a-галактозидаза з трансгалактозуючою активністю

1. Послідовність ДНК, яка кодує αгалактозидазу, де послідовність вказана в SEQ ID NO: 1. 2. Фермент α-галактозидаза , який кодується ДНКпослідовністю за п. 1. 3. Фермент α-галактозидаза, який містить амінокислотну послідовність за SEQ ID NO: 2. 4. Фермент α-галактозидаза, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 2. 5. Рекомбінантний вектор, який містить послідовність ДНК за п. 1. 6. Вектор за п. 5, де вказаний вектор являє собою вектор експресії. 7. Клітина-хазяїн, яка містить ДНК-послідовність за п. 1. 8. Клітина-хазяїн, яка містить вектор за п. 5 або 6. 9. Клітина-хазяїн за п. 7 або 8, де вказана клітина являє собою бактерійну клітину, дріжджову клітину або грибкову клітину. 10. Клітина-хазяїн за п. 9, де вказана клітина вибрана з групи, яка складається з Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus і Aspergillus. 11. Клітина-хазяїн за п. 10, де вказана клітина вибрана з групи, яка складається з Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Bacillus circulans і Aspergillus niger. UA (21) a200809397 (22) 19.12.2006 (24) 10.02.2012 (86) PCT/GB2006/004796, 19.12.2006 (31) 0525857.9 (32) 20.12.2005 (33) GB (46) 10.02.2012, Бюл.№ 3, 2012 р. (72) ЦОРЦИС ГЕОРГІОС, GB, ГОУЛАС АТАНАСІОС К., GB, ГОУЛАС ТЕОДОРОС, GB (73) КЛАСАДО ІНК., PA (56) EP 1227152 A, 31.07.2002 WO 2004074496 A, 02.09.2004 WO 2005003329 A, 13.01.2005 DATABASE Geneseq [Online] 19 November 2002, "Bifidobacterium longum NCC2705 DATABASE UniProt [Online] 1 November 1999, "Alphagalactosidase (EC 3.2.1.22)." retrieved from EBI accession no. UNIPROT:Q9XCX2 Database accession no. Q9XCX2 DATABASE UniProt [Online] 27 September 2005, "Glycoside hydrolase, clan GH-D." retrieved from EBI accession no. UNIPROT:Q40Z83 Database accession no. Q40Z83 SCALABRINI P ET AL: "CHARACTERIZATION OF BIFIDOBACTERIUM STRAINS FOR USE IN SOYMILK FERMENTATION" INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 39, no. 3, 1998, pages 213-219 VAN LAERE K M J ET AL: "Transglycosidase activity of Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 alphagalactosidase" APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, SPRINGER VERLAG, BERLIN, DE, vol. 52, no. 5, November 1999, pages 681-688 LAMOUREUX L ET AL: "PRODUCTION OF OLIGOSACCHARIDES IN YOGHURT CONTAINING BIFIDOBACTERIA AND YOGURT CULTURES" JOURNAL OF DAIRY SCIENCE, AMERICAN DAIRY SCIENCE ASSOCIATION, SAVOY, IL, US, vol. 85, no. 5, May 2002, pages 1058-1069 GEORGE TZORTZIS ET AL: "Synthesis of prebiotic galactooligosaccharides using whole cells of a novel strain, Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171" 2 (19) 1 3 97353 4 12. Застосування ферменту α-галактозидази за п. 3 для отримання α-галактобіозних дисахаридів. 13. Застосування ферменту α-галактозидази за п. 3 для отримання α-галактобіозних дисахаридів, які є частиною продукту, вибраного з групи, яка складається з молочних продуктів, таких як рідке молоко, сухе молоко, молочні суміші, суміші для дитячого харчування, морозиво, йогурт, сир, ферментовані молочні продукти, напоїв, таких як фруктові соки, продуктів для дитячого харчування, зернових, хліба, крекерів, кондитерських виробів, випічки, харчових добавок, дієтичних добавок, харчових продуктів з пробіотиками, харчових продуктів з пребіотиками, кормів для тварин, кормів для домашньої птиці і лікарських засобів. 14. Застосування клітини-хазяїна за п. 7 для отримання продукту, вибраного з групи, яка складається з молочних продуктів, таких як рідке молоко, сухе молоко, молочні суміші, суміші для дитячого харчування, морозиво, йогурт, сир, ферментовані молочні продукти, напоїв, таких як фруктові соки, продуктів для дитячого харчування, зернових, хліба, крекерів, кондитерських виробів, випічки, харчових добавок, дієтичних добавок, харчових продуктів з пробіотиками, харчових продуктів з пребіотиками, кормів для тварин, кормів для домашньої птиці і лікарських засобів. 