Одноланцюжкова кільцева рнк і спосіб її одержання

Реферат: UA 101806 C2 (12) UA 101806 C2 Винахід належить до одноланцюжкової кільцевої РНК, що має тривалий або повільно вивільнюваний ефект інтерференції РНК, відмінну тим, що одноланцюжкова кільцева РНК містить послідовність смислового ланцюга, послідовність антисмислового ланцюга, комплементарну послідовність смислового ланцюга, однакові або відмітні дві послідовності петлі між смисловим ланцюгом і антисмисловим ланцюгом, зо з'єднують обидва ланцюги, де смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг спарені з утворенням стебла, дн послідовності петлі ідентичні або відрізняються і їх довжина складає 6-9 нуклеотидів, які не містить послідовності 5'-UUYG-3'. Також винахід належить до способу одержання одноланцюжкової кільцевої РНК, способу пригнічення експресії гена за допомогою зазначеної одноланцюжкової кільцевої РНК та фармацевтичної композиції, що містить зазначену молекулу РНК. UA 101806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується одноланцюжкової кільцевої РНК, способу одержання такої РНК і фармацевтичної композиції, що містить таку РНК. Передумови винаходу Звичайні способи інтерференції РНК, як правило, розділяють на дві групи: спосіб з використанням хімічно синтезованих дволанцюжкових РНК, і спосіб з використанням плазмідних векторів. Спосіб інтерференції РНК з використанням плазмідних векторів широко використовується в галузі біотехнології, головним чином, в фундаментальних біологічних експериментах. Однак коли спосіб інтерференції РНК застосовується для розробки фармацевтичних препаратів, спосіб з використанням плазмідних векторів пов'язаний з проблемою безпеки для людського організму. Таким чином, ймовірно, більш переважним є використання хімічно синтезованих дволанцюжкових РНК. Однак з хімічно синтезованими дволанцюжковими РНК пов'язана проблема, що полягає в тому, що вони нестабільні in vivo, а саме сприйнятливі до деградації ферментами (нуклеазами) в клітинах. Для розв'язання цієї проблеми були розроблені ланцюжки РНК з штучними нуклеїновими кислотами для збільшення стабільності дволанцюжкових РНК в клітинах; однак, існує інша проблема, що полягає в тому, що їх біологічна активність знижується, незважаючи на те, що стабільність підвищується. Більше того не відома токсичність, викликана штучними нуклеїновими кислотами. Тому зберігається трудність в застосуванні в фармацевтичних препаратах. Форми дволанцюжкової РНК, що використовуються в способі інтерференції РНК, включають дволанцюжкову РНК, що має тупі кінцями або липкі кінця, РНК, що має шпилькову структуру з петлею на будь-якому кінці дволанцюжкової РНК (JP2003-502012A), кільцеву нуклеїнову кислоту, яка містить приблизно 19 пар основ, дві петлі, і необов'язково хімічно модифіковані полінуклеотиди (JP2006-271387A) і тому подібне. Однак цю кільцеву нуклеїнову кислоту не піддавали тестуванню на ефект інтерференції РНК. Крім того, описана химерна РНК-ДНК нуклеїнова кислота в формі гантелі (JP11137260A(1999)). Ця нуклеїнова кислота не призначена для використання для інтерференції РНК. Рибонуклеїнова частина нуклеїнової кислоти в формі гантелі розщеплюється ферментом в клітинах, і одержана антисмислова дезоксирибонуклеїнова частина зв'язується з мРНК в клітинах і інгібує її. У JP11-137260A(1999) описана нуклеїнова кислота, яка має високу стійкість до ферментів, що беруть участь в деградації нуклеїнової кислоти в клітинах, і залишається стабільною в процесі дії рибонуклеази Н, через її структуру в формі гантелі. Додатково описано, що, оскільки одноланцюжковий олігонуклеотид, що містить антисмислову дезоксирибонуклеїнову частину, може бути вивільнений в цитоплазму клітини тільки після розщеплення комплементарної рибонуклеїнової частини під дією рибонуклеази Н, то передбачається збільшення антисмислового ефекту на дозу. Крім того, відносно способу синтезу кільцевої нуклеїнової кислоти, що має структуру в формі гантелі, наприклад, розкрито, що