенту, протиінфекційногоагенту і вітаміну, такого як вітамін A або E. Загоювальний агент може бути, наприклад, сіллю цинку, екстрактом зерна плоду цератонії, багатого на олігогалактоманани. Протизапальний засіб може бути полісахаридом, таким як Rhamnosoft® або Teflose® (Solabia), який інгібує клітинну адгезію і обмежує запальні реакції, або екстрагує камедь з Boswellia serrata (Soothex®), яка діє шляхом ензиматичного інгібування синтезу лейкотрієнів. Додатковий протиінфекційний засіб може вибиратися серед сіланолу і активатора формування антимікробного пептиду, такого як метилкапроїлтирозинат (Defensamide®). Композиції згідно з представленим винаходом можуть мати будь-які форми галенового препарату, використовувані для місцевого застосування, зокрема для зовнішнього місцевого застосування. Вони можуть мати, наприклад, форму водних або водно-спиртових розчинів, міцелярних лосьйонів, розчинів для розпилення, шампунів, дисперсій, сироваток, гігієнічних серветок, легких пластирів, сіток або пов'язок з контрольованим вивільненням, гелів (водних, зневоднених або ліпофільних), олеогелів (ліпідних гелів), мазей, суспензій, іонних або неіонних везикулярних дисперсій, рідких або напіврідких емульсій (наприклад молоко), твердих або напівтвердих емульсій. Емульсії можуть бути типу масло у воді (H/E) або вода в маслі (E/H), наприклад гелями або кремами. Ексципієнти і основи, використовувані для приготування композицій згідно з представленим винаходом, є тими, які зазвичай використовуються у дерматологічних препаратах і вибираються в залежності від передбаченої форми призначення. Для прикладу, можна зазначити емульгатори, розріджувачі, загущувачі, пом'якшувальні засоби, консерванти, розчинники, суспендуючі агенти, так само як основні лавани і парфуми. Емульгуючий агент може вибиратися, наприклад, серед карбоксивінілових полімерів з ® ® великою молекулярною масою, полісорбатів, таких як Polysorbate 20 або Tween 60 , естерів ® сорбітану і, точніше, стеарату, пальмітату або лаурату сорбітану, такого як Arlacel . Також 4 UA 115894 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 можна використовувати як емульгуючий агент похідне стеаринової або пальмітинової кислоти, ® наприклад стеарат поліетиленгліколю, стеарат гліцерину, стеарат PEG 100 (напрклад Arlacel ® 165 ), стеарез або цетеарез, жирний спирт, такий як стеариловий спирт, каприловий спирт або ® цетеариловий спирт, наприклад Montanov 68 або, крім того, здатний до формування емульсії силікон. Желатинізатори і загущувачі вводяться в композицію для покращення текучості. Їх можна вибирати, наприклад, серед поліакриламідів типу Карбопол, співполімерів акрилату/акрилової ® ® кислоти, таких як Aculyn , поперечнозшитих акрилатів, таких як Carbopol Ultrez , похідних целюлози, таких як гідроксипропілцелюлоза, або природних камедей, таких як ксантанова камедь і гумітрагантна камедь. Гідратуючі і пом'якшуючі агенти, використовувані в композиції, можуть вибиратися, наприклад, серед пропіленгліколю, гліцерину, бутиленгліколю і масла каріте, так само як жирні спирти. Відповідний суспендуючий агент є, наприклад, глиною, такою як бетоніт або смектит. Також можна вигідно додавати агент, який полегшує проникнення крізь епідерміс, такий як космоперин. Композиції згідно з представленим винаходом одержуються звичайними технологіями в залежності від вибраної форми призначення, від об'ємних кількостей гіалуронової кислоти або її солей, які змішуються з антимікробним