15. Спосіб отримання ферменту α-галактозидази за п. 3, що включає культивування клітини-хазяїна за п. 7 у відповідному культуральному середовищі при умовах, які дозволяють експресувати вказаний фермент і діставати отриманий в результаті фермент з культурального середовища. 16. Спосіб отримання дисахариду, який включає контактування ферменту за п. 3 або клітинихазяїна за п. 7 з розчином мелібіози. Винахід належить до нової -галактозидази з трансгалактозуючою активністю, здатною перетворювати мелібіозу в -галактобіозні дисахариди. Зокрема, винахід належить до -галактозидази, виділеної з нещодавно відкритого штаму Bifidobacterium bifidum. Винахід, зокрема, належить до послідовностей ДНК, які кодують виділений фермент галактозидазу, до ферменту, який кодується такою послідовністю ДНК, і до клітини-хазяїна. що містить послідовність ДНК або містить рекомбінантний вектор, що вбудовує послідовність ДНК. Винахід також належить до застосування ферменту, який кодується послідовністю ДНК, або клітиніхазяїну, що містить послідовність ДНК або рекомбінантний вектор для отримання -галактобіози. Біфідобактерії звичайно населяють нижній відділ кишечнику, і таке середовище бідне моно- і дисахаридами, оскільки вказаний цукор, переважно, споживається хазяїнами і мікробами, присутніми у верхньому відділі кишечнику. Для виживання в нижньому відділі кишечнику біфідобактерії продукують різні види екзо- і ендоглікозидаз, поверхнево зв'язаних і/або таких, що знаходяться у вигляді позаклітинних форм, які здатні утилізувати різні вуглеводи. Крім гідролізної активності, деякі ферменти біфідобактерій володіють трансферазною активністю. Така трансглікозилююча активність глікозидаз інтенсивно використовується для ферментативного синтезу різних олігосахаридів, які, як було доведено, виконують функції чинників, стимулюючих зростання біфідобактерій. Відомо, що деякі види біфідобактерій продукують β-галактозидазні ферменти, які беруть участь в бактерійному метаболізмі лактози. Так в Mollet, P.L. et al in Appl & Environ Microbial., (2001), 62, (5), 2276-2283 описано виділення і характеристики трьох генів β-галактозидази з штаму Bifidobacterium bifidum. Автори виявили, що всі три β-галактозидази здатні каталізувати утворення бета-зв'язаних галактоолігосахаридів в результаті трансгалактозиляції. Відомо, що деякі види біфідобактерій, на відміну від В. bifidum продукують -галактозидази, а також β-галактозидази. -Галактозидази належать до групи глікозилгідролаз і можуть бути класифіковані на дві групи за специфічністю до субстрату, тобто одна з таких груп володіє специфічністю до малих сахаридів, таких як р-нітрофеніл--Dгалактопіранозид, мелібіоза і рафіноза, а інша група здатна вивільняти галактозу з галактоманаз таких, як гуарова камедь, крім інших малих субстратів. Було виявлено, що штам Bifidobacterium bifidum здатний продукувати фермент з галактозидазною активністю, яка перетворює лактозу в нову суміш галактоолігосахаридів, яка, як несподівано було відмічено, містить до 35% дисахаридів, включаючи галабіозу (Gal ( 1-6)-(Gal)). Відомо, що такий дисахарид (див. Paton, J.S. & Paton A.W. (1989), Clin. Microbial. Revs, 11, 450-479; Carisson, K.A. (1989), Ann. Revievs Biochem, 58, 309-350) володіє антиадгезивною здатністю запобігати адгезію токсинів, наприклад, токсину Shiga і таких патогенів, як Е. соlі, на стінки травного тракту. Штам В. bifidum депонований під номером доступу NCIMB 41171 в the National Collection of Industrial & Marine Bacteria, Aberdeen, UK 31 березня 2003 p. Крім того, він також описаний в патенті США No.2412 380. Було виявлено, що штам В. bifidum продукує -галактозидазу, здатну перетворювати мелібіозу в -галактобіозні дисахариди. Даний винахід належить до послідовності ДНК, яка кодує білок з амінокислотною послідовністю, приведеною в SEQ ID NO:2 або яка гібридизується в жорстких умовах з послідовністю ДНК, яка кодує білок, що розглядається. Послідовність ДНК приведена в SEQ ID NO:1 або може містити фрагменти або вироджену послідовність. Термін «вироджена» належить до послідовності ДНК, яка гомологічна послідовності SEQ ID NO:1 щонайменше на 50%, більш переважно на 50-98%, найбільш переважно, на 75-95%. 