Рекомбінантна термостабільна днк-полімераза, фрагмент нуклеїнової кислоти, композиція для застосування в реакції секвенування днк, спосіб секвенування нуклеїнової кислоти-мішені, набір для секвенування нуклеїно

1 Рекомбінантна термостабільна ДНКполімераза, яка являє собою мутовану форму нативної термостабільної ДНК-полімерази, що має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, яка містить амінокислотний фрагмент Ser Gin lie Glu Leu Arg Xaa, в якому Хаа в положенні 7 вказаного фрагменту є залишком валіну Val або ізолейцину Не, причому вказана мутована форма модифікована таким чином, що вона містить відмінну від Glu амінокислоту в положенні 4 ПОСЛІДОВНОСТІ приведеного фрагменту і згадана мутована форма має знижену вибірковість по відношенню до включення невластивих нуклеотидів в порівнянні з нативною термостабільною ДНК-полімеразою 2 Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п 1, яка відрізняється тим, що и здатність включати невластиві нуклеотиди перевищує здатність відповідної нативної термостабільної ДНКполімерази включати невластивий нуклеотид принаймні у 20 разів 3 Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п 2, яка відрізняється тим, що має достатню активність для застосування в реакції секвенування ДНК, що передбачає використання невластивого нуклеотиду і ВІДПОВІДНОГО звичайного нуклеотиду при співвідношенні 1 1 або менше 4 Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п 3, яка відрізняється тим, що невластивий нуклеотид є рибонуклеозидтрифосфатом 5 Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п 4, яка відрізняється тим, що рибонуклеозидтрифосфат присутній в концентрації меншій за 100 мкМ, а ВІДПОВІДНИЙ звичайний нуклеотид присутній в концентрації більшій за 100 мкМ 6 Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п 5, яка відрізняється тим, що нативна термостабільна ДНК-полімераза вибрана з групи, яка включає термостабільні ДНК-полімерази Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus chharophilus, Thermus fihformis, Thermus flavus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus вид Z05, Thermus вид sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga mantima, Thermotoga neapohtana, Thermosipho afncanus, Anaerocellum thermophilum, Bacillus caldotenax, Bacillus stearothermophilus 7 Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п 5, яка відрізняється тим, що нативна термостабільна ДНК-полімераза є термостабільною ДНК-полімеразою роду Thermus 8 Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п 5, яка відрізняється тим, що нативна термостабільна ДНК-полімераза є термостабільною ДНК-полімеразою роду Thermotoga 9 Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п 5, яка відрізняється тим, що нативна термостабільна ДНК-полімераза містить амінокислотну П О С V a l Л І L Д О e u В Н A І l С a Т Ь H i s L e u L e A u s S p e T y r S e r G i n l i e G l u L e u A r g r 10 Фрагмент нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну ПОСЛІДОВНІСТЬ, яка кодує рекомбінантну термостабільну ДНК-полімеразу за п 1 О со 47423 11 Фрагмент нуклеїнової кислоти за п 10, який відрізняється тим, що рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза має достатню активність для застосування в реакції секвенування ДНК 12 Фрагмент нуклеїнової кислоти за п 11, який відрізняється тим, що в реакції секвенування ДНК використовують невластивий нуклеотид та ВІДПОВІДНИЙ звичайний нуклеотид при співвідношенні 1 1 або менше 13 Фрагмент нуклеїнової кислоти за п 12, який відрізняється тим, що невластивий нуклеотид є рибонуклеозидтрифосфатом 14 Фрагмент нуклеїнової кислоти за п 13, який відрізняється тим, що нативна термостабільна ДНК-полімераза вибрана з групи, яка включає термостабільні ДНК-полімерази Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus chharophilus, Thermus fihformis, Thermus flavus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus вид Z05, Thermus вид sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga mantima, Thermotoga neapohtana, Thermosipho afncanus, Anaerocellum thermophilum, Bacillus caldotenax, Bacillus stearothermophilus 15 Фрагмент нуклеїнової кислоти за п 13, який відрізняється тим, що нативна термостабільна ДНК-полімераза є термостабільною ДНКполімеразою роду Thermus 16 Фрагмент нуклеїнової кислоти за п 13, який відрізняється тим, що нативна термостабільна ДНК-полімераза є термостабільною ДНКполімеразою роду Thermotoga 17 Фрагмент нуклеїнової кислоти за п 12, який відрізняється тим, що нативна термостабільна ДНК-полімераза містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ Leu Asp Tyr Ser Gin lie Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser 18 Композиція ДЛЯ застосування в реакції секвенування ДНК, яка містить нуклеїнову кислотуматрицю, праймер, суміш звичайних дНТФ та принаймні один невластивий нуклеотид, яка відрізняється тим, що містить рекомбінантну термостабільну ДНК-полімеразу за п 5, і де праймер, комплементарний вказаній матриці є олігонуклеотидним праймером, причому співвідношення між невластивим нуклеотидом та ВІДПОВІДНИМ звичайним нуклеотидом складає 1 1 або менше, а невластивий нуклеотид є рибонуклеозидтрифосфатом Даний винахід відноситься до термостабільної ДНК-полімерази, здатної більш ефективно включати рибонуклеозидтрифосфати У винаході описані методи і способи виділення такої полімерази Ферменти по винаходу можуть застосовуватися для різних цілей, зокрема для секвенування нуклеїнових кислот Таким чином, винахід також відноситься до поліпшених методів аналізу ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеїнових кислот Секвенування ДНК звичайно включає отримання чотирьох популяцій фрагментів одноланцюгової ДНК, що мають одне певне закінчення і одне вариабельне закінчення Вариабельне закінчення 19 Композиція за п 18, яка відрізняється тим, що рибонуклеозид присутній в концентрації нижчій ніж 100 мкМ, а ВІДПОВІДНИЙ звичайний нуклеотид присутній в концентрації більшій ніж 100 мкМ 20 Композиція за п 19, яка відрізняється тим, що невластивий нуклеотид є неміченим 21 Спосіб секвенування нуклеїнової кислотимішені, що включає підготовку реакційної суміші, обробку реакційної суміші, обробку продуктів подовження праймера, розділення продуктів реакції і визначення ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеїнової кислотимішені, який відрізняється тим, що включає підготовку невластивого нуклеотиду і ВІДПОВІДНОГО звичайного нуклеотиду для реакції секвенування ДНК, причому невластивий і ВІДПОВІДНИЙ звичайний нуклеотиди присутні в співвідношенні менш ніж 1 1, де реакція секвенування ДНК передбачає використання рекомбінантної термостабільної ДНК-полімерази за п 1, обробку отриманої реакційної суміші в умовах, придатних для подовження праймера, що включає цей невластивий нуклеотид, обробку отриманих продуктів подовження праймера в умовах, придатних для гідролізу цих продуктів подовження праймера, розділення отриманих продуктів реакції і визначення ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеїнової кислоти-мішені 22 Спосіб секвенування за п 21, який відрізняється тим, що невластивий нуклеотид є рибонуклеотидом 23 Спосіб секвенування за п 22, який відрізняється тим, що рибонуклеотид присутній в концентрації приблизно 0,1 мкМ -100 мкМ 24 Спосіб секвенування за п 23, який відрізняється тим, що ВІДПОВІДНИЙ звичайний нуклеотид присутній в концентрації приблизно 50 - 500 мкМ 25 Набір для секвенування нуклеїнової кислоти, який містить реагенти для секвенування нуклеїнової кислоти, який відрізняється тим, що містить ензим термостабільної ДНК-полімерази з амінокислотною ПОСЛІДОВНІСТЮ Ser Gin lie Xaa Leu Arg Xaa, де Xaa в положенні 4 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ Є амінокислотним залишком, ВІДМІННИМ від глютамінової кислоти Glu та Хаа в положенні 7 приведеної ПОСЛІДОВНОСТІ є залишком валіну Val або ізолейцину Не, суміш звичайних дНТФ і принаймні один невластивий нуклеотид, причому співвідношення між невластивим нуклеотидом та ВІДПОВІДНИМ звичайним нуклеотидом переважно менше ніж 1 звичайно закінчується на конкретних основах нуклеотидів [на гуанині (Г), аденині (А), тимидині (Т), або на цитозині (Ц)] Кожний з чотирьох різних наборів фрагментів розділяють на основі їх довжини З цією метою використовують поліакриламідний гель з високою дозволяючою здатністю Кожна смуга на таких гелях відповідає конкретному нуклеотиду в ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК, показуючи тим самим його положення в ПОСЛІДОВНОСТІ Методом секвенування ДНК, що часто застосовується, є дидезоксі-або ланцюг-термінуючий метод секвенування, який включає ферментативний синтез ланцюга ДНК (Sanger і інш , 1977, Ргос 47423 Nail Acad Sci 74 5463) Звичайно здійснюють чотири різні реакції синтезу, кожна з яких повинна закінчитися на певній основі (Г, А, Т або Ц) шляхом включення ВІДПОВІДНОГО термінуючого ланцюга нуклеотида, такого, як дідезоксінуклеотид Продукти реакції легко визначити, оскільки кожна смуга відповідає тільки Г, А, Т або Ц У дидезоксі- або ланцюг-термінуючому методі випалюють короткий одноланцюговий праймер, ВІДПОВІДНИЙ одноланцюговій матриці Праймер подовжують на його З'-КІНЦІ шляхом включення дезоксінуклеотидів (дНТФ) до включення дідезоксінуклеотида (ддНТФ) Після включення ддНТФ подовження припиняється Однак для гарантії правильності реплікації ДНК ДНК-полімераза володіє більш вираженою здатністю включати природні для них субстраті, тобто дНТФ, і не включати аналоги нуклеотидів, звані невластивими нуклеотидами При синтезі ДНК рибонуклеотиди (рНТФ) розглядаються як невластиві нуклеотиди, оскільки на відміну від ддНТФ рНТФ звичайно не є природними субстратами для ДНК-полімераза in vivo У КЛІТЦІ ця властивість сприяє зниженню включення аномальних основ, таких, як дезоксінозинтрифосфат (дИТФ) або рНТФ, в зростаючий ланцюг ДНК Двома методами автоматичного секвенування, що найбільш часто використовуються, є секвенування з використанням забарвленого праймера і забарвленого термінатора Ці методи придатні для використання з флуоресцентно міченими фрагментами Хоч секвенування також може бути здійснене з використанням радіоактивне мічених фрагментів, секвенування, засноване на флуоресценції, є більш переважним Загалом, при секвенуванні із забарвленим праймером флуоресцентно мічений праймер застосовують в комбінації з неміченими ддНТФ Процес здійснюється з використанням чотирьох реакцій синтезу і до отримання на гелі чотирьох смуг для кожної підлягаючої секвенуванню матриці, (ВІДПОВІДНИХ продукту термінации, який специфічний для кожної основи) Після подовження праймера підлягаючі секвенуванню суміші, що містять продукти термінацм з включеними дідезоксінуклеотидами, звичайно аналізують з використанням електрофореза на гелі для секвенування ДНК Після електрофоретичного розділення флуоресцентно мічені продукти вирізають за допомогою лазера з основи геля і флуоресценцію визначають з використанням ВІДПОВІДНОГО монітора У автоматичних системах при проходженні реакційних сумішей через матрикс геля під час електрофореза детектор сканує основу геля для виявлення, який з мічених фрагментів використовується (Smith і інш , 1986, Nature 321 674-679) У модифікації цього методу кожний з чотирьох праймерів мітять різним флуоресцентним маркером По завершенні чотирьох різних реакцій секвенування реакційні суміші об'єднують і об'єднані реакційні суміші піддають гель-аналізу для кожної смуги, за допомогою чого індивідуально виявляють різні флуоресцентні мітки (ВІДПОВІДНІ чотирьом різним продуктам термінацм, які специфічні для кожної основи) У іншому варіанті застосовують метод секвенування з використанням забарвленого термінатора У цьому методі для включення дНТФ засто совують ДНК-полімераза і флуоресцентно мічені дцНТФ на КІНЦІ ДНК-праймера, що нарощується (Lee і інш , 1992, Nucleic Acid Research 20 2471) Перевагою цього способу є відсутність необхідності синтезувати мічені барвником праймери Крім того, реакції з використанням забарвленого термінатора є більш зручними, оскільки при цьому всі чотири реакції можуть бути здійснені в одній і тій же пробірці Раніше були описані модифіковані термостабільні ДНК-полімерази, що володіють зниженою здатністю розрізнювати дцНТФ (див публікацію європейської заявки ЕР-А-655506 і заявку на патент США 08/448223) Прикладом модифікованої термостабільної ДНК-полімерази є мутантна форма ДНК-полімерази з Т aquaticus, що