Поліпептид для блокування індукованої колагеном адгезії тромбоцитів

1. Поліпетид, виділений із Нirudo medicinalis, з молекулярною масою близько 12000±1 кД, який має біологічну активність інгібітора індукованої колагеном адгезії тромбоцитів, та по всій своїй довжині принаймні на 80% ідентичний амінокислотній послідовності, наведеній в SEQ.ID.NО.2. 2. Поліпептид за п. 1 з ізоелектричною точкою, яка має рН 3,7±0,5. 3. Поліпептид за будь-яким із пп.1, 2, який має шість молекул цистеїну, здатних утворювати містки -S-S-. 4. Поліпептид за будь-яким з пп.1-3, який містить амінокислотні послідовності, наведені в SEQ.ID.NО.2. 5. Виділений полінуклеотид, що кодує поліпептид за будь-яким із пп.1-4. C2 2 (11) 1 3 74780 4 ючої колагеном адгезії тромбоцитів і, таким чином, кращою такової з використанням стандартного можуть використовуватися в терапії різних станів, гепарину. Нажаль, те ж саме можна сказати і про пов'язаних із закупорюванням судин та захворюінші прямодіючі антитромбіни, такі, як гірудин, гіваннями кровеносної системи. Накінець, цим прорулог і варфарин. Є усі підстави думати, що одна з теїном можливо покривати поверхні природних головних проблем полягає в тромбіні, синтез якого або штучних колагенів, запобігаючи їх здатності до у ході усунення тромбів різко підвищується [Rao злипання з клітинами не даючи останнім активуваΑ.Κ., Circulation, 1996, 94, 389-2395]. тися. Таким чином, в останній час особливу увагу При гемостазі або тромбозі тромбоцити злиприділяли гальмуванню процесу активації протропаються з позаклітинним матриксом пошкодженої мбіну, який контролюється фактором Ха. Першосудини та покривають поверхню постраждалої черговою задачею, є одержання інгібіторів цього ділянки. Перешкодження цьому процесу, який є фактора, однак перспективи їх використання в початковою стадією патогенезу тромбоза та закутерапії ще не вивчені. порювання артерій, повинно стати новим кроком Крім того, існує також тромболітичні методи. до вирішення проблеми попередження тромботиПри цьому основною задачею є одержання актичних захворювань. ватору плазміногену типа стафілокінази, стрептоКолаген вважається найбільш тромбогенним кінази, урокінази, активатора плазміногену тканеповерхневим компонентом. Встановлено, що він вого типу та активаторного комплексу активно стимулює адгезію тромбоцитів, а також анізоілірованої плазміногенстрептокінази. Ці тромагрегацію та вивільнення тромбоцитарних гранул, болітичні речовини суттєво різняться за часом, що призводить до притоку [Ruggeri,Z.M. та інш.; який їм необхідний для поновлення перфузії, одSeminars in Hematology, 1994, 31,229-39] до діляннак показник загальної смертності не залежить від ки, де проходить цей процес, додаткових тромбовикористання того чи іншого з них. Крім того, в цитів та, в результаті, утворення агрегатів або результаті їх введення бувають ускладнення, такі, тромба. Первинна взаємодія тромбоцитів з поверяк повторна оклюзія або довготривала кровотеча. хнею судини проходить при участі зв'язаного з Це можливо пояснити низькою специфічністю до колагеном фактора фон Віллебранда (ФфВ) та фібрину та коротким періодом напіврозпаду цих з специфічного рецептора ФфВ на тромбоцитах, єднань. В цей час з метою усунення недоліків, які глікопротеїнового комплексу Ib-V-IX. В той же час, все ще дають про себе знати при проведенні троАДФ, епінефрин та фактори згортання крові актимболітичної терапії, досліджуються різні способи вують тромбоцити, та в результаті підвищення використання і комбінації цілого ряду фібринолітитромбінової активності утворюється перехреснозчних діючих початків. Однак від цих досліджень не шитий фібриновий згусток. Цьому процесу сприяє чекають особливих результатів. агрегація тромбоцитів, опосередкована фібриноНещодавно з’явилася нова група пацієнтів з геном, який з'єднує клітини в рецепторі глікопротетакими проблемами, як гостра тромботична оклюїну ІIb/ІІІа (місточкові зв'язки). зія та пізній растеноз у результаті ангіопластики, Ця нормальна фізіологічна реакція стає доартеріоектимії, трансплантації артерії або імплансить небезпечною, якщо має місце в ході патологітації стента у стінку судини. Терапію можливо прочного процесу, коли тромбоцити злипаються з ководити, використовуючи антитромбоцитні, антитлагенами, які утворюються на ділянках ромботичні та тромболітичні речовини. Здатністю склеротичних пошкоджень [Van der Rest Μ. И др.; до прямої дії на активність тромбоцитів також має FASEB Journal, 1991,5, 2814-23] і починають агрецілий ряд інших речовин. Які є антагоністами АДФ, гуватися в оклюзії. В залежності від місцезнахотаких як тіклопдин або кальцієвий іонофор Адження і розміру оклюзії, вона може призвести до 23187 та асприн. Ці речовини пропонували застосерйозних ускладнень, таких, як інфаркт міокарду, совувати, або застосовували для попередження удар, запалення чи легенева емболія. чи мінімалізації процесу агрегації тромбоцитів. Сьогодні найбільш відомими лікарським засоНова речовина за даним винаходом, яке блокує бом, який використовують для уникнення тромбоадгезію тромбоцитів, також може допомогти униктичних захворювань, є безпосередньо діючий аннути агрегації останніх у ході хірургічних операцій. титромбін гепарин, блокуючий активність тромбіну Ще одна проблема виникає при взаємодії штуі, таким чином, запобігає утворенню фібринових чних поверхней з кров ю. Штучні матеріали мають тромбів. Гепарин широко використовується при тенденцію індукувати тромботичні процеси, актитаких захворюванях, як прогресуюча ангіна та госвуючи тромбоцити та/або індукуючи коагуляцію. трий інфаркт міокарду. Однак незважаючи на це, Це може призвести до порушення трансплантатів він також має ряд недоліків. Ось ці недоліки: його судин, серцевих клапанів, стентів, катетерів чи можливо вводити тільки внутрішньовенно, він має будь яких інших пристроїв або матеріалів, взаємознижену спорідненість зі зв'язаним згустком тромдіючих з кров’ю. Таким чином, протеїн за даним біном, може інактивуватися деякими плазматичвинаходом, завдяки його здатності утворювати ними протеїнами, інколи викликає тромбоцитопенетромбогенні поверхні, можливо також викориснію, біологічно гетерогенен та не діє без товувати, імобілізуючи його на вищеописаних макофактора, в якості якого використовують антиттеріалах та пристроях. Така обробка повинна посромбін-III. Таким чином, використання гепарину в лужити забезпеченню біологічної сумісності та клінічних умовах не дало бажаних результатів. резистентності таких матеріалів або