Композиція програмованого нуклеопротеїнового молекулярного комплексу і спосіб модифікування заданої послідовності нуклеїнової кислоти-мішені

Номер патенту: 115772

Опубліковано: 26.12.2017

Автори: Вейнтал Дан Майкл, Шиболет Йоєл Моше

Формула / Реферат

1. Спосіб модифікування заданого сайта-мішені в послідовності нуклеїнової кислоти-мішені в клітині-хазяїні за допомогою програмованого нуклеопротеїнового молекулярного комплексу, який включає

доставку в клітину-хазяїна:

a) програмованого поліпептиду або послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує програмований поліпептид, при цьому вказаний поліпептид містить:

(i) функціональний домен, здатний до модифікування вказаного сайта-мішені, при цьому функціональний домен позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти; і

(ii) зв'язувальний домен, здатний до взаємодії з нуклеїновою кислотою (SCNA), що надає специфічність, при цьому зв'язувальний домен позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти-мішені;

b) молекулу нуклеїнової кислоти (SCNA), що надає специфічність, або нуклеїнової кислоти, що кодує SCNA, при цьому вказана молекула SCNA містить:

(i) нуклеотидну послідовність, комплементарну ділянці нуклеїнової кислоти-мішені; і

(ii) ділянку розпізнавання, здатну до специфічного приєднання до зв’язувального домену програмованого поліпептиду;

причому наявність поліпептиду в клітині-хазяїні, що містить SCNA, створює можливість для приєднання вказаного поліпептиду до SCNA, утворюючи активний запрограмований нуклеопротеїновий комплекс, внаслідок чого активний запрограмований нуклеопротеїновий комплекс націлюється на сайт-мішень в послідовності нуклеїнової кислоти-мішені в клітині-хазяїні, що сприяє модифікації сайта-мішені за допомогою вказаного активного запрограмованого нуклеопротеїнового комплексу.

2. Спосіб за п. 1, в якому вказаною нуклеїновою кислотою-мішенню є ДНК.

3. Спосіб за п. 2, в якому вказаною ДНК-мішенню є геномна ДНК.

4. Спосіб за п. 3, в якому геномна ДНК-мішень еукаріотичного походження.

5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, в якому функціональний домен вибраний з нуклеази, метилази, фактора, що зв'язується з метильованою ДНК, фактора транскрипції, фактора реконструкції хроматину, полімерази, деметилази, ацетилази, деацетилази, кінази, фосфатази, інтегрази, рекомбінази, лігази, топоізомерази, гірази, хелікази, дестабілізуючої подвійної спіралі і FokI без сайта специфічного зв’язувального нуклеїнової кислоти.

6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, в якому вказаною послідовністю нуклеїнової кислоти-мішені є послідовність екстрахромосомної нуклеїнової кислоти, яка вибирається з групи, що складається з нуклеїнових кислот мітохондрії, хлоропласту, амілопласту і хромопласту.

7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, в якому вказану послідовність нуклеїнової кислоти-мішені вибирають з послідовності вірусної нуклеїнової кислоти, послідовності прокаріотичної нуклеїнової кислоти і синтетичної послідовності нуклеїнової кислоти.

8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, в якому вказану модифікацію вибирають з групи, що складається з мутації, заміни основи, делеції, вставки, заміни, зв’язування, розщеплення, створення дволанцюжкового розриву, одноланцюжкового розриву, метилування, ацетилювання, лігування, рекомбінації, розкручування спіралі, хімічної модифікації, мічення, активації, інактивації і репресії.

9. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, в якому вказана SCNA включає молекулу нуклеїнової кислоти, вибирану з групи, що складається з одноланцюжкової ДНК, одноланцюжкової РНК, дволанцюжкової РНК, модифікованої ДНК, модифікованої РНК, закритої нуклеїнової кислоти (LNA) і пептидонуклеїнової кислоти (PNA) або їх комбінацій.

10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, в якому взаємодія між SCNA і нуклеїновою кислотою-мішенню здійснюється через спарювання основ.

11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-10, в якому ділянка розпізнавання в SCNA включає РНК вторинної або третинної структури.

12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-11, в якому ділянка розпізнавання в SCNA містить нуклеотидний мотив, здатний до взаємодії зі зв'язувальним доменом поліпептиду.

13. Спосіб за будь-яким з пп. 1-12, в якому взаємодією між модифікацією SCNA і вказаним зв'язувальним доменом є взаємодія нуклеїнової кислоти з білком.

14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, в якому взаємодією між нуклеотидним мотивом і зв'язувальним доменом є взаємодія РНК-зв’язувального мотиву зв’язувального домену зі структурою РНК.

15. Спосіб за будь-яким з пп.1-14, в якому зв'язувальний домен містить поліпептид, який зв'язується зі структурним мотивом РНК в SCNA.

16. Клітина-хазяїн із заданою генетичною модифікацією в заданому сайті-мішені, створеною за допомогою способу за будь-яким з пп. 1-15, яку вибирають з групи, що складається з клітини хребетної тварини, клітини ссавця, клітини людини, клітини тварини, клітини гриба, клітини рослини, клітини безхребетного, клітини круглого черв'яка, клітини комахи і стовбурової клітини.

17. Клітина-хазяїн за п. 16, яка відрізняється тим, що клітиною-хазяїном є клітина рослини або клітина комахи.

18. Трансгенний організм або нокаутний організм із заданою генетичною модифікацією, створеною за допомогою способу за будь-яким з пп. 1-15, де організмом є рослина, тварина або гриб.

19. Композиція програмованого нуклеопротеїнового молекулярного комплексу, яка містить:

а) молекулу програмованого поліпептиду, при цьому вказаний поліпептид містить:

(i) функціональний домен, здатний до модифікування вказаного сайта-мішені, при цьому функціональний домен позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти; і

(ii) зв'язувальний домен, який здатний до взаємодії з нуклеїновою кислотою (SCNA), що надає специфічність, при цьому зв’язувальний домен позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти-мішені;

b) молекулу нуклеїнової кислоти (SCNA), що надає специфічність, яка містить:

(i) нуклеотидну послідовність, комплементарну ділянці нуклеїнової кислоти-мішені; і

(ii) ділянку розпізнавання, здатну до специфічного приєднання до зв’язувального домену програмованого поліпептиду;

причому наявність поліпептиду в клітині-хазяїні, що містить SCNA, створює можливість для приєднання зазначеного поліпептиду до SCNA, утворюючи активний запрограмований нуклеопротеїновий комплекс, внаслідок чого активний запрограмований нуклеопротеїновий комплекс націлюється на сайт-мішень в послідовності нуклеїнової кислоти-мішені в клітині-хазяїні, що сприяє модифікації сайта-мішені за допомогою вказаного активного запрограмованого нуклеопротеїнового комплексу.

20. Композиція за п. 19, в якій вказаною нуклеїновою кислотою-мішенню є ДНК.

21. Композиція за п. 20, в якій вказаною ДНК-мішенню є геномна ДНК.

22. Композиція за п. 21, в якій геномна ДНК-мішень еукаріотичного походження.

23. Композиція за будь-яким з пп. 19-22, в якій функціональний домен вибраний з нуклеази, метилази, фактора, що зв'язується з метильованою ДНК, фактора транскрипції, фактора реконструкції хроматину, полімерази, деметилази, ацетилази, деацетилази, кінази, фосфатази, інтегрази, рекомбінази, лігази, топоізомерази, гірази, хелікази, дестабілізуючої подвійної спіралі і FokI без сайта специфічного зв’язувального нуклеїнової кислоти.

24. Композиція за будь-яким з пп. 19-23, в якій вказаною послідовністю нуклеїнової кислоти-мішені є послідовність екстрахромосомної нуклеїнової кислоти, що вибирається з групи, яка складається з нуклеїнових кислот мітохондрії, хлоропласту, амілопласту і хромопласту.

25. Композиція за будь-яким з пп. 19-24, в якій вказану послідовність нуклеїнової кислоти-мішені вибирають з послідовності вірусної нуклеїнової кислоти, послідовності прокаріотичної нуклеїнової кислоти і синтетичної послідовності нуклеїнової кислоти.

26. Композиція за будь-яким з пп. 19-25, в якій вказану модифікацію вибирають з групи, що складається з мутації, заміни основи, делеції, вставки, заміни, зв'язування, розщеплення, створення дволанцюжкового розриву, одноланцюжкового розриву, метилювання, ацетилювання, лігування, рекомбінації, розкручування спіралі, хімічної модифікації, мічення, активації, інактивації та репресії.

27. Композиція за будь-яким з пп. 19-26, в якій вказана SCNA включає молекулу нуклеїнової кислоти, що вибирається з групи, що складається з одноланцюжкової ДНК, одноланцюжкової РНК, дволанцюжкової РНК, модифікованої ДНК, модифікованої РНК, закритої нуклеїнової кислоти (LNA) і пептидонуклеїнової кислоти (PNA) або їх комбінацій.

28. Композиція за будь-яким з пп. 19-27, в якій взаємодія між SCNA і нуклеїновою кислотою-мішенню здійснюється через спарювання основ.

29. Композиція за будь-яким з пп. 19-28, в якій ділянка розпізнавання в SCNA включає РНК вторинної або третинної структури.

30. Композиція за будь-яким з пп. 19-29, в якій ділянка розпізнавання в SCNA містить нуклеотидний мотив, здатний до взаємодії зі зв'язувальним доменом поліпептиду.

31. Композиція за будь-яким з пп. 19-30, в якій взаємодією між модифікацією SCNA і вказаним зв'язувальним доменом є взаємодія нуклеїнової кислоти з білком.

32. Композиція за будь-яким з пп. 19-31, в якій взаємодія між нуклеотидним мотивом і зв'язувальним доменом є взаємодією РНК-зв’язувального мотиву зв’язувального домену зі структурою РНК.

33. Композиція за будь-яким з пп. 19-32, в якій зв'язувальний домен містить поліпептид, який зв'язується зі структурним мотивом РНК в SCNA.

34. Композиція за будь-яким з пп. 19-33, в якій фізична взаємодія між зв'язувальним доменом білкового компонента і ділянкою розпізнавання в компоненті, який стосується нуклеїнової кислоти, яка надає специфічність, утворює запрограмований функціональний комплекс в клітині-мішені.

35. Вектор, що містить нуклеотидну послідовність програмованого поліпептиду або послідовність нуклеїнової кислоти (SCNA), що надає специфічність, відповідно до будь-якого з пп. 19-34.