пептидом і, в разі необхідності, з хітином або хітозаном, і їх основами та ексципієнтами в прийнятному фізіологічному середовищі. Під прийнятним фізіологічним середовищем в сенсі представленого винаходу розуміють основи і ексципієнти типу, які зазвичай використовуються в дерматологічних композиціях в людській медицині, нейтральних по відношенню до використовуваних активних природних речовин, які не мають токсичного впливу і не викликають жодної шкідливої побічної дії на шкіру. Наприклад, у випадку крему, можна починати з дисперсії жирної фази у водній фазі для одержання емульсії масла у воді або навпаки для одержання емульсії води в маслі, при цьому активні природні речовини перебувають в одній або в іншій фазі. Композиція винаходу, наприклад у формі крему, наноситься переважно два-три рази в день на ділянку шкіри, яка потребує лікування, протягом часового періоду, який може становити від кількох днів до чотирьох тижнів згідно з тяжкістю захворювання. Наступні приклади детально ілюструють винахід без обмеження його правових рамок. В усіх прикладах композицій, які слідують, частини виражаються в масових відсотках, якщо не зазначено нічого іншого. Приклад 1 Готують водний гель шляхом змішування складових при температурі навколишнього середовища в порядку, вказаному далі. Демінералізовна вода 78,60 Carbopol Ultrez 20 0,80 Сода (32 % водний розчин) 0,50 Гліцерин 2,00 ® Shield Bact Peptide (0,1 % розчин) 5,00 Демінералізовна вода 10,00 ® Гіалуронова кислота (PrimalHyal 450 ) 0,10 Демінералізована вода 2,00 Петиленгліколь 1,00 Композиція водного гелю може типово використовуватися два-три рази в день протягом кількох послідовних днів в залежності від тяжкості захворювання, яке лікується. Приклад 2 Згідно з класичною технологією готують лосьйон, який має наступну композицію. Демінералізована вода 82,65 Carbopol Ultrez 20 0,45 Сода (32 % водний розчин) 0,30 Демінералізована вода 7,00 ® Гіалуронова кислота (PrimalHyal 450 ) 0,10 Гліцерин 2,00 ® Teflose (Solabia) 2,00 Естер PEG-7 Оливкової олії 2,00 Полісорбат 20 0,50 Shield Bact Peptide® (0,1 % розчин) 3,00 Цей лосьйон може використовуватися один-два рази в день протягом кількох днів для лікування офтальмологічних захворювань, таких як блефарит. 5 UA 115894 C2 5 10 Приклад 3 Готують антимікробний крем згідно зі звичайними технологіями шляхом послідовного змішування фаз, які містять композиції, вказані далі, при цьому фази A і B змішують в гарячому стані (65-70 °C), потім додають фазу C при температурі 50 °C з ретельним перемішуванням, потім - фазу D. Фаза A Неіонний емульгатор (Montanov 68) 4,00 Мірістиловий спирт 2,00 Стеариловий спирт 0,50 ® Cetiol RLF 3,00 Стеарат гліцерину 3,00 Соняшникова олія 4,00 Фаза B Демінералізована вода 67,90 ® Carbopol Ultrez 21 0,45 Пропандіол 2,00 Фаза C Гліцерин 2,00 ® Shield Bact Peptide (0,1 % розчин) 6,00 Фаза D Сода (32 % водний розчин) 0,05 Демінералізована вода 5,00 ® Гіалуронова кислота (PrimalHyal 300 ) 0,10 pH композиції встановлюється на рівні 6,5 шляхом додавання 32 % соди. Цей крем може використовуватися для нанесення на ділянки шкіри, які потребують лікування, один-два рази в день протягом часового періоду, який призначається лікаремпрактиком, і який може становити від одного до трьох тижнів згідно з природою і тяжкістю захворювання, яке лікується. Приклад 4 Вибраний вплив гіалуронової кислоти на одержання β-дефензинів і на кератиноцитарну проліферацію визначали наступним чином. Бета дефензини AH hpm AH pmm 