5 Така послідовність ДНК може містити нуклеотидні заміни, вставки або делеції, здатні змінювати амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 менше ніж на 60%, переважно, менше ніж на 45%, більш переважно, менше ніж на 25%. Нуклеотидні заміни можуть давати консервативні заміни в амінокислотних послідовностях. У другому аспекті даний винахід належить до ферменту, який кодується вказаною вище послідовністю ДНК. Такий фермент може містити амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 або її фрагмент. У третьому аспекті даний винахід належить до рекомбінантного вектора, переважно, експресуючого вектора, що містить вказану вище послідовність ДНК. Такий вектор може вводитися в клітинухазяїн таку, як бактерія, дріжджі або грибки. Як альтернатива, послідовність ДНК може бути введена в таку клітину-хазяїн. Відповідна клітинахазяїн може бути вибрана з Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Bacillus, наприклад, Bacillus subtilis, або Bacillus circulans, Esherichia і Aspergillus, наприклад, Aspergillus niger. При використанні як субстрата мелібіози, фермент, який кодується вказаною вище послідовністю ДНК, продукує суміш олігосахаридів, головним чином, -галактобіозних дисахаридів. Вказаний вище фермент або клітина-хазяїн можуть використовуватися для отримання галактобіозних дисахаридів, які можуть бути частиною продукту, призначеного для стабілізації діяльності шлунково-кишкового тракту. Продукти такого типу можуть бути вибрані з групи, яка складається з молочних продуктів (наприклад, таких як рідке молоко, сухе молоко, наприклад, сухе збиране молоко, сухе знежирене молоко, сухе повножирне молоко, суха сироватка, молочні суміші для дитячого харчування, суміші для дитячого харчування, морозиво, йогурт, сир, ферментовані молочні продукти) а також напоїв, таких як фруктові соки, продукти для дитячого харчування, зернові, хліб, крекери, кондитерські вироби, випічка, харчові добавки, дієтичні добавки, харчові продукти з пробіотиками, харчові продукти з пребіотиками, корми для тварин, корми для домашньої птиці, а також інших харчових продуктів або напоїв. Як альтернатива, отримані таким чином дисахариди можуть використовуватися для отримання лікарських засобів у вигляді таблеток або капсул для запобігання адгезії на стінках кишкового тракту патогенів або токсинів, продукованих патогенами. Лікарські засоби такого типу можуть застосовуватися пацієнтом, наприклад, після курсу лікування антибіотиками, яке часто порушує нормальну флору травного тракту. Також даний винахід належить до описаного вище способу отримання ферментів, який включає культивування клітин-хазяїнів у відповідному культурному середовищі в умовах, які забезпечують експресію ферменту і діставання отриманого в результаті ферменту або продуктів ферментації з культурного середовища. Таким чином, винахід також належить до способу отримання галактобіозних дисахаридів, який 97353 6 включає контактування описаних вище ферменту або клітини-хазяїна з матеріалом, який містить мелібіозу, в умовах, які приводять до утворення дисахаридів. Прийнятні матеріали, ті, які містять мелібіозу можуть бути вибрані з комерційно доступних мелібіоз, рафіноз, стахіоз або соєвих екстрактів. На фігурі 1 приведена нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO:1) -галактозидази