Текст

Реферат: Винахід стосується композиції програмованого нуклеопротеїнового молекулярного комплексу, який містить поліпептидний компонент і нуклеїнову кислоту, що надає специфічність (SCNA), який піддається самозбиранню in vivo, в клітині-мішені, і здатний до взаємодії із заданою послідовністю нуклеїнової кислоти-мішені. Винахід також стосується способу модифікування заданої послідовності нуклеїнової кислоти, клітин-хазяїв та трансгенних організмів із заданою генетичною модифікацією. UA 115772 C2 (12) UA 115772 C2 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід стосується композицій і способів для направленого впливу на послідовності нуклеїнових кислот і їх модифікації, використовуючи програмований молекулярний комплекс. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Основною сферою, що представляє інтерес в біології і медицині, є направлена зміна геномних нуклеотидних послідовностей. Такі зміни включають вставку, делецію і заміну ендогенних хромосомних послідовностей нуклеїнових кислот. У минулому були зроблені іншими спроби змінити геномні послідовності за допомогою різних методів. Направлений вплив на ген є біотехнологічним засобом, необхідним для маніпуляції з геномом або функціональної модифікації геному. Направлений вплив на ген може викликати зміну в конкретному місці в геномі, яка може бути або може не бути пов'язана з кодуючими послідовностями. У випадку направленого впливу на ген, заданий ендогенний ген або інша задана ендогенна послідовність нуклеїнової кислоти або направлено піддається розщепленню, що приводить до делеції, мутації, вставки або заміни, або направлено піддається хімічній модифікації згідно з направленою функціональною модифікацією гена. Однією перевагою направленого впливу на ген в порівнянні з ненаправленим одержанням трансгенного організму є можливість модифікувати або делетувати існуючі геномні послідовності без вставки чужорідної ДНК, або в альтернативному випадку помістити чужорідну донорну ДНК, за допомогою вставки або заміни, в заданий локус. Переважною є здатність до маніпулювання таким чином послідовністю без зайвих послідовностей, оскільки вони небажані для тваринників, фермерів, споживачів і регуляторних органів, і хоч була запропонована множина способів уникнення таких послідовностей, кожний має свої власні недоліками. Стратегії направленого впливу на ген в еукаріотах залежать від двох клітинних механізмів репарації розриву длРНК: гомологічної рекомбінації (HR) і шляхів репарації з використанням негомологічного з'єднання кінців (NHEJ). При NHEJ вставки гена залежать від існування розриву длДНК, який може відбуватися випадково (наприклад, завдяки випромінюванню або окислювальному пошкодженню) або бути наведеним нуклеазою, такою як TALE-нуклеаза (TALEN), мегануклеаза або нуклеаза з білковим доменом "цинкові пальці" (ZFN). HR можуть бути індуковані розривами длДНК. При HR, розрив длДНК не є необхідним, але може збільшити ефективність у випадку його знаходження поблизу сайта рекомбінації. Були проведені великі дослідження направленого впливу на ген з використанням HR, який працює досить ефективно в багатьох організмах, таких як бактерії, дріжджі і примітивні рослини, мох. HR також використовувалася у вищих організмах, таких як дрозофіла, миші і люди. -6 Коефіцієнти HR в цих організмах становлять приблизно 10 і можуть бути збільшені до більше -2 10 , при HR зі сприянням, за допомогою створення геноспецифічного DSB. Низькі коефіцієнти трансформацій є однією з причин, через які ці способи не є поширеними в генотерапії або програмах по селекції. Були запропоновані різні методи модифікації нуклеїнових кислот in vivo, і їх можна розділити на методи на основі ферментів і методи на основі нуклеотидів. Як правило, в методах на основі ферментів використовується ДНК-зв'язувальний білок, який має як необхідну каталітичну активність, так і здатність до зв’язування з бажаною послідовністю-мішенню за допомогою взаємодії білок-нуклеїнова кислота таким чином, який схожий з рестриктазами. Приклади включають мегануклеази, які являють собою ферменти, що зустрічаються в природі або сконструйовані, які розщеплюють рідкі послідовності, нуклеази з білковим доменом "цинкові пальці" (ZFN) або нуклеази, подібні до активаторів транскрипції (TALEN), які містять каталітичну нуклеазну субодиницю FokI, зв'язану з модифікованим ДНК-зв'язувальним доменом, і можуть розрізати кожну одну задану послідовність. У ZFN зв'язувальний домен складається з ланцюгів амінокислот, що скручуються в спеціалізовані домени "цинкові пальці". У TALEN, також, 34амінокислотні повтори, що походять з факторів транскрипції, скручується у великий ДНКзв'язувальний домен. У випадку направленого впливу на ген ці ферменти можуть розщеплювати геномну ДНК з утворенням дволанцюжкового розриву (DSB) або створювати одноланцюжковий розрив, який може бути репарований за допомогою одного з двох шляхів репарації, негомологічного з'єднання кінців (NHEJ) або гомологічної рекомбінації (HR). Потенційно шлях NHEJ може приводити до специфічних мутацій, делецій, вставок або подій заміни. Шлях HR приводить до заміни послідовності, що піддається направленому впливу, донорною послідовністю, що доставляється. Одним з недоліків цих методів на основі лише білків є необхідність в тривалій і трудомісткій розробці і забезпеченні відмінного білка для кожної бажаної послідовності-мішені. Інші недоліки включають частково обмежену підмножину нуклеотидних триплетів або послідовностей, розпізнаваних ZFN і мегануклеазами, відповідно. 1 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, навіть ZFN з шістьма білковими доменами "цинкові пальці", який дуже важко сконструювати, обмежується сайтом зв’язування, що складається лише з 18 нуклеотидів, і оскільки 18 нуклеотидів статистично недостатньо для надання специфічності послідовності на протязі послідовності, або складності, всього геному, вони повинні надаватися у вигляді гетеродимерів. Крім того, природа ZFN і TALEN вимагає скринінгу на предмет функціональності, і навіть вдалі нуклеази можуть демонструвати слабку ефективність направленого впливу на ген. У випадку методів на основі нуклеотидів в організм доставляються нуклеїнові кислоти, і ендогенні процеси здійснюють репарацію ДНК або направлений вплив на ген через гомологічну рекомбінацію без сприяння або інтеграцію олігонуклеотиду в геном. Ці нуклеїнові кислоти можуть доставлятися, використовуючи вірусні вектори, плазмідні вектори, Т-ДНКвектори і дволанцюжкові ДНК-олігонуклеотиди. Більш короткі нуклеотиди, називані олігонуклеотидами, що утворюють потрійну спіраль (TFO), використовуються для виправлення помилок спарювання на основі олігонуклеотидів, і можна добитися виправлення точкових мутацій або виправлення аж до 4 нуклеотидів. Існує достатній доказ, що ці методи до того ж залежать від утворення DSB, які можуть бути випадковими, випадково індукованими або локально індукованими ферментативними або хімічними модифікаціями за допомогою ферментів або реакційноздатних хімічних речовин, ковалентно зв'язаних з нуклеїновою кислотою, що доставляється. Дволанцюжкові розриви (DSB) в ДНК необхідні для HR. Специфічні попередньо існуючі DSB не є необхідними, але збільшують ефективність. Природні розриви в ДНК розташовуються випадковим чином і є рідкими, і, таким чином, ефективність -6 повинна бути низькою (10 ). DSB можна навмання індукувати за допомогою іонізуючого випромінювання або окислювальних хімічних речовин, збільшуючи ефективність ціною генотоксичності. При удосконаленні цієї системи, в минулому була виконана HR зі сприянням або репарація, використовуючи неферментативне розщеплення ДНК за допомогою хімічної модифікації кінця нуклеїнової кислоти. Ці модифікації включають EDTA-Fe або фотоактивований псорален і були використані для одержання специфічного відносно послідовності DSB в длДНК після включення in vitro з утворенням потрійної спіралі. У додатковому методі використовуються олігонуклеотиди, або модифіковані олігонуклеотиди, що походять з одноланцюжкової ДНК (олДНК), інакше відомі як "короткі синтетичні одноланцюжкові олігодезоксинуклеотиди" (ODN або ssODN). Однак, хоч методи на основі олігонуклеотидів можуть приводити до відносно ефективних точкових мутацій в геномах клітин ссавців, вони обмежуються цим способом коректування. Кон’югати олігонуклеотид-фермент є комбінацією двох методів, що включає нуклеїнову кислоту, ковалентно зв'язану in vitro з каталітичним ферментом до доставки кон’югата в організм. Ці методи, на відміну від методів на основі тільки ферментів, є модульними, дозволяючи готувати кон’югати, націлені на різноманіття послідовностей-мішеней. Основним недоліком кон’югатів олігонуклеотид-фермент є те, що вони не можуть піддаватися самозбиранню in vivo, внаслідок чого сильно обмежується їх застосовність для коректування геному in vivo. Додатковим вирішальним недоліком таких систем, відомих в даній галузі техніки, є те, що при використаннях цих кон’югатів ферментний компонент є активним у вигляді мономера, і тому будь-яке зв’язування ферменту з нуклеїновою кислотою, специфічне чи ні, буде приводити до розщеплення. Таке неспецифічне розщеплення дуже зменшує безпеку таких систем, оскільки вони могли б ввести небажані зміни/мутації в небажаних місцях. Некон’юговані системи олігонуклеотид-білок також використовувалися для розщеплення субстрату олДНК. У цій системі рестриктаза класу IIS, FokI, яка розщеплює поза сайтом розпізнаванням, використовувалася in vitro, разом з олігонуклеотидом, що утворює структуру "шпильки", який відтворює послідовність розпізнавання FokI, з ферментом PolIk і dNTP для створення дволанцюжкової ділянки ДНК, праймером для якої служить олігонуклеотид, що піддається розщепленню. У цій системі розщеплюється не тільки запланована послідовність, але будь-який сайт для FokI, що зустрічається в природі, буде розпізнаватися, і послідовність, що примикає до нього, буде розщеплюватися. Оскільки FokI характеризуються сайтом розпізнавання, що складається з лише 5 нуклеотидів, це означає, що існують тисячі потенційних сайтів розщеплення в цілому геномі, що робить цю систему непридатною для коректування геному. У вищих рослин і людей, на відміну від інших організмів, у випадку яких HR може використовуватися для направленого впливу на ген, шлях NHEJ є переважаючим ендогенним механізмом. Механізми репарації ДНК в рослинах не допускають ефективну HR між донорною і хромосомною ДНК. Дійсно, загальновизнано, що молекули чужорідної донорної ДНК, які часто доставляють за допомогою генетичної трансформації з використанням Agrobacterium, 2 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розпізнаються шляхом негомологічного з'єднання кінців (NHEJ) у рослин, що приводить до їх випадкової інтеграції по всьому геному хазяїна. Таким чином, найсучасніші методи трансформації рослин не вважаються направленим впливом на ген, оскільки в цих методах послідовності випадково вбудовуються в геном і, як небажаний побічний ефект, можуть руйнувати існуючий ген, і часто вбудовуються у множині копій або містять небажані залишки плазмідних, маркерних або бактеріальних послідовностей. У способах індукції специфічних розривів длДНК, застосовних для HR зі сприянням і направленого NHEJ, використовується експресія нуклеаз in vivo. Вони включають розрізувальні рідкі послідовності нуклеази (рідкі "різальники"), такі як мегануклеази або химерні мегануклеази, що походять з самонавідних ендонуклеаз, спеціально створені рекомбінантні ендонуклеази з білковими доменами "цинкові пальці" (ZFN) або спеціально створені рекомбінантні TAL нуклеази-ефектори. У цих методах розпізнавання розщеплюваного сайтамішені досягається за допомогою взаємодії білкового домену або субодиниці, що природно розпізнає специфічну нуклеотидну послідовність, або спеціально сконструйований для розпізнавання специфічної нуклеотидної послідовності, і не основане на гібридизації полінуклеотид-полінуклеотид або спарюванні основ. Наприклад, нуклеази з білковими доменами "цинкові пальці" являють собою химерні білки, сконструйовані у вигляді гібридів між нуклеазною субодиницею FokI і синтетичними доменами "цинкові пальці" (ZF). Нуклеази з білковими доменами "цинкові пальці" не містять компонент, що належить до нуклеїнової кислоти. Розроблені ZFN, які специфічно розпізнають нуклеотидні триплети завдяки комбінації з декількох мотивів ZF. Не можна сконструювати ZFN, які розпізнають всі послідовності внаслідок властивої їм здатності розпізнавати тільки обмежену підмножину нуклеотидних триплетів. Використання гетеродимерів ZFN, згідно з яким дві різних ZFN, які неактивні у вигляді мономера, доставляються разом, надає позитивний ефект на специфічність, хоч це ускладнює подальшу розробку і зменшує вибір послідовностей-мішеней. ZFN також використовувалися для створення штучних факторів транскрипції як для активації, так і для репресії генів, для зміни регуляції генів. Однак такі фактори транскрипції на основі "цинкових пальців" не можуть зв'язуватися зі всіма послідовностями, будучи обмеженими за розміром сайта розпізнавання і обмеженими декількома специфічними тринуклеотидними мотивами, і, таким чином, не можуть використовуватися для активації або супресії всіх можливих генів. Наприклад, Schierling і ін. описують нову платформу для нуклеаз з білковими доменами "цинкові пальці" зі специфічним відносно послідовності елементом розщеплення. Наприклад, Eisenschmidt K. і ін. описують запрограмовану рестрикційну ендонуклеазу для дуже специфічного розщеплення ДНК. Наприклад, WO 2006/027099 направлена на кон’югати з ферментами з програмованою специфічністю, які реагують з ДНК дуже специфічним чином. Kubo і ін., наприклад, описують контролювання внутрішньоклітинної доставки олігонуклеотидів за допомогою сигнальних пептидів і генетичної експресії в клітинах людини. Jinek і ін. описують програмовану, направлювану здвоєною РНК ДНК-ендонуклеазу в адаптивному антибактеріальному імунітеті. WO 2012/129373, наприклад, направлена на способи створення трансгенного локусу складної ознаки. Проте, в даній галузі техніки все ще існує незадоволена потреба в безпечних, надійних, модульних і недорогих композиціях і способах, які роблять можливим специфічний направлений вплив і модифікацію послідовностей нуклеїнових кислот-мішеней in vivo. КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ Даним винаходом забезпечуються композиції і способи для направленого впливу і модифікації послідовностей нуклеїнових кислот, in vivo або in vitro. Відповідно до деяких варіантів здійснення новий складений програмований молекулярний комплекс (нуклеопротеїновий комплекс), що забезпечується тут, використовується для точного, надійного і економічно ефективного коректування або функціональної модифікації заданої послідовності нуклеїнової кислоти-мішені. У деяких варіантах здійснення молекулярний комплекс, розкритий тут, використовується для направленого впливу на ген і/або направленої функціональної модифікації гена, в тому числі, але без обмеження, створення розривів в одному або двох ланцюгах нуклеїнової кислотимішені для викликання появи мутації гена, делеції, заміни гена і інтеграції чужорідної молекули нуклеїнової кислоти або для його хімічної, конформаційної або біологічної функціональної модифікації. Відповідно до деяких варіантів здійснення молекулярний комплекс, розкритий тут, включає (a) химерний поліпептид (який може кодуватися полінуклеотидною молекулою), при цьому химерний поліпептид включає: (i) функціональний (ефекторний) домен (FD), здатний до 3 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 модифікації сайта-мішені; і (ii) зв'язувальний домен (LD); і (b) нуклеїнову кислоту, що надає специфічність (SCNA), при цьому SCNA включає: (i) нуклеотидну послідовність, комплементарну ділянці нуклеїнової кислоти-мішені, фланкуючій сайт-мішень; і (ii) ділянку розпізнавання, здатну до специфічного приєднання до зв'язувального домену поліпептиду; внаслідок чого в результаті збирання поліпептиду і SCNA в клітині-хазяїні/мішені утворюється функціональний, програмований нуклеопротеїновий комплекс, здатний до специфічного модифікування нуклеїнової кислоти-мішені в сайті-мішені. У деяких варіантах здійснення даним винаходом забезпечується переважна композиція, яка включає білковий ефекторний модуль (елемент) (або молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує його) і програмуючий/націлюючий елемент, що належить до нуклеїнової кислоти, які можуть піддаватися самозбиранню in vivo в специфічний, активний, модифікуючий нуклеїнову кислоту молекулярний нуклеопротеїновий комплекс. У цьому комплексі, нуклеїнова кислота, також називана тут "програмуючим компонентом", "програмуючим олігонуклеотидом" або "нуклеїновою кислотою, що надає специфічність" (SCNA), забезпечує специфічність і здатності молекулярного комплексу до зв’язування з нуклеїновою кислотою-мішенню через спарювання основ вказаної нуклеїнової кислоти, що надає специфічність, і нуклеїнової кислоти-мішені. Білковий ефекторний компонент або модуль цього комплексу призначений для зв’язування/приєднання до нуклеїнової кислоти, що визначає специфічність, за допомогою хімічного компонента, приєднаного до олігонуклеотиду, модифікації нуклеотиду або нуклеотидів в олігонуклеотиді, послідовності специфічного розпізнавання в олігонуклеотиді і т. п. або їх комбінацій. Переважно, розкриті тут композиції і способи надають більш високу специфічність з широким діапазоном бажаних послідовностей-мішеней, є менш генотоксичними, з використанням модулів (елементів) при їх збиранні, надійними, з використанням однієї платформи без спеціалізації, зручними для незалежного застосування поза спеціалізованими головними центрами, і характеризуються більш короткими часовими рамками розробки і зниженими витратами. Активність білкового модуля може приводити до модифікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені і/або функціональної модифікації нуклеїнової кислоти-мішені. Модифікація нуклеїнової кислоти-мішені може включати, але без обмеження, мутацію, делецію, вставку, заміну, зв’язування, розщеплення, одноланцюжковий розрив, метилування, ацетилювання, лігування, рекомбінацію, розкручування спіралі, хімічну модифікацію, мічення, активацію і інактивацію або будь-які їх комбінації. Функціональна модифікація нуклеїнової кислоти-мішені може приводити до, але без обмеження, змін активації транскрипції, інактивації транскрипції, альтернативного сплайсингу, реконфігурації структури хроматину, інактивації патогену, інактивації вірусу, зміни клітинної локалізації, компартменталізації нуклеїнової кислоти і т. п. або їх комбінацій. Будь-яка коректувальна дія або інша модифікація, здійснювана білковим компонентом, направлена або наведена на заплановану (задану) специфічну нуклеїнову кислоту-мішень внаслідок його зв'язку з нуклеїновою кислотою, що надає специфічність. Переважно, що використання кожного одного типу білкового компонента може поєднуватися з необмеженим набором нуклеотидних послідовностей нуклеїнових кислот, що визначають специфічність, разом або роздільно, щоб зробити можливою схожу дію на різні ділянки запланованої нуклеїнової кислоти-мішені. Це дозволяє подолати недоліки способів рівня техніки в результаті забезпечення універсальних, надійних і економічно ефективних способів і композицій для модифікації заданих послідовностей нуклеїнових кислот-мішеней. Таким чином, при використанні в одному вмістищі або організмі, тільки один тип білка повинен забезпечуватися разом з будь-якою комбінацією або множиною типів нуклеїнових кислот, що визначають специфічність. Це також включає можливість одночасного використання більше одного типу білкового компонента з більше ніж одним типом нуклеїнових кислот, що визначають специфічність. Відповідно до деяких варіантів здійснення розкритий тут комплекс є модульним і може піддаватися самозбиранню в клітині-мішені або in vivo, або in vitro, що робить можливим забезпечення одного типу білкового компонента в даний момент часу разом з одним або множиною олігонуклеотидів, що визначають специфічність. Крім того, в деяких варіантах здійснення білковий компонент