пристроїв до Нещодавно був одержаний низькомолекулярутворення тромбів. ний гепарин, який можливо вводити підшкірно. При використанні антитромботичних препараОднак, подібна терапія виявилася не набагато тів потрібно враховувати цілий ряд обмежень. Та 5 74780 6 ким чином, виникає реальна потреба у розробці У Gan та ін. описаний ехристатин, який, на думку нових альтернативних методик та лікарських заавторів, є інгібітором, який зв'язується з рецептособів. ром фібриногена GP Iia/IIIb [J. Biol. Chem., 1988, Запоруки нових успіхів у лікуванні серцево263, 19827-32]. судинних захворювань можуть бути розкриті в даОднак, незважаючи на усі ці успіхи, існує одна ному винаході методи, направлені безпосередньо проблема, яка все ще потребує рішення. Міститьна блокування адгезії тромбоцитів, яка індукується ся вона у одержанні нових антикоагулянтів та анколагеном та/або ФфВ. титромбіну, які мали б підвищену здатність до інгіДеякі нові інгібітори, які блокують адгезію тробування утворення згустків, індукуємої ФфВ мбоцитів, представляють собою моноклональні активації тромбоцитів та активації ендотеліальнх антитіла проти ФфВ. Також було висловлено приклітин, могли б використовуватися у фармацевтипущення, що інгібітори глікопротеїну Ilb/IIIa з таким чній промисловості та вироблятися в кількостях, же успіхом можливо використовувати для інгібудозволяючих говорити про їх комерційну цінність. вання адгезії тромбоцитів. Оскільки ні один з описаних до цих пір протеїДеякі з цих інгібіторів, наприклад, моноклонанів не можна назвати ідеальним з точки зору теральний Ab c7E3, встигли пройти клінічні випробупевтичного використання, винахідники даного вивання, тоді, як інші, такі, як інгібітори KGD та находу вирішили використати нової методи RGDF, все ще є предметом вивчення. Специфічскринінгу, щоб з її допомогою знайти сполуки, які б ність більшості із цих нових інгібіторів ще не до дозволили прискорити вирішення цієї проблеми. кінця вивчена, таким чином, про побічні дії, якими В даному винаході описаний виділений з може супроводжуватися їх використання, доки Hirudo medicinalis інгібітор, який діє безпосередньо нічого не відомо. на взаємодію колагену з тромбоцитами і, таким Нові сполуки, які блокують індукуючу колагечином, інгібуючий активацію тромбоцитів та їх взаном адгезію тромбоцитів, не потребують тривалих ємодію на перщій стадії. пошуків. їх достатньо у природі, а саме, в організВ літературі немає жодного прикладу нового мах кровосисних. В літературі описано декілька антиадгезійного механізму або речовини, ідентиінгібіторів, виділених з природного матеріалу: профікованого методом скринінгу, який передбачає теїн з молекулярною масою 65кД під назвою калін, виключення з природнього джерела інгібіторів агвиділений із Hirudo medicinalis [(US 5,537,360, WO регації та літичних протеїнів. Саме ця метода ви92/07005) (Munro, R-та інш., Blood Coagulation and користовувалася при створенні даного винаходу. Fibrinolysis, 1991,2,179-184)], та протеїн з молекуНа перших порах в можливість ідентифікації нових лярною масою 16кД (LAPP) виділений із слинних інгібіторів адгезії не вірилося, оскільки відомо, що залоз п’явки Haementeria officinalis [US 5,324,715]. як мінімум шість тромбоцитарних поверхней глікоОбидва протеїни описані, як інгібітори агрегації, до протеінів приймають участь в адгезії з колагеном яких вони приліковані на основі результатів досліта, окрім того, декілька сполук тромбоцитарного джень індукуємої колагеном агрегації тромбоцитів походження, такі, як фактор фон Віллебранда, у статичних умовах. фібронектин та тромбоспондин, є непрямими меНезважаючи на доведену наявність активності діаторами адгезії колагена з тромбоцитами. in vitro, LAPP не діяв у ряді добре зарекомендуваТим не менше, усвідомлюючи неможливість вших себе доти моделей in vivo [(Schaffer L.W.та виключення усіх описаних або невідомих інгібіторів ін.; Arterioscler. Thromb., 1993,13,1593-1601) та ФфВ та сполук, які діють безпосередньо на рецепConnolly Τ.Μ.та ін.; Thromb. Haemostas., тори тромбоцитів, скринінг слини Hirudo medicinalis 1993,69,589)]. У м'якому кліщі Ornithodoros здійснювали саме цим методом. Результат переmoudata також міститься антитромбоцитний протевершив усі очікування - отримали новий протеїн, їн (маубатин), здатний блокувати стимулюючу коякий назвали саратином. Цей протеїн, здатний лагеном агрегацію тромбоцитів [Waxman, L. та ін.; блокувати адгезію тромбоцитів, можливо виділити J. Biol. Chem., 1993,268,5445-49]. Інший інгібітор із тканин та секрецій добре вивченої п’явки виду агрегації тромбоцитів, виділений із клопа, описаHirudo medicinalis. ний [Noeske-Jungblut С. Та ін. В WO 9309137. Даний винахід стосується активного поліпепSmith та ін.] виділили із зміїного яду протеїн з мотиду саратину, який виділений з п’явки Hirudo лекулярною масою 50кД та з слини клопа Triatoma medicinalis. Цей протеїн був виділений із слини pallidipennis з молекулярною масою 19кД. Було останньої методом, який представляє собою комвстановлено, що протеїн містить фактор, який бінацію діаліза з підвищеним тиском, як мінімум специфічно інгібує агрегацію тромбоцитів, яка іноднієї стадії хроматографії, наприклад, аніонообдукується колагеном. Протеїн з молекулярною мінної, та по меншій мірі одного етапу високорозмасою 19кД, названий палідіпіном, інгібує опоседільної хроматографії зі зворотною фазою (ЖХВР редковану колагеном агрегацію тромбоцитів у з ОФ). Діаліз під тиском в даному випадку був проплазмі. Інгібування агрегації, стимульованої іншисто необхідний - підвищена концентрація слини ми ефекторами (АДФ, тромбіном, імітатором тродопомогла виключити дуже суттєвих втрат біологімбоксана А2 U46619, складним форболовим ефічно активного саратину. Виділений саратин активром), не виявлено. Палідипін не діяв на адгезію но зв'язується з декількома колагенами та, в залетромбоцтів з колагеном, однак при цьому інгібував жності від дози, в тому чи іншому ступені блокує вивільнення з тромбоцитів АТФ. Він зворотно взаадгезію тромбоцитів з колагеном. ємодіє з тромбоцитами не перешкоджаючи при З метою оптимізації каскаду скринінгу, методи цьому колагену. Точнй механізм дії та терапевтичякі малися були модифіковані з чітким розмежуна цінність цього протеїну в даний час вивчається. ванням адгезивності тромбоцитів та їх тенденції 7 74780 8 до агрегації. Такі модифікації включають оцінку ної експресії в клітинах, наприклад, дріжджових здатності тромбоцитів уповільнювати чи зупиняти клітинах, клітинах комах. Клітинах нирки хом'ячка проходження потоку скрізь волокна, визначення та таких Е.