Bifidobacterium bifidum з ініціюючим або термінуючим кодоном, вказаним жирним курсивом; на фігурі 2 приведена нуклеотидна послідовність згідно з фігурою 1 з амінокислотною послідовністю (SEQ ID NO:2) ферменту; на фігурі 3 приведені перші 540 амінокислот амінокислотної послідовності (SEQ.ID. NO:2) згідно з фігурою 2; на фігурі 4 приведений графік, що демонструє кінетику реакції під час синтезу галалактоолігосахариду -галактодизазою з використанням 40% (мас/мас) мелібіози в 0,1 Μ фосфатному буфері як субстрату; і на фігурі 5 приведена хроматограма, отримана високоефективною аніонообмінною хроматографію суміші -галактоолігосахаридів, синтезованою за допомогою -галактозидази з В. bifidum NCIMB 41171 з використанням 40% (мас/мас) мелібіози в 0,1 Μ фосфатному буфері як субстрату при рН 6,0. (Тут Glc = глюкоза; Gal = галактоза, Mel = мелібіоза; СП = ступінь полімеризації). Стрілки, позначені пунктирними лініями, визначають положення галактоолігосахаридних продуктів. Геномну ДНК виділяли з штаму Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) з використанням способу Lawson et al. (1989) Fems Microbiol Letters, 65, (12), 41-45. ДНК обробляли рестрикційними ферментами, і фрагменти з максимальним розміром 15 т.п.н. лігували вектором PBluescript KS(+). Клітини Ε. coli трансформували вектором, який містить інсерції, що складаються з PstI обробленої ферментами хромосомної ДНК з В. bifidum. Клони з галактозидазною активністю піддавали селекції на пластинах з агаром Luria Bertani, який містить пнітрофеніл -D-галактопіронозид і ізопропіл--Dтіогалактозид (IPTG). Ідентифікували два галактозидазних позитивних клони (рМеІА1 і рМеІА2). Два отриманих позитивних клони, оброблені ферментами EcroRI, PstI і Ваm НІ, продемонстрували аналогічні ретрикційні карти, що вказує на те, що обидва вони містять однакові ДНК-вставки. Секвенування вставленого фрагмента ДНК MelΑ1 здійснювали за допомогою Sanger дідеокси методу обриву ланцюга (Russel P., 2002 iGenetics, Pearson Education Inc., San Francisco, 187-189) з використанням набору для циклічного секвенування BigDye Terminator V.3.0. (Applied Biosystems, USA). Послідовність ДНК MelA1 представлена на Фігурі 1 (SEQ ID NO:1). Відкриту рамку зчитування (ORF) локалізували з використанням ORF finder від NCBI (National center of Biotechnology information). Використовували генетичний код бактерії і визначили довжину рамки зчитування в 300 пн. Нуклеотидну послідовність, показану на фігурі 1 транслювали в шість 7 можливих рамок і була виявлена одна відкрита рамка зчитування з 759 амінокислот, яка коду с передбачувану α-галактозидазу (трансляція показана на Фігурі 2 SEQ ID NO:2). Наступні приклади ілюструють даний винахід. Приклад 1 Матеріали і методи Всі хімічні реагенти і препарати середовищ, використані в цій роботі, були отримані від Sigma (Dorset, UK), Invitrogen (Paisley, UK), Oxoid (Basingstoke, UK), Qiagen (West Sussex, UK) і Promega (Southmpton, UK). Бактерійні штами Штам Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) зберігали на кріогенних умовах в пробірках Microbank при -70°С. Для подальших експериментів штам оживляли на агарі Wilkinson Chalgren (WC) агарі (Oxoid, UK) і середовищі ΤΡΥ (середовище, Тріптиказу з фітоном і дріжджовим екстрактом) і вирощували анаеробно (склад СО2 і Ν2 80% і 20%, відповідно) при 37°С протягом 38 годин. Морфологію колоній, і відсутність забруднень перевіряли фарбуванням по Граму. Штами Е.