синтезовані лінійні олігонуклеотиди, стебло і петля шпильки утворені для одержання одноланцюжкового розриву олігонуклеотиду в формі гантелі, де цільовий кільцевий олігонуклеотид в формі гантелі (протилежний кінець вищезазначеної петлі шпильки) в одному місці не зв'язаний, і 5'-кінець лігований лігазою для створення кільцевої нуклеїнової кислоти в формі кільцевій гантелі (JP11-137260(1999)). Метою даного винаходу є одноланцюжкова кільцева РНК і спосіб її одержання. Опис винаходу У цей час автори даного винаходу несподівано виявили, що одноланцюжкова кільцева РНК може бути одержана з високим виходом за допомогою роздільного синтезу смислового ланцюга і антисмислового ланцюга, обидві містять нуклеотидну послідовність з неспареними нуклеотидами на кожному кінці, і надання лігазі можливості діяти на нуклеотиди на обох кінцях одночасно, і що одержана одноланцюжкова кільцева РНК приводить в дію ефект інтерференції РНК, що тривалий або повільно вивільняється. Основуючись на цих наукових даних, автори даного винаходу здійснили даний винахід. Більш конкретно, даний винахід стосується наступних винаходів. (1) Одноланцюжкової кільцевої РНК, що має ефект інтерференції РНК, який тривалий або повільно вивільняється, відмінна тим, що одноланцюжкова кільцева РНК містить послідовність смислового ланцюга, послідовність антисмислового ланцюга, комплементарну послідовності смислового ланцюга, дві послідовності петлі, які однакові або відмінні, між смисловим ланцюгом і антисмисловим ланцюгом, з'єднуючі обидва ланцюги, де смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг спарені з утворенням стебла. 1 UA 101806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (2) Одноланцюжкова кільцева РНК, як описано в (1), де експресія цільової РНК становить 0,4 або менше 24 години після введення одноланцюжкової кільцевої РНК в еукаріотичні клітини, в порівнянні з контрольними клітинами, рівень експресії в яких цільової РНК взятий за 1. (3) Одноланцюжкова кільцева РНК згідно з вищезазначеним (1) або (2), де 70% або більше одноланцюжкової кільцевої РНК після 8 годин зберігається в сироватці людини. (4) Спосіб одержання одноланцюжкової кільцевий РНК згідно з будь-яким з вищезазначених з (1) до (3), включаючий синтез смислового ланцюга і антисмислового ланцюга, які містять нуклеотидну послідовність з неспареними нуклеотидами на 5'-кінці і 3'-кінці, і одночасне лігування нуклеотиду на 5'-кінці нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в смисловому ланцюгу, з нуклеотидом на 3'-кінці нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в антисмисловому ланцюгу, і навпаки, використовуючи лігазу, де нуклеотидна послідовність з неспареними нуклеотидами на 5'-кінці смислового ланцюга і нуклеотидна послідовність з неспареними нуклеотидами на 3'-кінці антисмислового ланцюга зв'язані одна з одною з утворенням петлі, нуклеотидна послідовність з неспареними нуклеотидами на 3'-кінці смислового ланцюга і нуклеотидна послідовність з неспареними нуклеотидами на 5'-кінці антисмислового ланцюга зв'язані одна з одною з утворенням петлі, і смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг спарені з утворенням стебла. (5) Спосіб згідно з вищезазначеним (4), додатково включаючий фосфорилування кожного 5'кінця нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в смисловому ланцюгу і нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в антисмисловому ланцюгу. (6) Спосіб згідно з вищезазначеним (4) або (5), в якому послідовності петлі є однаковими або відрізняються одна від одної. (7) Спосіб згідно з будь-яким з вищезазначених з (4) до (6), де довжина петлі становить від 2 до 20 нуклеотидів. (8) Спосіб згідно з будь-яким з вищезазначених з (4) до (7), де довжина стебла становить від 19 до 31 нуклеотидів. (9) Спосіб придушення експресії гена, що кодує білок in vitro, який включає введення одноланцюжкової кільцевої РНК згідно з будь-яким з вищезазначених з (1) до (3) у виділені