соlі, трансформованих відповідними ступеня участі тромбоцитів в утворенні сгустку in векторами. Яким чином зв'язати ці процеси, поvivo, оцінку адгезивності зі скляною дріб'ю чи фільвинно бути відомо спеціалісту у даній області. Чутрування цільної крові та визначення ступеня злидова експресія мала місце, коли в ролі хазяїна пання тромбоцитів обробленою антикоагулянтом була Е.соlі. В цьому випадку периплазматична плазми з підвищеною концентрацією тромбоцитів експресія ініціювалася шляхом інерції слідуючої з фільтрами, які складаються з скляних волокон чи послідовності реlВ. Одержанню продукта (біля колагену, у регульованому градієнті тиску. 5мг/л) з Е.соlі передував осмоліз та центрифугуПротеїн (під назвою саратин) характеризуєтьвання. Паралельно проводився експеримент над ся амінокислотними послідовностями, приведениSaccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) (>10мг/л ми в послідовності (SEQ. ID. NO. 2), та складаєтькультуральної рідини) з вектором, адаптованим до ся з 103 амінокислот з теоретичною відносною дріжджів. Речовину із секреції виділяли шляхом молекулярною масою, яка становить біля 12068 центрифугування. Очистку проводили методом дальтонів ±1КД. Протеїн має унікальну первинну поперечноточної фільтрації та іонообмінної хроструктуру, яка не має помітної схожості з іншими матографії. При використанні клітин COS або СНО послідовностями, описаними раніше. Протеїн місекспресія продукту становила біля 750нг/мл. Ретить великі кількості аспарагінової та глутамінової зультати електрофоретичного та хроматографічкислот, завдяки чому його молекула відрізняється ного аналізів свідчили про чистоту та гомогенність низькою ізоелектричною точкою (pH 3,7±0,5, виочищеного матеріалу, а при секвенуванні амінокизначена методом електрофореза поліакриламідслоти та визначенні її молекулярної маси, змогли ном гелі з ізоелектричним фокусуванням). переконатися в його ідентичності до одержаного із Провівши електрофорез у поліакриламідному слини саратину. Крім того, даний винахід відногелі додецилсульфатом натрію попередньо відноситься до способів очистки активного протеїну із вленого протеїну, виявили різкі зміни його рухомослини п’явки та оцінки рівня його антитромбоцитасті, що свідчить про посттрансляційні модифікації. рної активності за допомогою статичного та динаВ результаті секвенування поліпептиду отримали мічного аналізів, а також застосуванню цих спосошість молекул цистеїну, які і могли складати постбів для виділення рекомбінантного протеїну. трансляційні модифікації протеїну. Методом елекМетоди одержання саратину описані в Приктронно-променевої мас-спектрометрії була визналадах 6, 7, 8 та 13. Слід відмітити, що способи чена фактична молекулярна маса саратину, яка експресії цими прикладами не обмежуються. Надорівнювала 12061, що вказувало на участь в приклад, експресувати саратин також можливо в утворенні вторинної структури нативної форми трансгенних мишах або інших організмах, у тому протеїну від однієї до трьох дисульфідних зв'язків. числі ссавців. Інгібітор адгезії за даним винаходом є новим, До протеїнів за даним винаходом також віднооскільки відрізняється від відомих, виділених із сяться варіації, які зберігають активність розкритих пиявок інгібіторів агрегації, зокрема, калина або тут послідовностей, у тому числі фрагменти або LAPP, молекулярною масою, ізоелектричною точсубодиниці, природні варіації, алельні варіації, кою, амінокислотною послідовністю та біологічною випадкові штучні мутанти та направлені варіації активністю. послідовностей, як, наприклад, одержані в резульКрім того, даний винахід відноситься до видітаті нарощування, які зберігають вказану активленої ДНК, яка включає полінуклеотид, кодуючий ність. Фрагментом або субодиницею може бути одержаний із п’явки інгібітор адгезії тромбоцитів з будь яка ділянка послідовності, яка містить менше амінокислотною послідовністю, подібною привеамінокислот, ніж повний протеїн, наприклад, неподеній для протеїну. Нуклеотидна послідовність, вні послідовності, які не містять N- та/або Сяка представляє собою клон кДНК, приведена в кінцевих ділянок протеїну. SEQ. ID. NO. 1. Положення 1-63 даної нуклеотидКрім того, даний винахід відноситься до гібриної послідовності - це припущена лідуюча послідодних протеїнів, таких, як злиті протеїни або протевність із 21 амінокислоти, а положення 64-372 місїни, які утворюються в результаті експресії декільтить відкриту рамку зчитування, кодуючу кох генів у межі вектора експресії, які можуть поліпептид, який складається із 103 амінокислотвключати поліпептид, маючий специфічну активних залишків, та амінокислотну послідовність, ність протеїну за даним винаходом, зв'язаний пепприведену для дозрілого протеїну в SEQ. ID. тидними зв'язками з другим поліпептидом. Крім NO. 2. того, даний винахід відноситься до інших варіацій Даний винахід також стосується рекомбінантпротеїнів за даним винаходом, головним чином, до них векторів, які включають синтетичний ген, кобудь яких варіацій, які відрізняються від виділенодуючий одержаний із п’явки інгібітор адгезії тромго протеїна виключно консервативними замінами боцитів за даним винаходом, та клітину-хазяїн, яка амінокислот. Останні описані у [Taylor та ін., J. Mol. містить рекомбінантні вектори. В основу методів Biol., 1986, 188, 233]. відбору та виділення експресованих протеїнів буДаний винахід також відноситься до способів ли покладені методи мітки чи адаптувалися такі зі застосування протеїнів для блокування або уповісхеми очистки природного саратину. Те, яким чильнення активації тромбоцитів шляхом інгібування ном здійснювався відбір рекомбінантного протеїну взаємодії колагену з тромбоцитами. Протеїн можз надосадової рідини або осаду, визначається ливо застосовувати для попередження, профілаксхемою його позаклітинної або внутрішньоклітинтики, терапії та лікування тромботичних захворю 9 74780 10 вань. Механізм дії протеїну за даним винаходом цевтично прийнятні носії, розчинники, адьюванти відрізняється від таких раніше описаних протеїнів, та сполучні, типові для парентерального введенякі діють на різні тромбоцитарні поверхневі протеня. їни. Він міцно зв'язується з поверхнею колагена та, Під терміном "парентеральний" розуміється в одному з варіантів. Покриває її специфічні ділянпідшкірна, внутрішньовенна, внутрисуглобні та ки, таким чином, позбавляючи їх можливості взаєвнутритрахеальні ін’єкції, а також вливання. Крім модії з