соlі Штам Eschericia coli RAllr і DH5a, використаний в цій роботі, звичайно інкубували в аеробних умовах при 37°С на агаровому середовищі ЛуріяБертані (LB) або бульйоні (Sambrook J. and Russel W.D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laborotory Press, New York) і при необхідності додавали антибіотики (100 мкг/мл ампіциліну і/або 15 мкг/мл хлорамфеніколу) і 40 мкл 2% Φ--галактопіранозиду (X--Gal), 7 мкл 20% розчини IPTG (ізопропіл--D-тіогалактозиду), які наносили на поверхні зазделегідь приготованих підготовленої 90-мм агарових чашок. У експериментах по експресії використовували дефіцитний по -галактозидазі штам E.coli RA11r (Hanatani et al., 1983, J.Biol. Chem, 259(3) (генотип: - + - melA B recA , lacZ Y ), отриманий з E.coli. K12. Штам E.coli DH5a (Invitrogen, Paisley, UK) (генотип: F 80lacZM (lacZYA-argF)U169 recA1 і endA1 hsdR17 (rk ; mk ) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1-) використовували у всіх інших генетичних експериментах. Вибір штамів E.coli RAllr для експериментів по експресії проводили відповідно до генотипу. Вибраний штам не кодує активну -галактозидазу за рахунок mеlА мутації в його власній ДНК. Однак штам, що розглядається містить активний переносник мелібіози, який необхідний для перенесення цукру (мелібіози) в цитоплазму і, отже, для їх метаболізму активною -галактозидазою. На даному етапі досліджень не можна зробити висновок про те, чи протікає експресія -галоксидази Bifidobacterium bifidum внутрішньоклітинно або позаклітинно. Таким чином, наявність активного переносника мелібіози є істотним чинником для ідентифікації -gal позитивних клонів і, отже, для виділення генів, що кодують -галактозидазну. Потрібно зазначити, що в тому випадку, коли штам, який розглядається, являє собою мутант rесА, який мінімізує рекомбінацію введеної ДНК під 97353 8 впливом ДНК хазяїна, спостерігається підвищення стабільності інсерції. Екстракція Геномної ДНК з Bifidobacterium bifidum. Геномну ДНК виділяли з штаму Bifidobacterim bifiidum (NCIMB 411171) з використанням методу Lawson et al. (1989). Згідно з описаним способом клітини збирали з пластин в пробірки Еппендорфа місткістю 1,5 мл, які містять 0,5 мл TES буфера. Вводили 10 мкл суміші лізозим/мутанолізин (4:1, лізозим 10 мг/мл; мутанолізин 1 мг/мл) і далі отриману суміш перемішували і інкубували протягом 30 хвилин при 37°С. Далі клітини обробляли 10 мкл протеїнази К (в концентрації 20 мг/мл) і 10 мкл рибонуклеази (10 мг/мл), перемішували і інкубували протягом 1 години при 65°С. Після інкубації в систему додавали 100 мкл 10% розчину SDS і клітинні лізати обережно перемішували методом інверсії і інкубували ще протягом 15 хвилин при 65°С, після чого додавали 0,62 мл суміші фенолу/хлороформу перемішували методом інверсії до утворення емульсії. Далі клітинні лізати центрифугували з швидкістю 6500 об./хв. протягом 10 хвилин, і верхній шар рідини переносили в чисту пробірку Еппендорфа, використовуючи для цієї операції випалені ширококанальні піпетки. Екстракцію (етап депротеінізії) повторювали до повного видалення клітинних фрагментів. ДНК осаджували доданням 1 мл крижаного етанолу, після чого проводили інкубацію щонайменше протягом 30 хвилин на льоду або, зберігаючи протягом ночі в морозилці при температурі -20°С. Геномну ДНК виділяли центрифугуванням при швидкості 13000 об./хв. протягом 5 хвилин, і після сушіння ресуспендували в 5 мкл стерильній суміші з 1 мМ Трис-СІ при рН 8. Екстраговану ДНК аналізували методом гельелектрофорезу і її концентрацію вимірювали при 260 нм. Зберігали при температурі -20°С або -70°С протягом тривало періоду часу, уникаючи багаторазового відтавання і заморожування для зниження можливості руйнування. Векторний ДНК препарат У цьому дослідженні використовували pBluescript KS(+) (Stratagen, Norh Torreyv Road). Вибір цього клонуючого засобу зумовлений тим, що lac промотор кодуючої плазміди pBluescript KS(+) необхідний для ініціації транскрипції генів, втрачаючих власний промотор. Вектор перетравлювали в присутності наступних рестракційних ферментів: Pstl, ВаmHl і ЕсоRl відповідно до інструкцій виробника, використовуючи десятиразовий надлишок ферменту відносно кількості ДНК (ферментативні одиниці: мкг ДНК