має залишок тирозина в положенні 667 (замість залишку фенілаланину), тобто так звана F667Yмутантна форма ДНК-полімерази Taq AmphTaq® FS, яка виготовляється фірмою Hoffmann-La Roche і продається через фірму Perkm Elmer, знижує КІЛЬКІСТЬ дцНТФ, необхідну для ефективного секвенування нуклеїнової кислоти-мішені, в декілька сотень або декілька тисяч разів AmphTaq® FS являє собою мутантну форму ДНК-полімерази з Т aquaticus, що має мутацію F667Y і додатковий залишок аспарагінової кислоти в положенні 46 (замість залишку гліцина, С46О-мутація) Таким чином, існує необхідність в термостабільної ДНКполімеразі, що застосовується для альтернативних методів синтезу нуклеїнових кислот, придатних для точного і ефективного з точки зору вартості аналізу нуклеотидної ПОСЛІДОВНОСТІ В ДНК Також існує необхідність в розробці методів, заснованих на флуоресценції, для яких не потрібне застосування дідезоксінуклеотидів Даний винахід направлений на рішення цих задач Даний винахід відноситься до залежної від матриці термостабільної ДНК-полімерази, яка включає характерну амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ-МОТИВ SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID NO 1), причому "Хаа" в положенні 4 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ ЯВЛЯЄ собою залишок будь-якої амінокислоти, крім залишку глутамшової кислоти (G10), а "Хаа" в положенні 7 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ являє собою залишок валіну (Val) або залишок ізолейцину (Не) При вираженні в однолітерному коді амінокислот ця ПОСЛІДОВНІСТЬ-МОТИВ може бути позначена як S Q І X L R V/I, де "X" в положенні 4 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ ЯВЛЯЄ собою залишок будь-якої амінокислоти, крім залишку глутамшової кислоти Здатність термостабільної ДНК-полімерази, що має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, що включає вказану ПОСЛІДОВНІСТЬ мотив, де "X" в положенні 4 цієї ПОСЛІДОВНОСТІмотиву не є залишком глутамшовою кислоти, обмежувати включення рибонуклеотидів в порівнянні з раніше описаної термостабільної полімерази знижена Для зростаючого ланцюга ДНК рибонуклеотиди є невластивими нуклеотидами Таким чином, першим предметом винаходу є нові ферменти, здатні включати невластиві аналоги основ, такі, як рибонуклеотиди, в зростаючий ланцюг ДНК і на декілька порядків більш ефективні, ніж виявлені раніше термостабільні ДНК-синтезуючі ферменти Гени, що кодують ці ферменти, також відносяться до цього винаходу, рівно як і рекомбінантні вектори експресії і клітки-господарі, 47423 що включають ці вектори За допомогою таких трансформованих кліток-господарів можуть бути отримані великі КІЛЬКОСТІ обчищених термостабільних ферментів полімерази ВІДПОВІДНО ДО даного винаходу була виявлена область або ПОСЛІДОВНІСТЬ-МОТИВ всередині амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ термостабільной ДНКполімерази, збільшуюча здатність полімерази включати рибонуклеотиди, зберігаючи при цьому здатність правильно включати дезоксірибонуклеотиди Зміни В ЦІЙ області, наприклад, заміна однієї або декількох амінокислот (наприклад, введення їх шляхом сайтнаправленого мутагенеза), приводить до отримання термостабільного ферменту полімерази, який здатний синтезувати РНК або РНК/ДНКхимери або гібридний ланцюг на матриці ДНК Іншим предметом винаходу є вдосконалені методи і композиції, призначені для визначення ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеїнової кислоти-мішені, при цьому необхідність в термінуванні ланцюг ддНТФ відпадає За допомогою представлених в даному описі вдосконалених методів рибонуклеотиди (рНТФ) включаються в продукти подовження праймерів Оскільки ферменти, що є предметом винаходу, точно і ефективно включають як рНТФ, так і дНТФ, в реакціях секвенування можуть використовуватися суміші обох нуклеотидів Після подовження праймера знову синтезовані олігонуклеотидні продукти можуть бути розщеплені по місцях включення рНТФ методами, відомими в даній області техніки, наприклад, шляхом гідролізу, що приводить тим самим до отримання популяції фрагментів, придатних для фракціонування і аналізу ПОСЛІДОВНОСТІ стандартними методами, такими, як гель-електрофорез Ці методи, засновані на застосуванні нових термостабільних ферментів полімерази, представлені в даному описі Таким чином, цей предмет винаходу відноситься до термостабільної ДНК-полімерази, яка відрізняється тим, що полімераза включає критичний мотив SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID N0 1), де "Хаа" в положенні 4 може являти собою залишок будь-якої амінокислоти, крім залишку глутамшовою кислоти (Glu), а "Хаа" в положенні 7 являє собою залишок валіну (Val) або залишок изолейцина (Не) Іншим предметом винаходу є модифіковані полімерази, представленого в справжньому описі, який включає рибонуклеотиди або аналоги, що містять гідроксильну групу або інший заступник в положенні 2, які звичайно відсутні у дезоксірибонуклеотидів Ці нуклеотиди можуть бути порізному помічені, що створює альтернативні варіанти звичайному застосуванню дідезоксінуклеотидів для цілей секвенування ДНК Мутантні термостабільні полімерази по винаходу здатний більш ефективно включати невластиві нуклеотиди, зокрема рибонуклеотиди, в порівнянні з ВІДПОВІДНИМИ ферментами дикого типу У переважному варіанті здійснення винаходу підлягаючий включенню невластивий нуклеотид може бути аналогом термінувати ланцюг основи, таким, як 2'-гидрокси-3'-дезоксіАТФ (кордицепінтрифосфат), що є "риботермшатором"-аналогом АТФ, або нетермінуючим ланцюгом нуклеотидом, таким, як рНТФ Іншим предметом винаходу є мутантні термо 8 стабільні полімерази, які здатні більш ефективно включати невластиві нуклеотиди, зокрема рибонуклеотидам, чим ВІДПОВІДНІ ферменти дикого типу Таким чином, цей предмет винаходу відноситься до рекомбінатних термостабільних ДНК- полімераз, кожна з яких характеризується тим, що (а) в своїй нативній формі полімераза включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO 2), де "Хаа" в положенні 7 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ означає залишок валіну (Val) або залишок изолейцина (Не), (б) в амінокислотній ПОСЛІДОВНОСТІ рекомбшантного ферменту, переважно в положенні 4 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ, отримують мутацію, при якій залишок глутамшової кислоти в положенні 4 являє собою залишок іншої амінокислоти, переважно залишок гліцина, і (в) здатність рекомбінантного ферменту обмежувати включення рибонуклеотидів і аналогів рибо нуклеотид їв в порівнянні з нативной формою цього ферменту знижена Іншим предметом винаходу є полімераза, який призначений для фрагментації продуктів амплифікацм і продуктів подовження праймера, причому такі фрагментированні продукти можуть бути придатні для використання в методах, заснованих на гибридизации, і для різних стратегій визначення ПОСЛІДОВНОСТІ Ферменти по даному винаходу і кодуючі їх гени можуть застосовуватися для створення композицій, придатних для здійснення реакцій секвенування ДНК і включаючих суміш звичайних нуклеотидів і принаймні один рибонуклеотид або аналог рибонуклеотида У переважному варіанті здійснення винаходу невластивий нуклеотид являє собою рибонуклеотид, а концентрація рибонуклеотида нижче за концентрацію ВІДПОВІДНОГО дезоксірибонуклеотида, тобто відношення рНТФ дНТФ складає 1 1 або менш Ферменти по винаходу також придатні для продажу у вигляді наборів, які також можуть включати будь-який з додаткових елементів, необхідних для здійснення реакції секвенування нуклеїнової кислоти, такої, як, наприклад, дНТФ, рНТФ, буфери та/або праймери Даний винахід відноситься до нового і поліпшеного модифікованого термостабільного ДНКпол і меразам, композицій і наборів, охарактеризованого в формулі винаходу Ферменти по винаходу більш ефективно включають невластиві нуюіеозидтрифосфати в порівнянні з раніше ВІДОМИМІ полімеразамі або ВІДПОВІДНИМИ полімеразами дикого типу, з яких отримують ці нові полімерази Згідно З винаходом також пропонуються ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК, що кодують ці модифіковані ферменти, вектори для експресії модифікованих ферментів і клітки з такими впровадженими в них векторами Ферменти по винаходу придатні для практичного застосування в нових методах секвенування ДНК, які володіють рядом переваг в порівнянні з методами секвенування ДНК, відомими з рівня техніки Нижче для полегшення розуміння суті даного винаходу визначені деякі поняття Поняття "звичайний", якщо воно згадується в зв'язку з основами нуклеїнової кислоти, нуклеозидтрифосфатами або нуклеотидами, відноситься до такого, який зустрічається в природних умовах у вказаному полинуклеотиді (наприклад, для ДНК це дАТФ, дГТФ, дЦТФ та дТТФ) Крім того, в реак 47423 ціях синтезу ДНК in vitro, таких, як секвенування, замість дЦТФ часто використовують с7дГТФ і дИТФ (хоч вони включаються з меншою ефективністю) Загалом вони можуть бути узагальнені поняттям дезоксірибонуклеозидтрифосфати (дНТФ) Поняття "система експреси" відноситься до последователностям ДНК, що містить необхідну кодуючу ПОСЛІДОВНІСТЬ і функціонально пов'язані контролюючі ПОСЛІДОВНОСТІ, так що господарі, трансформовані цими послідовностями, володіють здатністю продуцировать протеїни, що кодуються Для осуществлениия трансформації система експреси може бути включена у вектор, хоч придатна ДНК також може бути включена в хромосому господаря Поняття "ген" відноситься до ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК, яка включає контролюючі і кодуючі ПОСЛІДОВНОСТІ, необхідні для отримання, що відтворюється біологічно активного полипептида або попередника Поліпептид може кодуватися повноразмірною ПОСЛІДОВНІСТЮ гена або будь-якою маючу достатню довжину частиною кодуючої ПОСЛІДОВНОСТІ, щоб зберегти ферментативну активність Поняття "клітка(і) -господар(і)" відноситься як до одноклітинним прокариотическим або еукариотическим організмам, таким, як бактерії, дріжджі і актиномицети, так і до окремих кліток з рослині або тваринних вищих загонів, якщо вони здатні рости в культурі кліток Поняття, що Використовується в даному описі "реакційна суміш для секвенування ДНК" відноситься до реакційної суміші, яка включає елементи, необхідні для реакції секвенування ДНК Таким чином, реакційна суміш для секвенування ДНК придатна для використання в методі секвенування ДНК для визначення ПОСЛІДОВНОСТІ нуклеїнової кислоти-мішені, хоч спочатку реакційна суміш може бути неповною, щоб користувач міг контролювати ініціація реакції секвенування У цьому випадку реакція може бути почата після того, як буде доданий останній елемент, такий, як фермент, який вводиться для отримання повної реакційної суміші для секвенування ДНК Звичайно реакційна суміш для секвенування ДНК повинна містити буфер, придатний для полімеризації, нуклеозидтрифосфати і принаймні один невластивий нуклеотид Реакційна суміш також може містити праймер, який може подовжуватися на мішені полімеразою, полімеразу і нуклеїнову кислоту-мішень Праймер, рівно як і один з нуклеотидів звичайно включає той, що містить мітку, наприклад, флуоресцентну, фрагмент, який може бути виявлений Звичайно реакційна суміш являє собою суміш, яка включає чотири звичайних нуклеотид и і принаймні один невластивий нуклеотид У переважному варіанті здійснення полімераза являє собою термостабільну ДНК-полімеразу, а невластивий нуклеотид являє собою рибонуклеотид Поняття "олігонуклеотид", що використовується в даному описі, відноситься до молекули, що складається з двох або декількох дезоксірибонуклеотидов або рибонуклеотидів, переважно більш ніж з трьох і звичайно більш ніж з десяти Точний розмір олігонуклеотида може залежати від багатьох чинників, включаючи основну функцію або застосування олігонуклеотида 10 Олігонуклеотиди можуть бути отримані будьяким придатним методом, включаючи, наприклад, клонирование і рестрикцию ВІДПОВІДНИХ последовательностей, і методом прямого ХІМІЧНОГО синтезу, таким, як фосфотриефирний метод Narang і інш , 1979, Meth Enzymol 68 90-99, фосфодиефирний метод Brown і інш , 1979, Meth Enzymol 68 109-151, диетилфосфорамидний метод Beaucage і інш, 1981, Tetrahedron Lett 22 18591862, триефирний метод Matteucci і інш , 1981, 5 Am Chem Soc 103 3185-3191, автоматичними методами синтезу або методом з використанням твердої підкладки, описаним в патенті США 4458066 Поняття "праймер", що використовується в даному описі, відноситься до природному або синтетичному