тромбоцитами та зв'язування останніх. Петого, прийнятні інші форми застосування, такі як ревага цього варіанта нового механізму дії оральна та місцева. Композиції та комбіновані міститься в повному збереженні функціональної препарати для парентерального використання в активності тромбоцитів, що дозволяє навіть повнінайбільш прийнятному варіанти і вводять внутрішстю уникнути кровотечі після введення протеїну. ньовенно у формі болюса чи в якості постійних Цей протеїн також можливо застосовувати ,що фузій, користуючись при цьому відомими методадуже суттєво, для обробки різних поверхонь, тим ми. самим надаючи їм здатність відштовхувати тромТаблетки та капсули, призначені для оральнобоцити, що дозволяє говорити про створення суміго введення, містять звичайні ексципієнти, такі, як сних з кров'ю пристроїв. зв'язуючи речовини, наповнювачі, розчинники, Як вказували вище, поліпептиди за даним виагенти таблетування, змащувальні матеріали, які находом можливо застосовувати як фармацевтичсприяють вивільненню діючого початку, та поверно ефективні сполуки в складі фармацевтичних хнево-активної речовини. За допомогою широко композицій та комбінованих препаратів. відомих у даній області методів таблетки можливо Фармацевтичні композиції за даним винахопокривати оболонкою. дом можуть містити додаткові активні компоненти, Рідкі препарати для орального використання наприклад, аспірин. Антикоагулянти, такі, як гіруможуть мати форму водних чи олійних суспензій, дин чи гепарин, або тромболітичні речовини, такі, розчинів, емульсій, сиропів чи еліксирів або випусяк активатор плазміногена чи стрептокіназа. катися у якості сухого продукту, який перед викоЗ будь якою нетоксичною, органічною чи неорристанням слід довести до необхідної консистенганічною кислотою новий поліпептид за даним ції, додавши воду чи інше зв'язуюче. Подібні рідкі винаходом може утворювати фармацевтично припрепарати можуть містити домішки, такі, як суйнятні солі. Як праймери неорганічних кислот моспендуючі агенти, емульгатори, неводні зв'язуючі жна привести соляну, бромистоводневу, сірчану та антикоагулянти. чи фосфорну кислоту, а також кислі солі металів, Препарати для місцевого використання мотакі, як вторинний кислий фосфат натрію та кисжуть мати форму водних чи олійних суспензій, лий сірчанокислий калій. Приклади органічних кирозчинів, емульсій, гелів чи, що є переважним, слот - моно-, ди- та трикарбонові кислоти, такі, як емульсійних мазей. оцтова, гліколієва, молочна. Піровиноградна, маРазові дози за даним винаходом можуть склалонова. Янтарна, глутарова, фумарова, яблучна, дати добові норми протеїну за даним винаходом винна, лимонна, аскорбінова, малеїнова, оксимачи його дольні одиниці, які складають необхідну леінова, бензойна, оксибензойна, фенілоцтова, дозу. Яке дозування буде оптимальним для того корична, саліцилова кислота та сульфокислоти, чи іншого пацієнта(ссавець, у тому числі людина), такі, як метасульфонова кислота. До солей карбозалежить від цілого раду факторів, таких, як актиксикінцевих амінокислотних залишків відносяться вність діючої речовини, вік, маса тіла, загальний солі нетоксичної карбонової кислоти, одержані з стан здоров'я, стать, дієта, час та спосіб введення, використанням будь яких підходящих неорганічних швидкість введення, мета використання препарачи органічних основ. Ці солі включають, наприту, тобто чи призначений він для терапії чи профіклад, солі лужних металів, таких, як кальцій та лактичного лікування, характер тромботичного магній, легких металів групи 111А, у тому числі захворювання, а також активність діючого початку, алюмінію, а також солі органічних первинних, втояке може діяти у якості антитромбоцитного засобу ринних та третинних амінів, таких, як триалкіламічи антикоагулянту. ни, включаючи триетиламін, прокаін, дибензилаТаким чином, фармацевтично ефективна домін, 1-етиленамін, Ν,Ν'-дибензилетилендіамін, бова доза пептидів за даним винаходом в комподигідроабиетиламін та N-алкілпиперидин. зиціях та комбінованих препаратах, які вводяться У контексті цього опису термін "фармацевтичв організм пацієнта (in vivo) у якості антитромботино прийнятний носій" відноситься до нетоксичного чних речовин, складають біля 0,01-100мг/кг, перетвердого чи рідкого наповнювача, розчинник або важно від 0,1 до 10мг/кг від ваги тіла. В залежності речовина, який утворює оболонку капсули, який не від форми застосування одна доза може містити реагує з активною сполукою та не може зашкодити від 0,5 до 10мг інгібітора тромбіну. Щоб досягти пацієнту. Придатні, в даному варіанті рідкі носії, антизгортаючої дії у екстракорпоральній крові, в широко відомі у даній області. Такими носіями ній повинно бути 0,2-150мг/л, переважно 1-20мг/л можуть служити стерильна вода, сіль, водна декпептидів за даним винаходом. строза, цукрові розчини, етанол, гліколі та олії, які Метою даного винаходу також є розробка одержані в результаті переробки нафти, а також вживляємого чи екстракорпорального медичного такі тваринного чи рослинного походження, чи пристрою для використання на ділянках, де він синтетичні, наприклад, арахісова олія, соєва олія буде вступати у взаємодію з циркулюючими у орта мінеральна олія. ганізмі рідинами, поверхня якого шляхом її покритСполуки за даним винаходом можливо вводитя імобілізованим поліпептидом, приведеним вище ти в разових дозах, які містять нетоксичні фармата в пунктах формули винаходу, робиться резис 11 74780 12 тентною до утворення тромбів. Поліпептид за даФіг.4 ним винаходом імобілізується на медичному приБакуловірусна донорська плазміда саратину строї, тим самим забезпечуючи біологічну суміс(Приклад 8). ність поверхні останнього та її резистентність до Фіг.5 утворення тромбів. Поверхні подібних пристроїв Цільна кров введена у взаємодію з поверхнею іноді мають властивості, як правило, властивості штучного колагену з візуалізацією адгезії тромбоіндукування агрегації тромбоцитів, через що виницитів шляхом фарбування. Саратин застосовувакають серйозні проблеми з їх використанням на ли у якості інгібітора (протеїн #607) (Приклад 9). ділянках, які обумовлюють взаємодію з кров'ю чи Фіг.6 іншими присутніми в організмі рідинами. У якості Інгібування адгезії тромбоцитів на покривних прикладів таких пристроїв, як правило, вироблескельцях, покритих колагеном типу III, в умовах них з пластмас та синтетичних волокон, можливо зрушеного потоку. Порівняння інгібуючої дії слини привести протези, штучні органи. Лінзи для очей. та саратину (Приклад 9). Сутури, штучні