може бути доставлений в бажану клітину(и) і експресований in vivo, очікуючи доставку будь-якої відповідної SCNA в більш пізній момент часу. У деяких варіантах здійснення білковий компонент і SCNA можуть доставлятися одночасно або по суті одночасно. Таким чином, комбінація білкового компонента і SCNA, переважно всередині бажаної клітини-мішені, може здійснювати індукцію специфічних геномних дволанцюжкових розривів (DSB) або будь-яку іншу бажану модифікацію нуклеїнової кислоти, in vivo. Способи даного винаходу не обмежуються введенням точкових мутацій в нуклеїнову кислоту-мішень, 4 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 оскільки молекулярний компонент може здійснювати направлений вплив на будь-яку послідовність нуклеїнової кислоти або пару послідовностей, здійснювати розрізання/рестрикцію/розщеплення в безпосередній близькості від них і в результаті делетувати невелику або велику ділянку нуклеїнової кислоти або здійснювати розрізання/рестрикцію/розщеплення послідовності для ініціації видалення або вставки, або заміни будь-якої послідовності нуклеїнової кислоти. Переважно, що даний винахід, в його варіантах здійснення, вперше розкриває експресію білкового компонента in vivo і його зв’язування/приєднання до SCNA в результаті самозбирання in vivo з утворенням молекулярного комплексу in vivo, без необхідності попереднього ковалентного/хімічного зв’язування білкового компонента з націлюючою нуклеїновою кислотою. Відповідно до варіантів здійснення даного винаходу, на відміну від відомої в даній галузі техніки системи на основі олігонуклеотидів, зв'язана з білком SCNA призначена не для функціонування як донора, а швидше як компонента, що надає специфічність, і не стає частиною модифікованої нуклеїнової кислоти. Крім того, в деяких варіантах здійснення даного винаходу SCNA може бути експресована in vivo так, що викликається збирання всіх компонентів молекулярного комплексу з використанням одного прийому доставки. Крім того, відповідно до деяких варіантів здійснення ефекторний білок може бути сконструйований так, щоб він був активним тільки після його димеризації (тобто він повинен утворити димер, щоб бути активним), відповідно до чого димеризацію можна контролювати з умови, щоб активний димер міг утворюватися лише тоді, коли він є направленим/запрограмованим за допомогою SCNA і зв'язується зі своїм сайтоммішенню, наприклад, коли відстані між молекулами-мономерними партнерами (білками) димеру є достатньо визначеними. Таким чином, переважно, молекулярний комплекс активується тільки в запланованому для нього сайті-мішені, внаслідок чого збільшується специфічність і надійність. Відповідно до подальших варіантів здійснення один білковий компонент може бути експресований для утворення/продукування гомодимерів, при цьому кожний є запрограмованим/направленим за допомогою відмінного олігонуклеотиду, що надає специфічність. Крім того, оскільки вірусні експресійні системи, які відомі в даній галузі техніки для використання для експресії білків in vivo, часто обмежуються продукцією одного білка через обмеження за розміром і часто є єдиними для схожих вірусів через перехресний імунітет, використання одного білкового компонента має, таким чином, важливу перевагу для цього способу доставки. Крім того, на відміну від інших способів, відомих в даній галузі техніки (таких як ZFN і мегануклеази), які характеризуються обмеженою підмножиною послідовностей розпізнавання, програмуючі олігонуклеотиди (SCNA), розкриті тут, мають необмежений набір послідовностей, таким чином, мабуть, досягаючи надзвичайної специфічності відносно послідовності в геномах з високою складністю. Крім того, оскільки множину програмуючих олігонуклеотидів можна забезпечити разом з одним білковим ефекторним компонентом, можна модифікувати більше ніж одну мішень в один і той же час, що дає додаткові переваги в порівнянні з відомими в даній галузі техніки способами. Це може застосовуватися, наприклад, для швидкого нокауту множини генів або для вставки декількох різних ознак в різні положення, або мічення декількох різних положень однією донорною нуклеотидною міткою. Відповідно до деяких варіантів здійснення, оскільки незапрограмований білковий компонент (тобто білок, не приєднаний/не зв'язаний з програмуючим олігонуклеотидом) не має або має дуже низьку спорідненість до нуклеїнових кислот-мішеней, переважно досягається збільшена специфічність і безпека і зменшена генотоксичність. Як детально описано вище, ефектор або каталітичний домен білкового компонента є активним тільки після димеризації, відповідно до чого принаймні два програмуючих олігонуклеотиди (SCNA) повинні зв'язатися з фланкуючими мішень послідовностями для викликання димеризації білка і його активації. Два достатньо довгих програмуючих олігонуклеотиди можуть надати дуже високу теоретичну специфічність, необхідну в геномах з високою складністю, за допомогою створення великої комплементарності з сайтами зв’язування. Оскільки незапрограмований експресований білок не має спорідненість до нуклеїнової кислоти-мішені, він не зв'язується і/або не модифікує нуклеїнову кислоту-мішень. Таким чином, у випадку застосувань, коли, наприклад, програмуючі олігонуклеотиди доставляються окремо в клітину-мішень (яка вже експресує незапрограмований білковий компонент), або в умовах, коли олігонулеотиди виснажені в клітині-мішені (наприклад, внаслідок розведення або деградації), неспецифічне розщеплення не відбувається, внаслідок чого збільшується безпека і зменшується генотоксичність. Таким чином, відповідно до варіантів здійснення даного винаходу, як направлене негомологічне з'єднання кінців (NHEJ), так гомологічна рекомбінація (HR) зі сприянням можуть використовуватися специфічно і програмованим чином для досягнення одного або більше з наступного. 5 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1) Мутування послідовності ДНК за допомогою розщеплення всередині неї, створення дволанцюжкового розриву (DSB), який піддається деградації до деякої міри під дією ендогенних нуклеаз і знов лігуванню за допомогою ендогенного механізму репарації ДНК-NHEJ для створення або делеції в рамці зчитування і/або мутації зі зсувом рамки зчитування ДНК. На відміну від ліній на основі вставки Т-ДНК або транспозону рослин, цей спосіб делеції і мутації ендогенного гена не залишає після себе чужорідну ДНК, і рослину можна було б назвати нетрансгенною згідно з деякими визначеннями. При NHEJ один або більше нуклеотидів можуть бути також додані в DSB на основі ще не охарактеризованого ендогенного механізму, внаслідок чого досягається по суті той же ефект зсуву рамки зчитування або мутації. 2) Делеції ділянки послідовності ДНК за допомогою розщеплення двох послідовностей, фланкуючих її, які піддаються знов лігуванню за допомогою ендогенного механізму репарації ДНК-NHEJ, або за допомогою HR зі сприянням за допомогою розщеплення в або поблизу послідовності, яка делетується, і забезпечення донорної ДНК, яка надалі піддається рекомбінації з мішенню і яка містить послідовності, фланкуючі послідовність, яка делетується з мішені. 3) Вставки донорної нуклеїнової кислоти в DSB за допомогою розщеплення нуклеїнової кислоти-мішені і або забезпечення донорної ДНК, яка безпосередньо піддається лігуванню в гепі за допомогою механізму NHEJ, або переважно забезпечення донора, який гомологічний кінцям гепа, що піддається рекомбінації і лігуванню в гепі за допомогою HR зі сприянням. 4) Заміни послідовності нуклеїнової кислоти мішені за допомогою розщеплення обох послідовностей, фланкуючих її, і забезпечення вбудовуваної донорної нуклеїнової кислоти, яка або піддається лігуванню з фланкуючою мішень послідовністю за допомогою NHEJ, або переважно піддається рекомбінації і лігуванню за допомогою HR, за допомогою додавання послідовностей, схожих з нуклеїновою кислотою-мішенню, або послідовностей, фланкуючих її, на кінці донора. Відповідно до деяких варіантів здійснення, і без бажання обмежитися якою-небудь теорією або механізмами, переваги композицій і способів, розкритих тут, включають створення загальної схеми конструювання ферментативного комплексу, яка може бути направлена на необмежену вибірку послідовностей. Після оптимізації білкового компонента з конкретною метою (наприклад, розщеплення длДНК), цей же білок може використовуватися з необмеженою вибіркою послідовностей програмуючих нуклеїнових кислот (SCNA). Таким чином, різноманітність послідовностей-мішеней, на які впливають, досягається за допомогою розробки SCNA, без необхідності у важкій і трудомісткій повторній розробці і оптимізації білка, яка властива іншим методам, відомим в даній галузі техніки, наприклад TALEN, ZFN і мегануклеазам, у випадку яких сам білок повинен бути змінений і адаптований для кожної послідовності-мішені. Розробка і приготування синтетичних SCNA є відносно простою, швидкою і відносно недорогою. У деяких варіантах здійснення цього винаходу також можливе продукування SCNAs in vivo, що усуває необхідність доставки в клітину хімічно синтезованих SCNA. Крім того, можна розробити SCNA, які піддаються спарюванню основ з майже будь-якою бажаною послідовністю-мішенню, і, таким чином, можна направити молекулярний комплекс на майже будь-яку послідовність-мішень. Крім того, декілька послідовностей-мішеней можуть використовуватися в одній і тій же клітині одночасно. Наприклад, при коректуванні функцій, при якому потрібно більше ніж один сайт розщеплення, наприклад делетуванні або заміні конкретних ділянок нуклеїнової кислоти, за допомогою просто забезпечення чотирьох різних SCNA і одного білкового компонента. Відповідно до деяких варіантів здійснення, таким чином, забезпечується нуклеопротеїнова композиція для модифікації заданого сайта-мішені в послідовності нуклеїнової кислоти-мішені в клітині-мішені, при цьому композиція включає: (а) молекулу полінуклеотиду, що кодує поліпептид, або поліпептид, при цьому вказаний поліпептид включає: (i) функціональний (ефекторний) домен (FD), здатний до модифікування вказаного сайта-мішені, при цьому функціональний домен позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти; і (ii) зв'язувальний домен (LD), здатний до взаємодії з нуклеїновою кислотою, що надає специфічність (SCNA), при цьому зв'язувальний домен позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти-мішені; і (b) нуклеїнову кислоту, що надає специфічність (SCNA), або нуклеїнову кислоту, що кодує SCNA, при цьому SCNA включає: (i) нуклеотидну послідовність, комплементарну ділянці нуклеїнової кислоти-мішені, фланкуючій сайт-мішень; і (ii) ділянку розпізнавання, здатну до специфічного приєднання до зв'язувального домену поліпептиду з високою спорідненістю зв’язування; відповідно до чого внаслідок збирання поліпептиду і SCNA всередині клітини-мішені утворюється функціональний нуклеопротеїновий 6 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 комплекс, здатний до специфічної модифікації вказаної нуклеїнової кислоти-мішені в сайтімішені. У деяких варіантах здійснення функціональний домен включає каталітичний домен. У деяких варіантах здійснення поліпептид, крім того, включає домен субклітинної локалізації. У деяких варіантах здійснення модифікацію нуклеїнової кислоти-мішені вибирають з мутації, делеції, вставки, заміни, зв’язування, розщеплення, створення дволанцюжкового розриву, одноланцюжкового розриву, метилування, ацетилювання, лігування, рекомбінації, розкручування спіралі, хімічної модифікації, мічення, активації і інактивації. Відповідно до деяких варіантів здійснення SCNA включає молекулу нуклеїнової кислоти, вибирану з групи, що складається з одноланцюжкової ДНК, одноланцюжкової РНК, дволанцюжкової РНК, модифікованої ДНК, модифікованої РНК, закритої нуклеїнової кислоти (LNA) і пептидонуклеїнової кислоти (PNA) або їх комбінації. У деяких варіантах здійснення ділянка розпізнавання в SCNA включає модифікацію, вибирану з 5'-кінцевої модифікації, 3'-кінцевої модифікації і внутрішньої модифікації. У деяких варіантах здійснення хімічну модифікацію вибирають з групи, що складається з модифікації нуклеотиду і додавання ненуклеотидного компонента. У деяких варіантах ненуклеотидний компонент вибирають з біотину, флуоресцеїну, амінолінкерів, олігопептидів, аміноалілу, молекули барвника, флуорофорів, дигоксигеніну, акридиту, аденілювання, азиду, NHS-ефіру (N-гідроксисукцинімідного ефіру), холестерил-TEG (триетиленгліколю), алкінів, фоторуйновного біотину, тіолу, дитіолу. У деяких варіантах здійснення модифікацію нуклеотиду вибирають з групи, що складається з фосфату, 2-амінопурину, Тримеру-20, 2,6-діамінопурину, 5бромдезоксіуридину, дезоксіуридину, інвертованого dT, дидезоксинуклеотидів, 5метилдезоксицитидину, дезоксіінозину, 5-нітроіндолу, 2-О-метил-РНК-основ, ізо-dC, ізо-dG, фтормодифікованих основ і фосфоротіоатних зв'язків. У деяких варіантах здійснення модифікацію вибирають з групи, що складається з модифікації нуклеотиду, біотину, флуоресцеїну, амінолінкерів, олігопептидів, аміноалілу, молекули барвника, флуорофорів, дигоксигеніну, акридиту, аденілювання, азиду, NHS-ефіру, холестерил-TEG, алкінів, фоторуйновного біотину, тіолу, дитіолу, модифікованих основ, фосфату, 2-амінопурину, Тримеру-20, 2,6-діамінопурину, 5-бромдезоксіуридину, дезоксіуридину, інвертованого dT, дидезоксинуклеотидів, 5-метилдезоксицитидину, дезоксіінозину, 5-нітроіндолу, 2-О-метил-РНКоснов, ізо-dC, ізо-dG, фтормодифікованих основ і фосфоротіоатних зв'язків, і білків, ковалентно зв'язаних внаслідок їх взаємодії зі специфічними нуклеотидними послідовностями. У деяких варіантах здійснення білки, ковалентно зв'язані в результаті їх взаємодії зі специфічними нуклеотидними послідовностями, можна вибрати, але без обмеження, з білка VirD2 Agrobacterium, VPg пікорнавірусів, топоізомерази, білка А фага X174, білка А* X і будь-яких їх варіантів. У деяких варіантах здійснення приєднання/зв’язування/асоціація між модифікацією в SCNA і зв'язувальним доменом є результатом взаємодії пари партнерів по зв’язуванню, вибираної з нековалентної взаємодії пари партнерів по зв’язуванню, вибираної, але без обмеження, з пар біотин-авідин; біотин-стрептавідин; біотин-модифіковані форми авідину; білок-білок; взаємодій білок-нуклеїнова кислота; взаємодій ліганд-рецептор; взаємодій ліганд-субстрат; антитілоантиген; одноланцюжкове антитіло-антиген; антитіло або одноланцюжкове антитело-гаптен; гормон-білок, що зв'язується з гормоном; рецептор-агоніст; рецептор-антагоніст рецептора; IgG-білок А; фермент-кофактор ферменту; фермент-інгібітор ферменту; одноланцюжкова ДНКVirE2; StickyC-длДНК; RISC-РНК; білок оболонки вірусу-нуклеїнова кислота; одноланцюжковий Fv-фрагмент антитіла проти флуоресцеїну (анти-FAM ScFV) - флуоресцеїн; одноланцюжковий Fv-фрагмент імуноглобуліну проти DIG (анти-DIG-ScFv) - дигоксигенін (DIG) і VirD2 Agrobacterium - білок, що зв'язується з VirD2, і будь-яких їх варіантів. У деяких варіантах здійснення ділянка розпізнавання в SCNA включає нуклеотидний мотив, здатний до специфічного приєднання/зв’язування/асоціації зі зв'язувальним доменом химерного білка. У деяких варіантах здійснення приєднання/зв’язування/асоціацію між нуклеотидним мотивом і зв'язувальним доменом вибирають, але без обмеження, з таких між парами білок "цинкові пальці" - мотив для білкового домену "цинкові пальці"; домен розпізнавання рестриктази-послідовність розпізнавання рестриктазою; ДНК-зв'язувальний домен фактора транскрипції - ДНК-мотив; репресор-оператор; лейцинова блискавка-промотор; спіраль-петля-спіраль - домен Е-бокс; РНК-зв'язувальні мотиви, що включають домени з багатими аргініном мотивами, домени білка , домени з мотивом розпізнавання РНК (RRM), домени K-гомології, мотиви зв’язування дволанцюжкової РНК, РНК-зв'язувальні білкові домени "цинкові пальці" і ферменти, мішенню яких є РНК, - упізнавана специфічна послідовність РНК; білок rev ВІЛ - "Ніжка" IIB елемента ВІЛ, що відповідає на rev (RRE); основний зв'язувальний 7 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 домен Tat бичачого вірусу імунодефіциту (BIV) - петльова ділянка 1 послідовності трансдіючого елемента відповіді (TAR) BIV; N-білки фага , 21 і P22 - "шпильки" петлі боксу-В в сайтах Nвикористання (nut) у відповідних ним РНК. Відповідно до деяких варіантів здійснення забезпечується спосіб модифікування заданого сайта-мішені в послідовності нуклеїнової кислоти-мішені за допомогою програмованого нуклеопротеїнового молекулярного комплексу, який включає стадії: a) доставки послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує програмований химерний білок (поліпептид), або білка (поліпептиду) в клітину-хазяїна; b) доставки молекули нуклеїнової кислоти, що надає специфічність (SCNA), або нуклеїнової кислоти, що кодує SCNA, у вказану клітину-хазяїна; c) зв’язування вказаного химерного білка з SCNA, внаслідок чого химерний білок націлюється на задану послідовність нуклеїнової кислоти-мішень в клітині-хазяїні, з утворенням активного запрограмованого нуклеопротеїнового комплексу; і d) допуску модифікації заданого сайтамішені послідовності нуклеїнової кислоти-мішені за допомогою вказаного активного запрограмованого нуклеопротеїнового молекулярного комплексу. У деяких варіантах здійснення забезпечується спосіб модифікування заданого сайта-мішені в послідовності нуклеїнової кислоти-мішені за допомогою програмованого нуклеопротеїнового молекулярного комплексу, який включає стадії: a) доставки послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує програмований химерний поліпептид, в клітину-хазяїна, при цьому вказаний химерний поліпептид включає: (i) функціональний домен, здатний до модифікування вказаного сайта-мішені, при цьому функціональний домен позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти; і (ii) зв'язувальний домен, здатний до взаємодії з нуклеїновою кислотою, що надає специфічність, при цьому зв'язувальний домен позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти-мішені; b) доставки молекули нуклеїнової кислоти, що надає специфічність (SCNA), або нуклеїнової кислоти, що кодує SCNA, у вказану клітину-хазяїна, при цьому вказана молекула SCNA включає: (i) нуклеотидну послідовність, комплементарну ділянці нуклеїнової кислоти-мішені, фланкуючій сайт-мішень; і (ii) ділянку розпізнавання, здатну до специфічного приєднання до зв'язувального домену поліпептиду з високою спорідненістю зв’язування; причому експресія поліпептиду в клітині, що містить SCNA, створює можливість для приєднання вказаного химерного поліпептиду до SCNA, утворюючи активний запрограмований нуклеопротеїновий комплекс, внаслідок чого химерний білок націлюється на задану послідовність нуклеїнової кислоти-мішень в клітині-хазяїні, допускається модифікація заданого сайта-мішені послідовності нуклеїнової кислоти-мішені за допомогою вказаного активного запрограмованого нуклеопротеїнового молекулярного комплексу. У деяких варіантах здійснення нуклеїновою кислотою-мішенню є ДНК. У деяких варіантах здійснення ДНК-мішенню є геномна ДНК. У деяких варіантах здійснення послідовністю нуклеїнової кислоти-мішенню є послідовність екстрахромосомної нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах здійснення послідовність екстрахромосомної нуклеїнової кислоти, що є мішенню, знаходиться в органелі, вибираній з групи, що складається з мітохондрії, хлоропласта, амілопласту і хромопласта. У деяких варіантах здійснення послідовністю нуклеїнової кислотимішенню є послідовність вірусної нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах здійснення послідовністю нуклеїнової кислоти-мішенню є послідовність прокаріотичної нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах здійснення послідовністю нуклеїнової кислоти-мішенню є синтетична послідовність нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах здійснення модифікацію вибирають з мутації, делеції, вставки, заміни, зв’язування, розщеплення, створення дволанцюжкового розриву, одноланцюжкового розриву, метилування, ацетилювання, лігування, рекомбінації, розкручування спіралі, хімічної модифікації, мічення, активації і інактивації. У деяких варіантах здійснення химерний білок (поліпептид) включає білковий компонент, що має модифікуючу нуклеїнову кислоту активність. У деяких варіантах здійснення химерний білок включає білковий компонент, що містить функціональний модифікатор нуклеїнової кислоти, причому функціональну модифікацію вибирають з групи, що складається з активації транскрипції, інактивації транскрипції, сайленсингу РНК-транскрипту, альтернативного сплайсингу РНК, реконфігурації структури хроматину, інактивації внутрішньоклітинного паразита і вірусу і зміни клітинної локалізації або компартменталізації вказаної послідовності нуклеїнової кислоти-мішені. 