еквівалентно десяти одиницям ферменту на один μΓ плазмідної ДНК або десяти одиницям ферменту з розрахунку на 0,5 пікомолей плазмідної ДНК). Після термоінактивації ферменту (20 хвилин при 65°С) аналізували карту рестрикції методом горизонтального гель-електрофорезу. Далі вектори дефосфорилювали з використанням кишкової лужної фосфотази теляти СІАР (Promega, Southampton, UK) відповідно до інструкцій виробника. Ефективність обробки тестували само-лігуванням вектора (Bacteriofag Т4 ДНК ліга 9 зою відповідно до інструкцій виробника) після чого проводили трансформацію DH5a клітин. Наявність єдиного фрагмента гелю є свідченням повного перетравлення вектора і його одиничного рестрикційного перетравлення. Ступінь перетравлення вектора тестували трансформацією нелігованих молекул компетентних клітин Е. соlі DH5a. Число колоній, які утворилися на пластинах LB агару, що додатково містять ампіцилін (100 мкл/мл), служило показником числа неперетравлених молекул і могло служити фоновим сигналом для подальших експериментів. Конструювання бібліотеки геномних ДНК Геномні ДНК частково перетравлювали в присутності трьох рестрикційних ферментів, здатних розпізнавати гекса-нуклеотидні послідовності, які часто зустрічаються, в які включена прокаріотна ДНК. ЕсоRl, ВаmHl і Pstl являють собою ретрикційні ендонуклеази типу II послідовності типу, які специфічно розпізнають 5'G/AATTC'3, 5'G/GATCC'3 і 5'CTGCA/G'3 відповідно, це явище супроводжується двонитковим розривом, який призводить до формування 5' виступаючих кінців з чотирьох нуклеотидів ААТТ, GATS для ЕсоRl і ВаmHl, відповідно, а також 3' виступаючих кінців при використанні ACGT для Pstl. Було встановлено, що всі ферменти володіли активністю і були здатні розщеплювати ДНК тільки в присутності іонів двовалентного магнію. Такі іони служили єдиним необхідним кофактором. 97353 10 Рестрикційне перетравлення ДНК Все ретрикційні перевари зразків геномної ДНК інкубували протягом 2 годин при 37°С і інактували при 65°С протягом 20 хвилин. Потім реакційну суміш охолоджували до кімнатної температури і додавали необхідну кількість буфера, піддаючи суміш м'якому перемішуванню з використанням герметизованого скляного капіляра. Далі розчини завантажували в ампули з 0,8% агарозного гелю (підведення потужності 4-5 вольт/см протягом 14-16 годин) і розмір перевареної ДНК визначали з використанням 1 т.п.н. стандартних ДНК (Promega, UK) (Sambrook, J, Molecular Cloning: A Laboratory Mannual (2002). Очищення фрагментів, які утворилися після процесу рестрикційного перетравлення Очищення фрагментів від реакційної суміші і агарозного гелю виконували з використанням набору для екстракції гелю QIAEX від Qiagen (West Sussex, UK). Протоколи аналізу детально викладені в інструкціях виробника. Лігування і трансформація ДНК Після очищення фрагментів ДНК з використанням набору для екстракції гелю QIAEX, матеріал піддавали лігуванню з використанням СІАРобробленого pBluescript KС(+) вектора. З метою лігування певні кількості ДНК переносили в стерильні мікроцентрифугальні пробірки місткістю 0,5 мл, як показано в Таблиці 1. Таблиця 1 Пробірка А В С ДНК Кількість вектора (1 фемтомолей) (29,7 нг) Кількість вектора (1 фемтомолей 29,7 нг ДНК) плюс вставка (сторонні речовини в 1 фемтомолях 69,3 нг) pUc контроль (0,056 фемтомолей {100 пг}) У реакції лігування молярне співвідношення між плазмідним ДНК вектором і вбудовуваним ДНК фрагментом становило ~1:1. Кінцева концентрація ДНК становила 10 нг/мкл. Суміші для лігування. Пробірка А показує кількість самолігованої векторної ДНК, яку потрібно виключити із загальної кількості трансформантів після завершення процесу трансформації. Дані отримані в пробірці В демонструють лігування вектора фрагментами ДНК, а дані з колонки С демонструють контрольні значення, що дозволяють розрахувати ефективність