з людини клітини, і ослаблення цільової РНК з допомогою одноланцюжкової кільцевої РНК для тривалого інгібування трансляції цільової РНК в білок. (10) Спосіб придушення експресії гена, що кодує білок, який включає введення одноланцюжкової кільцевий РНК згідно з будь-яким з вищезазначених з (1) до (3) в тварину, відмінну від людини, рослину або їх клітин, і ослаблення цільової РНК з допомогою одноланцюжкової кільцевий РНК для тривалого інгібування трансляції цільової РНК в білок. (11) Фармацевтична композиція, що містить одноланцюжкову кільцеву РНК згідно з будьяким з вищезазначених з (1) до (3) як активний інгредієнт. Як використовують в цьому документі термін «одноланцюжкова кільцева РНК» може означати РНК в формі гантелі. РНК в формі гантелі стосується одноланцюжкової кільцевої РНК, в якій смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг комплементарно спарені з утворенням стебла, петлі утворені обома сторонами стебла за допомогою нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами, і повна форма одноланцюжкової кільцевої РНК являє собою гантелю. Може бути ефективно одержана синтетична РНК в формі гантелі за даним винаходом, яка має відмінну стабільність, стійкість і властивість, що повільно вивільняється. Зокрема, РНК в формі гантелі для використання в способі інтерференції РНК може бути одержана циклізацією двох ланцюжків РНК. Оскільки обидва кінці закриті в петлю, у РНК немає кінця і тому малоймовірно, що вона буде служити субстратом для ферментнів, екзонуклеази (РНаза) і тому подібне, за винятком певних ферментів, таких як дайсер в клітинах. Таким чином, вона є менш сприйнятливою до ферментативної деградації і має значно збільшеною стабільністю в клітині. У результаті, відсутня необхідність у використанні штучних нуклеїнових кислот для збільшення стабільності. Крім того, РНК в формі гантелі специфічно розпізнається ферментами in vivo, такими як дайсер в клітинах, і петльові ділянки на обох сторонах розщеплені для формування типу дволанцюжкової РНК, що зустрічається в природі (фігура 1). У результаті, вона може мати активність, еквівалентну активності дволанцюжкової РНК, і приводити в дію ефект, що більш стійкий або ефект інтерференції РНК, що повільно вивільняється, ніж з допомогою традиційних дволанцюжкових РНК. РНК в формі гантелі за даним винаходом також є більш стабільною, ніж звичайні дволанцюжкові РНК в сироватці людини. Короткий опис креслень 2 UA 101806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На фігурі 1 схематично представлений вигляд РНК в формі гантелі за даним винаходом. На фігурі 2 показана структура РНК і зображення електрофорезу кожної РНК. На фігурі 3 показана структура міРНК і РНК в формі гантелі. На фігурі 4 показані зображення електрофорезу РНК в формі гантелі і лінійні дволанцюжкових РНК, розщеплені дайсером. На фігурі 5 показаний ефект інтерференції кожної РНК в формі гантелі через 24 години після трансфекції. На фігурі 6 показаний стійкий ефект інтерференції РНК для РНК в формі гантелі. На фігурі 7 показана стабільність РНК в формі гантелі в сироватці людини. Найбільш переважний варіант здійснення винаходу Одноланцюжкова кільцева РНК за даним винаходом містить послідовність смислового ланцюга, гомологічну нуклеотидній послідовності цільової РНК або її частині, послідовність антисмислового ланцюга, яка комплементарна послідовності смислового ланцюга і здатна спарюватися з нею, і послідовності петель, які не можуть утворювати спаровування між ланцюгами. Смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг спарені з утворенням стебла. Довжина стебла конкретно не обмежена і може бути визначена в залежності від типу, структури цільової РНК і тому подібного. Наприклад, стебло складається з 19-31 пари основ, переважно від 21 до 25 пар основ, більш переважно від 22 до 24 пар основ і, ще більш переважно 23 пари основ. Нуклеотидні послідовності з неспареними нуклеотидами присутні на 5'-кінці і 3'-кінці як