1 AH bpm 2 AH tbpm 3 Кератиноцитарна проліферація 0 ++++ + (+) NS S NS NS 15 20 25 У вищенаведеній таблиці знак "+" вказує силу дії від дуже слабкої (+) до дуже сильної (++++). NS вказує "незначний". Використовувана гіалуронова кислота (AH) має велику молекулярну масу (hpm), середню молекулярну масу згідно з винаходом (pmm – приблизно 450 кДа), малу молекулярну масу (bpm) або дуже малу молекулярну масу (tbpm). Одержання β - дефензинів: Культури кератиноцитів після злиття оброблялися протягом 18 годин 0,2 %AH pmm або позитивним контрольним зразком (LPS Escherichia coli 5 мкг/мл) або: • з одного боку, гіалуроновою кислотою з високою молекулярною масою (AH hpm) • з іншого боку, гіалуроновими кислотами з малою молекулярною масою (AH з 20кДа і AH з 10кДа). Вивільнення HBD2 оцінювали у відстояній рідині за допомогою набору ELISA. Представлені величини є середніми величинами результатів. пікограм/мл Контрольний зразок 11 LPS 43 AH pmm 105 AH bpm 20 AH tbpm 18 30 Кератиноцитарна проліферація: J0: рана виконується на моношарі кератиноцитів (HaCaT) при злитті. Клітини потім обробляються при температурі 37 °C в 2,5 % SVF (сироватка телячого ембріону) без AH (еталонна умова) або з AH із зростаючою молекулярною масою (AH 50, AH 300, AH 1.000). 6 UA 115894 C2 5 10 15 20 25 30 Більший з двох країв рани вимірюється в 3 різних місцях на одній і тій же фотографії для кожного з способів лікування J0 і J1. Кожен дослід виконується незалежно 5 раз. Середні величини статистично обробляються (аналіз дисперсій з коефіцієнтом згідно з тестом Даннетта (SigmaStat). Єдина AH pmm (AH 300) дозволяє прискорювати процеси відновлення шкіри за допомогою проліферації кератиноцитів (HaCat). Стимулювання бактеріального захисту: Готують 3 розчини: Розчин A: 0,10 % AH pmm Розчин B: 0,05 % гексапептид Розчин C: 0,05 % гексапептид + 0,10 % AH pmm ® Використовуваний гексапептид є Shield Bact Peptide , який можна придбати на ринку (Infinitec). Гіалуронова кислота (AH pmm) має середню молекулярну масу 300 кДа. Протеїни біопсії людської шкіри після обробки (Розчини A B C або один з них) екстрагують зі слабким помішуванням протягом 2 годин в розчині, який містить 5 % оцтової кислоти і інгібітори протеаз (0,02 мМ PMSF, 2 нг/мл пепстатину і 2 нг/мл лейпептину). Протеїни, розчинні у відстояній рідині, сушать у вакуумі і гомогенізують в розчині 0,01 % оцтової кислоти. 4 10 бактерій/мл E. Coli (ATCC 4157) інкубують в середовищі з логарифмічним законом росту в буферному фосфатному розчині (pH 7,4) з кінцевим об'ємом 100 мкл. Цю суспензію E. Coli змішують з 30 мкг протеїнових екстрактів і з 10 мкл розчину 0,01 % оцтової кислоти, який містить інгібітори протеаз (негативний контрольний зразок), і суміші інкубують протягом 120 хвилин при температурі 37 °C. В кінці інкубаційного періоду відбирають 10 мкл і розводять в пропорції 1/10 і 1/100 тричі висівають в чашки Петрі, які містять казеїн-соєвий бульйон, і інкубують на ніч при температурі 37 °C. Після висівання в чашку Петрі і інкубації протягом ночі при температурі 37 °C, для кожного зразка визначають кількість КУО(одиниця, що утворює колонію). Нижченаведена таблиця результатів показує, що поєднання антимікробного гексапептиду, зв'язаного з пальмітиновою кислотою, з гіалуроновою кислотою з середньою молекулярною масою згідно з винаходом (Розчин C) є найефективнішим, відсоток інгібування формування КУО складає 100 %. Контрольний зразок % інгібування 35 40 45 Розчин A Розчин B Розчин C 40 55 77 