8 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення SCNA включає молекулу, вибирану з групи, що складається з одноланцюжкової ДНК, одноланцюжкової РНК, дволанцюжкової РНК, модифікованої ДНК, модифікованої РНК, закритої нуклеїнової кислоти (LNA) і пептидонуклеїнової кислоти (PNA) або їх комбінацій. У деяких варіантах здійснення SCNA включає послідовність, що визначає специфічність, сформовану так, що вона специфічно взаємодіє з нуклеїновою кислотоюмішенню. Взаємодія між SCNA і нуклеїновою кислотою-мішенню здійснюється через спарювання основ, вибиране з групи, що складається зі спарювання основ з утворенням повної подвійної спіралі, спарювання основ з утворенням часткової подвійної спіралі, спарювання основ з утворенням повної потрійної спіралі, спарювання основ з утворенням часткової потрійної спіралі і D-петель або розгалужених форм, утворюваних внаслідок вказаного спарювання основ. У додаткових варіантах здійснення SCNA включає ділянку розпізнавання, сформовану так, що вона асоціюється/зв'язується/сполучається зі зв'язувальним доменом химерного білка. У деяких варіантах здійснення ділянка розпізнавання включає модифікацію, вибирану з групи, що складається з 5'-кінцевої модифікації, 3'-кінцевої модифікації і внутрішньої модифікації. Модифікацію можна вибрати, але без обмеження, з модифікації нуклеотиду, біотину, флуоресцеїну, амінолінкерів, олігопептидів, аміноалілу, молекули барвника, флуорофорів, дигоксигеніну, акридиту, аденілювання, азиду, NHS-ефіру, холестерил-TEG, алкінів, фоторуйновного біотину, тіолу, дитіолу, модифікованих основ, фосфату, 2-амінопурину, Тримеру-20, 2,6-діамінопурину, 5-бромдезоксіуридину, дезоксіуридину, інвертованого dT, дидезоксинуклеотидів, 5-метилдезоксицитидину, дезоксіінозину, 5-нітроіндолу, 2-О-метил-РНКоснов, ізо-dC, ізо-dG, фтормодифікованих основ і фосфоротіоатних зв'язків, і білків, ковалентно зв'язаних внаслідок їх взаємодії зі специфічними нуклеотидними послідовностями. Білки, ковалентно зв'язані в результаті їх взаємодії зі специфічними нуклеотидними послідовностями, вибирають з білка VirD2 Agrobacterium, VPg пікорнавірусів, топоізомерази, білка А фага X174, білка A* X і будь-яких їх варіантів. У деяких варіантах здійснення асоціація/зв’язування/сполучення між модифікацією в SCNA і зв'язувальним доменом є результатом нековалентної взаємодії пари партнерів по зв’язуванню, вибираної з пар біотин-авідин; біотин-стрептавідин; біотин-модифіковані форми авідину; взаємодій білок-білок; взаємодій білок-нуклеїнова кислота; взаємодій ліганд-рецептор; взаємодій ліганд-субстрат; взаємодій антитіло-антиген; одноланцюжкове антитіло-антиген; одноланцюжкове антитіло-антиген; антитіло або одноланцюжкове антитело-гаптен; гормонбілок, що зв'язується з гормоном; рецептор-агоніст; рецептор-антагоніст рецептора; одноланцюжковий Fv-фрагмент антитіла проти флуоресцеїну (анти-FAM ScFV) - флуоресцеїн; одноланцюжковий Fv-фрагмент імуноглобуліну проти DIG (анти-DIG-ScFv) - дигоксигенін (DIG); IgG-білок А; фермент-кофактор ферменту; фермент-інгібітор ферменту; одноланцюжкова ДНКVirE2; StickyC-длДНК; RISC-РНК; білок оболонки вірусу-нуклеїнова кислота і VirD2 Agrobacterium - білок, що зв'язується з VirD2, і будь-яких їх варіантів. У деяких варіантах здійснення зв’язування/зв'язок між послідовністю нуклеїнової кислоти, що надає специфічність, і зв'язувальним доменом білкового компонента ковалентно створюється in vivo. У деяких варіантах здійснення ковалентний зв'язок зв'язувального домену з SCNA є результатом біологічної взаємодії VirD2 Agrobacterium - послідовність правого краю або будь-яких їх варіантів, і утворюється в бактерії, що включає Agrobacterium. У деяких варіантах здійснення ділянка розпізнавання включає нуклеотидний мотив, здатний до взаємодії/сполучення/зв’язування зі зв'язувальним доменом химерного білка. У деяких варіантах здійснення пару партнерів по взаємодії вибирають з пар білок "цинкові пальці" - мотив для білкового домену "цинкові пальці"; домен розпізнавання рестриктази - послідовність розпізнавання рестриктазою; ДНК-зв'язувальний домен фактора транскрипції - ДНК-мотив; репресор-оператор; лейцинова блискавка-промотор; спіраль-петля-спіраль - домен Е-бокс; РНК-зв'язувальні мотиви, що включають домени з багатими аргініном мотивами, домени білка , домени з мотивом розпізнавання РНК (RRM), домени K-гомології, мотиви зв’язування дволанцюжкової РНК, РНК-зв'язувальні білкові домени "цинкові пальці" і ферменти, мішенню яких є РНК, - упізнавана специфічна послідовність РНК; білок rev ВІЛ - "Ніжка" IIB елемента ВІЛ, що відповідає на rev (RRE); основний зв'язувальний домен Tat бичачого вірусу імунодефіциту (BIV) - петльова ділянка 1 послідовності трансдіючого елемента відповіді (TAR) BIV; N-білки фага , 21 і P22 - "шпильки" петлі боксу-В в сайтах N-використання (nut) у відповідних ним РНК. Відповідно до деяких варіантів здійснення задана послідовність нуклеїнової кислоти-мішені пов'язана з генетичною ознакою, і модифікація приводить до змін транскрипції або трансляції генетичного елемента, внаслідок технічної процедури, вибираної з групи, що складається зі 9 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стабільного заміщення, нокауту, тимчасового або постійного збільшення, вимкнення, зниження експресії і зсуву рамки зчитування. У деяких варіантах здійснення генетична ознака модифікується при коректуванні самої послідовності генетичного елемента, регулюючих її послідовностей, генів, регулюючих ген, що представляє інтерес, або регулюючих їх послідовностей в регуляторному ланцюзі подій. Відповідно до подальших варіантів здійснення забезпечується нуклеопротеїновий комплекс, причому внаслідок фізичного зв'язку білкового компонента з компонентом, що належить до нуклеїнової кислоти, що надає специфічність, утворюється запрограмований функціональний комплекс. У деяких варіантах здійснення фізичний зв'язок між зв'язувальним доменом білкового компонента і SCNA оснований на афінній взаємодії, вибираній з групи, що складається з взаємодій ліганд-рецептор, ліганд-субстрат, водневих зв'язків, сил Ван-дер-Ваальса, іонних зв'язків і гідрофобної взаємодії. Відповідно до деяких варіантів здійснення забезпечується клітина-хазяїн, що має задану генетичну модифікацію в заданому сайті-мішені, створену за допомогою розкритого тут способу. У деяких варіантах здійснення клітиною-хазяїном може бути клітина будь-якого типу, наприклад, але без обмеження, клітина хребетної тварини, клітина ссавця, клітина людини, клітина тварини, клітина рослини, клітина безхребетного, клітина круглого черв'яка, клітина комахи і стовбурова клітина. Відповідно до деяких варіантів здійснення забезпечується трансгенний організм або нокаутний організм, що має задану генетичну модифікацію, створену за допомогою розкритого тут способу. У деяких варіантах здійснення організмом є рослина або тварина. Відповідно до деяких варіантів здійснення, забезпечується спосіб лікування генетичного захворювання організму, який включає введення в клітину організму нуклеопротеїнового програмованого молекулярного комплексу. Відповідно до деяких варіантів здійснення забезпечується клітина-хазяїн, яка включає: a) поліпептид, що включає: (i) функціональний домен, здатний до модифікування сайтамішені в послідовності нуклеїнової кислоти-мішені в клітині, при цьому функціональний домен позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти; і (ii) зв'язувальний домен, який здатний до взаємодії з нуклеїновою кислотою, що надає специфічність, і позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти-мішені; і b) нуклеїнову кислоту, що надає специфічність (SCNA), яка включає: (i) нуклеотидну послідовність, комплементарну ділянці нуклеїнової кислоти-мішені, фланкуючій сайт-мішень; і (ii) ділянку розпізнавання, здатну до специфічного приєднання до зв'язувального домену поліпептиду; відповідно до чого внаслідок збирання поліпептиду і SCNA в клітині-хазяїні утворюється функціональний нуклеопротеїновий комплекс, здатний до специфічного модифікування нуклеїнової кислоти-мішені в сайті-мішені. У деяких варіантах здійснення забезпечується клітина-хазяїн, яка містить: (a) молекулу полінуклеотиду, що кодує поліпептид, при цьому поліпептид включає: (i) функціональний домен, здатний до модифікування сайта-мішені в послідовності нуклеїнової кислоти-мішені в клітині, при цьому функціональний домен позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти; і (ii) зв'язувальний домен, який здатний до взаємодії з нуклеїновою кислотою, що надає специфічність, і позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти-мішені; і (b) нуклеїнову кислоту, що надає специфічність (SCNA), яка включає: (i) нуклеотидну послідовність, комплементарну ділянці нуклеїнової кислоти-мішені, фланкуючій сайт-мішень; і (ii) ділянку розпізнавання, здатну до специфічного приєднання до зв'язувального домену поліпептиду; відповідно до чого внаслідок збирання поліпептиду і SCNA в клітиніхазяїні утворюється функціональний нуклеопротеїновий комплекс, здатний до специфічного модифікування нуклеїнової кислоти-мішені в сайті-мішені. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фіг. 1A-В являють собою схематичні ілюстрації, на яких представлені елементи/компоненти програмованого молекулярного комплексу, відповідно до деяких варіантів здійснення. Фіг. 2A-В являють собою схематичні ілюстрації, на яких представлене збирання програмованого молекулярного комплексу, відповідно до деяких варіантів здійснення. На фіг. 3 представлений з використанням просторового моделювання приклад молекулярного комплексу, розробленого для розщеплення заданою ядерною послідовності длДНК-мішені, відповідно до деяких варіантів здійснення. Фіг. 4A-В являють собою схематичні ілюстрації (масштаб не витриманий) способу, що наводиться як приклад, збирання компонентів програмованого молекулярного комплексу на нуклеїновій кислоті-мішені, відповідно до деяких варіантів. 10 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фіг. 5 являє собою схему, що демонструє доставку програмованого молекулярного комплексу в клітину, використовуючи in vitro одержані SCNA, відповідно до деяких варіантів здійснення. Фіг. 6 являють собою загальну схему, що демонструє доставку програмованого молекулярного комплексу в клітину, використовуючи in vivo продуковану SCNA, відповідно до деяких варіантів здійснення. Фіг. 7A-В являють собою схеми, на яких представлені необмежувальні приклади доставки компонента молекулярного комплексу, що належить до програмуючої нуклеїнової кислоти, в клітину, використовуючи SCNA у вигляді одноланцюжкової ДНК, продуковану в Agrobacterium (фіг. 7A), і бактеріальну систему секреції (фіг. 7В), відповідно до деяких варіантів здійснення. Фіг. 8A-В є схематичним ілюстраціями, що демонструють доставку програмуючого компонента програмованого молекулярного комплексу в клітину, використовуючи SCNA-РНК, продуковані з використанням Agrobacterium (фіг. 8A) або з використанням вектора, що автономно реплікується, такого як вірус (фіг. 8B), відповідно до деяких варіантів здійснення. На фіг. 9 представлена схематична ілюстрація (масштаб не витриманий) необмежувального прикладу транспортного засобу або вектора для одночасної доставки композиції, що включає компоненти, необхідні для збирання програмованого молекулярного комплексу, в сприйнятливу еукаріотичну клітину-мішень за один прийом доставки, відповідно до деяких варіантів здійснення. Фіг. 10 є схематичною ілюстрацією (масштаб не витриманий), що демонструє використання запрограмованого молекулярного комплексу для створення мутації в нуклеїновій кислоті-мішені, відповідно до деяких варіантів здійснення. Фіг. 11 є схематичною ілюстрацією (масштаб не витриманий), що демонструє використання запрограмованого молекулярного комплексу для вставки одного або множини нуклеотидів в нуклеїнову кислоту-мішень, використовуючи донорну нуклеїнову кислоту, що доставляється, відповідно до деяких варіантів здійснення. Фіг. 12 є схематичною ілюстрацією (масштаб не витриманий), що демонструє використання запрограмованого молекулярного комплексу для заміни одного або множини нуклеотидів в нуклеїновій кислоті-мішені, використовуючи донорну нуклеїнову кислоту, що доставляється, відповідно до деяких варіантів здійснення. Фіг. 13 є схематичною ілюстрацією (масштаб не витриманий), що демонструє використання запрограмованого молекулярного комплексу для створення делеції одного або множини нуклеотидів, що ідуть один за одним, з нуклеїнової кислоти-мішені, відповідно до деяких варіантів здійснення. Фіг. 14 є схематичною ілюстрацією (масштаб не витриманий), що демонструє використання запрограмованого молекулярного комплексу для заміни одного або множини нуклеотидів в нуклеїновій кислоті-мішені, використовуючи донорну нуклеїнову кислоту, що доставляється, відповідно до деяких варіантів здійснення. На фіг. 15 представлена схематична ілюстрація необмежувального прикладу транспортного засобу або вектора (масштаб не витриманий) для одночасної доставки в сприйнятливу еукаріотичну клітину-мішень білка програмованого молекулярного комплексу (PMCP) разом з послідовністю-мішенню для перевірки його активності, відповідно до деяких варіантів здійснення і як детально описано в прикладі 10. На фіг. 16 представлений схематична ілюстрація (масштаб не витриманий) параметрів для емпіричного визначення оптимальної відстані між парами SCNA і для перевірки здатності різних типів запрограмованих молекулярних комплексів до специфічного розщеплення ДНК-мішені, як детально описано в прикладі 12. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ДАНОГО ВИНАХОДУ Відповідно до деяких варіантів здійснення забезпечуються композиції і способи для модифікації заданої нуклеїнової кислоти-мішені. Зокрема, розкриті способи модифікування послідовності-мішені in vivo, використовуючи композицію, яка включає програмований молекулярний комплекс. Програмований молекулярний комплекс (також називаний тут "нуклеопротеїновим комплексом") включає білковий компонент (також званий тут "програмованим компонентом") і компонент, що належить до нуклеїнової кислоти (також званий тут "нуклеїновою кислотою, що надає специфічність" (SCNA), або "програмуючою нуклеїновою кислотою"). Відповідно до деяких варіантів здійснення компоненти молекулярного комплексу піддаються самозбиранню in vivo в живій клітині, організмі, тканині, калусі, органі або його частині, або диференційованій, або ні, в присутності послідовності(ей) нуклеїнової кислотимішені з утворенням активного, запрограмованого функціонального молекулярного комплексу. 11 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Потрібно розуміти, що використовувана тут термінологія призначена лише для опису конкретних варіантів здійснення і, як передбачається, не є обмежувальною. Необхідно зазначити, що використовувані в описі і прикладеній формулі винаходу форми однини включають посилання на множину, якщо контекстом не встановлене інше. У випадку наведення тут діапазону числових значень, однозначно передбачається кожне проміжне значення між ними з тією ж мірою точності. Наприклад, у випадку діапазону 6-9 передбачаються значення 7 і 8 крім 6 і 9, а у випадку діапазону 6,0-7,0 однозначно передбачаються значення 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 і 7,0. ВИЗНАЧЕННЯ Приблизно Використовуваний тут термін "приблизно" стосується +/-10%. Введення "Введення" направлене на забезпечення суб'єкта фармацевтичним засобом або композицією і включає, але без обмеження, введення медичним працівником і самостійне введення. "Парентеральне введення" означає введення не через кишечник. Парентеральне введення включає, але без обмеження, підшкірне введення, внутрішньовенне введення або внутрішньом'язове введення. "Підшкірне введення" означає введення безпосередньо під шкіру. "Внутрішньовенне введення" означає введення у вену. "Внутрішньопухлинне введення" означає введення в пухлину. "Хіміоемболізація" означає процедуру, при якій хірургічно або механічно блокують кровопостачання пухлини, і хіміотерапевтичні засоби вводять безпосередньо в пухлину. Антисмислові Використовуваний тут термін "антисмислові" стосується нуклеотидних послідовностей, які комплементарні специфічній послідовності ДНК або РНК. Термін "антисмисловий ланцюг" використовується відносно ланцюга нуклеїнової кислоти, який комплементарний "смисловому" ланцюгу. Антисмислові молекули можна продукувати будь-яким способом, включаючи синтез з використанням лігування гена(ів), що представляє інтерес, в зворотній орієнтації з вірусним промотором, який робить можливим синтез комплементарного ланцюга. Після введення в клітину, цей транскрибований ланцюг об'єднується з природними послідовностями, продукованими клітиною, з утворенням дуплексів. Ці дуплекси потім блокують або подальшу транскрипцію, або трансляцію. Таким чином можна створити мутантні фенотипи. Вектори, що автономно реплікуються "Вектори, що автономно реплікуються", як тут визначають, включають будь-яку природну або неприродну послідовність нуклеїнової кислоти, здатну до реплікації всередині хазяїна, включаючи, але без обмеження, віруси, модифіковані віруси, деякі рекомбінантні вектори і плазміди, реплікони і внутрішньоклітинні паразити. Клітина "Клітина", як тут визначають, включає будь-який тип клітини, прокаріотичну або еукаріотичну клітину, виділену чи ні, піддану культивуванню чи ні, диференційовану чи ні, і включає також організації клітин на більш високому рівні, такі як тканини, органи, калуси, організми або їх частини. Клітини, що наводяться як приклади, включають, але без обмеження, клітини хребетних тварин, клітини ссавців, клітини людини, клітини рослин, клітини тварин, клітини безхребетних, клітини круглих черв'яків, клітини комах, стовбурові клітини і т. п. Комплемент "Комплемент" або "комплементарний", як тут використовується, означає спарювання основ по Уотсону-Кріку (наприклад, A-T/U і C-G) або хугстинівське спарювання основ між нуклеотидами або аналогами нуклеотидів молекул нуклеїнових кислот. Повний комплемент або повністю комплементарний може означати 100% комплементарне спарювання основ між нуклеотидами або аналогами нуклеотидів молекул нуклеїнових кислот. Часткова комплементарність може означати компліментарність, що складає менше 100%, наприклад комплементарність, що складає 80%. Вектор для доставки Термін "вектор для доставки" або "вектори для доставки" призначений для будь-якого вектора для доставки, який можна використовувати в даному винаході для здійснення контакту з клітинами або доставки всередину клітин або субклітинних компартментів агентів/хімічних речовин і молекул (білків або нуклеїнових кислот), необхідних в даному винаході. Він включає, але без обмеження, вектори для трансдукції, ліпосомні вектори для доставки, плазмідні вектори для доставки, вірусні вектори для доставки, бактеріальні вектори для доставки, вектори 12 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для доставки лікарських засобів, хімічні носії, полімерні носії, ліпоплекси, поліплекси, дендримери, мікропузирчики (контрастні засоби для ультразвукової візуалізації), наночастинки, емульсії або інші відповідні вектори для перенесення. Ці вектори для доставки дозволяють доставляти молекули, хімічні речовини, макромолекули (гени, нуклеїнову кислоту(и), білки) або інші вектори, такі як плазміди і Т-ДНК. Ці вектори для доставки є носіями молекул. Доза "Доза", як тут використовується, означає певну кількість фармацевтичного засобу, що надається при одному введенні. У деяких варіантах здійснення дозу можна вводити у вигляді двох або більше