олігонуклеотиду, який здатний служити точкою ініціація синтезу при створенні умов, при яких починається подовження праимера Праймер переважно являє собою одноланцюговий олігодезоксірибонуклеотид Відповідна довжина праимера залежить від призначення праимера, але звичайно складає від 15 до 35 нуклеотидів Для коротких молекул праимера звичайно необхідні більш низькі температури для утворення досить стабільних гібридних комплексів з матрицею Праймер не повинен відображати точну ПОСЛІДОВНІСТЬ матриці, але для того, щоб відбувалося подовження праимера, повинен володіти достатньою мірою комплементарное™ для гибридизацп з матрицею При необхідності праймер може бути помічений шляхом включення мітки, яка може бути виявлена спектроскопичними, фотохимичними, біохімічними, иммунохимичними або ХІМІЧНИМИ способами Наприклад, придатні мітки включають 32 Р, флуоресцентние барвники, електронноплотние реагенти, ферменти (такі, як звичайно що застосовуються в методах ELISA), биотин або гаптени і протеїни, для яких є антисиворотки або моноклональние антитіла Поняття "термостабільна полімераза" відноситься до ферменту, який стабільний при нагріванні і який стійкий до нагрівання і зберігає достатню активність для послідуючего здійснення реакції подовження праимера при впливі підвищених температур протягом часу, необхідного для здійснення денатурації двохланцюгових нуклеїнових кислот Згідно З даним описом термостабільна полімераза придатний для використання в реакції з температурними циклами, такій, як полімерізна ланцюгова реакція (ПЛР) Для термостабільної полімерази під ферментативною активністю розуміють здатність ВІДПОВІДНИМ образом катализувати приєднання нуклеотидів для формування продуктів подовження праимера, які комплементарии до ланцюга нуклеїнової кислоти-матриці Необхідні для денатурації нуклеїнової кислоти умови нагрівання можуть залежати, наприклад, від концентрації солі в буфері, а також складу і довжини нуклеїнових кислот, що підлягає денатурации, але звичайно вони знаходяться в інтервалі від приблизно 90°С до приблизно 105°С, переважно від 90°С до 100°С, а тривалість нагрівання в основному залежить від температури і довжини нуклеїнової кислоти, і звичайно вона складає від декількох секунд до чотирьоххвилин 12 11 47423 Поняття "невластивий" або "модифікований", типу вони мають модифікацію в амінокислотній коли воно характеризує основу нуклеїнової кислоти, нуклеозидтрифосфат або нуклеотид, включає ID NO 2), де "Хаа" в положенні 7 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ П О С Л І Д О В Н О С Т І - М О Т И В І модифікацію, ПОХІДНІ або аналоги звичайних основ або нуклеотидів, які зустрічаються в ДНК в природних умовах Зокрема згідно з даним описом невластиві нуклеотиди модифіковані в положенні 2 цукру рибози в порівнянні із звичайними дНТФ Таким чином, хоч рибонуклеотиди (тобто АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ, звані в цілому рНТФ) і явялються нуклеотидами, що зустрічаються в природних умовах РНК, в контексті даного опису ці рибонуклеотиди є невластивими нуклеотидами, оскільки мають в положенні 2 цукру гідроксильну групу, яка відсутня в дНТФ Аналоги рибонуклеотидів, що містять заступники в положенні 2, такі, як 2'-фтор-, 2'-аминозамещенние аналоги, підпадають під об'єм винаходу Крім того, аналоги рибонуклетидів можуть бути модифіковані в положенні 3', наприклад, шляхом заміщення нормальної гідроксильної групи на водневу групу (З'-дезоксі), що приводить до отримання аналога-термінатор рибонуклеотида Такі нуклеотиди також включені в об'єм поняття "невластиві нуклеотиди" Оскільки ДНК звичайно складається з дНТФ, включення рНТФ повинно розглядатися як невластиве, і, отже, рНТФ повинен розглядатися як невластива основа Таким чином, в переважному варіанті винаходу при здійсненні методів подовження ДНК-праймера, включаючи методи секвенування ДНК, як продукти отримують нуклеїнові кислоти, які містять як звичайні, так і невластиві нуклеотиди, але в основному вони містять звичайні нуклеотиди, які являють собою дНТФ Невластиві основи можуть бути флуоресцентно міченими, наприклад, флуоресцином або родаміном, нефлуоресцентно міченими, наприклад, біотином , міченими ізотопами, наприклад, 32 Р, 3 Р або 35 S , або неміченими Для пояснення суті винаходу в описі приведені приклади специфічних термостабільних ферментів ДНК-полімераз по винаходу, однак ці посилання не повинні розглядатися як обмежуючі об'єм винаходи У переважному варіанті термостабільні ферменти по винаходу застосовували в різних методах секвенування нуклеїнових кислот, хоч нові термостабільні полімерази, приведеного в даному описі, може застосовуватися для будь-якої мети, де така ферментативна активність є необхідною або бажаною Фермент також може застосовуватися в реакціях амплифікацм, таких, як ПЛР Термостабільні полімерази по винаходу відрізняється тим, що кожна з них містить критичний мотив SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID NO 1), де "Хаа" в положенні 4 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ ЯВЛЯЄ собою залишок будь-якої амінокислоти, крім залишку глутамшовою кислоти (Glu), а "Хаа" в положенні 7 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ являє собою залишок валіну (Val) або залишок изолейцина (Не) Гени, які кодують термостабільні полімерази, які мають залишок глутамшової кислоти в положенні 4 цього мотиву, може бути модифіковані згідно з справжнім описом з отриманням придатних модифікованих полімераз Ці модифіковані термостабільні полімерази відрізняється тим, що в порівнянні з ВІДПОВІДНИМИ нативними ферментами або ферментами дикого S e r G l n l l e G l u L e u A r g X a a ( S E Q означає залишок валіну (vai) або залишок изолейцина (Не), тобто цей мотив був модифікований шляхом заміщення залишку глутамшовою кислоти в положенні 4 залишком іншої амінокислоти Критичний мотив термостабільної ДНК-полімерази по даному винаходу приведений нижче з використанням стандартного однолітерного коду амінокислот (Lehmnger, Biochemistry, New York, Worth Publishers Inc , 1970, crop 67) SEQ ID NO 1 SerGlnlleXaaLeuArgXaa, де "Хаа" в положенні 4 представляє з себе залишок будьякої амінокислоти, крім залишку глутамшовою кислоти (Glu), а "Хаа" в положенні 7 являє собою залишок валіну (Val) або залишок изолейцина (є) Кодуючі ПОСЛІДОВНОСТІ генів, рівно як і протеїни, що містять цю критичну амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, де Хаа в положенні 4 не є залишком глутамшовою кислоти (Glu), відносяться до полімерази, здатність якої обмежувати включення рНТФ знижена, і включені в об'єм даного винаходу Всередині критичного мотиву можуть бути здійснені додаткові модифікації залишків інших амінокислот, переважно залишків амінокислот, вибраних з групи, що включає глутамин (Gin або Q), лейцин (Leu або L) або аргинин (Arg або R) Даний винахід може використовуватися для отримання термостабільних ДНК-полімераз з поліпшеними властивостями шляхом певної модифікації в ПОСЛІДОВНОСТІ гена, який кодує термостабільну ДНК-полімеразу У переважному варіанті винаходу ПОСЛІДОВНІСТЬ гена і фермент, що кодується відбуваються з видів роду Thermus, хоч еубактерии, що не відносяться до роду Thermus, також включені в даний винахід, як це більш детально описане нижче Аналогічно цьому, в зв'язку з висококонсервативною природою виявленого в даному дослідженні критичного мотиву, нові термостабільні ДНК-полімерази можуть бути виявлені на основі їх гомологи, наприклад, з Taqполімеразою Такі термостабільні полімерази включений в об'єм даного винаходу при умові, що їх амінокислотна ПОСЛІДОВНІСТЬ включає мотив SQI XLRV/I, де X означає залишок будь-якої амінокислоти, крім залишку глутамшовою кислоти, і ця амінокислотна ПОСЛІДОВНІСТЬ в цілому гомологична (ідентичність ПОСЛІДОВНОСТІ) принаймні приблизно на 39%, переважно принаймні приблизно на 60%, більш переважно принаймні приблизно на 80% амінокислотній ПОСЛІДОВНОСТІ нативної Taqполімерази Вся довжина ПОСЛІДОВНОСТІ ЦІЄЇ Taq полімерази приведена в W O 89/06691 і зареєстрована під реєстраційним номером Р90556 в базі даних запатентованих послідовностей GENESEQ або під реєстраційним номером М26480 в базі даних послідовностей EMBL і під реєстраційним номером А33530 в базі даних послідовностей PIR Прикладом термостабільних ДНК-полімераз по даному винаходу є рекомбшантні ПОХІДНІ нативних полімераз з організмів, приведених нижче в таблиці 1 У таблиці 1 приведена конкретна ПОСЛІДОВНІСТЬ критичного мотиву і положення залишку "X" для кожної з цього нативних полімераз Оскільки кожного термостабільного ДНК-полімераза є уні 47423 14 13 кальною, положення амінокислот критичного моstearothermophilus ПОСЛІДОВНІСТЬ-МОТИВ тиву є визначеним для кожного ферменту Для SerGlnlleGluLeuArglle (SEQ ID NO 4), наприклад, перерахованих нижче полімераз амінокислотний присутній в нативних термостабільних полімеразалишок в положенні "X" критичного мотиву SQI зах Thermotoga mantima, Thermotoga neapohtana і XLRV/I являє собою глутаминовую кислоту МолеAnaerocellum thermophilum кулярна маса переважних полімераз по даному винаходу складає від 85000 до 105000 Так, більш Таблиця 1 переважно від 90000 до 95000 Так Амінокислотна ПОСЛІДОВНІСТЬ цих полімераз складається з при близно 750-950 залишків амінокислот, переважно із 800-850 залишків амінокислот Полімерази по даному винаходу може перебувати з приблизно 540 або більше за амінокислоти і включають принаймні полімеразний домен і частину, відповідну 3'-5'-екзонуклеазному домену (отримана полімераза може володіти або не володіти 3'-5'екзонуклеазной активністю), і можливо частини 5'З'-екзонуклеазного домена, який розташований на першій третині амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ багатьох повнорозмірних термостабільних полімераз Для термостабільних ДНК-полімераз, не приведеного в таблиці 1, вибір ВІДПОВІДНОЮ глутамшовою кислоти, що підлягає модифікації, є простоєм, якщо визначений критичний мотив або консенсусний мотив в амінокислотній ПОСЛІДОВНОСТІ Незалежно від точного положення всередині термостабільної ДНК-полімерази, заміщення залишку глутамшовою кислоти (Glu) на залишок іншої амінокислоти всередині послідовності-мотиву SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO 2), де "Хаа" в положенні 7 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ означає залишок валіну (Val) або залишок изолейцина (Не), в полімеразному домені дозволяє отримати термостабільного полімераза, здібного до ефективного включення невластивих нуклеотидів У переважному варіанті глутамшовую кислоту замінюють на амінокислоту, що має ненавантажену полярну Догрупу, таку, як гліцин, серии, цистеин, треонин, або на амінокислоту, що має невелику неполярну Rгрупу, таку, як, наприклад, аланин У найбільш переважному варіанті залишок глутамшовою кислоти замінюють на залишок гліцина (G) Програми, що дозволяють встановити амінокислотну і нуклеотидную ПОСЛІДОВНІСТЬ, можуть бути придбані у фірми Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Медісон, шт Віськонсин Програми, придатні для конкретного, певного в даному описі мотиву включають, наприклад, "GAP", "BESTFIT" і "PILEUP", сприяючі виявленню точної ПОСЛІДОВНОСТІ підлягаючої модифікації області Як видно з приведеній нижче таблиці 1, існують дві необхідні форми консервативні послідовності-мотиву SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO 2) всередині полімеразного домену термостабільних ДНК-полімераз цих термофільних організмів ПОСЛІДОВНІСТЬ-МОТИВ SerGlnlleGluLeuArgVal (SEQ ID NO 3) присутній в нативних термостабільних полімерах таких видів роду Thermus, як, наприклад, Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus thermophilus, Thermus flavus і Thermus fihformis, а також видів Thermus spsl7 і Z05 Послідовність-мотив SerGlnlleGluLeuArgVal (SEQ ID NO 3) також присутній в полімеразном домені інших термостабільних ДНК- полімераз, які отримуються, наприклад, з Thermosipho afncanus і з різних штамів Bacillus, таких, як Bacillus caldotenax і Bacillus Амінокислотна Організм Thermus aquaticus (Taq) Thermus caldophilus (Tea) Thermus thermophilus (Tth) Thermus flavus (Tfl) Thermus fihformis (Tfi) Вигляд Thermus spsl7 Вигляд Thermus Z05 Thermotoga mantima (Tma) Thermotoga neapohtana (Tne) Thermosipho afncanus (TaO Anaerocellum thermophilum (Ath) Bacillus caldotenax (Bca) Bacillus stearothermophilu s (Bst) ПОСЛІДОВНІСТЬ консенсусного мотиву SQIXLRV/I Положення глутамшової кислоти SQIXLRV 