сегменти судин, катетери, діалізаФіг.7 тори. Трубки та судини для транспортування крові. Інгібування саратином адгезії тромбоцитів з Помутніння задньої капсули кришталика покривними скельцями, покритими колагеном типу (ПЗКК) є ускладненням після екстракції катаракти, III, в умовах зрушеного потоку. Активність саратизапобігти якому не вдається навіть за допомогою ну залежить від дозування (Приклад 9). сучасних хірургічних методик та лінз, які викорисФіг.8 товуються в ході цієї операції. ПЗКК виникає внаВектор експресії саратину у дріжджах (Прикслідок проліферації та міграції епітеліальних клілад 13). тин кришталика у його задню капсулу, що знижує Приклад 1 гостроту зору. З метою полегшення ПЗКК пропоСкринінг інгібіторів адгезії нувалося використовувати методи фізіотерапії та Адгезія тромбоцитів з колагеном була прийняхімічні модифіковані лінзи. Так, використовувалися та у якості критерію, по якому здійснювали скригепаринові покриття для лінз чи гепаринові глазні нінг компонентів слини. Крім того, щоб виключити краплі, з чого можна зробити висновок, що ПЗКК виявлення останніми функціональних властивосмає тромбогенне походження. тей, які неможливо віднести на рахунок інгібітора Було встановлено, що саратин набагато переадгезії, були проведені чотири додаткових досліважає гепарин з точки зору попередження та блоди, які ставили за мету оцінку дії різних антитромкування тромбогенності. Таким чином, ще однією ботичних засобів: аналіз AZOCOLL, оцінка активвідрізняючою ознакою даного винаходу є одерності амідази, випробування зв'язування за участю жання покриття, яке містить саратин, яке дозволифактору фон Віллебранда та аналіз агрегації троло б знизити тромбогенність матеріалу, який викомбоцитів. Всі ці випробування є стандартними, ристовується у заломлюючих імплантантах, які однак аналіз адгезії тромбоцитів був нами модифіхірургічним шляхом вживлюються в передню чи кований. Якщо коротше, модифікація складається задню камеру. Це нове покриття допомогає уникз наступного: колагеном Horm (фірма Nycomed) нути проблем, які виникають внаслідок стимульопокривали 96-чарункові планшети (фірма Nunc) ваного росту клітин. У комбінації з іншими лікарсь(при цьому використовували підкислений колаген кими речовинами, наприклад, які викликають в концентрації 20мкг/мл та планшети інкубували загибель клітин, саратинове покриття дає можлипротягом ночі) Тричі промивши планшети сополівість повністю уникнути замутніння задньої капсумером стиролу та бутадиену, колаген, який залили кришталика. шився на дні чарунок, блокували 1%-вим сировотБільш докладно фігури роз'яснюються в прикковим альбуміном великої рогатої худоби. Потім ладах 1-10. додавали свіжі тромбоцити, виділені з цитрониліФіг.1 рованої людської крові, та, паралельно з ними, Розділення компонентів слини. Елюювання фракції, які отримали на окремих стадіях колонкосаратину позначено вої хроматографії. При необхідності, перед викоа) профіль розділення слини після аніонобміну ристанням тромбоцити піддавали інкубації в третз ДЕАЕ. Фракції саратину збирали у піку 3 (Прикбутилстиролі в присутності іонів двохвалентного лад 2). оксиду магнію. Вихідний матеріал слини з загальб) повторне хроматографування об'єднаних ною концентрацією протеїну, стабілізованої на фракцій на Mono Q HR5/5. Зразки збирали у відмітці 200мкг/мл, використовувався як еталон останній частині головного піку, як показано риспорівняння інгібуючої дії. Як виявилося, з точки кою (Приклад 2). зору активності інгібітори тромбоцитів високочутв) остання стадія напівпрепаративної аналітиливі до змін в буфері і підвищених концентрацій чної ЖХВР з ОФ саратин-позитивних фракцій, зібсолі. Всі зразки піддавали обробці методом іоноораних з Mono Q HR5/5 (Прикладі). Активний сарабмінної хроматографії, а тому проведення безпотин відбирали у головному піку (пік 3). середнього дослідження фракцій в процесі аналізу Фіг.2 інгібування виявилося надто обтяжливим і не могЕлектрофорез в поліакриламідному гелі додело дати точних результатів. По цій причині всі зрацилсульфатом натрію фракцій, зібраних на стадії зки, які були піддані дослідженню, пройшли стадію ЖХВР з ОФ. Позитивні фракції саратину відмічені концентрування (на обладнанні Centricon), що до(Приклади2 та 3). зволило зменшити іонну силу і в той же час стабіФіг.3 лізувати концентрацію перед проведенням виміВектор експресії саратину в Е. соlі (Приклад 7). рювань. 13 74780 14 Приклад 2 Mono Q і RP18, приведені на фігурах 1а, б, в. РозОчистка природного інгібітора ділення в системі ВіоСоrе масштабували за допоВ даному винаході використовувалася слина, могою методів рідинної хроматографії з програмувиділена з R.medicinaiis. Відомо, що вона містить ванням потоку. Відповідно інструкціям виробника, цілий ряд біологічно активних протеїнів, таких, як від оптимізованих робочих умов, за винятком стагірудин, інгібітори еластази, колагенази та інгібітодії з використанням колонки RP18, на якій, щоб ри агрегатації тромбоцитів, такі, як калін [(Munro. мінімізувати втрати очищеного матеріалу, продовR.U, Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1991, 2, жували працювати в режимі, передбаченому для 179-184) LAPP (Schaffer, L.W., Arterioscler. Tromb., методики ВіоСоrе, переходили безпосередньо до 1993, 13, 1593-1601)]. Ці протеїни добре вивчені, напівпрепаратного розділення. Відбір очищеного однак про більшу частину приблизно восьмидесяпротеїна, одержаного на заключній стадії хроматоти протеїнів, які можна виявити методом електрографії з оберненою фазою, здійснювали методом фореза в поліакриламідному гелі додецилсульфашвидкісного вакуумного центрифугування. Зразки, том натрію, все ще нічого не відомо. При створенні зібрані на згаданій стадії, об'єднували і аналізуваданого винаходу, застосовуючи методику, описану ли за допомогою електрофореза в поліакриламідв прикладі 1, проводили скринінг фракціонованої ному гелі додецилсульфатом натрію (фігура 2). слини на предмет знаходження нових протеїнів, Потім зразки повторно суспендували в сополімері безпосередньо блокуючих взаємодію тромбоцитів стиролу та бутадієну, післячого їх використовуваз колагеном. ли для проведення аналітичних та функціональних Основною задачею виявилося виділення інгіаналізів. Як правило, вихід саратину з необроблебітора адгезії від вихідного матеріалу слини, що ної слини складав близько 750мкг/л. залежало, головним чином, від того, ідо на першій Приклад 3 стадії хроматографічного розділення інгібітор неБіохімічне дослідження оборотно позбувався