смислового ланцюга, так і антисмислового ланцюга. Нуклеотид на 5'-кінці нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в смисловому ланцюгу і нуклеотид на 3'-кінці нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в антисмисловому ланцюгу ліговані разом з утворенням петлі. Нуклеотид на 3'-кінці нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в смисловому ланцюгу і нуклеотид на 5'-кінці нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в антисмисловому ланцюгу ліговані разом з утворенням петлі. Довжина петлі, переважно, становить від 2 до 20 основ, більш переважно від 6 до 12 основ. Тому ціла одноланцюжкова кільцева РНК переважно складається з від 42 до 102 основ. Якщо нуклеотидна послідовність з неспареними нуклеотидами на 5'-кінці смислового ланцюга представлена як А, то нуклеотидна послідовність з неспареними нуклеотидами на 3'кінці антисмислового ланцюга представлена як В, нуклеотидна послідовність з неспареними нуклеотидами на 3'-кінці смислового ланцюга представлена як С, і нуклеотидна послідовність з неспареними нуклеотидами на 5'-кінці антисмислового ланцюга представлена як D, наприклад, якщо довжина петлі становить 20 основ, то А в довжину становить від 1 до 19 основ, В в довжину становить від 19 до 1 основ, С в довжину становить від 19 до 1 основи, і D в довжину становить від 1 до 19 основ. Тому нуклеотид на 5'-кінці А і нуклеотид на 3'-кінці В ліговані разом з утворенням петлі з 20 основ, і нуклеотид на 3'-кінці З і нуклеотид на 5'-кінці D ліговані разом з утворенням петлі з 20 основ. Переважно, послідовності, які не можуть спарюватися одна з одною, відрізнялися по довжині між А і В, і між С і D, наприклад, на 1 основу, 2 основи або 3 основи або, альтернативно, щоб послідовності були однакової довжини. Тому, наприклад, якщо довжина петлі становить 8 основ, переважно, щоб А становила від 3 до 5 основ в довжину, В становилавід 5 до 3 основ в довжину, С становила від 5 до 3 основ в довжину, і D становила від 3 до 5 основ в довжину. Коли довжина петлі становить 9 основ, переважно, щоб А становила від 3 до 6 основ в довжину, В становила від 6 до 3 основ в довжину, С становила від 6 до 3 основ в довжину, і D становила від 3 до 6 основ в довжину. Коли довжина петлі становить 10 основ, переважно, щоб А становила від 4 до 6 основ в довжину, В становила від 6 до 4 основ в довжину, С становила від 6 до 4 основ в довжину, і D становила від 4 до 6 основ в довжину. Крім того, нуклеотидні послідовності петлі, утвореної з допомогою А і В, і петлі, утвореної з допомогою C і D, можуть бути однаковими або різними. Одноланцюжкові кільцеві РНК за даним винаходом можна використовувати в способі інтерференції РНК. Інтерференція РНК, також відома як RNAi і являє собою феномен, коли маленька молекула РНК, що має послідовність, комплементарну цільовій РНК, зв'язується з цільовою РНК, таким чином, деградуючи цільову РНК або придушуючи трансляцію цільової РНК. Антисмисловий ланцюг РНК в формі гантелі має послідовність, комплементарну цільовій РНК (наприклад, мРНК або її прекурсорної РНК). Крім того, нуклеотидні послідовності з неспареними нуклеотидами включають, але ними не обмежуючись, UUCAAGAGA і UGUGCUGUC (M. Miyagishi et al., Oligonucleotides 2003, Vol. 13: pp. 1-7). 3 UA 101806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, петля в РНК в формі гантелі може бути хімічно модифікована. Наприклад, стабільність РНК в формі гантелі in vivo може бути збільшена за допомогою модифікації поліетиленгліколем, молекулярна маса якого становить приблизно від 2000 до 5000. Петля РНК в формі гантелі розщеплюється ферментом, подібним дайсеру, в клітинах, що підлягають видаленню. Тому вважають, що поліетиленгліколь має невеликий ефект, якщо стебло приводить в дію свій ефект інтерференції РНК у вигляді міРНК або мкРНК. З РНК в формі гантелі за даним винаходом, експресія цільової РНК в клітинах, в які була введена РНК в формі гантелі, переважно становить 0,4 або менше