100 Приклад 5 Два клінічні досліди провели на різних породах собак і один клінічний дослід провели на пацієнтах в сфері людської дерматології. Перший дослід на собаці: П'ять собак різних порід віком від 3 до 10 років, 2 ока яких заражені інфекційним блефарокон'юктивітом, лікували розчинами, приготованими наступним чином. - розчин A: міцелярний розчин, який містить 0,10 % AH pmm і 0,03 % гексапептиду, згідно з винаходом наносили на праве око - розчин B: розчин, який містить 0,03 % гексапептиду, наносили на ліве око Середня молекулярна маса гіалуронової кислоти композиції складає 450 кДа, а гексапептид є Shield Bact Peptide (Infinitec). Клінічний розвиток тривав 4, 8, 12, 24 і 48 годин. Результати наведені в нижчевказаній таблиці. розвиток 4год 8год 12год 24год 48год Собака 1 2 3 4 5 Праве око + ++ +++ +++ ++++ 7 Ліве око + +(+) ++ ++ +++ UA 115894 C2 5 10 15 20 25 30 35 Результати вказують швидше зростання інфекційної симптоматології при застосуванні розчину A згідно з винаходом, яка виражається 8-ма годинами і підтверджується через 12 і 24 години Другий дослід на собаці: Випадок № 1: Собаку породи ердельтер'єр (10 років), яка має сухий кератокон'юктивіт, який розвивається протягом кількох років, лікували без успіху циклоспорином. Око є сухим і вторинно заражене кон'юнктивітом із зменшеною очною щілиною. Застосування вищезгаданого лосьйону A один раз в день протягом 8 днів приводить до ефектного покращення стану (звичайне око, відкрите із зникненням болі). Випадок № 2: Собаку породи мальтійська болонка (15 років), яка мала тяжку корнеальну виразку внаслідок довготривалої анестезії без покращення після традиційних способів лікування. Око залишається сухим, виразка є глибокою і біль є живою. Застосування лосьйону A згідно з винаходом 2 рази в день протягом 8 днів приводить до загоєння і зникнення болі. Випадок № 3: Собака породи Boxer West (7 років), яка має виразку роговиці з грануляційною тканиною розміром 8 мм. Одужання досягалося шляхом застосування лосьйону A 2 рази в день протягом 8 днів. Випадок № 4: Собака породи Tzu Bans, яка має сухий кератокон'юктивіт з корнеальною виразкою і болями. Звичайне лікування протягом 3 тижнів залишається без ефекту. Застосування лосьйону A згідно з винаходом 2 рази в день протягом 8 днів приводить до відчутного послаблення болю без явної зміни виразки. Перехід до застосування циклоспроміну приводить до клінічного покращення виразки через 8 днів. Випадок №° 5: котеня, яке має тяжку нежить, ускладнену пробиттям очного яблука. Антибіотикотерапія не надає жодного покращення. Невдача терапевтичної пальпебральної оклюзії. Тому, лосьйон A згідно з винаходом використовують 3 рази в день і це виражається швидким покращенням. Дослід з людиною: Атопічний дерматит характеризується особливою чутливістю стосовно золотистого стафілококу. Його роль підкреслюється під час екзематичних висипань і контроль за його проліферацією на поверхні шкіри необхідний для покращення симптоматології. Чотири дорослі пацієнти (2 чоловіки і 2 жінки) віком від 18 до 31 року, які мають вторинне інфекційне екзематичне висипання, яке перебуває на рівні великих зморшок (зморшки ліктя, підколінної ямки), лікувалися двома рідкими емульсіями. - емульсію A, яка містить 0,05 % єдиного гексапептиду, наносять на правий бік; - емульсію B, яка містить гексапептид (0,05 %) і AH pmm (0,20 %), наносять на лівий бік. Середня молекулярна маса гіалуронової кислоти становить 300 кДа. Гексапептид є Shield Bact