майже всієї своєї активності. Як описано в прикладі 1, в результаті очистки Ситуація ніяк не покращилася і після введення саратину був одержаний в основному чистий продобавок (Munro, R.), таких, як 12%-ний етанол і теїн з середньою молекулярною масою близько двохвалентні катіони. В той же час, висока концен21кД (визначалася в відновлювальних умовах метрація солі в слині при низькій загальній конценттодом електрофореза в поліакриламідному гелі рації протеїну (190-250мкг/мл) потребувала попедодецилсульфатом натрію) (Фігура 2). Повну аміреднього концентрування або заміни буфера. нокислотну послідовність одержали шляхом пряТаким чином, було випробувано декілька методик мого секвенування перших 48 амінокислот очищезбагачення, концентрування або заміни буфера. ного протеїну. Ця послідовність була завершена Традиційний діаліз призводить до повної втрати шляхом секвенування декількох внутрішніх пептиактивності. Більша частина стандартних методик, дів, утворених в результаті ферментативного розтаких, як іонообмінна або афінна хроматографія і щеплення. Повна послідовність протеїну приведерозділення молекул по розміру (втрата не залежана в SEQ. ID. NO. 2 ла від полімеру, який містився в колонці), не дали Протеїн складається з 103 амінокислот з розрезультатів, не дивлячись на застосування різнорахунковою молекулярною масою 12067,9 та таманітних способів розділення і використання цілокою фактичною 12061,9 (визначена методом елекго ряду буферів та добавок. Неочікувано авторами тронно-променевою мас-спектрометрії). Із такої даного винаходу було виявлено, що шляхом діалірізниці між теоретичною та виміряною молекулярзу з підвищеним тиском 500мл слини можна досяними масами можна заключити, що в утворенні гнути підвищення концентрації в ній протеїнів мітків S-S приймають участь всі шість ідентифіко(приблизно в 30-40 разів) і в той же час позбавиваних в саратині цистеїнів. Це підтверджується і тися від небажаних компонентів буфера. Також результатами хроматографічного аналізу протеїну було виявлено, що оброблений таким чином вихіметодом електрофорезу в поліакриламідному гелі дний матеріал слини ставав ідеальним для проведодецилсульфатом натрію як у відновлювальних дення з ним подальшої очистки. Таким чином, відумовах, так і в відсутності таких, коли спостерігабір біологічно активних антиадгезійних ється різка зміна його рухливості. Крім того, протекомпонентів слини переставав бути проблемою. їн багатий на кислі амінокислоти, такі, як Glu та Так як катіонообмінники або колонки для афінної Asp. Електрофорез в поліакриламідному гелі з хроматографії не дозволяли досягнути бажаної ізоелектричним фокусуванням (фірма Immobiline) ступені очистки, перейшли до використання слабдозволив визначити ізоелектричну точку, яка дорікого аніонобмінника, такого, як DEAE-Fastflow або внює pH 3,7 0,5. В порівняльному аналізі як етаEMD-DEAE-Fractogel. Були опробувані 12%-ний нол ми використовували очищений протеїн п’явки, етанол та двохвалентні катіони, але як з викориспорівнючи його фізико-хімічні властивості з такими танням цих добавок, так і без них результати заж рекомбінантного саратину, одержаного із екслишалися незмінними. Як на оптимальному варіапресуючих його бакуловірусу, дріжджів та E.coli. нті хроматографічного розділення зупинилися на Властивості всіх трьох протеїнів виявилися ідентинаступній послідовності: колонка DEAE, колонка чними. Mono Q і на завершення колонка RP18 для хромаЗа допомогою електрофорезу в поліакриламітографії з оберненою фазою. Умови хроматоградному гелі додецилсульфатом натрію з візуалізафічного розділення оптимізували, застосовуючи цією шляхом окрашення методом Кумассі (Фігура хроматографічну систему ВіоСоrе з аналітичними 2) або посрібнення та/або вестерн-блоттингу було колонками фірми Pharmacia. Градієнти, що виковстановлено, що протеїн гомогенний ті не глікозиристовувалися для роботи на колонках DEAE, лований. 15 74780 16 Приклад 4 амінокислотної послідовності. Ці зміни навряд чи Одержання МРНК та синтез кДНК могли бути наслідком ПЦР, так як одні і ті ж модиРНК одержували з медицинської п’явки Hirudo фікації були виявлені в різних клонах.mеdісіnаlіs з використанням тіоцианату гуанидинія. Ген ORF саратину має довжину, яка складає МРНК з повної РНК виділяли за допомогою набору 372 комплементарні пари основ, і містить сигналь"Oligotex mRNA kit"(фірма QIAGEN). ну послідовність, яка містить 21 амінокислоту, і кДНК синтезували за допомогою набору послідовність, яка кодує зрілий протеїн, в склад "Marathon cDNA Amplification kit (фірма якої входить 103 амінокислоти. Було виявлено, що CLONTECH). Потім послідовність ДНК, яка кодує амінокислотна послідовність, яка виведена із клосаратин, дотримуючись інструкцій виробника, амну продукту ПЦР, ідентична послідовності, одерпліфікували олігонуклеотидними праймерами ПЦР жаної в результаті секвенування природного про(полімеразна ланцюгова реакція). По завершенні теїну, виділеного із слини. синтеза кДНК з обома її кінцями лігірували універПриклад 6 сальний адаптер. Послідовність універсального Експресія в клітинах COS і виявлення експреадаптера та універсальних праймерів АРІ або АР2 сованого протеїну вибирали у відповідності з інструкціями виробника З метою експресії гену саратину в клітинах згаданого набору. ссавців, таких, як COS або СНО, його за допомоПриклад 5 гою Xhol+Xbal вирізали із вектора pCR Script SK(+) Ампліфікація та виділення гена саратину мета клонували в вектор експресії pCL-neo (фірма тодом ПЦР Promega) клітини ссавця. Останній був вибраний, Вироджені праймери синтезували на базі найтак як він містить промотори Т7 та Т3, що дозвоближчого N-кінця зворотно трансльованої амінокиляє проводити експресію in vitro, та ген стійкості до слотної послідовності саратину. неоміцину, необхідний для відбору G418, а також Ці праймери 01 та 02 призначені для специфіможе застосовуватися як в клітинах COS, так і чної гібридизації з 5'-кінцемкДНК саратину. В осСНО. нову конструкції праймерів була покладена звороКрім сигнальної послідовності і послідовності тно трансльована амінокислотна послідовність зрілого протеїну, на 5'-кінці інсерція містить послівосьми N-кінцевих амінокислот очищеного протеїдовність Κοz., яка дозволяє провести ефективну ну саратину, які були визначені експериментально. трансляцію, а на 3'-кінці (С-кінець) мітку his Праймери 01 та 02 синтезували с метою стабіліMRGS(H)g для виявлення експресії та відмічання зації виродженості на як можна більш низькому очистки та концентрування