через 24 години після введення РНК в формі гантелі в клітини, в порівнянні з контрольними клітинами (без введеної РНК в формі гантелі), в яких рівень експресії цільової РНК взятий за 1. Відповідно до даного винаходу клітини являють собою еукаріотичні клітини, переважно клітини тварин і клітини рослин. Експресія цільової РНК може бути підтверджена, наприклад, трансформацією клітин репортерним геном (наприклад, геном люциферази, -галактозидази, -глюкуронідази або зеленого флуоресцентного білка (GFP)), і вимірюванням забарвлення або флуоресценції білка, одержаного з репортерного гена, для перевірки рівня інгібування експресії цільової РНК з допомогою РНК в формі гантелі, де мРНК репортерного гена можна використовувати як цільову РНК. Крім того, РНК в формі гантелі за даним винаходом відрізняється тим, що 70% або за РНК в формі гантелі зберігається без деградації після 8 годин в сироватці людини. Наприклад, це може бути підтверджене інкубацією РНК в формі гантелі в сироватці людини і вимірюванням молекулярної маси з використанням електрофорезу і тому подібне для перевірки деградації з плином часу. Спосіб одержання одноланцюжкової кільцевої РНК в формі гантелі за даним винаходом стосується синтезу смислового ланцюга і антисмислового ланцюга, що містять нуклеотидну послідовність з неспареними нуклеотидами на 5'-кінці і 3'-кінці, і одночасне лігування нуклеотиду на 5'-кінці нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в смисловому ланцюгу з нуклеотидом на 3'-кінці нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в антисмисловому ланцюгу, і навпаки, з використанням лігази. Смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг можуть бути сконструйовані для придушення функції цільового гена, основаного на нуклеотидній послідовності цільового гена. Конструкції можуть бути підтверджені за допомогою синтезу множини смислових і антисмислових ланцюгів і тестування кожної на ефективність придушення. Наприклад, може бути використаний алгоритм конструювання з використанням конструкції міРНК або подібного (посилання: J. A. Jaeger et al., Methods in Enzymology (1989) 183: 281-306; D. H. Mathews et al., J. Mol. Biol. (1999) 288: 911-940). При конструюванні переважно, щоб ланцюги не придушували експресію генів, відмінних від цільового гена, генів, що мають послідовності, схожі з цільовим геном (що відомо як неспецифічний ефект). Довжини смислового і антисмислового ланцюгів переважно розроблені, наприклад, в діапазоні від 19 до 31 основи, переважно від 21 до 25 основ, більш переважно від 22 до 24 основ і навіть більш переважно 23 основи. Цільовий ген включає, але ними не обмежується, ген лейкемії abl/bcr, ген VEGF вікової дегенерації жовтої плями і HCV генів гепатиту. Послідовність, яка згодом утворює петлю, наприклад, вищезазначена послідовність UUCAAGAGA, розділена на два фрагменти у випадковому положенні з утворенням нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами (де послідовність складається з 9 основ і коли розділена на два фрагменти, як описано вище, різниця по довжині переважно знаходиться в діапазоні від 1 до 3 основ). Послідовність сконструйована так, щоб один фрагмент був лігований до 3'-кінця антисмислового ланцюга, і інший лігований до 5'-кінця смислового ланцюга. Тим же способом інша послідовність сконструйована так, щоб один фрагмент був лігований до 3'-кінця смислового ланцюга, інший лігований до 5'-кінця антисмислового ланцюга. Одноланцюжкові нуклеїнові кислоти, ті, що мають ці два сконструйовані послідовності синтезуються роздільно. При виконанні цього переважно здійснити фосфорилування 5'-кінця з використанням хімічного фосфорилуючего агента. Крім того, переважно сконструювати послідовність з утворенням петлі, довжина якої становить, наприклад, від 2 до 20 основ, і, переважно, від 6 до 12 основ. Існують різні способи синтезу нуклеїнових кислот, такі як спосіб транскрипційного синтезу in vitro, способи з використанням плазмід або вірусних