процесу трансформації. Перед кожною операцією лігування фрагменти ДНК нагрівали при 45°С протягом 5 хвилин до плавлення всіх «липких» кінців, які повторно випалювалися при отриманні фрагмента. Реакцію проводили згідно з інструкцією Promega для всіх реакцій лігування, молярне співвідношення вектор:вставка ДНК вибиралося 1:1. У пробірки А і В вводили по 1,0 мкл 10-кратних надлишки лігуючого буфера і 0,5 одиниць Weiss Т4 ДНК лігази (Promega, UK), і весь об'єм реакційної суміші доводили до рівня 10 мкл за допомогою біологічно очищеної води. У пробірки С вводили 1,0 мкл 10-кратного надлишку лігуючого буфера, і весь об'єм реакційної суміші доводили до рівня 10 мкл за допомогою біологічно очищеної води. Фрагменти ДНК додавали в пробірки спільно з водою, після чого суміш нагрівали до 45°С протягом 5 хвилин для плавлення всіх «липких» кінців, які повторно випалювалися при отриманні фрагмента. ДНК охолоджували до 0°С перед доданням реагентів лігування, які залишилися, і реакційну суміш інкубували протягом ночі при 16°С (Sambrook and Rusell, 2001). Після осадження етанолом і очищення лігованих фрагментів (з метою видалення лігуючого середовища, яке може знижувати ефективність трансформаційних перетворень) подальші операції проводили, слідуючи інструкціям Hanan. 50 нг лігованої ДНК в 5 мкл розчини додавали до 100 мкл компетентних Е. Соlі RAllr клітин. Після термообробки і експресії в присутності ампіцилінстійкого гена клітини розподіляли по поверхні LB пластин, які містять ампіцилін (100 мкг/мл), X-Gal (40 мкл 2% Φ--Gal) і (7 мкл 20% IPTG). Вимірювали число трансформацій в кожній реакції лігування. Число трансформантів в пробір5 6 ці С становило 210 -110 КУО/мкг, в той час як відповідну кількість в пробі В становило 500-600 11 КУО/мкг. Число трансформантів в пробі А відображає ефективність обробки векторної ДНК. Чис4 ло трансформантів в пробі В становило 2-4  10 КУО/мкг. Число трансформантів При лігуванні сумішей в присутності Pstl хромосомної ДНК отримували два -галктозидазних позитивних клони (рМеlА1 і PmelA2) з приблизно 2500 скринованих трансформантів, тоді як в присутності хромосомної ДНК, обробленої ЕсоRl і ВаmНІ, не спостерігалося утворення якого-небудь позитивного клону з приблизно 4000 всіх скринованих трансформантів. Перетравлення позитивного клону Два позитивних Pstl клони перетравлювали рестрикційними ферментами ЕсrоRl, Pstl, ВаmНІ, Hindlll, Smal і Kpnl. Рестриційні ферменти EcroRI, Pstl і ВаmHl показали аналогічну рестрикційну карту, один фрагмент ~5 т.п.н. (цільовий ген) і інший ~ приблизно 3 т.п.н. (плазмідна ДНК), яка свідчить про те, що вказані ферменти ріжуть в аналогічних позиціях. Hindlll дають фрагмент розміром 6,5 т.п.н. і фрагмент розміром 1,5 т.п.н. тоді як ферменти Smal і Kрnl утворять лише один фрагмент розміром ~8 т.п.н., що свідчить про розрізання лише в одній позиції. Аналогічні ретрикційні карти для обох плазмід вказують на те, що обидві містять аналогічні ДНК вставки. Секвенування послідовності ДНК Секвенування ДНК здійснювали з використанням набору для циклічного секвенування BigDye Terminator V.3.0 (Applied Biosystems, USA) і аналіз проводили з використанням АВІ Prism 3100 системи для флуоресцентного аналізу ДНК, який включає методи капілярного електрофорезу. 