болюсів, таблеток або ін'єкцій. Наприклад, в деяких варіантах здійснення, коли бажаним є підшкірне введення, бажана доза вимагає об'єм, який нелегко забезпечити за допомогою однієї ін'єкції. У таких варіантах здійснення можна використовувати дві або більше ін'єкцій для досягнення бажаної дози. У деяких варіантах здійснення дозу можна вводити у вигляді двох або більше ін'єкцій для мінімізації реакції в місці ін'єкції у індивідуума. Уніфікована доза "Уніфікована доза", як тут використовується, означає форму, в якій надається фармацевтичний засіб. У деяких варіантах здійснення уніфікованою дозою є пляшечка, що містить ліофілізований олігонуклеотид. У деяких варіантах здійснення уніфікованою дозою є пляшечка, що містить відтворену форму олігонуклеотиду. Донорна нуклеїнова кислота Термін "донорна нуклеїнова кислота" визначається тут як будь-яка нуклеїнова кислота, що доставляється в організм або вмістище для вбудовування або піддавання рекомбінації повністю або частково в (з) послідовність(ю)-мішень(ню) за допомогою механізмів репарації ДНК або гомологічної рекомбінації (HR) або за допомогою негомологічного з'єднання кінців (NHEJ). Тривалість "Тривалість", як тут використовується, означає період часу, під час якого триває активність або подія. У деяких варіантах здійснення тривалість лікування є періодом часу, під час якого вводять дози фармацевтичного засобу або фармацевтичної композиції. Експресійний вектор "Експресійний вектор", як тут використовується, означає будь-яку нуклеїнову кислоту, призначену для штучного кодування екзогенного білка або білків в клітині-хазяїні. Приклади експресійних векторів включають плазмідну ДНК, Т-ДНК, вірусну РНК, олДНК або длДНК, реплікони, вектори, що автономно реплікуються, лінійну олДНК, лінійну длДНК, продукти полімерази , РНК-транскрипт, РНК, що замикається в коло, а в деяких застосуваннях цього винаходу геномну ДНК або органельну ДНК, трансфіковану в клітину-хазяїна. Фрагмент "Фрагмент" використовується тут для указання на неповнорозмірну частину нуклеїнової кислоти або поліпептиду. Таким чином, сам фрагмент є також нуклеїновою кислотою або поліпептидом, відповідно. Ген "Ген", як тут використовується, може бути природним (наприклад, геномним) або синтетичним геном, що включає регулюючі транскрипцію і/або трансляцію послідовності і/або кодуючу область і/або нетрансльовані послідовності (наприклад, інтрони, 5'- і 3'-нетрансльовані послідовності). Кодуючою областю гена може бути нуклеотидна послідовність, що кодує амінокислотну послідовність або функціональну РНК, таку як тРНК, рРНК, каталітична РНК, кіРНК, мікроРНК або антисмислова РНК. Геном може також бути мРНК або кДНК, що відповідає кодуючим областям (наприклад, екзони і мікроРНК), що необов'язково включає 5'- або 3'нетрансльовані послідовності, зв'язані з нею. Ген може також являти собою молекулу ампліфікованої нуклеїнової кислоти, одержану in vitro, що включає всю і частину кодуючої області і/або 5'- або 3'-нетрансльовані послідовності, зв'язані з нею. Направлений вплив на ген "Направлений вплив на ген" використовується тут як будь-який генетичний метод, який викликає появу постійної зміни в послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, в тому числі делеції, вставки, мутації і замін нуклеотидів в послідовності-мішені. Геномна модифікація "Геномна модифікація" використовується тут як будь-яка модифікація, породжена в геномі або хромосомі, або екстрахромосомній ДНК, або органельній ДНК організму внаслідок направленого впливу на ген або функціональної модифікації гена. Клітина-хазяїн "Клітина-хазяїн", як тут використовується, може являти собою клітину, що зустрічається в природі, або трансформовану клітину, яка може містити вектор. Клітинами-хазяїнами можуть 13 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бути клітини, що піддаються культивуванню, експланти, клітини in vivo і т. п. Клітинамихазяїнами можуть бути прокаріотичні клітини, такі як Е. coli, або еукаріотичні клітини, такі як клітини рослин, дріжджові клітини, клітини комах, земноводних або ссавців, такі як CHO і HeLa. Відповідно до деяких варіантів здійснення вказана клітина-хазяїн є цілою або не цілою, диференційованою або не диференційованою, клітиною в організмі, органі, тканині або калусі. Ідентичність "Ідентичні" або "ідентичність", як тут використовується в зв'язку з двома або більше послідовностями нуклеїнових кислот або поліпептидів, означає, що послідовності мають певний процент залишків, які є однаковими на протязі певної ділянки. Процент можна розрахувати за допомогою оптимального поєднання двох послідовностей, порівняння двох послідовностей протягом певної ділянки, визначення числа положень, в яких ідентичний залишок зустрічається в обох послідовностях, для одержання числа співпадаючих положень, ділення числа співпадаючих положень на загальне число положень в певній ділянці і множення результату на 100 для одержання процента ідентичності послідовностей. У випадках, коли дві послідовності мають різні довжини, або поєднання приводить до одного або більше зміщених кінців, і певна ділянка порівняння включає тільки одну послідовність, залишки однієї послідовності включають в знаменник, але не в чисельник при розрахунку. При порівнянні ДНК і РНК, тимін (Т) і урацил (U) можуть вважатися еквівалентними. Розрахунок ідентичності можна виконати вручну або з використанням алгоритму для порівняння послідовностей за допомогою комп'ютера, такого як BLAST або BLAST 2.0. Інгібувати "Інгібувати", як тут використовується, може означати запобігати, приглушувати, пригнічувати, зменшувати або усувати. In vitro "In vitro" визначається тут як штучне середовище зовні оболонок (мембран) цілого або не цілого, диференційованого або не диференційованого живого організму, органа, тканини, калусу або клітини. У деяких варіантах здійснення термін "in vitro" означає не всередині життєздатної клітини. In vivo "In vivo" визначається тут як всередині цілого або не цілого, диференційованого або не диференційованого організму, органа, тканини, калусу або клітини. Набори "Набір", як тут використовується, може включати описані тут композиції разом з будь-якими або всіма з наступних: реагентами для дослідження, буферами, зондами і/або праймерами і стерильним сольовим розчином або іншою фармацевтично прийнятною основою для емульсії і суспензії. Крім того, набори можуть включати інструктивні матеріали, що містять указання (наприклад, протоколи) відносно здійснення на практиці описаних тут способів. Мітка "Мітка", як тут використовується, означає композицію, що піддається виявленню з використанням спектроскопічних, фотохімічних, біохімічних, імунохімічних, хімічних або інших 32 фізичних способів. Наприклад, застосовні мітки включають P, флуоресцентні барвники, електронно-щільні реагенти, ферменти (наприклад, які звичайно використовуються в ELISA), біотин, дигоксигенін або гаптени і інші молекули, які можна зробити виявлюваними. Мітка може бути включена в нуклеїнові кислоти і білки в будь-якому положенні. Невідповідність "Невідповідність" означає нуклеотидну основу першої нуклеїнової кислоти, яка не здатна до спарювання з нуклеотидною основою у відповідному положенні другої нуклеїнової кислоти. Модифікований олігонуклеотид "Модифікований олігонуклеотид", як тут використовується, означає олігонуклеотид, що має одну або більше модифікацій відносно кінця, що зустрічається в природі, цукру, нуклеотидної основи і/або міжнуклеозидного зв'язку. Модуляція "Модуляція", як тут використовується, означає флуктуації функції і/або активності, і/або структур. У деяких варіантах здійснення модуляція означає збільшення експресії гена. У деяких варіантах здійснення модуляція означає зменшення експресії гена. Мутант "Мутант", як тут використовується, стосується послідовності, у якої втрачена принаймні частина функціональності послідовності, наприклад, зміни послідовності промоторного або енхансерного району будуть впливати принаймні частково на експресію кодуючої послідовності в організмі. Використовуваний тут термін "мутація" стосується будь-якої зміни послідовності 14 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїнової кислоти, яка може відбуватися, наприклад, в результаті делеції, додавання, заміни або перестановок. Мутація може також впливати на одну або більше дій, в які залучена послідовність. Наприклад, зміна послідовності ДНК може приводити до синтезу зміненої мРНК і/або білка, яка(ий) є активною(им), частково активною(им) або неактивною(им). Нуклеїнова кислота "Послідовність нуклеїнової кислоти" або "олігонуклеотид", або "полінуклеотид", як тут використовується, означає принаймні два нуклеотиди, ковалентно зв'язані разом. Зображення одного ланцюга також визначає послідовність комплементарного ланцюга. Таким чином, нуклеїнова кислота також охоплює комплементарний ланцюг зображеного одного ланцюга. Множина варіантів нуклеїнової кислоти може використовуватися для того ж ланцюга, що і задана нуклеїнова кислота. Таким чином, нуклеїнова кислота також охоплює по суті ідентичні нуклеїнові кислоти і їх комплементи. Один ланцюг забезпечує зонд, який може гібридизуватися з послідовністю-мішенню в жорстких умовах гібридизації. Таким чином, нуклеїнова кислота також охоплює зонд, який гібридизується в жорстких умовах гібридизації. Нуклеїнові кислоти можуть бути одноланцюжковими або дволанцюжковими або можуть містити частини і дволанцюжкової, і одноланцюжкової послідовності. Нуклеїновою кислотою може бути ДНК, як геномна, так і кДНК, РНК або гібрид, у випадку якого нуклеїнова кислота може містити комбінації дезоксирибо- і рибонуклеотидів і комбінації основ, що включають урацил, аденін, тимін, цитозин, гуанін, інозин, ксантин, гіпоксантин, ізоцитозин і ізогуанін. Нуклеїнові кислоти можна одержати за допомогою методів хімічного синтезу або за допомогою рекомбінантних методів. Нуклеїнова кислота буде, як правило, містити фосфодіефірні зв'язки, хоч можуть бути включені аналоги нуклеїнової кислоти, які можуть містити принаймні один відмінний зв'язок, наприклад фосфорамідатний, фосфоротіоатний, фосфородитіоатний або Ометилфосфороамідитний зв'язки і кістяки і зв'язки пептидонуклеїнових кислот. Інші нуклеїнові кислоти-аналоги включають НК з позитивно зарядженими кістяками; неіонними кістяками і кістяками, що не містять рибозу, в тому числі ті, які описані в патентах США №№ 5235033 і 5034506, що включені за допомогою посилання. Нуклеїнові кислоти, які містять один або більше нуклеотидів, що не зустрічаються в природі або модифіковані, також включені в одне визначення нуклеїнових кислот. Модифіковані аналоги нуклеотидів можуть знаходитися, наприклад, на 5'-кінці і/або 3'-кінці молекули нуклеїнової кислоти. Репрезентативні приклади аналогів нуклеотидів можуть бути вибрані з рибонуклеотидів, модифікованих по цукру або кістяку. Однак потрібно зазначити, що також модифіковані по нуклеотидній основі рибонуклеотиди, тобто рибонуклеотиди, що містять замість нуклеотидної основи, що зустрічається в природі, нуклеотидну основу, що не зустрічається в природі, таку як уридини або цитидини, модифіковані в 5-положенні, наприклад 5-(2-аміно)пропілуридин, 5-бромуридин; аденозини і гуанозини, модифіковані в 8-положенні, наприклад 8-бромгуанозин; деазануклеотиди, наприклад 7-деазааденозин; О- і N-алкіловані нуклеотиди, наприклад N6метиладенозин, є придатними. 2'-ОН-група може бути заміщена групою, вибираною з Н, OR, R, галогену, SH, SR, NH2, NHR, NR2 або CN, причому R являє собою C1-C6алкіл, алкеніл або алкініл, а галоген являє собою F, Cl, Br або I. Модифіковані нуклеотиди також включають нуклеотиди, кон’юговані з холестерином через, наприклад, гідроксипролінольний зв'язок. Модифікації рибозофосфатного кістяка можуть бути зроблені по ряду причин, наприклад, для збільшення стабільності і напівперіоду існування таких молекул в фізіологічних середовищах, для збільшення дифузії через клітинні мембрани або як зонди на біочипі. Модифікація кістяка може також підвищити стійкість до деградації, наприклад, в жорстких ендоцитозних умовах клітин. Модифікація кістяка може зменшити кліренс нуклеїнових кислот за допомогою гепатоцитів, наприклад, в печінці. Можна приготувати суміші нуклеїнових кислот, що зустрічаються в природі, і аналогів; альтернативно можна приготувати суміші різних аналогів нуклеїнових кислот і суміші нуклеїнових кислот, що зустрічаються в природі, і аналогів. Функціонально зв'язаний "Функціонально зв'язаний", як тут використовується, може означати, що експресія гена знаходиться під контролем промотору, з яким він просторово сполучений. Промотор може бути розташований 5' (вище) або 3' (нижче) від гена, що знаходиться під його контролем. Відстань між промотором і геном може бути приблизно такою ж, як відстань між цим промотором і геном, який він контролює в гені, з якого походить промотор. Як це відомо в даній галузі техніки, зміна цієї відстані може бути забезпечена без втрати функції промотору. Промотор "Промотор", як тут використовується, може означати синтетичну молекулу або молекулу природного походження, яка здатна до забезпечення, активації або збільшення експресії нуклеїнової кислоти в клітині. Промотор може включати одну або більше специфічних, 15 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 регулюючих транскрипцію послідовностей для додаткового збільшення експресії і/або для зміни просторової експресії і/або часової експресії того ж. Промотор може також включати дистальний енхансер або елементи-репресори, які можуть знаходитися на відстані аж до декількох тисяч пар основ від місця початку транскрипції. Промотор може походити з джерел, що включають віруси, бактерії, гриби, рослини, комах і тварин. Промотор може регулювати експресію компонента гена конститутивно, або диференціально, враховуючи клітину, тканину або орган, де має місце експресія, або враховуючи стадію розвитку, на якій має місце експресія, або у відповідь на зовнішні стимули, такі як фізіологічні стреси, патогени, іони металів або індуктори. Репрезентативні приклади промоторів включають промотор бактеріофага T7, промотор бактеріофага T3, промотор SP6, промотор-оператор lac, промотор tac, пізній промотор SV40, ранній промотор SV40, промотор RSV-LTR, промотор IE CMV, промотор 35S CaMV, промотор NOS, промотори генів білків теплового шоку, регульовані стероїдами промотори, регульовані металом промотори, специфічні для насіння промотори і промотори убіквітину рослин. Рекомбінантні клітини-хазяїни "Рекомбінантні клітини-хазяїни" стосується клітин, які були трансформовані векторами, сконструйованими з використанням методів рекомбінантних ДНК. Селектований маркер "Селектований маркер", як тут використовується, може означати будь-який ген, який надає фенотип клітині, що є хазяїном, тканині, органу, калусу або організму, в якій(ому) він експресується для полегшення їх ідентифікації і/або відбору тих з них, які трансфіковані або трансформовані генетичною конструкцією. Репрезентативні приклади селектованих маркерів включають ген стійкості до ампіциліну (AmpR), ген стійкості до тетрацикліну (TcR), бактеріальний ген стійкості до канаміцину (KanR), ген стійкості до зеоцину, ген AURI-C, який надає стійкість до антибіотика ауреобазидину А, ген стійкості до фосфінотрицину (Bar), ген неоміцин-фосфотрансферази (nptII), ген стійкості до гігроміцину, ген -глюкуронідази (GUS), ген хлорамфенікол-ацетилтрансферази (CAT), ген, що кодує зелений флуоресцентний білок (GFP), і ген люциферази. В деяких варіантах здійснення цього винаходу селектований маркер можна створити внаслідок модифікації ендогенного гена, наприклад анулювання рецептора хемокінів, експресованого і представленого на поверхні клітини, коли мутація цього гена приводить до мутації зі зсувом рамки зчитування і може бути потім піддана негативній селекції з використанням антитіла, або, наприклад, мутація W568L в гені ацетолактатсинтази тютюну, яка приводить до стійкості до гербіцидів хлорсульфурону і імазаквіну. Жорсткі умови гібридизації "Жорсткі умови гібридизації", як тут використовується, означає умови, при яких перша послідовність нуклеїнової кислоти (наприклад, зонд) буде гібридизуватися з другою послідовністю нуклеїнової кислоти (наприклад, мішенню), наприклад, в складній суміші нуклеїнових кислот. Жорсткі умови залежать від послідовності і будуть відрізнятися в різних обставинах. Можна вибрати жорсткі умови, які на приблизно 5-10°С нижче температури плавлення (Tm) для конкретної послідовності при заданій іонній силі і pH. T m може бути температурою (при заданій іонній силі, pH і концентрації нуклеїнової кислоти), при якій 50% зондів, комплементарних мішені, гібридизується з послідовністю мішені при рівновазі (оскільки послідовності мішені присутні в надлишку, при T m, 50% зондів захоплено при рівновазі). Жорсткими умовами можуть бути умови, при яких концентрація солі складає менше ніж приблизно 1,0M іона натрію, наприклад концентрація, що складає приблизно 0,01-1,0M іона натрію (або інших солей), при pH 7,0-8,3, а температура складає принаймні приблизно 30°С у випадку коротких зондів (наприклад, приблизно 10-50 нуклеотидів) і принаймні приблизно 60°С у випадку довгих зондів (наприклад, більше ніж приблизно 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можна також одержати за допомогою додавання дестабілізуючих агентів, таких як формамід. У випадку вибірної або специфічної гібридизації позитивний сигнал може в принаймні 2-10 разів перевищувати фонову гібридизацію. Жорсткі умови гібридизації, що наводяться як приклад, включають наступні: 50% формаміду, 5× SSC і 1% SDS, інкубація при 42°С, або 5× SSC, 1% SDS, інкубація при 65°С, з відмиванням в 0,2× SSC і 0,1% SDS при 65°С. Комплементарні "Комплементарні", як тут використовується, означає, що перша послідовність ідентична на принаймні 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% або 99% комплементу другої послідовності на протязі ділянки з 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 або більше нуклеотидів, або що дві послідовності гібридизуються в жорстких умовах гібридизації. По суті ідентичні 16 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 "По суті ідентичні", як тут використовується, означає, що перша і друга послідовності ідентичні на принаймні 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% або 99% на протязі ділянки з 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 або більше нуклеотидів або амінокислот, або, що стосується нуклеїнових кислот, якщо перша послідовність по суті комплементарна комплементу другої послідовності. Нуклеїнова кислота-мішень "Нуклеїнова кислота-мішень" або "послідовність-мішень", як тут використовується, є будьякою бажаною заданою послідовністю нуклеїнової кислоти, на яку впливають, в тому числі, але без обмеження, кодуючими або некодуючими послідовностями, екзонами або інтронами, регуляторними послідовностями, міжгенними послідовностями, синтетичними послідовностями і послідовностями внутрішньоклітинних паразитів. У деяких варіантах здійснення нуклеїнова кислота-мішень знаходиться в клітині, тканині, органі або організмі, що є мішенню. Нуклеїнова кислота-мішень включає сайт-мішень, який включає один або більше нуклеотидів всередині послідовності-мішені, які є модифікованими будь-якою мірою за допомогою розкритих тут способів і композицій. Наприклад, сайт-мішень може включати один нуклеотид. Наприклад, сайт-мішень може включати 1-300 нуклеотидів. Наприклад, сайт-мішень може включати приблизно 1-100 нуклеотидів. Наприклад, сайт-мішень може включати приблизно 1-50 нуклеотидів. Наприклад, сайт-мішень може включати приблизно 1-35 нуклеотидів. У деяких варіантах здійснення нуклеїнова кислота-мішень може включати більше одного сайта-мішені, який може бути ідентичним або відмінним. Направленна функціональна модифікація гена Терміни "направлена функціональна модифікація гена" і "модифікація гена-мішені" призначені для будь-якого генетичного методу, який приводить до постійної або тимчасової зміни нуклеїнової кислоти-мішені, в тому числі, але без обмеження, делеції, вставки, мутації, заміни, одноланцюжкового розриву, метилування, ацетилювання, лігування, рекомбінації, розкручування