Peptide (Infinitec). Критерії свербіжу, підтікання, вторинного зараження нумеруються від 0 до 4 для визначення оцінки розвитку. T0 СИМПТОМИ СВЕРБІЖ ПІДТІКАННЯ ВТОРИННЕ ЗАРАЖЕННЯ A 4 4 4 T12 B 4 4 4 A 3 2 2 T24 B 2 1 1 A 2 1 1 B 1 0 0 T48 A 2 (1) 0 B 1 0 0 РЕЗУЛЬТАТИ B>A B>A B>A 40 Ці результати показують, що два креми є ефективними, проте крем B має швидшу дію на симптоматологію, яка виражається 12-ма годинами. Вторинне зараження пригнічується за 24години. Загальне покращення більш явне із застосуванням крему B згідно з винаходом. 45 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 1. Застосування місцевої антимікробної дерматологічної композиції у виробництві лікарського засобу офтальмологічного призначення, яка містить в комбінації щонайменше один катіонний антимікробний пептид, зв'язаний з ліпідом, та гіалуронову кислоту з молекулярною масою від 200 до 600 кДа або її сіль, де антимікробний пептид є гексапептидом, зв'язаним з пальмітиновою кислотою, що містить дисульфідні містки, та де композиція знаходиться у формі для зовнішнього місцевого застосування. 8 UA 115894 C2 5 10 15 20 25 30 2. Застосування композиції за п. 1, де сіль гіалуронової кислоти вибирають серед солей лужних металів та солей лужноземельних металів. 3. Застосування композиції за п. 2, де сіль гіалуронової кислоти є гіалуронатом натрію, гіалуронатом калію, гіалуронатом кальцію або гіалуронатом магнію. 4. Застосування композиції за п. 1, де антимікробний пептид є зв'язаним з ліпідом ковалентним зв'язком. 5. Застосування композиції за будь-яким одним із попередніх пунктів, де композиція додатково містить хітин або хітозан. 6. Застосування композиції за будь-яким одним із попередніх пунктів, де композиція містить 0,005-2 мас. % гіалуронової кислоти та 0,001-1 мас. % катіонного антимікробного пептиду відносно загальної маси композиції. 7. Застосування композиції за будь-яким одним із попередніх пунктів, де композиція додатково містить один або декілька вторинних природних активних агентів, вибраних із загоювального агента, протизапального засобу, протиінфекційного засобу та вітаміну, такого як вітамін А або Е. 8. Застосування композиції за будь-яким одним із попередніх пунктів, де зазначену місцеву антимікробну дерматологічну композицію застосовують для лікування блефариту, мейбоміту або кон'юктивіту. 9. Застосування композиції за будь-яким одним із попередніх пунктів, де антимікробний пептид є амфіфільним. 10. Застосування композиції за будь-яким одним із попередніх пунктів, де антимікробний пептид містить менше ніж 50 амінокислот, та переважно менше ніж 30 амінокислот. 11. Застосування композиції за будь-яким одним із попередніх пунктів, де гіалуронова кислота являє собою гідролізовану гіалуронову кислоту. 12. Застосування місцевої антимікробної дерматологічної композиції у виробництві лікарського засобу для лікування шкірних, інтегументальних мікробних інфекцій та мікробних інфекцій слизової оболонки, яка містить в комбінації щонайменше один катіонний антимікробний пептид, зв'язаний з ліпідом, та гіалуронову кислоту з молекулярною масою від 200 до 600 кДа або її сіль, де антимікробний пептид є гексапептидом, зв'язаним з пальмітиновою кислотою, що містить дисульфідні містки. 13. Застосування композиції за п. 12, де лікування являє собою лікування інфекцій, пов'язаних з хронічними гострими ранами, фолікулітом, або надінфекцій дерматологічних запальних захворювань. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9