протеїну. Плазмідну рівні та подовження праймерів на критичному 3'конструкцію назвали pNC-31. кінці на 8 комплементарних пар основ, ідеально ДНК плазміди pNC-31 використовували для погоджених з послідовністю кДНК саратину, що трансфекції клітин COS. Клітини COS, які знахозабезпечить ефективну та специфічну ампліфікадилися в фазі логарифмічного росту, двічі промицію матричної кДНК. В виродженому алфавіті ДНК вали сополімером стиролу та бутадієну та розчи(код ИЮПАК) R=A або G, М=А або С, Y=C або Т, няли в останньому в концентрації 1*107/мл. Потім та N=A або G або С або Т. в 0,7-0,8мл суспензії COS додавали 12мкг плазміПЦР 3'-RACE проводили з використанням судної ДНК (менше 50мкл в Н2О або буфері ТЕ) та міші праймерів 01 та 02 з одним універсальним перемішували в кюветі для електропортаціі. Елекпраймером, АР1 або АР2. Продукті ПЦР клонуватропортацію здійснювали при 1,9кВ, 25 мікрофали в клонуючому векторі ТА pCR2.1 або векторі рад протягом 10 хвилин. Потім клітини переносили pCR Script SK (+) та секвенували. Секвенувавши на 90-міліметрову пластину. Додавши 8мл середекілька фрагментів ПЦР 3'-RACE, одержали посдовища DMEM, яке містило 10% FCS та антибіотилідовність гену саратину (за винятком нетранльоки, клітинам давали рости протягом трьох днів. ванної області 5', сигнальної пептидної послідовНасадочні рідини та клітини використовувалися ності та послідовності, кодуючої перші 8 для подальшого виділення та виявлення протеїну. амінокислот N-кінця зрілого протеїну). Щоб одерЕкспресованний протеїн виявляли методом весжати інформацію, яка містилася в цих недостаютерн-блотингу за допомогою антитіла проти чих послідовностях кДНК саратину, був проведеMRGS(H)6- Для очистки використовували комплений експеримент з 5'-RACE, в ході якого ксони, такі, як НТУ або імідооцтова кислота, імобівикористовували ген-специфічний праймер з селізовані на матриці колонки і модифіковані іонами рединикДНК саратину та один з універсальних металів, такими, як Co, Ni або Сu. праймерів АР1 або АР2. Секвенувавши декілька Приклад 7 утворених в результаті фрагментів ПЦР 5'-RACE, Конструювання вектора експрессії в E.соlі та одержали повну послідовність гену саратину. В експресія результаті ампліфікації гену саратину шляхом Так як в тих або інших біологічних системах ПЦР з використанням ген-специфічних, невировикористовуються різні кодони, в E.coli деякі з них джених праймерів як з 3'-, так и з 5'-кінців гену сазустрічаються дуже рідко. Щоб експресувати опратину одержали повний ген саратину. тимізовану версію в E.соlі, користуючись стандарВ секвенуванні ДНК приймало участь більше тними методиками, ген спочатку слід привести у 15 різних клонів продуктів ПЦР. При цьому було відповідність з кодоном E.соlі. виявлено тільки одна суттєва зміна амінокислотної Експресію в E.соlі здійснювали за допомогою послідовності в єдиному клоні. Вірогідно, що ця модифікованої версії плазміди pASK75, яка несе зміна була викликана ПЦР. Крім того, було виявпромоторну область tet [Skerra, A.Ta інш., лено ще п'ять змін, які ніяк не подіяли на структуру Gene,1994, 151, 131-135]. Модифікація, якщо не 17 74780 18 вдаватися в подробиці, була здійснена шляхом кров людини пропускають через прямоточну камеклонування нового лінкера між сайтами Xbal та ру, оцінюючи адгезійну активність тромбоцитів у Hind III (Фігура 3). Новий лінкер містить лідуючу відношенні колагена на покритих останнім накривпослідовність оmрА, другий сайт багатократного них склах в умовах потоку зсуву (моделюючи умоклонування та мітку 6xHis замість strep. ви, при яких проходить перфузія в артерії in vivo), Щоб сконструювати вектор експресії саратину так як це описано в Sakariassen та інш. [Mette. методом ПЦР було необхідно ввести сайти рестEnz., 1988, 169, 37-70]. Колаген із плаценти людирикції 5'Сlа і 3 Есо47111. ни, тип III (фірма Sigma), розчинений в 50ммоль/л Для цього використовували 5'-праймер 03 та оцтової кислоти, за допомогою ретушерного аеро3'-праймер 04. Продукт ПЦР спочатку клонували в гарафа розпилювали на чисті накривні скельця векторну систему PCR II(фірма Invitrogen) та сек(18мм*18мм). Останні протягом ночі при 4°С вивенували. тримували в сополімері стиролу та бутадієну. На другій стадії ген саратину, використовуючи Перед використанням свіжу цілісну кров люсайти ресрикціі 5'Сlаl та 3'Hind III, клонували в модини (як антикоагулянт вводили низькомолекулярдифікований вектор pASK75. ний гепарин, 20од./мл) нагрівали при 37°С протяПо закінченні експресії, упевнившись в наявгом 10 хвилин. Препарати із протеїнів згідно ності рекомбінантного саратину активності, в ході даному винаходу за допомогою піпетки наносили другої ПЦР видаляли мітку His та безпосередньо з на накривні скельця (30мкл на накривне скло) та, лідуючою послідовністю omp A зливали стартовий перед поміщенням в перфузійнукамеру, інкубувакодон гену саратину. 5'-праймер 05 та 3'-праймер ли протягом 10 хвилин в камері з вологим середо06, використані в цій ПЦР, приведені в переліку вищем при кімнатній температурі. Потім кров пропослідовностей. пускали через перфузійну камеру (при 37°С Як приклад експресії в E.соlі можна привести протягом 5 хвилин зі швидкістю зсуву 1300с-1). трансформування вектора експресії pRG72 (Фігура Потім накривні скельця виймали, промивали 3), який містить структурний ген саратину, злитий сополімером стирола та бутадієна, протягом 30 слідуючою послідовністю оmрА, в компетентні кліхвилин закріплювали в 0,25%-ному глутеровому тини W3110. По досягненню останніми середини альдегіді та закрашували методом May-Grunwald логарифмічного росту їх збуджували. Через 1 гоGiemsa (Фігура 9). По необробленній контрольній дину можна було легко виявити рекомбінантний поверхні окрашені тромбоцити розповсюджувалисаратин. ся на дуже велику площу, тоді як на порівняльній Приклад 8 поверхні, попередньо обробленій саратином, споКонструювання бакуловірусної донорської стерігалось різке зниження (на 80 %) здатності плазміди та експресія останніх до зв'язування. Кількісний аналіз адгезійЗ метою експресії саратину в бакуловірусній ності тромбоцитів проводили за допомогою оптичсистемі експресії використовували систему Васного мікроскопу (Фігура 5, 1000-кратне збільшення), підключеного до аналізатора зображення з То-Вас фірми Gibco Life Technologies. Щоб одеуправлінням від ЕОМ (фірма Leica). Результати ржати систему відбору, з геном саратину зливали виражали в проценті агрегатів тромбоцитів від лідуючу послідовність мелитину медоносної бджопокритої останніми