615 SQIXLRV 617 SQIXLRV 617 SQIXLRV 616 SQIXLRV 613 SQIXLRV 613 SQIXLRV 617 SQIXLRI 678 SQIXLRI 678 SQIXLRV 677 SQIXLRI 632 SQIXLRV 659 SQIXLRV 658, 661 або 736* * Залежить від вибраної амінокислотної ПОСЛІДО ВНОСТІ (див нижче) Повна ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеїнової кислоти і амінокислотна последовнісгь для кожної з Taq-, Tth-, Z05-, spsl7-, Tma- і Taf-полімераз описана в патенті США 5466591 і включена в даний опис як посилання ПОСЛІДОВНІСТЬ ДНК-полімерази з Tea, Tfl, Tne, Ath, Bca і Bst описана в наступних публікаціях Tea в базі даних послідовностей EMBL під реєстраційним номером U62584 (див також у Kwon, 1997, Мої Cells 7(2) 264-271), Tfl у Akhmetzjanov і Vakhitov, 1992, Nucleic Acids Research 20(21) 5839, Tne в W O 97/09451 і в W O 96/41014, Ath в базі даних послідовностей EMBL під реєстраційним номером Х98575 (більш докладне штамм Ath описаний у Ramey і інш , 1993, 3 Bactenol 175(15) 4772-4779), Bst у Uemon і інш , 1993, J Biochem 113 401-410 і в базі даних послідовностей EMBL під реєстраційним номером U23149 (див також у Phang і інш , 1995, Gene 163 65-68) АМІНОКИСЛОТНІ ПОСЛІДОВНОСТІ Bst-полімерази, що містять "Е" в критичному мотиві в положенні 658, також описані 15 в опублікованому японському патенті JP 05/304964А, опублікованої європейській заявці ЕРА-699760 і у Ahotta і інш , 1996, Genet Anal 12 185-195, ПОСЛІДОВНІСТЬ також може бути отримана з бази даних послідовностей EMBL під реєстраційним номером U33536 ПОСЛІДОВНІСТЬ, Я К описано в Gene 163 65-68 (1995), містить залишок "Е" в положенні 661 критичного мотиву Вса-полімераза описана у Uemon і інш , 1993, J Biochem 113 4 0 1 410 і в базі даних послідовностей EMBL під реєстраційним номером D12982 Термостабільна ДНКполімераза з Thermus fihformis (див FEMS Microbiol Lett 22 149-153, 1994, також депонована в АТСС під номером 43280) може бути відновлена з використанням методів, описаних в патенті США 4889818, а також на основі інформації про ПОСЛІДОВНІСТЬ, представлену в таблиці 1 Кожна з вищезгаданих послідовностей і публікацій включені в даний опис як посилання Гомологія (ідентичність ПОСЛІДОВНОСТІ) МІЖ амінокислотною ПОСЛІДОВ НІСТЮ нативної форми Taq-полімерази, як указано в W O 89/06691, і ПОСЛІДОВНІСТЮ вказаного раніше Tfl-полімеразою складає більше за 87,4% Відповідна гомологія з Tth-полімеразою складає 87,4%, з Тса-полімеразою складає 86,6%, з Bstполімеразою (реєстраційний номер U23149) складає 42,0%, з Вса-полімераза складає 42,6% і з Athполімераза складає 39,7% Як видно з таблиці 1, критичний мотив є помітно консервативним у термостабільних ДНКполімераз У випадку, коли "X" означає залишок глутамшовою кислоти, зміна гена, що кодує полімеразу, дозволяє отримати фермент по винаходу, який легко включає рНТФ в порівнянні, наприклад, з Taq-полімеразою, у якій критичний мотив не модифікований Отже, винахід відноситься до класу ферментів, який також включає, наприклад, термостабільну ДНК-полімеразу, і до ВІДПОВІДНОГО гена і векторів експресії з Thermus oshimai (Williams і і н ш , 1996, Int J Syst Bactenol 46(2) 403-408), Thermus silvanus і Thermus chharophilus (Tenreiro і інш , 1995, Int J Syst Bactenol 45(4) 633-639), Thermus scotoductus (Tenreiro і інш , 1995, Res Microbiol 146(4) 315-324), Thermus brockianus (Munster, 1986, Gen Microbiol 132 1677) і Thermus ruber (Logmov і інш , 1984, Int J Syst Bactenol 34 498-499, також депоновані в АТСС під номером 35948) Крім того, винахід включає, наприклад, модифіковані форми термостабільних ДНК-полімераз і ВІДПОВІДНІ гени і вектори експресії з Thermotoga elfii (Ravot і інш , 1995, Int J Syst Bactenol 45 312, також депоновані в DSM під номером 9442) і Thermotoga thermaium (Wmdberger і і н ш , 1992, Int J Syst Bactenol 42, 327, також депоновані в DSM під номером 5069) Кожна з вищезгаданих послідовностей і публікацій включені в даний опис як посилання У переважному варіанті підлягаючий модифікації критичний мотив знаходиться всередині амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ LeuAspTyrSerGlnlleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuS (SEQ ID NO 5) Таким чином, одним з предметів винаходу є отримання мутантних термостабільних ДНК-полімераз, що виявляє істотно збільшену ефективність по включенню невластивих нукпеотидів при використанні матриці У особливо пере 47423 16 важному прикладі ПОСЛІДОВНІСТЬ полімерази включає LeuAspTyrSerGlnlleGlyLeuArgValLeuAlaHisLeuS (SEQ ID NO 6) Такі термостабілні ДНКполімерази особливо придатний в таких процесах, як секвенування ДНК, синтез РНК на основі ДНК і синтез in vitro ДНК, що мають як заступників рНТФ Отримання термостабільних ДНК-полімераз з підвищеною ефективністю по включенню невластивих основ може бути здійснене за допомогою таких способів, як сайтнаправлений мутагенез Див, наприклад, публікацію Sambrook і інш , Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, друге видання, розділ 15 5 1 , "Ohgonucleotide- Mediated Mutagenesis", включену в даний опис як посилання Наприклад, мутація, що полягає в заміні "А" на "G" у другому положенні кодона, що кодує залишок глутамшовою кислоти 615 в ПОСЛІДОВНОСТІ гена ДНК-полімерази Thermus aquaticus (Taq) (див SEQ ID NO 7), приводить до більш ніж 500-кратному збільшенню ефективності включення невластивих нуклеотидів згідно з даним описом, зберігаючи при цьому здатність ферменту медиирувати ПЛР в присутності звичайних нуклеотидів, тобто дНТФ Ця конкретна мутація в ДНК-полімеразі Taq приводить до заміни амінокислоти Е (глутаминова кислота) на Про (гліцин) Хоч ця конкретна заміна амінокислоти істотно змінює здатність ферменту включати невластиві нуклеотиди, потрібно чекати, що заміна залишку глутамшовою кислоти на залишки будь-яких інших амінокислот, такі, як, наприклад, залишки сершу, цистеїну, треоншу, аланіну, валіну або лейцину, буде надавати таку ж дію Отже, даний винахід включає і ІНШІ амінокислотні заступники, які заміняють Е615, хоч мутант E615G є переважним Таким чином, в основі винаходу лежить той факт, що четвертий залишок амінокислоти в мотиві, представленому в SEQ ID NO 1, не є залишком глутамшовою кислоти Сайт-направлений мутагенез також може бути здійснений шляхом сайт-специфічного праймернаправленого мутагенеза Цей спосіб в даний час є стандартним в даній області техніки, і його здійснюють з використанням синтетичного олігонуклеотидного праймера, комплементарного одноланцюгової ДН К фага, яка підлягає мутурванню, за винятком обмеженого помилкового спаровування, що являє собою необхідну мутацію Загалом як праймер для прямого синтезу ланцюга, комплементарній плазмиді або фагу, застосовують синтетичний олігонуклеотид, а двохланцюгову ДНК, що утворилася трансформують в бактерію-господаря, підтримуючу фаг Бактерія, що Утворилася може бути проаналізована, наприклад, методом секвенування Д Н К або шляхом гибридизацм із зондом з метою виявити ті бляшки, які несуть необхідну змінену ПОСЛІДОВНІСТЬ гена У альтернативному варіанті можуть застосовуватися методи "рекомбінантної ПЛР", описані в PCR Protocols, San Diego, Academic Press, під ред Innis і шш , 1990, розділ 22, озаглавлений "Recombmant PCR", Higuchi, crop 177-183 Як показано в таблиці 1, глутаминова кислота в критичному мотиві Taq-полімерази зберігається в інших термостабільних ДНКполімеразах, однак може бути локалізована в іншому, але близькому положенні амінокислотної 18 17 47423 ПОСЛІДОВНОСТІ Зміна консервативною глутамшоданому описі, за допомогою стандартних методів вою кислоти в SEQ Ю N0 2 термостабільних ДНКрекомбінації також можна конструювати химерні полімераз з представників роду Thermus і ДНКполімерази, які состоять з доменів, що відбуваполімераз з родинних родів Thermotoga, ються з різних термостабільних ДНК-полімераз У Thermosipho і Anaerocellum повинне також посипатентах США 5466591 і 5374553 описані методи лювати здатність полімерази по ефективному обміну різними функціональними сегментами тервключенню невластивих нуклеотидів в порівнянні з мостабільних полімераз, такими, як 5'-3'Taq-полімеразою, що містить SEQ ID NO 2 екзонуклеазний домен, 3'-5'-екзонуклеазнйй домен і полімеразний домен, з отриманням нових ферЗміна залишку глутамшовою кислоти в критиментів Переважні хімерні термостабільні ферменчному мотиві іншого термостабільних ДНКти полімерази включають 5'-3'-екзонуклеазний полімераз можуть бути здійснені з використанням домен, 3'-5'-екзонуклеазний домен і полімеразний принципів і способів, що застосовуються в сайтнадомен, причому один з доменов відбувається від правленому мутагенезі У GeneBank або в базі іншої полімерази, і полімеразний домен містить даних SwissProt/PIR існує декілька послідовностей критичний мотив SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID ДНК-полімерази Bacillus stearothermophilus Ці поNO 1), де "Xaa" в положенні 4 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ следовносп мають високу міру спорідненості, одявляє собою залишок будь-якої амінокислоти, крім нак дещо відрізняються один від одного, але кожзалишку глутамшовою кислоти (Glu), a "Xaa" в пона з них містить ідентичну критичну ПОСЛІДОВНІСТЬложенні 7 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ являє собою залишок мотив SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO 2), де валіну (Val) або изолейцина (Не) Прикладами та"Xaa" в положенні 7 цієї ПОСЛІДОВНОСТІ означає ких химерних молекул є химерні ферменти залишок валіну (Val) або залишок изолейцина Taq/Tma, будова яких приведена в таблиці 2 Як (Не), хоч і в різних положеннях ПОСЛІДОВНОСТІ Завидно з цієї таблиці, полімеразний домен цих хісновуючись на опублікованій інформації про домерних ферментів Taq/Tma містить мутацію у вкаступні амінокислотні і нуклеотидних ПОСЛІДОВНОСТІ заному вище критичному мотиві термостабільних ДНК-полімераз, представлені в Таблиця 2 Taq Tma Taq/Tma Taq/Tma 5'-3'-екзонуклеазний домен а к 1-289 а к 1-291 а к 1-289 (Taq) а к 1-289 (Taq) 3'-5'-екзонуклеазний домен а к 290-422 а к 292-484 а к 292-484 (Tma) а к 292-484 (Tma) Плазмида рСІ ВІДПОВІДНО за Будапештським договором була депонована в АТСС 17 липня 1996 р і отримала реєстраційний номер 98107 Плазмида рСІ містить ген, що кодує термостабільну ДНК-полімеразу з мутацією в кодоне, що кодує залишок глутамшовою кислоти в положенні 615 амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ нативної Taqгюлімерази, що приводить до отримання мутантні форми Taq-полімерази, яка має залишок гліцина в положенні 615 (Е615С-мутантна Taq-полімераза) Цей депозит дозволяеє застосовувати альтернативні способи для отримання термостабільних ДНК-полімераз, що володіють підвищеною ефективністю по включенню невластивих аналогів нуклеотидів У прикладі 1 показано, що застосування фланкуючих сайтів рестрикції, придатних для субклонування мутації E615G, дозволяє створити ІНШІ термостабільні ферменти ДНК- полімерази Оскільки для числених термостабільних ДНКполімераз відома повна ПОСЛІДОВНІСТЬ гена, засновуючись на інформації про ПОСЛІДОВНІСТЬ критичного мотиву, приведену в описі, для введення мутації Е615 можна використати ІНШІ ВІДОМІ фахівцям в даній області техніки способи, такі, як розщеплення рестриктазами і заміщення фрагмента або сайт-специфічний мутагенез in vitro Модифікований ген або фрагмент гена, отриманий сайтспецифічним мутагенезом, може бути отриманий з плазмиди або фага стандартними способами і лигирован з вектором експресії для наступного культивування і виділення ферменту, що утворив Полімеразний домен а а а а к к к к 423-832 485-893 423-832 (Taq) з мутацією E615G 485-893 (Tma) з мутацією E678G ся Для практичного здійснення винаходу придатні численні клониручи і експрессиручи вектори, включаючи системи, придатні для ссавців і бактерій, і вони описані, наприклад, у Sambrook і шш , Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, друге видання, 1989 Для зручності в даному винаході приведений приклад використання промотора PL, що відбувається з фага лямбда (Shimatake і шш , 1981, Nature 292 128) Застосування це промотора, зокрема, описане в патентах США 4711845 і 5079352 Термостабільні ДНК-полімерази по даному винаходу звичайно виділяє з мікроорганізмів, таких, як Е сої і, які були трансформовані вектором експреси, функціонально пов'язаним з геном, що кодує ДНК-полімеразу дикого типу або модифіковану термостабільну ДНК-полімеразу Прикладом придатного мікроорганізму-господаря є штамм Е соїі DG116, описаний у Lawyer і шш , 1993, PCR Methods