векторів, і способи з використанням ПЦР касет. Хоча спосіб синтезу нуклеїнових кислот конкретно не обмежений, спосіб хімічного синтезу є переважним з точки зору високої чистоти, можливості виробляти великі кількості, безпеку використання in vivo, можливості хімічної модифікації і тому подібне. Приклади способу 4 UA 101806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хімічного синтезу включають, але ними не обмежуються, спосіб з Н-фосфонатом і спосіб з фосфорамідитом. Для цієї мети можна використовувати комерційно доступні автоматичні синтезатори нуклеїнових кислот. Кінці нуклеотидних послідовностей з неспареними нуклеотидами на обох кінцях смислового ланцюга і антисмислового ланцюга ліговані лігазою (наприклад, T4 РНК лігазою або T4 ДНК лігазою) з утворенням двох петель одночасно. Умови реакції включають, наприклад, інкубування в буфері, що містить поліетиленгліколь (ПЕГ), БСА і тому подібне протягом 20 годин при низькій температурі. Синтезована одноланцюжкова кільцева РНК в формі гантелі може бути зібрана і обчищена за допомогою звичайних способів (наприклад, високоефективної рідинної хроматографії і способом з електрофорезом в поліакриламідному гелі). Крім того, одноланцюжкова кільцева РНК може бути хімічно модифікована з допомогою поліетиленгліколю (ПЕГ) або тому подібного, коли хімічна модифікація переважно виконується в зоні петлі. Для скріплення, обидва кінці ПЕГ модифіковані для введення функціональної групи, реагуючої з аміногрупами в основах, таких як формільна група або N-гідроксисукцинімідефірна група. Крім того, в цьому документі описується спосіб інтерференції РНК з використанням РНК в формі гантелі, одержаної вищезгаданим способом. Згідно з даним винаходом одноланцюжкова кільцева РНК за даним винаходом може вводитися в клітини і ослабляти цільову РНК для тривалого інгібування трансляції цільової РНК в білок, де клітини людини або тварини, що не належать до людини або клітини рослини можна використовувати як клітини. Коли спосіб інтерференції РНК здійснюється in vitro, РНК в формі гантелі вводять в клітини, наприклад, способом електропорації, способом мікроін„єкції, способом ліпофекції або трансфекцією з фосфатом кальцію. Коли спосіб інтерференції РНК здійснюється in vivo, спочатку зразок, що містить РНК в формі гантелі, піддають діалізу, регулюванню pH або тому подібного для того, щоб дозволити йому пристосуватися до живого організму. Способи введення РНК в формі гантелі в організм тварини або рослини включають, але ними не обмежуються, місцеве введення, внутрішньовенне введення і спосіб з використанням генної гармати. При використанні для людини, використання мікроорганізмів і тому подібного не є переважним з точки зору безпеки. РНК в формі гантелі, введена в клітини, розщеплюється дайсером в клітинах для створення дволанцюжкової РНК (міРНК), яка має ефектом інтерференції РНК (фігура 1). Кінці міРНК можуть бути або тупими кінцями або липкими кінцями. міРНК перетворюється в окремий ланцюг з утворенням РНК-нуклеазного комплексу (РНК-індукований сайленсинг комплекс (RISC)), який розпізнає цільову мРНК, що має послідовність, комплементарну для міРНК, і деградує цільову мРНК, таким чином придушуючи експресію відповідного цільового гена. Одноланцюжкову кільцеву РНК за даним винаходом можна використовувати на будь-яких рослинах, тваринних (наприклад, людях, кімнатних тваринах, ссавцях, включаючи домашніх тварин) і їх клітинах. Очікується широке застосування в галузі медицини і сільського господарства. Наприклад, одноланцюжкову кільцеву РНК за даним винаходом можна використовувати для різних цілей, включаючи пояснення функції певного гена або білка в рослинах або тваринах, або на клітинному рівні у рослин і тварин, з використанням, наприклад, способу нокауту. Крім того, даний винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить одноланцюжкову кільцеву РНК як активний інгредієнт. Кількість одноланцюжкової кільцевої РНК, введеної до складу