спіралі, хімічної модифікації, мічення, активації, інактивації і репресії одного або більше нуклеотидів в послідовності-мішені. Терапія "Терапія", як тут використовується, означає спосіб лікування захворювання. У деяких варіантах здійснення терапія включає, але без обмеження, хіміотерапію, хірургічну резекцію, трансплантацію і/або хіміоемболізацію. Трансгенний організм Цей термін призначений для організму, що містить одну або більше модифікацій генамішені в своєму геномі, внесених за допомогою розкритих тут композицій і способів. Наприклад, модифікацію вибирають з вставки, мутації, заміни одного або більше нуклеотидів, одноланцюжкового розриву, метилування, ацетилювання, лігування, рекомбінації, розкручування спіралі, хімічної модифікації, мічення, активації, інактивації і/або репресії. Організмом може бути організм будь-якого типу, наприклад людина, тварина, рослина і т. п. Транзиторна експресія "Транзиторна експресія" або "транзиторно експресуючий", як тут використовується, може стосуватися транскрипції або трансляції забезпечуваної нуклеїнової кислоти в цілому або не цілому, диференційованому або не диференційованому організмі, органі, тканині, калусі або клітині, при цьому вказана експресія є обмеженою внаслідок неінтеграції забезпечуваної нуклеїнової кислоти в стабільні нуклеїнові кислоти організму, органа, тканини, калусу або клітини, що включають геном або органельні нуклеїнові кислоти. Вектори для транзиторної експресії включають забезпечувані лінійні або замкнені в коло олДНК, длДНК або РНК, плазміди, вектори, що автономно реплікуються, віруси, in vitro транскрипти, Т-ДНК, синтетичні нуклеїнові кислоти і їх модифіковані похідні. Таким чином, хоч транзиторна експресія є неуспадковуваною по визначенню, вектор може експресуватися постійно в лініях клітин і автономно перенестися від клітини до клітини через реплікацію нуклеїнової кислоти поза хромосомою або органельним геномом. Лікувати "Лікувати" або "лікування", що використовується тут при посиланні на захист суб'єкта від стану, може означати запобігання,приглушення, пригнічення або усунення стану. Запобігання стану включає введення суб'єкту композиції, описаної тут, до виникнення стану. Приглушення стану включає введення суб'єкту композиції після викликання стану, але до його клінічного вияву. Пригнічення стану включає введення суб'єкту композиції після клінічного вияву стану, так що стан ослабляється або попереджується його погіршення. Усунення стану включає 17 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 введення суб'єкту композиції після клінічного вияву стану, так що суб'єкт більш не страждає на стан. Варіант "Варіант", як тут використовується з посиланням на нуклеїнову кислоту, означає (i) частину нуклеїнової кислоти, на яку посилаються; (ii) комплемент нуклеотидної послідовності, на яку посилаються, або її частини; (iii) нуклеїнову кислоту, яка по суті ідентична нуклеїновій кислоті, на яку посилаються, або її комплементу; або (iv) нуклеїнову кислоту, яка гібридизується в жорстких умовах з нуклеїновою кислотою, на яку посилаються, її комплементом або послідовністю, по суті ідентичною їй. Вектор "Вектор", як тут використовується, означає послідовність нуклеїнової кислоти, використовувану з метою доставки нуклеїнової кислоти. Вектор може використовуватися в цьому винаході для здійснення генетичної трансформації, експресії білка, транскрипції РНК або для використання безпосередньо як донора для гомологічної рекомбінації або негомологічного з'єднання кінців. Вектором може бути плазмідна ДНК, Т-ДНК, вірусна РНК, олДНК або длДНК, реплікони, вектори, що автономно реплікуються, лінійна або замкнена в коло олДНК, лінійна або замкнена в коло длДНК, розгалужені продукти полімерази , нуклеїнові кислоти у вигляді дендримерів, РНК-транскрипт, замкнена в коло РНК, бактеріофаг, бактеріальна штучна хромосома або дріжджова штучна хромосома, а в деяких застосуваннях цього винаходу геномна або органельна ДНК, перенесена в клітину-хазяїна. Вектором може бути або екстрахромосомний вектор, що не реплікується, самореплікується, або вектор, який інтегрується в геном хазяїна. Дикий тип Використовуваний тут термін "послідовність дикого типу" стосується кодуючої, некодуючої або пограничної послідовності, яка є алельною формою послідовності, що виконує природну або нормальну для цієї послідовності функцію. Послідовності дикого типу включають множину алельних форм спорідненої послідовності, наприклад множина алелів послідовності дикого типу може кодувати мовчазні або консервативні заміни в послідовності білка, яку кодує кодуюча послідовність. Відповідно до деяких варіантів здійснення композиція, що включає програмований молекулярний комплекс, який включає білковий (поліпептидний) компонент і компонент, що належить до нуклеїнової кислоти, піддається самозбиранню in vivo в живій клітині, організмі, тканині, калусі, органі або його частині в присутності послідовності(ей) нуклеїнової кислотимішені з утворенням активних, запрограмованих функціональних молекулярних комплексів. Відповідно до деяких варіантів здійснення можна сконструювати різні запрограмовані молекулярні комплекси, які постійно або тимчасово модифікують існуючу або можливу послідовність-мішень, що є еукаріотичною, прокаріотичною, синтетичною, належить до внутрішньоклітинного паразита або є вірусною, таку як послідовність, виявлювана в геномі, ядрі, хромосомі, цитоплазмі, органелі, або екстрахромосомна нуклеїнова кислота. Модифікація мішені, здійснювана під дією молекулярного комплексу, включає успадковані і неуспадковані, постійні і тимчасові зміни/модифікації. У деяких варіантах здійснення мішень складається з нуклеїнової кислоти, пов'язаної з генетичною ознакою, що представляє інтерес, яку корисно було б змінити. Зміни послідовності, підданої направленому впливу, включають, наприклад, але без обмеження, стабільну делецію, мутацію, вставку нуклеїнових кислот і заміну послідовності, підданої направленому впливу, іншою послідовністю нуклеїнової кислоти, нокаут, зсув рамки зчитування або будь-яку зміну яким-небудь чином транскрипції або трансляції гена, регулюючих його послідовностей, генів, регулюючих ген, що представляє інтерес, або регулюючих послідовностей в регуляторному ланцюзі подій. Постійні зміни нуклеїнової кислотимішені включають, наприклад, коректування генетичного матеріалу або зміни послідовності, такі як мутація, делеція, вставка, заміна і рекомбінація в нуклеїновій кислоті. Тимчасові зміни нуклеїнової кислоти-мішені включають, наприклад, зв’язування, розщеплення, одноланцюжковий розрив, розкручування спіралі, активацію, інактивацію, хімічну модифікацію, метилування, ацетилювання і мічення нуклеїнової кислоти-мішені. Модифікація мішені включає, наприклад, функціональну модифікацію мішені, яка може приводити в клітині до змін активації транскрипції, інактивації транскрипції, сайленсингу РНК, альтернативного сплайсингу РНК, реконфігурації структури хроматину, інактивації внутрішньоклітинного паразита і зміни клітинної локалізації або компартменталізації нуклеїнової кислоти-мішені. Відповідно до деяких варіантів здійснення, і без бажання обмежитися якою-небудь теорією або механізмом, розробка програмованого молекулярного комплексу основується на його здатності до самозбирання, його здатності до направленого впливу на задану заплановану 18 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність в нуклеїновій кислоті-мішені і його здатності впливати на послідовність-мішень заданим чином. Компоненти комплексу є модульними і пристосовуваними, щоб бути придатними для 1) конкретних типів необхідної молекулярної дії, 2) мішені і 3) бажаного способу доставки нуклеїнової кислоти, використовуваного для її експресії in vivo. Способи і композиції даного винаходу мають декілька переваг в порівнянні з іншими системами, відомими в даній галузі техніки. Наприклад, білкові компоненти комплексу є неактивними у вигляді мономерів, і тільки відповідна відстань, в межах обмеженого діапазону, між двома олігонуклеотидами SCNA, які зв'язуються з нуклеїновою кислотою-мішенню в заданій послідовності, буде приводити до такого розташування ефекторних доменів білкових компонентів, що вони будуть піддаватися димеризації і будуть здатні до специфічного впливу на бажаний, заданий сайт-мішень. Така установка, відповідно до якої тільки димери запрограмованих молекулярних комплексів (тобто комплексу, який включає білковий компонент, зв'язаний з SCNA, яка зв'язується з нуклеїновою кислотою-мішенню), зменшує або повністю усуває потенційне розщеплення поза сайтом або неспецифічне розщеплення, оскільки сам білковий компонент не зв'язується з нуклеїновою кислотою-мішенню і не функціонує у вигляді мономера. Відповідно до деяких варіантів здійснення конструюється активна частина (функціональний домен) молекулярного комплексу, що активується тільки після димеризації функціонального домену білкового компонента. Конструюється незапрограмований білковий компонент, який практично не має або має низьку неспецифічну спорідненість до послідовності нуклеїнової кислоти і до сайта-мішені. Таким чином, хоч у випадку всіх типів модифікацій необхідно експресувати один тип мономера білкового компонента, для мінімальних дій точкових модифікацій, таких як, наприклад, точкова мутація, опосередкована нуклеазним доменом, або в альтернативному випадку точкове метилування, опосередковане метилазним доменом, повинні бути присутніми дві SCNA, які призначені для зв’язування з послідовностями, фланкуючими сайт-мішень, щоб впливати на відповідну відстань між білками і допустити і їх зв’язування, і їх димеризацію одного з одним. Це переважно збільшує специфічність комплексу відносно послідовності. У деяких варіантах здійснення для коректування дій делетування і заміни може бути потрібне розщеплення одночасно двох різних сайтів, фланкуючих ділянку, що представляє інтерес. У такому варіанті здійснення, навіть в цьому випадку необхідно експресувати тільки один екзогенний білковий компонент разом з чотирма SCNA. Коли олігонуклеотиди виснажуються, або внаслідок розведення, або внаслідок деградації, незапрограмований експресований білок не має спорідненість до нуклеїнової кислоти-мішені і буде припиняти впливати на неї (тобто в цьому випадку припиняти розщеплення нуклеїнової кислоти-мішені). Відповідно до деяких варіантів здійснення білковий (поліпептидний) компонент можна експресувати у вигляді окремих поліпептидів або у вигляді одного безперервного білка (поліпептиду). У деяких варіантах здійснення білковий компонент (складова) може мати один або більше ідентифікованих доменів, що ідентифікуються згідно зі структурою і/або функцією (застосовністю). У деяких варіантах здійснення один структурний домен може мати більше одного домену застосовності, тобто структурний домен, що виділяється, може мати декілька функцій. Відповідно до деяких варіантів здійснення білковий компонент може включати один або більше наступних структурних доменів і/або доменів застосовності: a) "ефекторний домен" (функціональний домен), який може взаємодіяти з нуклеїновою кислотою-мішенню і в результаті здійснювати вплив на неї; і/або b) "зв'язувальний домен", який може безпосередньо або опосередковано специфічно зв'язуватися з SCNA; і/або с) "домен клітинної локалізації"; і/або d) міждоменні з'єднувачі або спейсери; і будь-яку їх комбінацію. Відповідно до деяких варіантів здійснення "ефекторний домен" (також званий тут "функціональним доменом") взаємодіє з нуклеїновою кислотою-мішенню після збирання молекулярного комплексу і надає запланований ефект на послідовність-мішень. У деяких варіантах здійснення, що наводяться як приклад, цей домен має ферментативну або каталітичну функцію, включаючи модифікуючу нуклеїнову кислоту активність. У деяких варіантах здійснення цей домен може походити з активних доменів, що походять з цілих або частин, або модифікованих частин білків з відомою функцією, таких як ДНК-зв'язувальний білок, нуклеаза, метилаза, фактор, що зв'язується з метильованою ДНК, фактор транскрипції, фактор реконструкції хроматину, полімераза, деметилаза, ацетилаза, деацетилаза, кіназа, фосфатаза, інтеграза, рекомбіназа, лігаза, топоізомераза, гіраза і хеліказа. У деяких варіантах здійснення функціональний домен можна сконструювати за допомогою злиття амінокислотної послідовності(ей) активних доменів, що походять з цілих або частин, або модифікованих частин білків з відомою функцією, таких як ДНК-зв'язувальний білок, нуклеаза, метилаза, фактор, що 19 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язується з метильованою ДНК, фактор транскрипції, фактор реконструкції хроматину, полімераза, деметилаза, ацетилаза, деацетилаза, кіназа, фосфатаза, інтеграза, рекомбіназа, лігаза, топоізомераза, гіраза і хеліказа. У деяких варіантах здійснення у випадку ефекторного домену, який є нуклеазою або походить з неї, ДНК-зв'язувальний домен розпізнавання нуклеази може бути видалений. Наприклад, коли ефекторний домен походить з нуклеази FokI, домени розпізнавання сайта для FokI і зв’язування з ним відсутні в ефекторному домені білкового компонента. У деяких варіантах здійснення ефекторний домен позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти-мішені, тобто він не може специфічно зв'язуватися зі специфічною послідовністю-мішенню. Відповідно до деяких варіантів здійснення "зв'язувальний домен" призначений для безпосереднього або опосередкованого зв’язування/приєднання SCNA (і особливо ділянки розпізнавання в SCNA). Зв’язування/приєднання між зв'язувальним доменом і SCNA може бути прямим або опосередкованим через, наприклад, модифікацію SCNA. Приєднання/зв’язування/сполучення між зв'язувальним доменом і SCNA робить можливим in vivo збирання SCNA з білковим компонентом. У деяких варіантах здійснення зв'язувальний домен конструюють за допомогою злиття амінокислотної послідовності білкового компонента з амінокислотами, що включають домен, який специфічно зв'язується з нуклеотидною послідовністю або хімічним або біологічним елементом в нуклеїновій кислоті, що надає специфічність. Фізична взаємодія між зв'язувальним доменом і нуклеїновою кислотою, що надає специфічність, може бути зумовлена, але без обмеження, афінностью внаслідок одного або більше з наступних типів взаємодій: взаємодій ліганд-рецептор, ліганд-субстрат, водневих зв'язків, сил Ван-дер-Ваальса, ковалентних зв'язків, що утворюються in vivo, іонних зв'язків і гідрофобної взаємодії. Приклади нековалентного зв’язування включають одне або більше, або фрагменти або частини або модифіковані форми, з наступного: приклади пар партнерів по зв’язуванню: біотин-авідин; біотин-стрептавідин; біотин-модифіковані форми авідину; білокбілок; нуклеїнова кислота-білок; ліганд-рецептор; субстрат-ліганд; антиген-антиген; антигенодноланцюжкове антитіло; гаптен-антитіло або одноланцюжкове антитіло; гормон-білок, що зв'язується з гормоном; агоніст-рецептор; антагоніст рецептора-рецептор; білок А-IgG; кофактор ферменту-фермент; інгібітор ферменту-фермент; одноланцюжкова ДНК-VirE2; длДНК-StickyC; РНК-білок сімейства Argonaute; длРНК-білок сімейства РНазиIII; нуклеїнова кислота-білок оболонки вірусу і VirD2 Agrobacterium або його частина - білок, що зв'язується з VirD2, і будь-які їх варіанти, відповідно до чого кожна нуклеїнова кислота, що надає специфічність, і кожний зв'язувальний домен включають один з членів пари. У варіанті здійснення, що наводиться як приклад, зв'язувальний домен містить одноланцюжковий Fvфрагмент антитіла, здатний до зв’язування з барвником флуоресцеїном, який в свою чергу хімічно зв'язаний через лінкер з 5'-кінцем або 3'-кінцем нуклеїнової кислоти, що надає специфічність, таким чином створюючи можливість для асоціації білкового компонента з компонентом програмованого комплексу, що належить до нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах здійснення зв'язувальний домен походить з восьмого потрійного спірального повтору PUF5-зв'язувального елемента С. elegans, а нуклеїнова кислота, що надає специфічність (SCNA), містить послідовність РНК, представлену в SEQ ID NO: 1 (CUCUGUAUCUUGU), на одному з її кінців або достатньо близько від нього. У цьому варіанті здійснення білок і SCNA безпосередньо об'єднуються без необхідності в хімічній модифікації SCNA, що робить можливим її біосинтез in vivo у вигляді транскрипту і, таким чином, робить можливою in vivo асоціацію білкового компонента і компонента програмованого комплексу, що належить до нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах здійснення, що наводяться як приклад, послідовність/молекула РНК, здатна до утворення вторинних або третинних структур (таких як петля "шпилька"), що знаходиться в SCNA, взаємодіє зі зв'язувальним доменом білкового компонента, який являє собою зв'язувальний домен, який зв'язується з РНК-мотивом, що походить з білків TAT-вірусів (таких як ВІЛ, бичачий вірус імунодефіциту т. п.). У деяких варіантах здійснення, що наводяться як приклад, 20-нуклеотидна послідовність, що зв'язується, шпильки РНК боксу-В з бактеріофага 21 знаходиться в SCNA і здатна до зв’язування/приєднання свого партнера - зв'язувального домену білкового компонента, який походить з РНК-зв'язувального білка (RBP) - N-білка бактеріофага 21. В іншому варіанті здійснення, що наводиться як приклад, який дозволяє продукувати SCNA in vivo, зв'язувальний домен походить з білка, який зв'язується з білком VirD2 Agrobacterium, включаючи VirD2зв'язувальні білки, що виявляються в бактеріях, включаючи VBP1, VBP2 і VBP3 і штучні одноланцюжкові антитіла, призначені для зв’язування з VirD2. В цьому варіанті здійснення SCNA продукується у вигляді олДНК з Т-ДНК в Agrobacterium, де вона ковалентно зв'язується на своєму 5'-кінці з тирозином 29 VirD2, який необхідний для ковалентного зв'язку, відповідно 20 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до чого ковалентний зв'язок виникає in vivo. Каталіз відбувається в бактерії, і комплекс надалі експортується з бактерії завдяки бактеріальній системі секреції в еукаріотичну клітину, включаючи клітини цілої або не цілої рослини, тварини і людини, їх тканини, калуси і органи. В цьому варіанті здійснення VirD2-зв'язувальний домен в зв'язувальному домені зв'язується з білком VirD2, прикріпленим до SCNA, що робить можливою асоціацію білкового компонента і компонента програмованого комплексу, що належить до нуклеїнової кислоти. В цьому варіанті здійснення можна було б розробити модифікації VirD2, експресованого в бактерії, які могли б зменшити інтеграцію ДНК і могли б принести користь для уникнення неспецифічної інтеграції ДНК. Приклади ковалентного зв'язку, що утворюється in vivo в організмі-мішені, включають, відповідно, в ділянці розпізнавання в SCNA і зв'язувальному домені, один або більше, фрагментів або частин або модифікованих форм, але без обмеження, з наступних прикладів пар партнерів по зв’язуванню, спарених за допомогою символу - тире: послідовність RB Т-ДНК GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCA (SEQ ID NO: 2) - VirD2 Agrobacterium; РНК пікорнавірусів VPg; ДНК - топоізомераза; послідовність, що походить з фага X174, в олДНК - білок А фага X174 або білок A* X і т. п. В одному варіанті здійснення такого in vivo приєднання SCNA до зв'язувального домену, що наводиться як приклад, синтетичний олігонуклеотид-олДНК, що містить послідовність RB на своєму 5'-кінці або поблизу нього, доставляють в клітину, де вона зустрічається з білковим компонентом. Білок містить частину VirD2, здатну до розщеплення послідовності RB, і надалі зв'язується з іншою частиною олігонуклеотиду, що містить послідовність TCA на своєму 5'-кінці, відповідний спейсер і послідовність, що піддається спарюванню основ з мішенню, таким чином ефективно "програмуючи" молекулярний комплекс in vivo. У деяких варіантах здійснення зв'язувальний домен позбавлений сайта специфічного зв’язування нуклеїнової кислоти-мішені, тобто він не може специфічно зв'язуватися зі специфічною послідовністю-мішенню. Відповідно до деяких варіантів здійснення "домен клітинної локалізації", який може переднести білковий компонент або запрограмований білковий