and Applications 2 275-287, і цей штамм також може бути отриманий з американської колекції типових культур (American Турові Culture Collection) під реєстраційним номером АТСС 53601 Методи очищення термостабільної полімерази також описані, наприклад, у Lawyer і шш , 1993, PCR Methods and Applications 2 275- 287 Для фахівця в даній області техніки очевидно, що вищезгадані термостабільні ДНК-полімерази, що володіють збільшеною ефективністю по включенню невластивих нуклеотидів, найбільш легко може бути отриманий з використанням методів, 19 47423 заснованих на технології рекомбінантної ДНК Необхідність отримання одного з ферментів по даному винаходу або похідного або гомолога цих ферментів припускає створення рекомбінантної форми ферменту, яке звичайно включає конструювання вектора експреси, трансформацію кліткигосподаря цим вектором і культивування трансформованою клітки-господаря в умовах, при яких така експресія буде відбуватися Способи отримання векторів експреси, трансформації і культивування трансформованою клітки-господаря добре ВІДОМІ в даній області техніки і детально описані, наприклад, у Sambrook і інш , 1989, див вище Даний винахід відноситься до термостабільних ДНК-полімеразам, який разом з рибонуклеозидтрифосфатами придатний для здійснення численних функцій, включаючи амплифікацію нуклеїнової кислоти, методи визначення і секвенування ДНК Застосування рибонуклеотидів при секвенуванні дозволяє виключити використання ланцюгтермінувати аналогів, що мають високу вартість, таких, як ддНТФ, і, що є важливим чинником, полегшує отримання нових продуктів амплифікацп, придатних не тільки для аналізу ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК, але і для інших типів аналізу, таких, як електрофорез або гібридизація, без необхідності наступного проведення реакцій секвенування ДНК Раніше вже було підтверджено, що пирофосфатаза поліпшує результати секвенування при використанні як мезофильних полімераз, так і термостабільних ДНК-полімераз за рахунок зниження КІЛЬКОСТІ продуктів подовження, що нагромаджуються, отриманого в результаті пирофосфоролизису При цьому до початку циклу секвенування необхідно використати методи, що дозволяють вводити додатковий фермент в реакцію секвенування Однак найбільш істотна перевага даного винаходу полягає в тому, що для секвенування ДНК не потрібно пирофосфатазу Таким чином, застосувавші нових, представлених в даному описі ферментів усуває необхідність в додаткових витратах по введенню другого ферменту в суміш для реакції секвенування При застосуванні ферментів по даному винаходу реакції амплифікацм і секвенування об'єднують, що сприяє економії часу і матеріалів, а також спрощує весь аналіз Ці, а також ІНШІ переваги досягаються, насамперед, завдяки тому, що включення як звичайних нуклеотидів, так і рибонуклеотидів і їх аналогів в продукт подовження праймера дозволяє отримати химерний ланцюг РНК/ДНК, чутливий до гідролізу РНК Обробка не надає впливу на скелет ДНК і приводить до отримання популяції фрагментів нуклеїнової кислоти, кожний з яких закінчується в тому положенні, де був вбудований рибонуклеотид замість ВІДПОВІДНОГО дНТФ Гідроліз легко здійснюють різними способами, що включають, алечне обмежуючись ними, лужний гідроліз (наприклад, обробка NaOH в кінцевій концентрації 0,2М, як описано нижче в прикладі VI), нагрівання або ферментативна обробка РНКазой (під ред Vogel і інш , Informational Macromolecular, New York, Academic Press, 1963, розділ, написана Berg і інш , озаглавлена "The Synthesis of Mixed Polynucleotides Containing Ribo 20 and Deoxynbonucleotide by Purified Preparation of DNA Polymerase from E coll", crop 467-483) У переважному варіанті даний винахід відноситься до нових і поліпшених композицій, найбільш придатних для методів секвенування ДНК Нові ферменти, приведені в даному описі, можуть використовуватися для методів секвенування нуклеїнових кислот, заснованих на застосуванні або забарвлених термінаторів, або забарвлених праймерів, а також для інших методів секвенування Як описано раніше, методи термінацм ланцюга звичайно вимагають використання матриці для подовження праймера в присутності термінувати ланцюг нуклеотидів, що приводить до створення неповних фрагментів, які потім розділяють по розміру У стандартному дидезоксі-секвенуванні для термінацм ланцюга використовуються дидезоксінуклеозидтрифосфати і ДНК-полімерази, такого, як фрагмент Кленова з штаму Е coh Pol I (Sanger і інш , див вище) Таким чином, основна методика дидезоксісеквенування включає (І) відпал олігонуклеотидного праймера, ВІДПОВІДНОГО матриці, (II) подовження праймера за допомогою ДНК-полімерази в чотирьох різних реакційних сумішах, в кожній з яких міститься один мічений нуклеотид або мічений праймер, суміш немічених дНТФ і один термінуючий ланцюг ддНТФ, (III) розділення чотирьох наборів продуктів реакцій за допомогою, наприклад, гель-електрофореза на денатурируючому поліакриламидном гелі з високою дозволяючою здатністю/мочевине, капілярного розділення або інших способів розділення, і (IV) отримання авторадюграфичного зображення геля, яке може бути проаналізоване для отримання висновку про ПОСЛІДОВНІСТЬ У альтернативному варіанті для отримання інформації про ПОСЛІДОВНІСТЬ ДНК можуть застосовуватися мас-спектрометричні методи або методи, засновані на гибридизацм, з використанням флуоресцентно мічених праймерів або нуклеотидів Доступність термостабільних полімераз, таких, як Taq-полімераза, привела до поліпшення методу секвенування (див патент США 507216) і до його модифікацій, званих "циклічним секвенуванням" При циклічному секвенуванні повторюють цикли нагрівання і охолоджування, що дозволяє отримати численні продукти подовження кожної молекули-мішені (див Murray, 1989, Nucleic Acids Research, 17 8889) Ця асиметрична ампліфікація послідовностей-мішеней, комплементарних послідовностей матриці, в присутності дидезоксітермінаторів ланцюга приводить до отримання родини продуктів подовження всіх можливих довжин Після денатурації продукту реакції подовження ДНК-матриці множинні цикли відпалу праймера і подовження праймера здійснюють в присутності дидезоксі-термінаторів Термостабільні ДНКполімерази мають декілька переваг при циклічному секвенуванні, вони стійки до жорстких температур відпалу, які необхідні для специфічної гибридізацм праймера з нуклеїновими кислотамимішенями, а також СТІЙКІ ДО безлічі циклів високотемпературної денатурації, які здійснюються в кожному циклі, тобто до температури 90-95°С З цієї причини різні форми ДНК-полімерази 22 21 47423 AmpliTaq® були включені в набори для циклічного зниження обмеження по інсерцм нуклеотидного секвенування з використанням Taq, які реалізовуаналога Раніше дослідники застосовували маргаються через фірму Perkm Elmer, Норуолк, шт Коннець з тією метою, щоб індукувати мутагенез при нектікут реплікації або ампліфікації ДНК Таким чином, марганець може впливати на правильність реакції Однак здатність ДНК-полімерази Taq обмежуполімеризації, а також на вихід продукту реакції вати включення невластивих нуклеотидів, таких, ПОСЛІДОВНІСТЬ, ЩО утворилася, може виявитися як ддНТФ, пов'язана з проблемою її використання неправильною або ж - в методі секвенування ДНК для циклічного секвенування, оскільки ддНТФ або - отримана інформація може виявитися невірною флуоресцентно мічені ддНТФ повинні бути вклюСпособи згідно з цим винаходом не вимагають чені як термінатори ланцюга Загалом, до ствовключення двовалентного катіона Марганця в сурення даного винаходу секвенування ДНК за доміш для реакції секвенування з метою посилення помогою термостабільних ДНК-полімераз здатності полімерази включати невластивий нуквимагало наявність суміші нуклеотидів, що термілеотид У протилежність відомим з рівня техніки нують ланцюг, звичайно дідезоксінуклеотидів, у ДНК-полімеразам в даному винаході описаний високій концентрації з метою гарантувати отрикритичний мотив, що входить в полімеразний домання популяції продуктів подовження, яка вклюмен, контролюючий здатність ферменту розрізнючає фрагменти, що мають всі можливі довжини, аж вати 2'-заміщені і незаміщені нуклеотиди, не викодо довжини в декілька сотень основ Часто для ристовуючи для цього марганець зниження вартості цього процесу застосовували протоколи з використанням дуже низьких концентФерменти по даному винаходу не вимагають рацій звичайних дНТФ, що робило реакції неефекдля секвенування високих концентрацій невластитивними Ці реакційні суміші, що включають низьку вих аналогів основ До створення даного винаходу концентрацію дНТФ і високу концентрацію дцНТФ, при здійсненні секвенування, заснованому на терстворювали умови, при яких термостабільна полімінацм ланцюгу ДНК (див також патент США мераза відчуває істотну нестачу нуклеотидних 5075216 на ім'я Innis і інш), невластиві аналоги субстратів основ і ВІДПОВІДНІ традиційні основи звичайно були Незважаючи на появу модифікованих ферментів, таких, як ДНК-полімераза AmpliTaq® FS, що дозволяють збільшити концентрацію дНТФ до більш оптимальних рівнів, для ферментівпрототипів все ще були необхідні ддНТФ, які дорого коштують, для секвенування ДНК У протилежність цьому даний винахід відноситься до ферментів, які не тільки дозволяють збільшувати концентрацію дНТФ, але і виключають застосування ддНТФ, які дорого коштують, оскільки замість них в зростаючий ланцюг включають рНТФ Здатність нових ферментів ефективно здійснювати часткове заміщення рибонуклеотидами полегшує отримання рівнів для секвенування ДНК при відсутності окремої реакції по включенню термінуючого нуклеотида Вибір невластивих нуклеотидних аналогів, придатних для використання в методах секвенування ДНК, раніше визначався здатністю термостабільної ДНК-полімерази включати ці аналоги На жаль ці нуклеотидні аналоги є досить дорогими Наприклад, ціна ддНТФ приблизно в 25 раз перевищує ціну як рНТФ, так і дНТФ Оскільки раніше термостабільні ДНК-полімерази не володіли здатністю ефективно включати рНТФ в зростаючий ланцюг ДНК при використанні матриці, такі рибонуклеотиди, які є легко доступними і недорогими, не могли використовуватися для секвенування ДНК з участю термостабільної ДНКполімерази Даний винахід дозволяє виключити необхідність в дцНТФ в реакціях секвенування ДНК Таким чином, одиним із предметів винаходу є метод секвенування ДНК, який є істотно менше дорогим в порівнянні з методами термінацм ланцюга, що раніше застосовувалися Присутність Марганця в реакції подовження праймера може впливати на здатність полімерази точно включати правильні пари нуклеотидних основ Марганець може застосовуватися для посилення некоректного спаровування основ або для присутніми в співвідношенні (наприклад, ддАТФ дАТФ) приблизно від 1,3 1 до 24 1 Для порівняння термостабільні полімерази, що описані в даному винаході, дозволяють знизити відношення невластивих аналогів основ до звичайних основ в сто або в декілька тисяч разів Відношення рНТФ дНТФ, рівне 1 1 або нижче, в поєднанні з новими ферментами, що представлені в даному описі, є достатнім для аналізу ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК У переважному варіанті відношення рНТФ дНТФ знижують до менш ніж 1 8 Відношення 2'заміщеного нуклеотида до ВІДПОВІДНОГО природного дНТФ може складати навіть 1 80 або 1 200, що залежить від конкретного плану експеримента і необхідної довжини фрагментів Таким чином, оскільки ферменти по даному винаходу легко включають невластиві нуклеотиди, такі, як 2'-заміщені нуклеотиди, немає необхідності посилювати їх здатність по включенню рНТФ з допомогою високої концентрації рНТФ і обмеження концентрації ВІДПОВІДНОГО дНТФ Отже, методи по даному винаходу дозволяють застосовувати оптимальні концентрації дНТФ в поєднанні з невеликими кількостями рНТФ Коли у відповідному методі, такому, як секвенування із забарвленим праймером, застосовують модифіковані ферменти полімерази по даному винаходу, хороші результати по секвенуванню ДНК отримують при концентрації кожного дНТФ в 50-500мкМ Переважно концентрація дНТФ складає від 100 до ЗООмкМ При використанні цих інтервалів ВІДПОВІДНИЙ рНТФ може бути присутнім приблизно в такій же концентрації, що і дНТФ, або в більш низкої Переважно концентрація рНТФ складає приблизно від 0,1мкМ-100мкМ, найбільш переважно приблизно від 2,5мкМ до 25мкМ Концентрація рНТФ, придатна для застосування модифікованих ферментів по даному винаходу, легко може бути визначена звичайним фахівцем в даній області