фармацевтичної композиції, може бути підібрана відповідно до типу і мети композиції. Наприклад, кількість РНК включає, але ними не обмежується, 1% мас., 3% мас., 5% мас., 10% мас., 20% мас., 30% мас., 40% мас., 50% мас., 60% мас., 70% мас., 80% мас., 90% мас. або 100% мас. по відношенню до загальної кількості композиції. Приклади фармацевтичної композиції за даним винаходом включають рідкі препарати (такі як розчин, суспензія, емульсія), тверді препарати (такі як ліофілізовані препарати, що допускають відновлення перед використанням), препарати, інкапсульовані в ліпосоми (переважно, катіонні ліпосоми). Крім того, переважним шляхом введення є парентеральне введення, яке включає, наприклад, місцеве введення із застосуванням препарату прямо в уражену ділянку, черезлегеневе введення, черезслизове введення, таке як назальне введення, і внутрішньовенне введення. Фармацевтична композиція за даним винаходом може включати в себе ексципієнти (сольовий розчин, стерилізована вода, розчин Рінгера і тому подібне), буферні речовини, тонічні засоби, стабілізатори і тому подібне, в залежності від складів або лікарських форм. 5 UA 101806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, дозування фармацевтичної композиції за даним винаходом може мінятися в залежності від статі, ваги, віку, важкості, симптомів пацієнта або подібного. Фармацевтична композиція за даним винаходом застосовна, наприклад, при лікуванні захворювань, таких як ракові пухлини (наприклад, придушення функцій генів або білків, які специфічно експресуються в злоякісних клітинах). Надалі даний винахід буде описаний більш конкретно за допомогою наступних прикладів. Однак потрібно розуміти, що об'єм даного винаходу не обмежується конкретними прикладами. Приклади Приклад 1: Одержання РНК в формі гантелі Всі 5'-фосфориловані РНК, що служать як сирий матеріал для РНК в формі гантелі, були синтезовані на ДНК синтезаторі (GeneWorld H8-SE) у відповідності зі способом з фосфороамідитом. Захищені TBDMS (Proligo Corp.) використовували для РНК амідитів, і хімічний фосфорилуючий реактив (Glen Research Corp.) використовували для 5'фосфорилування. Захисні групи знімали звичайним способом, з подальшим очищенням електрофорезом в поліакриламідному гелі. Послідовності синтезованих РНК показані в SEQ ID NO:1 (смисловий ланцюг, 28 мономерних ланок полімеру), SEQ ID NO:2 (антисмисловий ланцюг, 28 мономерних ланок полімеру), SEQ ID NO:3 (56 мономерних ланок полімеру), і на фігурі 2. Крім того, в послідовності РНК, показаній на фігурі 2, підкреслені послідовності являють собою послідовності, які утворять область петлі РНК в формі гантелі. Згодом, ферментативну реакцію проводили в суміші з 2 мкМ дволанцюжкової РНК, 2,0 одиниць/мкл T4 РНК лігази, 0,006% БСА, 25% ПЕГ6000, 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT і 1 мМ АТФ в кінцевому об'ємі 25 мкл. Більш конкретно, спочатку 5'-фосфориловану дволанцюжкову РНК розчинили в 12,5 мкл буфери (2буфер), що містить 100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 20 мМ MgCl2, 20 мМ DTT і 2 мМ АТФ, при концентрації 4 мкМ. Розчин нагрівали при 65°С протягом 5 хвилин, і потім повільно охолоджували до кімнатної температури. Згодом, розчин БСА, розчин ПЕГ6000 і T4 РНК лігазу (Takara Bio Inc.) додавали для утворення вищезазначеного складу і реакційного об'єму. Потім розчин інкубували при 11°С протягом 20 годин. РНК збирали преципітацією етанолом і аналізували електрофорезом в поліакриламідному гелі. На кожній доріжці електрофорезу в поліакриламідному гелі на фігурі 2 присутні наступні зразки. Доріжка 1: суміш смислового ланцюга з 28 основ і антисмислового ланцюга з 28 основ (маркер) Доріжка 2: РНК з 57 основ (маркер) Доріжка 3: РНК в формі гантелі, утворена з смислового ланцюга з 28 основ і антисмислового ланцюга з 28 основ Доріжка 4: РНК в формі гантелі, утворена з 56 основ (одноланцюжкова) Доріжка 5: смисловий ланцюг з 28 основ, оброблений РНК-лігазою (еталон) Доріжка 