5'- і 3'-кінці вбудованих фрагментів ДНК секвенували вектор-специфічними праймерами. Вставки додатково секвенували з використанням системи геномного праймування (Genome Priming System (GPS-1)) (New England Biolabs, Uk). GPS-1 являє собою in vitro систему на основі транспозону TN7, який використовує TnsABC транспозазу для вбудування випадковим чином в цільову ДНК. Донор: була використана цільова ДНК в масовому співвідношенні 1:4 згідно з інструкцією виробника. Кількість виділених плазмід для секвенування після вставки транспраймеру в цільову плазміду становила 25. Ця кількість була вирахувана згідно з інструкціями виробника і виходячи з 5-кратної глибини обхвату it assumes a 5-fold depth of coverage Унікальні сайти праймування на обох кінцях транспраймерного елемента дозволяють секвенувати обидві нитки цільовий ДНК в позиції вставки. Суміш для реакції секвенування містила приблизно 400-600 нг плазмідної ДНК, 3,2 пікомолю розчину праймера і 4 мкл розчину термінатора BigDye. Ідентифікація відкритої рамки зчитування Відкриту рамку зчитування (ORF) виявляли з використанням ORF finder від NCBI. Використовували генетичний код бактерії і визначили довжину рамки зчитування в 300 пн. Нуклеатидну послідовність транслювали в шість можливих рамок і була виявлена одна відкрита рамка зчитування з 759 амінокислот, що кодує передбачувану α 97353 12 галактозидазу (трансляція показана на фігурі 2). Були підтверджені ініціюючий і термінуючий кодони. Ген -галактозидази Bifidobacterium pMelA1 плазмідой був експресований в Е. соlі при умовах зростання, які в нормі придушують експресію з індуцибельним Е. соlі lacZ промотором, розташованим у фланкуючій ділянці клонуючого вектора. Ці результати вказують, що ендогенні, внутрішні біфідобактеріальні послідовності, направлені проти гена -галактозидази можуть служити сигналом ініціації транскрипції в Е. соlі. Початок транскрипції вказано жирним курсивом. Приведені вище результати вказують, що ген контролюється власним промотором транскрипції. Приклад 2 Синтез клонованого ферменту галактозидази, виділений з Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 в клітині-хазяїні Ε. coli (штам RA11) Синтез, описаний нижче, проводили, якщо не вказано інакше, із з цілими клітинами Е. coli RA11 як хазяїн після обробки біомаси Е.соlі (зібраної центрифугуванням при 10000 g) толуолом в концентрації 2000 чнм, для збільшення проникності клітини, щоб зробити її нежиттєздатною, зруйнувавши її цитоплазматичну мембрану. Біомасу Есоlі готували, як описано в п. «Штами Ε coli» Прикладу 1. Синтез клонованого ферменту Синтез -галактозидази проводили при початковій концентрації мелібіози в субстраті 40% (мас/мас). Синтезуючий розчин отримували в 0,1 Μ фосфатному буфері з рН 6,0. Синтез проводили при температурі 40°С на водній бані-шейкері при 150 обертах на хвилину. Оптимальні рН для конкретного ферменту вибирали, виходячи з вимірювань активності (з використанням як субстрату рнітрофеніл--D-галактопіранозиду) специфічного ферментного препарату при різних показниках рН. Для синтезуа-галактозидази 2 мл клітинної суспензії Е. coli RA11 (з активністю 0,3 од/мл) центрифугували (при 10000 g) для збору біомаси, і супернатант вивантажували. Цю біомасу ресуспендували 1 г 40% (мас/мас) розчину субстрату мелібіози для проведення синтезу. На Фігурі 4 показана концентрація різного цукру, присутнього в суміші під час синтезу. На фігурі 5 показані хроматограми галактоолігосахаридних сумішей, синтезованих -галактозидазою, клонованою з В. bifidum NCIMB 41171, отримані високоефективною аніонообмінюючою хроматографію спільно з імпульсним амперометричним детектуванням (HPAECPAD). У Таблиці 1 приведені концентрації цукру галактоолігосахаридної суміші в момент часу оптимального синтезу. Таблиця 1 Вуглеводна композиція при синтезі αгалактоолігосахаридів при 40% (мас/мас) початковій концентрації мелібіози в момент часу, коли спостерігається максимальна концентрація олігосахаридів 13 Синтез, почата, субст. % (мас/мас) 40 97353 ГОС СП  3 13,93 ГОС СП = 2 Mel Концентрація (% від всього цукру) 6,61 38,06 Mel: мелібіоза, Glc: глюкоза, Gal: галактоза, СП: ступінь полімеризації. 14 Glc Gal 24,1 17,9 15 97353 16 17 97353 18 19 97353 20 21 97353 22 23 97353 24 25 97353 26 27 97353 28 29 97353 30 31 Комп’ютерна верстка Л. Купенко 97353 Підписне 32 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601