техніки шляхом титрования і 23 47423 оптимізацм експериментів Необхідна КІЛЬКІСТЬ рНТФ або аналога визначається типом експеримента, і на нього може впливати розмір і чистота мішені, а також вибір буфера і конкретні види ферменту Відношення рНТФ дНТФ буде визначати частоту, з якої рНТФ вбудовуються в зростаючий олігонуклеотид Оскільки В кожному вбудованому рНТФ може відбуватися гідроліз, відношення рНТФ дНТФ можна регулювати таким чином, щоб забезпечити користувачеві гнучкість в можливості збільшення або зменшення розміру фрагментів, що утворилися Як добре відомо, ДНК являє собою полімер, синтезований з дНТФ Кожний дезоксінуклеозидтрифосфат включає цукор рибозу, який має гідроксильну групу в З'-положенні і водень в 2'- положенні Рібонуклеотіди також містять гідроксильну групу в З'-положенні цукру Однак рНТФ відрізняються від дНТФ тим, що в 2'-положенні цукру атом водня заміщений на другу гідроксильну групу У даному випадку рНТФ є прикладом, на якому виявляється здатність ферментів по винаходу точно включати 2'-заміщені нуклеотиди Однак З'єднання по винаходу не обмежені застосуванням невластивих нуклеотидів, які являють собою рибонуклеотиди Модифікація ПОСЛІДОВНОСТІ термостабільної полімерази в (Критичному домені, приведеному в даному описі, дозволяє матриці спрямовано включати альтернативні 2'заміщені нуклеотиди, такі, як 2'-гидроксил, 3'дезоксінуклеотиди і нуклеотиди, заміщені в 2'положенні фтором або аміногрупой Як описано в приведених нижче прикладах, включення З'-дезоксі, 2'-гидроксиАТФ, який в даному описі позначений також як кордицепинтрифосфат, полегшується наявністю другої мутації в термостабільній полімеразі, здатність якої обмежувати включення нуклеотида, що містить дезоксігрупу в З'-положенні рибози знижена Такі ферменти раніше були описані, наприклад, в ЕР-А655506 і в заявці на патент США 08/448223, поданій 23 травня 1995 р , яка включена в даний опис як посилання Депозит АТСС 69820, депонований ВІДПОВІДНО до Будапештського договору 10 травня 1995 р , забезпечує отримання гена, що кодує модифікованную термостабільную ДНК-полімеразу Thermus aquaticus, здатність якої обмежувати включення аналогів, таких, як ддНТФ, знижена Дідезоксінуклеотиди мають заступник в 3'положенні в порівнянні із звичайними дНТФ Таким чином, в поєднанні з справжнім винаходом подвійна мутація, прикладом якої в даному описі є Е615G, Р667У-мутант Taq-полімерази, дозволяє використати нуклеотидні аналоги, які містять заступник в 3'- і 2'-положеннях рибози в порівнянні з дНТФ (див приклади III і V) Конкретним застосуванням винаходу є метод секвенування з використанням рНТФ, де секвенуючий праймер що виявляється за допомогою флуоресцентної, або радіоактивної мітки На відміну від дцНТФ включення немодифікованого рНТФ не приводить до такої дії, яктермінація ланцюга Реакційна суміш для секвенування ДНК включає як рНТФ, так і дНТФ в поєднанні з ферментом по винаходу, що приводить до отримання суміші безладно заміщених продуктів подовження праймера, 24 чутливих до розщеплення по 3'-5'фосфодиефирному зв'язку між рибонуклеотидом і сусіднім дезоксірибонуклеотидом Після подовження праймера, наприклад, при ПЛРамгашфікацм або при циклічному секвенуванні, і до розділення продуктів подовження праймера, наприклад, за допомогою гель-електрофореза, реакційну суміш або обробляють лугом, нагрівають, обробляють рибонуклеазой, або іншими способами гидролізують продукти подовження по кожному рибонуклеотиду, що зустрічається Для кожного міченого продукту подовження праймера тільки найбільш великий 5'-фрагмент, який є проміжним продуктом подовження міченого праймера, виявляється на секвенируючим гелі Для даної мішені аналіз отриманого секвенуючого теля дає рівні секвенування, тобто серії сигналів, що виявляються в Г-, А-, Т- і Ц-ЛІНІЯХ, ВІДПОВІДНИХ нуклео тидній ПОСЛІДОВНОСТІ мішені Отримані рівні секвенування надають таку ж інформацію, що і звичайний метод, що передбачає використання дцНТФ або заснований на використанні рНТФ і нових термостабільних полімераз, представленого в даному описі Таким чином, при застосуванні даного винаходу ддНТФ, що дорого коштують для секвенування ДНК більше не потрібні (див приклад VI) У альтернативному методі секвенування застосовують термінувати ланцюг рибонуклеотиди У цьому варіанті як термінатори застосовують 2'гидрокси, З'-дезоксінуклеотиди, такі, як кордицепинтрифосфат Ці аналоги рНТФ можуть бути флуоресцентно міченими, і їх застосовують для секвенування ДНК У Lee і інш , див вище, описане застосування забарвлених термінаторів ддНТФ У ЕР-А-655506 і в заявці на патент США 08/448223, яка подана 23 травня 1995 р , описані модифіковані ферменти для застосування з ддНТФ Термостабільна ДНК-полімераза, що містить як модифікацію, присутню в ДНК-полімеразі FS AmpliTaq® (див вище), так і таку, представлену і SEQ ID NO 1, де X не означає глутамшову кислоту (Е), як описане раніше, може застосовуватися для ефективного включення мічених аналогів рНТФ при здійсненні реакції секвенування, яка заснована на термінацм ланцюгу Цей процес може бути автоматизований і не вимагає синтезу мічених барвником праймерів Крім того, оскільки реакції із забарвленим термінатором дозволяють здійснювати в одній і тій же пробірці всі чотири реакції, вони більш зручні, ніж методи із забарвленим праймером 2'-гидрокси, З'-дезоксінуклеотиди можуть бути синтезовані з комерческі доступних З'-нуклеотидів (З'-дА, З'-дЦ, З'-дГ і З'-дТ, наприклад, що поставляються фірмою Sigma Chemical Corporation, Ст Луис, шт Міссурі, і при доданні 5'трифосфата, як описано у Ludwig, Bi о phosphates and Their Synthesis Structure, Metabolism and Activity, під ред Bruzik і Stec, Амстердам, Elsevier Science Publishers, 1987, crop 201-204 Крім застосування в нових методах секвенування, модифіковані ферменти, представлені в даному описі, можуть застосовуватися для різних цілей в молекулярній біологи У одному з прикладів здійснення винаходу модифіковані ферменти застосовують в реакційних сумішах для амплифі 25 47423 кацм, що містять як звичайні, так і невластиві нуклеотиди, наприклад, дНТФ і принаймні що один виявляється в результаті помічений рНТФ, влучні, які включають, наприклад, флуоресцентні мітки або радіоізотоп Керований матрицею синтез комплементарного ланцюга приводить до отримання ДНК-продукту, що містить рибонуклеозидмонофосфат в різних положеннях по його довжині Нагрівання та/або обробка лугом гидролізують продукт подовження нуклеїнової кислоти на кожному рибонуклеотиді Таким чином, отримують сімейство сегментів ДНК, де кожний фрагмент містить один мічений залишок на своєму З'-КІНЦІ Розмір фрагментів нуклеїнової кислоти, що утворилися може бути змінений шляхом регулювання відношення і КІЛЬКОСТІ рНТФ, включеного в реакцію Ампліфікація мішені з використанням рНТФ і ферментів по даному винаходу створює численні переваги, зумовлені конкретним застосуванням У описаному вище методі при використанні міченого рНТФ все отримане сімейство фрагментів виявляється міченим з рівною інтенсивністю одна мітка на один олігонуклеотидний фрагмент Для досягнення оптимальних результатів при здійсненні таких методів, як виявлення нуклеїнової кислоти з використанням олігонуклеотидного зонда, певним чином фіксованого на тонкому шарі силікону, звичайно необхідне, щоб амплифікована мішень була випадковим образом фрагментована в межах фіксованого і розміру, що відтворюється з метою обмежити утворення повторних структур для контролю кінетики гибридизацм Крім того, для виявлення гибридизацм при впорядкованому розташуванні тисяч зондів на тонкому шарі силікону, може виявитися переважним, щоб фрагменти нуклеїнової кислоти були мічені з рівною інтенсивністю Згідно з справжнім винаходом були розроблені способи отримавші сімейств фрагментів, що задовольняють цьому стандарту, полегшуючи тим самим застосування альтернативних форматів виявлення, таких, як методи, засновані на використанні тонких шарів, описані, наприклад, у Cronm та інш , 1996, Human Mutation, 7 244-255 У іншому прикладі передбачається застосування одного міченого праймера і одного неміченого праймера в суміші для реакції амплифікацм, яка включає термостабільну полімеразу по винаходу, а також рНТФ і дНТФ, що дозволяє одночасно поліпшити реакції амплифікацм і секвенування Для цього методу потрібно, щоб здійснювалися чотири різні реакції амплифікацм, по одній для кожного рНТФ Таким чином, наприклад, оскільки фермент По винаходу придатний для амплифікацм мішені, наприклад, з допомогою ПЛР, або інших способів амплифікацм, отриманий продукт, якщо він присутній, може бути виявлений звичайними способами, такими, як гель-електрофорез або гібридизація із зондом при використанні частини продукту реакції Ці методи визначення не приводять до гідролізу включених рибонуклеотидів, а поведінка РНК/ДНК-химерних ланцюгів буде такою, як це очікується для звичайного продукту амплифікацм нуклеїнової кислоти Якщо необхідний продукт виявлений, частина цієї ж реакційної суміші, що залишилася може бути оброблена лугом і проаналізована за допомогою гель-електрофореза 26 з метою визначити ПОСЛІДОВНІСТЬ нуклеїнової кислоти Таким чином, після виявлення продукту наступна реакція секвенування не є необхідною Ця спрощена методика забезпечує економію витрат часу і матеріалів і характеризується підвищеною точністю завдяки зменшенню стадій виявлений продукт і є секвенованим продуктом Крім того, також може застосовуватися аналогічна методика з чотирма міченими рНТФ і одним бютинилированим (міченим біотином) праймером Після амплифікацм продукт розкладають за допомогою лужного гідролізу, а праймер, пов'язаний з продуктами, видаляють шляхом взаємодії з покритими стрептавидином гранулами Захоплені гранулами продукти потім аналізують на секвенуючому гелі Ця модифікація дозволяє здійснювати реакцію секвенування в одній пробірці, виключаючи тим самим необхідність в чотирьох різних амплифікаціях ВІДПОВІДНО ДО ІНШОГО предмета винаходу фе рменти, представлені в даному описі, можуть застосовуватися для отримання РНК з використанням ДНК-матриці або для отримання заміщеної ДНК для медиируючим лугом стерилізації без застосування звичайних стерилізуючих агентів, таких, як урацил-ІЧ-глікозілаза (UNG), як описано в міжнародній заявці WO 92/01814 У приведених прикладах здійснення винаходу термостабільна полімераза також містить мутацію в 5'-3'-екзонуклеазном домені, яка приводить до значного погіршення екзонуклеазній активність Модифіковані форми Taq-полімерази описані в патенті США 5466591 У одному з варіантів здійснення винаходу кодон, що кодує залишок гліцина (G) в положенні 46 амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ, заміняли кодоном, що кодує аспарагінову кислоту (D) Отриманим таким чином фермент володіє перевагою при використанні в реакціях циклічного секвенування завдяки зниженій 5'-3'екзонуклеазной активності і є переважним для застосування по даному винаходу У порівнянні з ферментом дикого типу наявність мутації G46D не надає впливу на полімеразний домен амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ і на полімеразну активність Згідно З винаходом пропонуються також набори для секвенування нуклеїнових кислот, що містять термостабільну полімеразу по даному винаходу, що є прикладом комерційного застосування винаходу Такі набори звичайно включають додаткові реагенти для секвенування ДНК, такі, як, наприклад, рНТФ, дНТФ і ВІДПОВІДНІ буфери Якщо рНТФ є неміченими, також може бути включений мічений праймер Нижче винахід проілюстрований на прикладах, що не обмежують його об'єм Приклад 1 Експресія гена модифікованої Тад-полімерази із зниженою здатністю обмежувати включення невластивих нуклеотидів С-кінцева частина амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК-полімерази Taq кодує домен, що включає сайт полімеразну активність (Lawyer і інш , 1993, PCR Methods and Applications 2 275-287, публікація включена в даний опис як посилання) Фрагмент ДНК, що містить цю область, виділяли з повнорозмірного гена Taq і здійснювали мутагенез з 27 47423 допомогою ПЛР-амплифікацм в присутності Марганця (Leung і інш , Technique 1(1) 11-15) У цьому прикладі все рестриктази були отримані від фірми New England Biolabs, Беверлі, шт Массачусетс Фрагменти, що містять мутації, розщеплювали рестриктазами Pstl і Bglll і тонували в плазмиді, експресуючій Taq, в даному випадку в плазмиді рІ_К102, яку заздалегідь розщеплювали Pstl і Bglll Плазмида рІ_К102 являє собою