компонент, або зібраний комплекс до певного клітинного або субклітинного місцеположення, може необов'язково бути частиною білкового компонента. Домен клітинної локалізації можна сконструювати за допомогою злиття амінокислотної послідовності білкового компонента з амінокислотами, які включають домен, що включає сигнал ядерної локалізації (NLS); мітохондріальну лідерну послідовність (MLS); хлоропластну лідерну послідовність і/або послідовності, призначені для перенесення або виведення або перенесення білка в органелу, що містить нуклеїнову кислоту, клітинний компартмент або будь-який підрозділ клітини. У деяких варіантах здійснення, що наводяться як приклад, організм є еукаріотичним, і домен клітинної локалізації включає домен ядерної локалізації (NLS), який робить можливим прохід білка в ядро і геномну ДНК в ньому. Послідовність вказаного NLS може включати будь-яку функціональну, позитивно заряджену послідовність NLS, включаючи, наприклад, послідовність SV40NLS - PKKKRKV (SEQ ID NO: 3). У іншому варіанті здійснення, що наводиться як приклад, цей домен складається з лідерної послідовності, що створює можливість для введення білкового компонента або запрограмованого нуклеопротеїну в органелу, що створює можливість для бажаної модифікації органельної ДНК за допомогою цього комплексу. У іншому варіанті здійснення, що наводиться як приклад, послідовність, що походить з дріжджового мітохондріального Cox4p (MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL (SEQ ID NO: 4)), або послідовність, що походить з мітохондріальної лідерної послідовності (MLS) малатдегідрогенази людини (MLSALARPASAALRRSFSTSAQNNAKVAVLGAS (SEQ ID NO: 5)) або походить з синтази ліпоєвої кислоти Arabidopsis (NCBI Ref. Seq. ID: NP 179682.1, позначена тут як SEQ ID NO: 6: MHSRSALLYRFLRPASRCFSSSS), може використовуватися для локалізації комплексу в мітохондріальному матриксі для модифікації мітохондріальної ДНК. Одне застосування цієї заявки може включати лікування успадкованих по материнській лінії дефектів мітохондріальної ДНК у різних еукаріот, таких як синдром хронічної прогресуючої зовнішньої офтальмоплегії у людей. Іншим прикладом є індукція дефектів для викликання чоловічої стерильності у рослин, використовуваних для створення гібридних рослин. У одному варіанті здійснення мітохондріальна мішень являє собою АТФазу і відтворює функцію локусу pcf в Petunia. Відповідно до подальших варіантів здійснення необов'язкові різні міждоменні з'єднувачі або спейсери розроблені для допуску бажаної дії комплексу, слугуючи як молекулярні адаптери або шарніри. Кваліфікована в даній галузі техніки фахівці можуть передбачити множину таких з'єднувачів. Вибір з'єднувача може впливати на специфічність запрограмованого молекулярного комплексу, впливаючи на зону нуклеїнової кислоти-мішені в радіусі дії активного центра функціонального домену. У одному варіанті здійснення, що наводиться як приклад, C' зв'язувального домену і N' функціонального домену нежорстко з'єднують за допомогою 21 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 амінокислот GGSGG (SEQ ID NO: 7), що охоплюють приблизно 15 ангстрем. У іншому варіанті здійснення використовують жорсткий -спіральний лінкер з амінокислотами NIHHVTWHMDFP (SEQ ID NO: 8), що охоплюють приблизно 16 ангстрем. У іншому варіанті здійснення використовують жорсткий спіральний лінкер з амінокислотами PNSLIVP (SEQ ID NO: 9), що охоплюють приблизно 16,88 ангстрем. У іншому варіанті здійснення використовують безладно скручений лінкер з амінокислотами TGLDSP (SEQ ID NO: 10), що охоплюють приблизно 15,55 ангстрем. Додаткові амінокислоти, що кодуються сайтами для рестриктаз, можуть бути додані в міждоменний з'єднувач для полегшення заміни білкових модулів (наприклад, GSLE (SEQ ID NO: 11), що кодують BamHI/XhoI). Відповідно до деяких варіантів здійснення компонент молекулярного комплексу, що належить до нуклеїнової кислоти, називаний тут "нуклеїновою кислотою, що надає специфічність" (SCNA), або "програмуючою нуклеїновою кислотою", включає одну або більше частин (ділянок) і функцій. Одна частина (ділянка) визначає ділянку-мішень, що піддається впливу, і містить послідовність, що визначає специфічність. Послідовність, що визначає специфічність, в SCNA визначає її специфічність відносно нуклеїнової кислоти-мішені за допомогою спарювання основ. Внаслідок цього спарювання може утворюватися, наприклад, але без обмеження, повна або часткова подвійна спіраль, повна або часткова потрійна спіраль, D-петлі і розгалужені форми, і це спарювання може бути результатом утворення водневих зв'язків або хугстинівських водневих зв'язків або їх комбінацій. У деяких варіантах здійснення послідовність, що визначає специфічність, здатна до взаємодії з нуклеїновими кислотамимішенями, в ділянках, які знаходяться поблизу сайта-мішені або фланкують його. У деяких варіантах здійснення послідовність SCNA, що визначає специфічність, не зв'язується/не взаємодіє з сайтом-мішенню. У деяких варіантах здійснення послідовність, що визначає специфічність, може включати будь-яке число нуклеотидів. Наприклад, довжина послідовності, що визначає специфічність, може становити приблизно 3-200 нуклеотидів. Наприклад, довжина послідовності, що визначає специфічність, може становити приблизно 10-100 нуклеотидів. Наприклад, довжина послідовності, що визначає специфічність, може становити приблизно 1550 нуклеотидів. Наприклад, довжина послідовності, що визначає специфічність, може перевищувати приблизно 18 нуклеотидів. Відповідно до деяких варіантів здійснення другою частиною SCNA є ділянка (частина) розпізнавання, що являє собою ділянку, яка може специфічно зв'язувати/приєднувати/розпізнавати зв'язувальний домен білкового компонента. У деяких варіантах здійснення ця ділянка розпізнавання може бути і/або включати модифікацію або послідовність розпізнавання зв'язувального домену (також звану тут нуклеотидним мотивом SCNA або нуклеотидною послідовністю SCNA, що зв'язується зі зв'язувальним доменом). Ділянка розпізнавання може бути невід'ємною частиною або може бути зв'язаною (наприклад, ковалентно) з послідовністю, що визначає специфічність, і може складатися з послідовності або модифікації, яка робить можливим зв’язування SCNA зі зв'язувальним доменом білкового компонента, як деталізовано вище. У деяких варіантах здійснення в склад SCNA входять, але без обмеження, молекули наступних типів: одноланцюжкова ДНК, одноланцюжкова РНК, дволанцюжкова РНК, модифікована ДНК, модифікована РНК, закрита нуклеїнова кислота (LNA), пептидонуклеїнова кислота (PNA) і будь-які їх комбінації. У деяких варіантах здійснення SCNA може, крім того, включати, одну або множину модифікацій, які можуть збільшити її стабільність, збільшити її специфічність відносно мішені, змінити її спорідненість до нуклеїнових кислот і/або зробити можливим її зв’язування зі зв'язувальним доменом комплексу. Модифікації можуть розташовуватися на її 5'-кінці, її 3'-кінці, у вигляді спейсерів і/або всередині SCNA. Модифікації, що наводяться як приклад, включають, але без обмеження, модифікації нуклеотидів, біотин, флуоресцеїн, амінолінкери, олігопептиди, аміноаліл, молекулу барвника, флуорофори, дигоксигенін, акридит, аденілювання, азид, NHS-ефір, холестерил-TEG, алкіни, фоторуйновний біотин, тіол, дитіол, модифіковані основи, фосфат, 2-амінопурин, Тример-20, 2,6-діамінопурин, 5-бромдезоксіуридин, дезоксіуридин, інвертований dT, дидезоксинуклеотиди, 5-метилдезоксицитидин, дезоксіінозин, 5-нітроіндол, 2-О-метил-РНК-основи, ізо-dC, ізо-dG, фтормодифіковані основи, фосфоротіоатні зв'язки і білок VirD2 Agrobacterium і частини вказаного VirD2 і модифікації VirD2. Відповідно до деяких варіантів здійснення SCNA може, крім того, включати необов'язкову спейсерну послідовність, яка може використовуватися для оптимізації молекулярних відстаней і степенів вільності, необхідних для об'єднання зв'язувального домену і нуклеїнової кислотимішені. У деяких варіантах здійснення довжина спейсерної послідовності може становити 22 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приблизно 0-100 нуклеотидів. Наприклад, довжина спейсера може становити приблизно 0-6 нуклеотидів. Відповідно до деяких варіантів здійснення SCNA можна створити хімічно і/або біологічно, in vitro і in vivo, а модифікація може бути передсинтезованою або доданою після синтезу. У деяких варіантах здійснення, що наводяться як приклад, SCNA створена хімічно і складається з фосфоротіоатмодифікованої олДНК, яка модифікована на одному з її кінців за допомогою приєднання молекули барвника C6-флуоресцеїну. Цю SCNA, отже, доставляють в клітину (наприклад, за допомогою бомбардування частинками, трансфекції з використанням поліетиленгліколю, ліпосом, вірусних частинок, карборундних ниткоподібних кристалів і/або електропорації), де вона зустрічається з білковим компонентом молекулярного комплексу, який включає зв'язувальний домен, що включає одноланцюжковий Fv-фрагмент антитіла, здатний до зв’язування барвника флуоресцеїну, таким чином програмуючи молекулярний комплекс і доставляючи/направляючи комплекс до запланованої для нього нуклеотидної послідовностімішені. Відповідно до деяких варіантів здійснення SCNA не зв'язується/не взаємодіє з сайтоммішенню. Тепер посилаються на фіг. 1A-В, які являють собою схематичні ілюстрації (масштаб не витриманий), на яких представлені елементи/компоненти програмованого молекулярного комплексу, відповідно до деяких варіантів здійснення. На схематичних ілюстраціях (масштаб не витриманий) фіг. 1A-В представлена молекула програмованого білкового компонента у вигляді мономера і дві молекули нуклеїнових кислот, що надають специфічність (SCNA). Як показано на фіг. 1A-В, білковим компонентом є поліпептид (ланцюг амінокислот), скомпонований в декілька структурних/функціональних доменів: зв'язувальний домен (LD), функціональний або ефекторний домен (FD); необов'язковий домен клітинної локалізації (CLD) і необов'язковий міждоменний з'єднувач(і) (IDC), кожний з яких визначений по його ролі в молекулярному комплексі. Функцією зв'язувального домену є зв’язування з SCNA. Функцією ефекторного домену є взаємодія з нуклеїновою кислотою-мішенню і структурна модифікація сайта-мішені і/або модифікація його функції і/або функції всієї нуклеїнової кислоти-мішені. Функцією необов'язкового домену клітинної локалізації є віднесення білкового комплексу до того ж клітинного або субклітинного компартменту, що і компартмент, в якому знаходиться нуклеїнова кислота-мішень. Функцією необов'язкових міждоменних з'єднувачів є допуск оптимальних молекулярних відстаней і степенів вільності між доменами для відповідного функціонування комплексу. SCNA складаються з нуклеотидного ланцюга або модифікованого нуклеотидного ланцюга (у формі гребеня) і включають модифікацію, переважно на одному з їх кінців (представлену на фіг. 1A у вигляді чорного овалу), для зв’язування з білковим компонентом, або послідовність (звану нуклеотидним мотивом SCNA або нуклеотидною послідовністю, що зв'язується зі зв'язувальним доменом, або послідовністю або сегментом розпізнавання зв'язувального домену, яка представлена на фіг. 1B, помічений стрілкою гребінь), яка може зв'язуватися зі зв'язувальним доменом білкового компонента. У необмежувальному прикладі, представленому на фіг. 1A-В, частина SCNA, що визначає специфічність, є одноланцюжковою. У деяких варіантах здійснення SCNA може утворювати дволанцюжкові сегменти/ділянки (в результаті самовідпалу, наприклад, утворюючи петлі шпильки). Специфічність SCNA відносно заданої послідовності нуклеїнової кислоти-мішені досягається завдяки ділянці основ нуклеїнових кислот, що піддаються спарюванню, або модифікованих нуклеїнових кислот (спарюванню основ з нуклеїновою кислотою-мішенню, у формі гребеня), також називаній варіабельною послідовністю, що може включати будь-яке число нуклеотидів, наприклад 3-200 нуклеотидів, або будь-які їх діапазони. Наприклад, довжина може складати 10-100 нуклеотидів. Наприклад, довжина може складати принаймні 18 нуклеотидів. Можуть бути присутніми необов'язкові послідовності спейсерів (спейсерна послідовність, у формі гребеня) для оптимізації молекулярних відстаней і степенів вільності, необхідних для об'єднання зв'язувального домену і нуклеїнової кислоти-мішені. У деяких варіантах здійснення довжина спейсерних послідовностей може складати приблизно 0-100 нуклеотидів. Наприклад, довжина спейсера може складати приблизно 0-6 нуклеотидів. Дію або ефект функціонального домену білкового компонента, що виникає після зв’язування з SCNA зв'язувального домену і димеризації і його подальшої колокалізації на нуклеїновій кислоті-мішені, зображено у вигляді символу блискавки ("Дія/Ефект"). Тепер посилаються на фіг. 2A-В, які являють собою схематичні ілюстрації, на яких представлене збирання програмованого молекулярного комплексу, відповідно до деяких варіантів здійснення. На схематичних ілюстраціях (масштаб не витриманий) фіг. 2А-В представлений спосіб збирання компонентів програмованого молекулярного комплексу на нуклеїновій кислоті-мішені. У прикладі, представленому на фіг. 2A-В, два мономери білка 23 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язуються з двома різними SCNA, при цьому кожна з них має відмінну детермінанту специфічності в своїй варіабельній ділянці послідовності. Ці SCNA піддаються спарюванню основ і зв'язуються із заданими гомологічними послідовностями в нуклеїновій кислоті-мішені (поміченій на фігурах як "нуклеїнова кислота-мішень"). Внаслідок цього спарювання основ може утворитися подвійна або потрійна спіраль з нуклеїновою кислотою-мішенню, залежно від того, є мішень дво- або одноланцюжковою (представлена на цих фігурах у вигляді длДНК). Обидві SCNA можуть зв'язуватися або з одним і тим же ланцюгом, або з протилежними ланцюгами, відповідно до вимоги, на оптимізованій відстані. SCNA можуть зв'язуватися з білковим зв'язувальним доменом завдяки модифікації на їх кінці (фіг. 2A) або завдяки нуклеотидному мотиву SCNA (фіг. 2B). Після збирання функціональний домен надає свій ефект на заданий сайт-мішень (помічений як "сайт-мішень") в нуклеїновій кислоті-мішені. Тепер посилаються на фіг. 3, на якій представлений з використанням просторового моделювання приклад молекулярного комплексу, розробленого для розщеплення заданої ядерної послідовності длДНК-мішені, відповідно до деяких варіантів здійснення. Запрограмований, підданий димеризації білковий компонент представлений в зв'язку з його мішенню, що є длДНК (А, представленої частково). Кожний мономер білкового компонента складається з функціонального домену, що походить з субодиниці нуклеази FokI (В); домену клітинної локалізації, що походить з SV40NLS (С); зв'язувального домену, що походить з одноланцюжкового Fv-фрагмента антитіла проти флуоресцеїну (анти-FAM ScFV, D), і міждоменного з'єднувача (Е). Показано, що кожний зв'язувальний домен (D) зв'язаний з нуклеїновою кислотою, що надає специфічність, SCNA олДНК (F, представленої частково) через її модифікатор - молекулу 6-карбоксифлуоресцеїну (G), який ковалентно зв'язаний з кінцем кожної SCNA. Передбачувані сайти розщеплення (сайт-мішень) длДНК-мішені (представлені у вигляді куль в спіральному кістяку) помічені стрілками 300A-B. Кожна SCNA зображена тут у вигляді утворюючої часткову потрійну спіраль, що займає велику борозенку фланкуючої мішень послідовності длДНК. Тепер посилаються на фіг. 4A-В, які являють собою схематичні ілюстрації (масштаб не витриманий) способу, що наводиться як приклад, збирання компонентів програмованого молекулярного комплексу на нуклеїновій кислоті-мішені, відповідно до деяких варіантів. Як показано в необмежувальних прикладах, представлених на фіг. 4A-В, два мономери білкового компонента зв'язують дві різні SCNA (SCNA1, SCNA2), при цьому кожна з них має відмінну детермінанту специфічності у варіабельній ділянці послідовності. Як показано на фігурах, обидві SCNA знаходяться в одній нуклеїновій кислоті і сполучені за допомогою послідовності з невизначеною послідовністю або довжиною, яка не піддається спарюванню основ з мішенню, називаною тут "з'єднувачем SCNA". З'єднувач SCNA може включати будь-яку послідовність нуклеотидів, будь-якої довжини (X(n)). У деяких варіантах здійснення X(n) означає невизначену довжину РНК-нуклеотидів, які з'єднують дві ділянки, що надають специфічність, одну з одною. У деяких варіантах здійснення, у випадку лінійної ДНК, імовірна оптимальна довжина (n) складає приблизно, наприклад, 10-100 нуклеотидів. Наприклад, довжина складає приблизно 3573 нуклеотидів. Наприклад, довжина перевищує приблизно 70 нуклеотидів. Наприклад, довжина менше, ніж приблизно 35 нуклеотидів. Ці SCNA піддаються спарюванню основ і зв'язуються із заданими гомологічними (відповідними) послідовностями в нуклеїновій кислотімішені. Внаслідок цього спарювання основ може утворитися подвійна або потрійна спіраль з нуклеїновою кислотою-мішенню, залежно від того, є мішень дво- або одноланцюжковою (в прикладі, представленому на фіг. 4А-В, длДНК). У деяких варіантах здійснення обидві SCNA можуть зв'язуватися або з одним і тим же ланцюгом, або з протилежними ланцюгами нуклеїнової кислоти-мішені, відповідно до вимоги, на відстані, оптимізованій для досягнення бажаного результату. У деяких варіантах здійснення тільки одна нуклеїнова кислота, що містить здвоєні, сполучені SCNA, необхідна для націлювання на сайт-мішень, розташовуючись по обидві сторони від обох кінців сайта-мішені. У деяких варіантах здійснення SCNA можуть зв'язуватися з сайтом зв’язування зв'язувального домену (заглибленням в зв'язувальному домені) білкового компонента завдяки нуклеотидним мотивам SCNA в обох SCNA (поміченим у вигляді гребенів в сайті зв’язування зв'язувального домену, фіг. 4А) або завдяки модифікації на обох кінцях (чорні овали в сайті зв’язування зв'язувального домену, фіг. 4В). Після збирання функціональний домен може надавати свій ефект на сайт-мішень в нуклеїновій кислоті-мішені. Відповідно до деяких варіантів здійснення способи доставки SCNA в організм або клітину включають множину способів, відомих кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям, і є, як правило, способами, оптимальними для типу організму або клітини, використовуваного у відповідному випадку. Вони можуть включати доставку нуклеїнової кислоти за допомогою біологічних методів: інфікування, використовуючи вектори, що автономно реплікуються, 24 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інфікування або трансдукції трансгенними вірусами, включаючи використання зруйнованих або неповних вірусів, інокуляції, доставки Т-ДНК Agrobacterium, селекції, схрещування, пересадки, перенесення органели, перенесення хромосоми, злиття клітин; методів поглинання з використанням хімічних речовин: використання агентів для трансфекції, DEAE-декстрану, фосфату кальцію, штучних ліпідів, дендримерів, полімерів (ПЕГ і т. д.), білків/пептидів, вірусоподібних частинок; механічних методів: бомбардування, ін'єкції/мікроін’єкції, вдавлювання, ниткоподібних кристалів; і електричного методу електропорації, і будь-якого методу, який змінює клітинну плазматичну мембрану, дозволяючи нуклеїновим кислотам активно або пасивно надходити в клітину. Відповідно до деяких варіантів здійснення способи доставки нуклеїнової кислоти, що кодує білковий модуль, в організм або клітину включають множину способів, відомих кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям, і є, як правило, способами, оптимальними для типу організму або клітини, використовуваного у відповідному випадку. Вони можуть включати доставку нуклеїнової кислоти за допомогою схрещування організму з трансгенним організмом, що містить ген, або за допомогою біологічних методів: інфікування, використовуючи вектори, що автономно реплікуються, інфікування або трансдукції трансгенними вірусами, включаючи використання зруйнованих або неповних вірусів, інокуляції, доставки Т-ДНК Agrobacterium, пересадки, перенесення органели, перенесення хромосоми, злиття клітин; методів поглинання з використанням хімічних речовин: використання агентів для трансфекції, DEAE-декстрану, фосфату кальцію, штучних ліпідів, дендримерів, полімерів (ПЕГ і т. д.), білків/пептидів, вірусоподібних частинок; механічних методів: бомбардування, ін'єкції/мікроін’єкції, вдавлювання, ниткоподібних кристалів; і електричного методу електропорації, і будь-якого методу, який змінює клітинну плазматичну мембрану, дозволяючи нуклеїновим кислотам активно або пасивно надходити в клітину. Відповідно до деяких варіантів здійснення способи доставки "донорної ДНК", в підгрупі застосувань, при яких потрібна така ДНК, що включає вставку гена або заміну гена, включають методи, схожі з тими, які описані для доставки нуклеїнової кислоти, яка кодує білковий модуль. Ця ДНК може бути або одноланцюжковою, дволанцюжковою, або частково дволанцюжковою, лінійною або замкненою в коло. Ця ДНК може доставлятися в одному векторі або в декількох векторах, разом або окремо від нуклеїнової кислоти, що кодує білковий компонент молекулярного комплексу, і від програмуючої нуклеїнової кислоти, що визначає специфічність. Таким чином, нуклеїнові кислоти можуть доставлятися, вибираючи з відповідних вищезазначених методів доставки, в рослину або частину рослини, в тканину або орган рослини, такий як зародок, пилок, яйцеклітина, пиляк, приймочка, ціла квітка, сім'ядоля, листок, корінь, стебло, черешок, в ізольовані клітини рослини, такі як протопласти, або в диференційовані або не диференційовані тканину, калус або клітини рослини. У деяких варіантах здійснення нуклеїнові кислоти можуть доставлятися в гриб, включаючи одноклітинні і багатоклітинні гриби, і член царства тварин, включаючи безхребетних (таких як членистоногі і круглі черв'яки), хребетних (таких як птахи, риби, ссавці, плазуни і земноводні), і частини цих організмів, в тому числі органи, культивовані органи, тканини, культивовані тканині, ізольовані клітини, культури клітин, лінії клітин і стовбурові клітини, такі як ембріональні стовбурові клітини людини або гемопоетичні стовбурові клітини людини. Тепер посилаються на фіг. 5, яка являє собою схематичну ілюстрацію, що демонструє можливі варіанти доставки програмованого молекулярного комплексу в клітину, використовуючи in vitro одержані SCNA, відповідно до деяких варіантів здійснення. Представлена загальна схема для вибору відповідного методу доставки. Молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує білковий компонент, вибирають з лівого стовпця і доставляють, використовуючи придатні методи, вибирані з наступних двох стовпців. Синтетичну SCNA доставляють за допомогою методів, вибираних з тих, які представлені в двох правих стовпцях. Всередині клітини-мішені нуклеїнова кислота, що кодує білок, здійснює експресію білка внаслідок його трансляції in vivo з молекули РНК-матриці. Якщо доставлена молекула нуклеїнової кислоти складається з длРНК, вона може спочатку транскрибуватися в РНК (з використанням наміченого промотору). Якщо доставлена молекула нуклеїнової кислоти складається з олДНК, вона може спочатку доповнюватися до длДНК, а потім транскрибуватися. Якщо доставлена молекула нуклеїнової кислоти складається з РНК, наприклад РНК, що кодує вірус, або іншого вектора, що автономно реплікується, вона може проходити через реплікацію через "мінус"-ланцюг до трансляції. Трансльований білок може потім локалізуватися в бажаному субклітинному компартменті, відповідно до його сигналу локалізації (у випадку його присутності). SCNA можуть доставлятися одночасно або окремо від молекули нуклеїнової кислоти, що кодує білковий компонент, за допомогою того ж або 25 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відмінного методу доставки. Після колокалізації SCNA, білкового компонента і нуклеїнової кислоти-мішені в клітині, вони можуть збиратися з утворенням активного молекулярного димерного комплексу. Донорна ДНК, відповідно до вимог, може також доставлятися окремо або одночасно. Тепер посилаються на фіг. 6, яка є загальною схемою, що демонструє доставку програмованого молекулярного комплексу в клітину, використовуючи in vivo продуковану SCNA, відповідно до деяких варіантів здійснення. Молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує білковий компонент, вибирають з лівого стовпця і доставляють, використовуючи придатні методи, вибирані з наступних трьох стовпців. In vivo продуковані SCNA кодуються молекулою нуклеїнової кислоти, передбаченою для цього ланцюга і введеною в клітину, використовуючи ці ж методи. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують білковий компонент і/або SCNA, можуть доставлятися по окремості або одночасно. У клітині нуклеїнова кислота, що кодує SCNA, експресує SCNA внаслідок транскрипції і розщеплення нуклеїнової кислоти. Якщо доставлена молекула нуклеїнової кислоти складається з длРНК, вона може спочатку транскрибуватися в РНК з використанням наміченого промотору. Якщо доставлена молекула нуклеїнової кислоти складається з олДНК, вона може спочатку доповнюватися до длДНК, а потім транскрибуватися. Якщо доставлена молекула нуклеїнової кислоти складається з РНК, наприклад РНК, що кодує вірус, або іншого вектора, що автономно реплікується, вона може проходити через реплікацію через "мінус"-ланцюг. Всередині клітини нуклеїнова кислота, що кодує білок, експресується через його трансляцію in vivo з молекули РНК, продукованої способом, схожим з таким, описаним для SCNA. Трансльований білок може потім локалізуватися в бажаному субклітинному компартменті, відповідно до його сигналу локалізації (у випадку його присутності). Молекули нуклеїнових кислот, що кодують білковий компонент, і/або молекули нуклеїнових кислот, що кодують SCNA, можуть доставлятися одночасно (в один і той же час) або по окремості, з використанням однакових або різних методів доставки. Після колокалізації SCNA, білкового компонента і нуклеїнової кислоти-мішені в клітині, вони можуть збиратися з утворенням активного молекулярного димерного комплексу. Донорна ДНК, відповідно до вимог, може також доставлятися окремо або одночасно. Відповідно до деяких варіантів здійснення біологічний синтез in vivo SCNA може бути виконаний декількома шляхами, такими як, але без обмеження: (a) використання Agrobacterium для синтезу і нуклеїнової кислоти, і компонента, що зв'язується зі зв'язувальним доменом, в цьому прикладі VirD2, який також каталізує їх ковалентний зв'язок. До того ж Agrobacterium сприяє перенесенню в клітину олДНК, ковалентно зв'язаної з VirD2, (b) використання Agrobacterium для перенесення Т-ДНК в клітину, при цьому вказана Т-ДНК включає промотори, керуючі синтезом в клітині SCNA у вигляді РНК, що мають домен РНК, який зв'язується зі зв'язувальним доменом комплексу після їх зустрічі. Таким чином, комплекс, експресований в клітині-мішені, збирається завдяки взаємодії РНК-білок, (с) використання векторів, що автономно реплікуються, включаючи віруси і експресійні вектори на основі вірусів, для доставки реплікону в клітину, при цьому вказаний реплікон включає субгеномні промотори, керуючі синтезом SCNA у вигляді РНК, що мають домен РНК, який зв'язується зі зв'язувальним доменом комплексу після їх зустрічі. Такимчином, комплекс, експресований в клітині-мішені, збирається завдяки взаємодії РНК-білок. Тепер посилаються на фіг. 7A-В, які являють собою схематичні ілюстрації (масштаб не витриманий), на яких представлені необмежувальні приклади доставки SCNA в клітину, використовуючи одноланцюжкову ДНК, продуковану в Agrobacterium. На фіг. 7A представлений необмежувальний приклад використання Agrobacterium для продукції SCNA у вигляді олДНК, що зв'язується з білком, VirD2, in vivo, на її 5'-кінці. Як показано в цьому прикладі, направляючу варіабельну послідовність SCNA вбудовують в сайт множинного клонування (MCS) в плазміді, здатній до реплікації в Agrobacterium. Потім Agrobacterium трансформують цією плазмідою. Послідовність правого краю (RB) Ti-плазміди в плазміді розщеплюється, і олДНК зв'язується білком VirD2 в бактерії. 3 нуклеотиди послідовності RB залишаються на 5'-послідовності після розщеплення, і 21 нуклеотид послідовності лівого краю (LB) Ti-плазміди залишається після розщеплення на 3'-послідовності. Послідовність LB може, крім того, сприяти стабілізації SCNA і скринінгу на предмет небажаних подій інтеграції. Мутовані форми агробактерій (наприклад, ті, в яких відсутній VirE1 або VirE2, або з частковою функціональністю VirD2) застосовні для інгібування небажаних подій інтеграції. До того ж Agrobacterium експортує Т-ДНК, що включає SCNA, зв'язану з VirD2, в клітину. На фіг. 7В представлений необмежувальний приклад використання бактеріальної системи секреції для доставки SCNA в клітину-хазяїна. Одну або множину агробактерій, трансформованих різними Т-ДНК, що кодують різні послідовності SCNA, використовують для інфікування однієї клітини. Зв'язана з VirD2 SCNA у вигляді олДНК, 26 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 створена таким чином в бактерії і експортована в клітину-хазяїна, може потім зустрітися і зв'язатися зі зв'язувальним доменом білкового компонента завдяки взаємодії між білком VirD2 і VirD2-зв'язувальним доменом в зв'язувальному домені в клітині-хазяїні. Приклад такого зв'язувального домену, що зв'язується з VirD2, включає штучний одноланцюжковий Fvфрагмент антитіла, створений проти VirD2. SCNA може, таким чином, здійснювати збирання молекулярного комплексу на нуклеїновій кислоті-мішені. Тепер посилаються на фіг. 8A-В, які є схематичним ілюстраціями, що демонструють доставку SCNA в клітину, використовуючи SCNA у вигляді РНК, продуковані всередині клітинихазяїна, з доставленою за допомогою Agrobacterium Т-ДНК (фіг. 8A), або з нуклеїновою кислотою, доставленою за допомогою вектора, що автономно реплікується, такого як вірус (фіг. 8B). SCNA у вигляді РНК, представлені на цих фігурах, включають мотив SCNA-РНК (помічений у вигляді гребенів), який може зв'язуватися з відповідним РНК-зв'язувальним мотивом зв'язувального домену білкового компонента. Як показано на фіг. 8A, послідовності SCNA вставлені в сайт множинного клонування (MCS) в плазміді, яка здатна до реплікації в Agrobacterium і містить відповідні еукаріотичні промотори для транскрипції однієї або множини SCNA-РНК в інфікованій клітині. Фіг. 8B: послідовність(ості) SCNA вставлена(і) в геном вірусу або вектора, що автономно реплікується, який походить з вірусу, кожна з них під контролем субгеномного (sg) промотору для транскрипції однієї або множини SCNA-РНК в інфікованій клітині. У необмежувальних прикладах, представлених на фіг. 8A-В, молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує білковий компонент, можна доставити в клітину-мішень попередньо, разом з (одночасно) або після доставки молекули нуклеїнової кислоти, що кодує SCNA. Коли білковий компонент і SCNA експресуються в клітині, відбувається збирання молекулярного комплексу на нуклеїновій кислоті-мішені. Тепер посилаються на фіг. 9, на якій представлена схематична ілюстрація (масштаб не витриманий) необмежувального прикладу транспортного засобу або вектора для одночасної доставки композиції, що включає компоненти, необхідні для збирання програмованого молекулярного комплексу, в сприйнятливу еукаріотичну клітину-мішень за один прийом доставки, відповідно до деяких варіантів здійснення. У випадку необмежувального прикладу, представленого на фіг. 9, бажаною дією є заміна геномної ділянки ДНК (нуклеїнової кислотимішені) заданою послідовністю "донорною касетою". Відповідно, домени білкового компонента включають: функціональний домен, що походить з нуклеази і має активність розщеплення нуклеїнових кислот; домен клітинної локалізації, який являє собою сигнал ядерної локалізації (NLS); і зв'язувальний домен, здатний розпізнавати і зв'язувати РНК-мотив в SCNA. У прикладі, представленому на фіг. 9, використовують біологічну систему доставки. Agrobacterium трансформують плазмідним вектором, таким як плазміда (800), який містить різні функціональні/структурні послідовності, такі як бактеріальний селектований маркер, різні сайти початку реплікації (Е. coli-ori, pSa Ori), послідовність LB, промоторні райони (позначені як (Р)), експресуюча білковий компонент послідовність (що включає ініціюючий кодон ATG і стоп-кодон в рамці зчитування), сайт-термінатор (Т), множина транскрибуючих SCNA касет (представлена у вигляді чотирьох транскрибуючих SCNA касет, кожна з яких включає послідовності промотору і термінатора), донорна касета і сайт RB. Плазмідний вектор (трансфіковану Agrobacterium) потім приводять в контакт з клітинами організму-мішенями. Agrobacterium потім утворює Т-ДНК з району між послідовностями правого краю (RB) і лівого краю (LB) і секретує її в еукаріотичну клітину. олДНК Т-ДНК доставляється в ядро, комплементується in vivo, щоб стати длДНК, і транскрибується в РНК з сумісних промоторів (Р) в плазміді. Утворений таким чином транскрипт для білкового компонента транслюється з утворенням наміченого білка. Транскрипти з транскрибуючої SCNA касети, які включають послідовність РНК-мотиву, зв'язуються доменом, що зв'язує специфічну послідовність РНК, в білковому компоненті. Донорна касета містить достатньо довгу послідовність, яка може піддаватися рекомбінації з нуклеїновою кислотою-мішенню в присутності дволанцюжкового розриву (DSB), утвореного поруч з сайтом рекомбінації. SCNA призначені для направленої доставки і гібридизації з послідовностями, фланкуючими заміщувану послідовність. У деяких варіантах здійснення схожа плазміда, в якій відсутні послідовності границь, або лінійна ДНК зі схожою конструкцією може, крім того, використовуватися для трансфекції клітин в небіологічній системі доставки, з тим же результатом. Відповідно до деяких варіантів здійснення, і як деталізовано вище, зміни/модифікації в підданій направленому впливу послідовності включають, наприклад, але без обмеження, стабільну делецію, мутацію, вставку нуклеїнових кислот і заміну підданої направленому впливу послідовності іншою послідовністю нуклеїнової кислоти, нокаут, зсув рамки зчитування або будь-яку зміну яким-небудь чином транскрипції або трансляції гена, регулюючих його 27 UA 115772 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей, генів, регулюючих ген, що представляє інтерес, або регулюючих їх послідовностей в регуляторному ланцюзі подій. Тепер посилаються на фіг. 10, яка є схематичною ілюстрацією (масштаб не витриманий), що демонструє використання запрограмованого молекулярного комплексу для створення мутації в нуклеїновій кислоті-мішені, відповідно до деяких варіантів здійснення. Як показано в необмежувальному прикладі, представленому на фіг. 10, функціональний домен білкового компонента походить з нуклеази, і мутацію в сайті-мішені в нуклеїновій кислоті-мішені одержують за допомогою створення розриву длДНК (DSB) в нуклеїновій кислоті-мішені в заданому положенні. SCNA-запрограмовані молекулярні комплекси піддаються самозбиранню внаслідок спарювання основ SCNA з відповідною послідовністю-мішенню в нуклеїновій кислотімішені. Після збирання компонентів комплексу, функціональний домен піддається димеризації, і активується нуклеаза, що розщеплює сайт-мішень, який знаходиться, в цьому прикладі, в центрі або поблизу нього, між двома молекулами SCNA, тим самим створюючи DSB (наприклад, DSB може мати 4-нуклеотидні 5'-кінцеві надмірності, такі як ті, які створюються рестриктазою FokI). Клітинні механізми репарації за допомогою негомологічного з'єднання кінців (NHEJ) намагаються репарувати DSB і при здійсненні цього можуть: 1) здійснити ідеальне лігування, в той час як комплекс може продовжувати знов розщеплювати ту ж послідовність для повторних спроб здійснити мутацію до виснаження компонентів комплексу, 2) додати один або множину нуклеотидів, тим самим збільшуючи відстань між SCNA і анулюючи димеризацію функціонального домену, тим самим припиняючи дію комплексу, або 3) видалити один або множину нуклеотидів (образ "розносника"), тим самим зменшуючи відстань між SCNA і анулюючи димеризацію функціонального домену, тим самим припиняючи дію комплексу. Коли будь-який з варіантів 2 або 3 має місце в клітині, одержують мутацію. Тепер посилаються на фіг. 11, яка є схематичною ілюстрацією (масштаб не витриманий), що демонструє використання запрограмованого молекулярного комплексу для вставки одного або множини нуклеотидів в нуклеїнову кислоту-мішень, використовуючи донорну нуклеїнову кислоту, що доставляється, відповідно до деяких варіантів здійснення. Як показано в необмежувальному прикладі, представленому на фіг. 11, функціональний домен білкового компонента походить з нуклеази, і розрив длДНК (DSB) в нуклеїновій кислоті-мішені в заданому положенні (сайті-мішені) сприяє процесу гомологічної рекомбінації (HR). SCNA-запрограмовані молекулярні комплекси піддаються самозбиранню внаслідок спарювання основ SCNA з відповідною послідовністю-мішенню. Після збирання компонентів комплексу, функціональний домен піддається димеризації, і активується нуклеаза, тим самим розщеплюючи нуклеїнову кислоту-мішень в сайті-мішені, який може знаходитися, наприклад, в центрі або поблизу нього, між двома молекулами SCNA, тим самим створюючи DSB. Донорна DNA містить послідовність, яка повинна бути вставлена, і достатньо довгі ділянки нуклеотидів, фланкуючі цю послідовність, які по суті ідентичні послідовності-мішені, фланкуючій заплановане місце DSB. Ці фланкуючі послідовності можуть потім піддаватися рекомбінації (X) з нуклеїновою кислотоюмішенню завдяки клітинному процесу HR, таким чином здійснюючи заміну заданої ділянки нуклеотидів в нуклеїновій кислоті-мішені і дійсно здійснюючи вставку бажаної послідовності. Після рекомбінації і вставки заданої донорної послідовності, відстань між SCNA збільшується, таким чином заважаючи димеризації функціонального домену, тим самим припиняючи дію комплексу. У тих випадках, коли відбувається ідеальне перелігування за допомогою NHEJ, активований запрограмований комплекс може продовжувати знов розщеплювати ту ж послідовність для повторних спроб здійснення вставки. Тепер посилаються на фіг. 12, яка є схематичною ілюстрацією (масштаб не витриманий), що демонструє використання запрограмованого молекулярного комплексу для заміни, вставки і/або делеції одного або множини нуклеотидів в нуклеїновій кислоті-мішені, використовуючи донорну нуклеїнову кислоту, що доставляється, відповідно до деяких варіантів здійснення. Як показано в необмежувальному прикладі, представленому на фіг. 12, функціональний домен білкового компонента походить з нуклеази, і розрив длДНК (DSB) в нуклеїновій кислоті-мішені в заданому положенні (сайті-мішені) сприяє процесу гомологічної рекомбінації (HR). SCNA-запрограмовані молекулярні комплекси піддаються самозбиранню внаслідок спарювання основ SCNA із заданою послідовністю-мішенню. Після збирання компонентів комплексу, функціональний домен піддається димеризації, і активується нуклеаза, що розщеплює нуклеїнову кислотумішень в сайті-мішені, який може знаходитися, наприклад, в центрі або поблизу нього, між двома молекулами SCNA, тим самим створюючи DSB. Донорна DNA містить екзогенну послідовність, яка повинна бути вставлена замість ендогенної послідовності-мішені, яка повинна бути видалена, а також достатньо довгі ділянки нуклеотидів, фланкуючі цю екзогенну послідовність, які по суті ідентичні послідовності-мішені, фланкуючій заплановану послідовність, 28

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Compositions and methods for modifying a predetermined target nucleic acid sequence

Автори англійською

Shiboleth, Yoel, Moshe, Weintal, Dan, Michael

Автори російською

Шиболет Йоел Мошэ, Вэйнтал Дан Майкл

МПК / Мітки

МПК: C12N 15/62, A61K 31/7088, C12N 5/10

Мітки: композиція, програмованого, кислоти-мішені, комплексу, молекулярного, заданої, нуклеїнової, нуклеопротеїнового, модифікування, послідовності, спосіб

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/166-115772-kompoziciya-programovanogo-nukleoprotenovogo-molekulyarnogo-kompleksu-i-sposib-modifikuvannya-zadano-poslidovnosti-nuklenovo-kisloti-misheni.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Композиція програмованого нуклеопротеїнового молекулярного комплексу і спосіб модифікування заданої послідовності нуклеїнової кислоти-мішені</a>

Подібні патенти