поверхні. ли, а з метою введення сайтів рестрикції 5' ВаmНІ Інгібуючу дію слини порівнювали з такою ж та 3' Крnl провели єдину ПЦР з використанням 5'очищеного протеїну (Фігура 6). Інгібування необпраймера 07 та 3'-праймера 08. робленою слиною (№616) адгезії тромбоцитів на Відповідний продукт ПЦР клонували в вектор накривних скельцях, покритих колагеном типу III, PCR II ( фірма Invitrogen) та секвенували. Продукт при швидкості зсуву 1300с-1 в порівнянні з контрозливання мелитину с саратином за допомогою лем склало близько 48%. При використанні очисайтів рестрикції 5'ВаmНІ та 3'Крnl клонували в щеного протеїну (№607, саратин) в нормалізовавектор pFastBac, одержуючи рТDІ3 (Фігура 4). Фоних концентраціях процес відкладення рмування рекомбінантних бакуловірусів та експретромбоцитів блокувався приблизно на 81%. Інгісія саратину здійснювались з використанням сисбуюча дія саратину підвищується із збільшенням теми еспресії Вас-То-Вас. Донорську плазміду дозування і підвищення концентрацій протеїну pTD13 трансформували в компетентні клітини (Фігура 7). DHIOBac, які містили бакмід з сайтом-мішенню Приклад 10 mini-attTn7 та плазміду-помічник. В присутності Імунізація і антитіла протеїнів пранспозиції із плазміди-помічника елеОдержавши першу партію природного протеїмент mini-Tn7 на донорській плазміді транспозувану високої чистоти, приступили до імунізації твався в сайт-мішень mini-attTn7 на бакміді. Колонії, рин. Імунні сироватки виділяли із кроликів. В наявякі містять рекомбінантні бакміди, ідентифікували ності були реагенти з високим титром, які шляхом розриву гена lacZ. Із відібраних клонів дозволяли проводити подальший скринінг. ОдерE.соlі, які містили рекомбінантний бакмід, одержужання додаткових антисироваток стало можливим вали низькомолекулярну міні-ДНК, яку потім викоз завершенням пептидної послідовності повного ристовували для трансфекції клітин комах. Детапротеїну. Синтезували три пептиду (амінокислотна льно все це викладено в посібнику по експлуатації послідовність 83-103, 13-30, 58-69), шляхом станнабору для експресії. дартного лінкеру зв'язані з KLN, які потім викорисПриклад 9 товували для імунізації. Були одержані три сироАдгезія тромбоцитів з колагеном в умовах поватки проти N-кінцевого пептидного сегменту і дві току (динамічний аналіз) проти С-кінцевих пептидів. Імунні сироватки з виВ процесі аналізу адгезії тромбоцитів цілісну 19 74780 20 соким титром дозволяли управляти процесом очипротеїни мали однакову здатність да зв'язування з стки як природного, так і рекомбінантного протеїколагеном. Далі проводили експерименти з перехну, а також здійснювати кількісний аналіз очищеної ресною конкуренцією біотинильованого саратину з речовини методом ЕЛИЗА. Таким чином, відпаданемодифікованим саратином, пептидами, саратила необхідність в довготривалому та трудоємному ном, виділеним із слини, слиною або антитілами аналізі інгібування тромбоцитів, який застосовують проти саратину. Аналіз зв'язування різних конкувиключно для того, щоб переконатися в наявності рентів" з колагеном здійснювали, оцінюючи здату кінцевого очищеного протеїну потенціала інгібіність до зв'язування біотинильованого саратину тора. (реакція з підложкою ODB з використанням кон'юПриклад 11 гату стрептавідин-POD). Цей експеримент з біотиІмунологічне випробування зв'язування саранильованим саратином, як правило, застосовуватину ли для визначення концентрації саратину в слюні Підкисленим колагеном Horm (фірма (750мкг/л), картирування антигенних детермінант Nycomed) покривали 96-коміркові мікротитрувальні антитіл проти саратину, оцінки біологічно активнопланшети (фірма Nunc) (50мкл розчину колагену в го та мутованого саратину. Щоб краще вивчити концентрації 20мкг/мл, інкубування протягом ночі). можливості, які заявляються при проведенні цього Починаючи аналіз, планшети тричі промивали експерименту, застосовували як блокуючі, так і сополімером стиролу та бутадієну та, для запобінеблокуючі антитіла проти саратину, одержані за гання неспецифічної адгезії, інкубували в розчині допомогою специфічних пептидів саратину. сироваткового альбуміна великої рогатої худоби Приклад 13 (1%). Потім в серійному розведенні додавали Вектор експресії та експресія в дріжджах 50мкл саратину та інкубували протягом однієї гоВикористовувалась система експресії pichia дини. Перед тим, як приступити до аналізу з викоmulti copy (фірма Invitrogen), типовий приклад ексристанням антитіла проти саратину, планшети пресії в дріжджах. Конструкція дріжджового вектотричі промивали. Провівши додаткове інкубування, ра експресії показана на Фігурі 8. При створенні надлишок антитіла видаляли та продовжували вектора експресії саратину застосовували амплівипробовування з другим антитілом, поміченим фікацію методом ПЦР, яка дозволяє сформувати біотином. Зчитування здійснювалося шляхом прокінці рестрикції (5'EcoR I, 3' Not І), котрі можна лігіведення колірної реакції з каталізом стрептавідинрувати у відповідний вектор (рРІС9К). При цьому POD з підложками, такими, як таблетки ODB (фірвикористовували 5'-праймер 09 та 3'-праймер 10. ма Dako) (довжина хвилі 490нм). Перед трансформуванням сферопластів Приклад 12 Pichia вектор експресії лінеаризували Sal І. Щоб Конкурентний аналіз скринінгу інгібіторів переконатися в інтеграції гену саратину, з колоніЗдатність рекомбінантного міченого саратину ями провели скринінг на предмет His+ Muf+(мітка His) з Прикладу 7 до зв'язування з колагепозитивних мутантів. Умови росту: 28-30°С, оптичном порівнювали з такою ж нативного неміченого на густина до 2-6. Експресію індукували шляхом саратину. Планшети з покриттям із підкисленого повторного суспендування центрифугованих кліколагену Horm (фірма Nycomed) готували як опитин в середовищі та додавання метанолу в кінцесано в Прикладі 11. Виявлення здійснювали за вій концентрації до 0,05%. Ці умови підтримувалидопомогою антитіл проти саратину кролика. Мічеся, як правило, протягом 24 годин. Через 6 днів ний та немічний саратини проявили ідентичну здаферментації продукт відбирали із надосадкової тність дo зкріплення. Як альтернативу немічений рідини та аналізували методами електрофореза в саратин модифікували шляхом біотинилювання поліакриламідному гелі додецилсульфатом натрію (фірма Pierce, набір для біотинилювання) та поріта ЕЛИЗА. внювали з немодифікованим саратином. Обидва 21 74780 22 23 74780 24 25 74780 26 27 74780 28 29 74780 30 31 Комп’ютерна верстка О.Воробєй 74780 Підписне 32 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601