модифіковану форму гшазмиди pSYC1578, яка експресує Taq (Lawyer і інш , див вище) Фрагмент Hmcll/EcoRV, локалізований на 3'-області, що кодучий полімеразу, видаляли для створення гшазмиди pLKIOI PstlBglll-фрагмент довжиною 898 пар основ потім видаляли з pLK101 і замінювали коротким олігонуклеотидним дуплексом Pstl-EcoRV-Bglll для створення плазмиди pLK102 Таким чином, в результаті цієї делеции було віддалено 900 пар основ з З'-кінця pol-гена ДНК Taq з їх заміщенням більш короткою ділянкою ДНК Отриманими експресуючими плазмидами трансформували штам Е соїі N1624 (описаний у Gottesman, 1973, J Мої ВюІ 77 531, він також може бути отриманий з Е coh Genetic Stock Center в Йельськом Університеті, номер штаму CGSC 5066) і отриманих трансформантів піддавали скринингу на здатність більш ефективно в порівнянні з ферментом дикого типу включати рНТФ Використовуючи цю методику виявляли мутант СІ, здатний більш ефективно включати рНТФ Для визначення, яка частина гена Taqполімерази відповідальна за змінений фенотип, що містить мутацію плазмиди, експресуючу Taq, названу рС1 і виділену з мутанта С1, розщеплювали різними рестриктазами і рестрикційні фрагменти, що утворилися субклонували в плазмиді pLK101, несучої ген ДНК-полімерази Taq дикого типу, заміняючи рестрикцийні фрагменти, що не містять мутацій Аналіз субклонів, що утворилися показав, що мутація, яка відповідає за фенотип, знаходилася в рестрикційному фрагменті NhelBamHI довжиною 265 пар основ Здійснювали аналіз ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК ЦІЄЇ об ласті плазмиди рС1, використовуючи набір АВІ PRISMa Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit, в який входить ДНК-полімераза FS AmphTaq®, що поставляється фірмою Applied Biosystems, Фостер Ситі, Каліфорнія, і система для секвенування Applied Biosystems, Model 373A DNA Sequencing System Аналіз ПОСЛІДОВНОСТІ ВИЯВИВ ДВІ миссенсмутаци в гені Taq-полімерази між сайтами Nhel і BamHI Мутація амінокислоти в положенні 615 привела до того, що залишок глутамшовою кислоти (Е) був заміщений залишком гліцина (G), а інша мутація в положенні 653 привела до заміщення залишку аланіну (А) на треонін (Т) Нумерацію починають з кодону, що кодує перший залишок метионіну зрілого протеїну, як описано в патенті США 5079352 Мутація E615G привела до заміни GAG на GGG в кодоні 615 Мутація А653Т привела до заміни GCC на АСС в кодоне 653 Плазмиди СІ в штамі-господарі Е coh T1624 була депонована ВІДПОВІДНО до Будапештським договору в АТСС 17 липня 1996 року і отримала реєстраційний номер 98107 Дві крапкові мутації аналізували роздільно 28 шляхом субклонування кожної окремо в гені Taqполімерази дикого типу, використовуючи рекомбінантну ПЛР (під ред Innis і інш , PCR Protocols, San Diego, Academic Press, 1990, розділ 22, озаглавлена "Pecombmant PCR", автор Higuchi, crop 177-183) Продукти експреси, що Утворилися аналізували з метою визначити, яка з мутацій E615G або А653Т або обидві відповідальні за фенотип, для якого характерно включення рибонуклеотидів Результати експеримента показали, що за мутантні фенотип відповідальна виключно мутація E615G Для подальшого аналізу і кількісної оцінки ефективності включення аналогів нуклеотидів ПЛР-фрагмент BamHI- Nhel довжиною 265 пар основ, що містить мутацію E615G, тонували у векторі експресії Taq, позначеному pRDA3-2 Вектор експресії pRDA3-2 містив повнорозмірний генів Taq, функціонально пов'язаний з промотором фага-лямбда PL Екзонуклеазний домен гена Taq в цьому векторі містив крапкову мутацію в кодоне, що кодує гліцин, тобто амінокислотний залишок в положенні 46, яка знижує 5'-3'-екзонуклеазную активність Однак ПОСЛІДОВНІСТЬ гена всередині полімеразного домену вектора експресії pRDA3-2 ідентична ПОСЛІДОВНОСТІ гена Taq дикого типу Плазмида pRDA3-2 повністю описана в патенті США 5466591, який включений в даний опис як посилання, де плазмида позначена як " т о н 3-2" Плазмиду pRDA3-2 розщеплювали з допомогою ВатНІ і Nhel і ПЛР-фрагмент довжиною 265 пар основ стандартними способами липрували з вектором Отриманою плазмидою pLK108 трансформували штамм Е coh DG116 (Lawyer і інш , 1993, див вище, цей штамм також може бути отриманий з американської колекції типових культур під номером АТСС 53606) Плазмида pLK108 кодує термостабільну ДНК-полімеразу, позначеного в даному описі як G46D, E615G-Taq 3 допомогою рекомбінантної ПЛР шляхом комбінації мутацій E615G і F667Y у фрагменті BamHI-Nhel отримували мутант 0460, Е615О, P667y-Taq Цей фрагмент тонували в плазмиді pRDA3-2 для створення плазмиди pLK109 Експресуючий гшазмидами pLK108 і pLK109 протеїн термостабільної ДНК-полімерази виділяли ВІДПОВІДНО до методу, описаного у Lawyer і інш , 1993, див вище, хоч стадії хроматографії були виключені Представляючу інтерес ПОСЛІДОВНІСТЬ підтверджували за допомогою аналізу ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК У вставці (инсерції) pLK108 була виявлена додаткова мутація в ПОСЛІДОВНОСТІ, однак ця мутація не змінювала амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ протеїну Після часткового очищення активність модифікованого ферменту визначали ВІДПОВІДНО ДО методу оцінки активності, описаного у Lawyer і інш , 1989, J ВюІ Chem 264 6427-6437, включеним в даний опис як посилання Активність модифікованого ферменту оцінювали таким чином одна одиниця ферменту відповідає 10 нмолям продукту, синтезованого протягом ЗОхвилин ДНКполімеразна активність ферменту дикого типу прямо пропорційна концентрації ферменту, що забезпечує включення до 80-100 пмолей дЦМФ (розбавлення ферменту складає до 0,12-0,15 оди 29 47423 ниць на реакцію) Активність мутантів E615G, G46D і E615G, F667Y, G46D прямо пропорційна концентраціям, що забезпечують включення до 0,25-3 пмолей дЦМФ (розбавлення ферменту складає від 6x10 4 до 5x10 3 одиниць на реакцію) Цей препарат ферменту використали для оцінки включення і для реакцій секвенування, описаних в прикладах III-V Для прикладів II і VI фермент очищали ВІДПОВІДНО до методів, описаних у Lawyer і інш (див вище) Приклад II Аналіз порівняльної ефективності включення Відносну здатність G46D- і G46D, E615G-Taq включати рНТФ визначали шляхом вимірювання КІЛЬКОСТІ [а-32Р] рНТФ, яке кожний з ферментів може включити на ДНК-матриці з активованої сперми лосося при обмеженій концентрації цього ферменту Для кількісної оцінки включення рАТФ реакційну суміш готували таким чином, щоб кінцеві концентрації в 50мкл реакційній суміші складали 12,5 мкг ДНК активованої сперми лосося, отриманої по описаній нижче методиці, 200мкМ кожного з дЦТФ, дГТФ і дТТФ (фірма Perkm Elmer, Норуолк, шт Коннектікут), ЮОмкМ [а-32Р]рАТФ, 1мМ рмеркаптоетанола, 25мМ N-тріс [гидроксіметіл] метил-3-аминопропансульфоновой кислоти (TAPS), рН 9,5 при 20°С, 50мМ КС1 і 2,25мМ МдСІ2 Аналогічну суміш для аналізу отримували для кількісної оцінки включення рЦТФ, рГТФ і рУТФ У кожному випадку рНТФ були радіоактивне міченими і були присутнім в концентрації ЮОмкМ, а кожний з трьох інших дНТФ (дАТФ, дГТФ і дТТФ для рЦТФ, дАТФ, дЦТФ і дТТФ для рГТФ і дАТФ, дЦТФ і дГТФ для рУТФ) був присутнім в концентрації 200мкМ Як стандарт також вимірювали включення кожним ферментом ВІДПОВІДНОГО дНТФ Суміш для аналізу в цих дослідах була аналогічна такої, що застосовуються в ДОСВІДІ ПО включенню рНТФ, які описані вище, за винятком того, що кожний [а32 Р]рНТФ був замінений ЮОмкМ ВІДПОВІДНОГО [а32 Р]дНТФ Неочищену ДНК сперми лосося в КІЛЬКОСТІ 1 г/л, отриману від фірми Worthington Фермент G46D G46D, E615G ДАТФ 27 74 (100%) 0 67 (100%) ЗО Biochemical (Фріхолд, шт Нью Йорк), активували шляхом інкубації в ЮмМ трис-НСІ, рН 7,2, 5мМ МдСЬ при температурі 2-8°С протягом 96 годин Потім додавали ЕДТК і NaCI до концентрації 12,5мМіО,1 М ВІДПОВІДНО Потім ДНК екстрагували фенолом/хлороформом і далі осаджували етанолом і ресуспендували в ЮмМ трис, 1мМ ЕДТК, рН 7,5 Потім препарат активованої ДНК піддавали диализу по відношенню до цього ж буфера 45мкл кожної реакційної суміші розливали у вигляді аликвотних кількостей в п'ять пробірок об'ємом 0,5 мл (наприклад, в пробірки Еппендорфа), вносячи в кожну 5'-мічені попередники нуклеотидів Таким чином, кожну полімеразу G46D-Taq та G46D, E615G-Taq оцінювали ДВІЧІ, при цьому одну пробірку залишали як негативний контроль Суміш, отриману в результаті реакції полімеризації, з кожного досвіду в двох пробірках, змішували спочатку з 5мкл або полімерази G46D-Taq (0,02 одиниці), або G46D, E615G-Taq (0,002 одиниці) Як контроль рівня фону до реакційної суміші, що застосовується як негативний контроль, замість ферменту додавали 5мкл буфера для розбавлення ферменту, Кожну реакційну суміш протягом короткого інтервалу часу центрифугували і инкубували протягом Юхвилин при температурі 75°С Реакції припиняли, додаючи Юмкл бОмМ ЕДТК, і зберігали на льоду Для кожного зразка аликвоти об'ємом 50мкл з бОмкл реакційної суміші розбавляли 1 мл 2мМ ЕДТК, 50 мкг/мл фрагментованою ДНК сперми лосося ДНК осаждали за допомогою трихлороцету кислоти (ТХО), використовуючи стандартні методи і збираючи на фільтрувальний диски типу GF/C (фірма Whatman, Кент, Великобританія) КІЛЬКІСТЬ включеного [а-32Р]- міченого нуклеотида або рибонуклеотида КІЛЬКІСНО оцінювали з допомогою рідинной сцинтилляційной спектрометрії і потім підраховували КІЛЬКІСТЬ включених пмолей КІЛЬКІСТЬ пмолей кожного рНТФ, включена кожним ферментом, СПІВВІДНОСИЛИ з КІЛЬКІСТЮ пмолей ВІД ПОВІДНОГО [а-32Р1дНТФ, включеного кожним ферментом Нижче приведені отримані дані Відношення рНТФ до дНТФ, включених з використанням полімераз G46D-I G46G E615G-Taq КІЛЬКІСТЬ включених пмолей (процент) РАТФ РЦТФ ДГТФ РГТФ ДЦТФ 0 052 34 6 0 76 36 94 0 133 (0,18%) (100%) (0,22%) (100%) (0,36%) 1 41 2 82 5 33 3 27 5 96(181%) (210%) (100%) (189%) (100%) Ці результати показують, що полімераза G46D.E615G включає рибонуклеотиди більш ніж в 500 раз ефективніше в порівнянні з тим, як це може здійснювати полімераза G46D (наприклад, ефективніше для рГТФ в 181 0,36 = 502 разу, для рЦТФ в 189 0,22 = 859 разів і для рАТФ в 210 0,18 = 1166 разів) Таким чином, миссенс-мутація в гені полімерази в кодоне 615 приводить до отримання нового фенотипу до отримання термостабільного ДНК- полімерази, що володіє здатністю крім дезоксірибонуклеотидів ефективно включати рибонуклеотиди Приклад III Аналіз порівняльної ефективності включення ДТТФ 28 79 (100%) 0 688 (100%) РТТФ 0(0) 0 545 (79%) З'-дезоксіАТФ (кордицепину) Відносну здатність полімераз G46D-, G46D.E615G- ,G46D,E615G,F667Y-, і G46D.F667YTaq включати 3'-дезоксіаденозин-5'- трифосфат (кордицепинтрифосфат) визначали шляхом вимірювання КІЛЬКОСТІ [а-32Р] кордицепинтрифосфата, яке кожний фермент може включити на ДНКматриці з активованої сперми лосося при обмеженій концентрації цього ферменту Для кількісної оцінки включення [а-32Р] кордицепинтрифосфата досвід проводили таким чином, щоб кінцеві концентрації в 50мкл реакційній суміші складали 12,5 мкг ДНК активованої сперми лосося, 200мкМ кожного з дЦТФ, дГТФ і дТТФ, 50мкМ дАТФ (фірма 47423 32 31 Perkm Elmer), 50мкМ [а-32Р] -З'дАТФ/З'-дАТФ (фірскладало від 1 80 до 1 8 Реакції подовження ма New England Nuclear, Sigma), 1 мМ рпраймера здійснювали в буфері, що складається з меркаптоетанола, 25мМ М-тріс [ги дроке и метил] 50мМ Вісте (К,К-біс(2-гидрокси-етил)гліцин), рН метил-3-аминопропансульфоновой кислоти 8,3), 25мМ КОАс і 2,5мМ МдСІ2 Проводили чотири окремі реакції, по одній для кожного з чотирьох (TAPS), pH 9,5 при 20°С, 55мМ КС1 і 2,25мМ рНТФ Кожна реакційна суміш (50мкл) містила по MgCI2 200мкМ кожного з дАТФ, дЦТФ, дГТФ і дТТФ (фір45мкл кожної реакційної суміші розливали у ма Perkm Elmer) і по 0,09 пмолей одноланцюгової ВИГЛЯДІ аликвотних кількостей в дев'ять пробірок ДНК-матриці МІЗІпрШ (фірма Perkm Elmer), яку об'ємом 0,5 мл, тобто кожну реакцію проводили випалювали з 5'-[32Р]-міченим DG48 (Lawyer і інш , або з G46D-, G46D, E615G-, G46D,E615G,F667Y-, 1993, PCR Methods and Applications 2 275-287) або з G46D,F667Y-Taq в двох повторностях, при Реакційні суміші також містили 2,5, 2,5, 2,5 або цьому одну пробірку залишали без ферменту як 25мкм рАТФ, рЦТФ, рГТФ або рУТФ ВІДПОВІДНО негативний контроль Суміш, отриману в результаті реакції полімеризації, для кожного досвіду в Кожну з цих чотирьох реакцій починали шлядвох пробірках, змішували спочатку з 5мкл (0,058 хом додання 7 одиниць ДНК-полімерази G46D, одиниць) полімераза G46D-Taq Таку ж операцію E615GB-Taq і шкубували протягом Юхвилин при проводили з полімераза G46D,E615G-Taq (0,0025 температурі 75°С Реакції припиняли доданням одиниць), полімераза G46D.E615G, F667Y-Taq Юмкл бОмМ ЕДТК і вміщували на лід 20мкл кож(0,0034 одиниці) або полімераза G46D, F667Y-Taq ної реакційної суміші додавали до 80мкл 50мМ (0,083 одиниці) ЯК контроль рівня фону в одну Вісте (рН 8,3), 25мМ КОАс і 2,5мМ МдСІ2 Продукпробірку, що залишилася замість ферменту спочати розщеплення отримували доданням 7мкл 1н тку додавали буфер для розбавлення ферменту NaOH і инкубували протягом 15хвилин при температурі 98°С Реакції нейтралізували доданням Кожну реакційну суміш протягом короткого ін7мкл 1н НС1 Кожну реакційну суміш осаджували, тервалу часу центрифугували і инкубували протядодаючи 312мкл 95%-ного етанола і Юмкл ЗМ гом Юхвилин при 75°С Реакції припиняли, додаацетату натрію (рН 4,8) Реакційні суміші мікроценючи Юмкл бОмМ ЕДТК, і зберігали на льоду трифугували протягом 15хвилин для збору осадка, Кожний зразок аликвоти об'ємом 50мкл з бОмкл супернатант видаляли, дебрис промивали 500мкл реакційної суміші розбавляли 1 мл 2мМ ЕДТК, 50 70%-ного етанола і сушили Кожний дебрис ресусмкг/мл фрагментований ДНК сперми лосося ДНК пендували в 5мкл 0,5-кратного стоп-буфера (що осаджали з допомогою ТХУ, використовуючи стапоставляється фірмою Perkm Elmer, Норуолк, ндартні методи і збираючи на фильтровальні дисшт Коннектікут, який містить 95% формамиду, ки типу GF/C (фірма Whatman, Кент, Великобрита32 20мМ ЕДТК і 0,05% бромфенолу синього), витринія) КІЛЬКІСТЬ включеного [а- Р]-міченого мували при температурі 98°С протягом Зхвилин і нуклеотида оцінювали з допомогою рідинной сцибезпосередньо завантажували на секвенуючий нтилляційної спектрометрии, після чого підраховугель для ДНК, що складається із заздалегідь підвали КІЛЬКІСТЬ включених пмолей КІЛЬКІСТЬ пмолей 32 даного електрофорезу 6%-ного поліакрилами[а- Р] кордицепинтри-фосфату, включена кожним ду/8М мочевини, і здійснювали електрофорез ферментом, СПІВВІДНОСИЛИ з КІЛЬКІСТЮ одиниць Гель сушили і знімали на рентгенівську плівку кожного ферменту, застосованого в ДОСВІДІ, ДЛЯ Отримана плівка показала виражені секвенируючі отримання КІЛЬКОСТІ пмолей, включених одиницею сходи, які дають надлишок в 100 основ правильної ферменту Нижче за приведені отримані дані ПОСЛІДОВНОСТІ Включення [а-32Р] кордииепину полімераза G46D- G46D E615G-, G46D E615G F667Y-1 G46D F667Y-Taq Фермент G46D G46D, E615G G46D, E615G, F667Y G46D, F667Y КІЛЬКІСТЬ пмолей, включених одиницею ферменту 0,221 1,56 893,6 0,74 Ці результати показують, що обидві мутації E615G і F667Y необхідні для ефективного включення молекули кордицепіна в ДНК Приклад IV Секвенування ДНК на основі лужного розкладання з використанням ДНК-полімерази G46D E615G-Taq У цьому прикладі показане застосування модифікованої полімерази по винаходу для секвенування на основі лужного розкладання з використанням ДНК, частково заміщеної рНТФ Відношення рНТФ до дНТФ в реакційних сумішах Приклад V Секвенування ДНК з використанням ДНКnoniMepa3HG46D,E615G F667Y-Taq і 3ідезоксінуклеотидтрифосфатів У цьому прикладі описане застосування модифікованої полімерази G46D, E615G, P667Y-Taq для секвенування ДНК з використанням 3'дезоксінуклеотидтрифосфатів Цей експеримент здійснювали з використанням З'-дезоксіАТФ, однак він також може бути здійснений з використанням інших З'-дезоксінуклеотидів Реакції подовження праймера здійснювали в буфері, що складається з 50мМ Вісте (рН 8,3), 25мМ КОАс і 2,5мМ МдСІ2Кожна реакційна суміш (50мкл) містила по 200мкМ кожного з дАТФ, дЦТФ, дГТФ і дТТФ (фірма Perkm Elmer) і по 0,09 пмолей одноланцюгової ДНКматриці М13тр18 (фірма Perkm Elmer), яку випалювали з 5'-[ 2Р]-міченим DG48 (Lawyer і інш , 1993, PCR Methods and Applications 2 275-287) Реакційні суміші також містили 0, 0,1, 0,25, 0,5, 1 або 5мкМ З'-дезоксіАТФ Кожну з реакцій починали шляхом додання 7 одиниць ДНК-полімерази G461D,E615G,P667YTaq і инкубували протягом Юхвилин при 75°С 33 47423 Реакції припиняли доданням Юмкл бОмМ ЕДТК і вміщували на лід ЗОмкл кожної реакційної суміші осаджували етанолом і ресуспендували в стопбуфері, витримували при температурі 98°С протягом Зхвилин і безпосередньо завантажували на секвенуючий гель для ДНК, що складається із заздалегідь підданого електрофорезу 6%-ного поліакриламиду/8М мочевини, і здійснювали електрофорез Гель сушили і знімали на рентгенівську плівку Смуги, які містили продукти реакції, проведеної в присутності кордицепину, свідчили про наявність ясно виражених сходів термінации Смуги, що містять найбільші КІЛЬКОСТІ кордицепину, тобто 5мкМ, показали сходи термінации, в якої в середньому смуги були коротше по довжині в порівнянні з смугами, ВІДПОВІДНИМИ більш низьким рівням кордицепина Смуги, які містили продукти реакції, проведеної у відсутності кордицепина, свідчили про наявність продукту, що має повну довжину, і показали відсутність сходів термінации Ці результати показують, що мутантний фермент здатний включати кордицепин, і включення цієї молекули в продукт подовження праймера викликає термінацію Цей метод також може застосовуватися для створення сходів секвенування ДНК з використанням З'-дезоксіЦТФ, З'-дезоксіГТФ і 3'дезоксіУТФ Приклад VI ПЛР-секвенування із забарвленим праймером з використанням ДНКполімерази G46D E615G-Taq Цей метод ілюструє застосування модифікованої полімерази по винаходу для секвенування із забарвленим праймером з використанням рибонуклеозидтрифосфатів (рНТФ) в ПЛР при відношенні рНТФ дНТФ не більше за 1 ЗО Проводили чотири окремі реакції, кожну з використанням рНТФ Реакції секвенування на основі ПЛР проводили в буфері, що складається з 25мМ трис-НСІ (рН 9), 5,0мМ МдСЬ і 10%-ного гліцерину (об'єм/об'єм) Кожна реакційна суміш також містила по 500мкМ кожного з дАТФ, дЦТФ, дГТФ і дТТФ (фірма Perkm Elmer), матрицю, що являє собою 5x10 копій/мкл плазміди pBSM13+ (фірма Stratagene), лінеаризований в результаті обробки ендонуклеазою рестрикції Xmnl і 0,05 одиниць/мкл ДНК-полімерази G46D, E615G-Taq Реакційні суміші рибо-АТФ (1 Омкл) містили 2,5мкМ АТФ (фірма Pharmacia Biotech), 0,1мкл праймера JOE M13 Reverse Dye Primer (фірма Perkm Elmer) і 0,1 мкМ праймера ASC46 (5'-CGCCATTCGCCATTCAG) Реакційні суміші рибо-ЦТФ (Юмкл) містили 2,5мкМ ЦТФ (фірма Pharmacia Biotech), 0,1мкл праймера FAM M13 Reverse Dye Primer (фірма Perkm Elmer) і 0,1 мкМ праймера ASC46 Реакційні суміші рибо-ГТФ (20мкл) містили 2,5мкМ ГГФ (фірма Pharmacia Biotech), 0,1 мкл праймера TAMRA M13 Reverse Dye Primer (фірма Perkm Elmer) і 0,1 мкМ праймера ASC46 Реакційні суміші рибо-УТФ (20мкл) містили 16мкМ УТФ (фірма Pharmacia Biotech), 0,1мкл праймера ROX M13 Reverse Dye Primer (фірма Perkm Elmer) і 0,1 мкМ праймера ASC46 Кожну з чотирьох реакційних сумішей вміщували в заздалегідь нагріту (75°С) термокомірку для проведення ПЛР типу Perkm Elmer GeneAMP® PCR System 9600 і піддавали ЗО циклам витримка 34 при температурі 95°С протягом 10 секунд, при температурі 55°С протягом Юсекунд, поступове пониження температури до 65°С протягом Іхвилини і витримка при 65°С протягом 5хвилин У результаті кожної з реакцій з участю рАТФ і рЦТФ отримували по 6х1011 копій міченого барвником амплифікованого продукту довжиною 300 пар основ, а в результаті реакцій з участю рГТФ і УТФ отримували по 1,2x1012 копій міченого барвником амплифікованого продукту довжиною 300 пар основ Для визначення ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК амплифікованих продуктів ПЛР без використання розділення за допомогою ферментативних реакцій секвенування ДНК реакційні суміші об'єднували, обробляли лугом і нагрівали, нейтралізували і осаждали таким чином Об'єднували 4мкл кожної з реакційних сумішей з використанням АТФ і ЦТФ і 8мкл кожної з реакційних сумішей з використанням ГТФ і УТФ До об'єднаних реакційних сумішей додавали 2мкл 0.25М ЕДТК (рН 8,0) (кінцева концентрація ЮмМ), Юмкл 1М NaOH (кінцева концентрація 200мМ) і 14мкл НгО, а потім инкубували при температурі 95°С протягом 5хвилин в термокомірці для проведення ПЛР типу Perkm Elmer GeneAMPo PCR System 9600 і нейтралізували ЮмкМ 1M HC1 Потім об'єднану реакційну суміш осаждали доданням 150мкл 95%-ного етанола з наступною інкубацією при температурі 4°С протягом 15хвилин Потім ІІ мікроцентрифугували протягом 15хвилин при температурі 4°С для збору осадка і супернатант видаляли шляхом аспирацм Дебріс промивали ЗООмкл 70%-ного етанола, мікроцентріфугували протягом 5хвилин, супернатант видаляли шляхом аспирацм і дебріс сушили Дебріс ресуспендували в бмкл формамиду, 50мг/мл блакитного декстрана (в 25мМ ЕДТК, 5 1 (об'єм/об'єм)) і витримували при температурі 90 С протягом Зхвилин 1,5мкл ресуспендованого дебріса безпосередньо завантажували на секвенуючий гель, що складається із заздалегідь підданого електрофорезу 5%-ного поліакриламіду типу Long Ranger (фірма FMC BioProducts) з 6М мочевиною Потім проводили електрофорез і аналізували на ДНК-секвенаторі типу Perkm Elmer ABI Prism™ 377 DNA Sequencer ВІДПОВІДНО ДО інструкції виробника Автоматичне визначення основ на основі програмного забезпечення для аналізу ПОСЛІДОВНОСТІ Perkm Elmer ABI Prism™ 377 DNA Sequencing Analysis показало більш ніж 99%-ную точність визначення ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК продукту довжиною 300 пар основ, амгашфікованого з використанням ПЛР 35 36 47423 (A) ЇМ Я/КЛЮЧ пептид (B) ПОЛОЖЕННЯ 7 (D) ІНША ІНФОРМАЦІЯ /label- Хаа /note = де Хза являє собою Не або VaJ" ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ (1) ЗАГАЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ (з) ЗАЯВНИК (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID NO 2 (A) НАЙМЕНУВАННЯ Ь Hoffmann LA Roche Ш (B) ВУЛИЦЯ Greivracheibtrasbe 124 !С) МІСТО Базиіь ф ) ОКРУГ BS (£) КРА/НА Швейцари (F) ПОШТОВИЙ КОД (ZIP) CH 4070 (G) ТЕЛЕФОН (0)616882403 (Н) ТЕЛЕФАКС (0) 61 6Ш395 (І) ТЕЛЕКС 962292/965512 hlr ch 0 0 НАЗВА ВИНАХОДУ МодифіковатермсеіабмьнаДНК Sei Gin lie GRi Leu Arg Xaa 1 5 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 3 noiiMcpaja (ш) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ 8 (rv) ФОРМА ПОДАННЯ ДЯЯ КОМП ЮТЬРА (A) ТИП НОСІЯ флопш ш е к (B) КОМП ЮТЕР сушений з IBM PC (C) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА PC DOS/MS DOS (D) ПРОГРАМНЕ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ Patenti« Release SI 0 версія ЬРО> ьеи 75a Mac hvn Ъич Ala мек 7^5 val Lys L«u TTC CCC AGG CIG GM GW *TG GGG GCC AGG ?TG СТГ C1T CAG GTC CAC Phe Pro Arg Lesi Glu GID Mat G3y Ala Ага Мес b t u Leu G^n Vsl Mis 770 775 ?30 A l s P h e V a l G l y Plie V a l LGU S e r \cq 305 310 Lys G l u P r o М ы I r p a i d hsp 315 320 Leu L e u A l a L e u A l a A l a M a S r g G l y G l y A r g v a l 335 330 G l u P r o T y r L y s A l a Leu A r g hsp 310 A l a L y s Чар •*SS LHH tfia Arg Ala F r o 335 Leu L y s G l u A l a A r g G l y L e a L e u 3A5 350 S e r Vaj. Lei; A l a Let. Arg G l u G l y Leu G l y I c u P r o 360 36b P r o G l y А ь р A s p е г о MeC L s u Leu A l a T v c L e u L e u A s p F 1 0 S e r A s n 370 375 380 T h r Тїіг P r o G l u G l y v a l A l a Йгд A r g T y r G l y C l y G l u T r p r h r ( Л и 385 390 335 400 GAC GAG CTG GTC CTC CAG GCC CCA A A GPG AGG GCG GAG GCC GTG 1=CC A Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 7Э5 JJO 795 800 G l u A l a G l y Gli, A r g A i d A l a Leu S a r G l u A r g 405 410 CGG CTC GCC АЛС GAG GTC ATG 6AG btG CfG 1АГ C( С ClG GtC GIG CCt Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Т у р>-о Leu Ala v a l Pro «Gi ew eis trp G l y A r g Leu G l u G l y G l u Glu Дед Leu L e u T r p L e u T y r A r g G l u «0 t?S 130 Val G l u A r g P r o Leu S e r ftj-a V a l ^etj A l a H i s Met G l u A l a № 1 G l y •135 440 445 Val l i r a L e u A s p V a l i>la Гуг Leu ЙГд %1а L e u S e r L e u G l u V a l A l a 3S0 455 460 CTG G G CTG G G СГС GGG ATA GuG bnd GAC C G СЧС К С GCC AJIG GAG A A G Leu Glu Val С і в Val Gly l i e 5 i y Glu Asp Tcp L B J SHE Н І Й Lys Glu Ш G25 838 IPU РПе A l a Йьп Leu «15 G l u G l u П е A l a A r g Leu G l u A l a G l u V«.l P h e A i g L e u A l a G l y H i s «S ^70 475 430 P r o Piie A?n Leu Asn S s r Arg A s p G J n LKU G l u A r g V a l Leu P h e A s p 495 S90 495 G l u Leu C l y L e u P r o A l a l i e G l y L y s I h r G l u L y s T h r G l y Ь у з Асд д00 5й5 510 S e e T h r Ser- JUd A l a V a l Leu Glu Ala Leu Л і д G l u A l a 515 ^20 525 HAS Pro 41 47423 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 42