6: антисмисловий ланцюг з 28 основ, оброблений РНК-лігазою (еталон) РНК в формі гантелі на доріжці 4 виготували синтезом одинарного ланцюга, що містить 56 основ (SEQ ID NO:3), створюючих область стебла і область шпильки, і лігуванням першого нуклеотиду і останню нуклеотиду T4 лігазою. Смуга, обведена в коло на доріжці 3 представляє РНК в формі гантелі, виготовлену способом за даним винаходом, і вихід становив приблизно 80%. РНК в формі гантелі на доріжці 4 мала вихід приблизно 5% або менше. Приклад 2: Перевірка довжини стебла РНК в формі гантелі РНК, представлені в SEQ ID NO:4-13 були синтезовані за допомогою вищезазначеного ДНК синтезатора. SEQ ID NO: 4 і 5 утворять дволанцюжкову РНК, яка утворює 18 пар основ (міРНК1), SEQ ID NO: 6 і 7 утворює РНК в формі гантелі, довжина стебла якої становить 19 основ (Db19), SEQ ID NO: 8 і 9 утворює РНК в формі гантелі, довжина стебла якої становить 23 основи (Db-23), SEQ ID NO: 10 і 11 утворює РНК в формі гантелі, довжина стебла якої становить 27 основ (Db-27), і SEQ ID NO: 12 і 13 утворює РНК в формі гантелі, довжина стебла якої становить 31 основу (Db-31) (фігура 3). Ферментативну реакцію проводили в складі з 2 мкМ дволанцюжковою РНК, 1,0 одиниці/мкл T4 РНК лігази, 0,006% БСА, 25% ПЕГ6000, 50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT і 1 мМ АТФ в реакційному об'єм в діапазоні від 1,5 до 2,5 мл. Більш конкретно, 5'-фосфориловану дволанцюжкову РНК розчиняли в буфері (2буфер, половина від об'єму кінцевого реакційного розчину), що містить 100 мМ трис-HCl (pH 7,5), 20 мМ MgCl2, 20 мМ DTT і 2 мМ АТФ, при концентрації 4 мкМ. Розчин нагрівали при 65°С протягом 5 хвилин і потім повільно охолоджували до кімнатної температури. Згодом, розчин БСА, розчин 6 UA 101806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ПЕГ6000 і T4 РНК лігазу (Takara Bio Inc.) додавали для утворення вищезазначеного складу і реакційного об'єму. Потім розчин інкубували при 11°С протягом 20 годин. РНК збирали преципітацією спиртом з реакційного розчину, і циклічні продукти виділяли з допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі. Смуги, що містять цілі, візуалізували способом ультрафіолетового відтінення, вирізали, дробили на маленькі шматочки і екстрагували 3 рази в 4 мл буфери для елюювання (0,2 M NaCl, 1 мМ ЕДТА (pH 8,0)). Екстракт знесолювали з використанням картриджу Sep-Pak (елюйованого 6-ю мл 50% ацетонітрилу у воді), конденсували за допомогою відцентового випарника і додатково піддавали осадженню спиртом в присутність ацетату амонію. Кількість цілей визначали за допомогою вимірювання УФ-спектрів. Дві одиниці ColdShock-DICER (Takara Bio Inc.) додавали до 2 мкг кожні з вищезазначених РНК в формі гантелі в буфері, що містить 20 мМ трис-HCl (pH 8,5), 150 мМ NaCl і 2,5 мМ MgCl2 (реакційний об'єм: 20 мкл), і потім одержаний розчин інкубували при 37°С. Після 1, 6 і 18 годин 3 мкл реакційного розчину забирали як зразок. Кожний зразок змішували з 2 мкл 120 мМ розчину ЕДТА для зупинки ферментативної реакції. Потім їх аналізували за допомогою нативного електрофорезу в поліакриламідному гелі (електрофорез в 10% поліакриламідному гелі, 1TBE) (після фарбування в 1SYBR Green I, зразки візуалізували і кількісно оцінювали на BioRad Molecular Imager FX). На фігурі 4 показаний електрофорез в поліакриламідному геле кожної РНК в формі гантелі. Як контроль, перед реакцією гантелеутворення реакцію розщеплення з використанням дволанцюжкової РНК як субстрат перевіряли тим же способом. У результаті, реакція розщеплення Db-19 була виконана приблизно на 5% після 1 години, і синтез дволанцюжкових РНК довжиною в 20 основ був підтверджений. Фрагменти розщеплення Db-19 в межах 20 основ підтримували майже той же рівень концентрації після 6 і 18 годин. На відміну від цього, майже 100% контролю, що містить лінійний ланцюг з 19 пар основ (лайнер), було розщепленню після 1 години, і спостерігалися дволанцюжкові РНК довжиною в 20 основ. Згодом, дволанцюжкові РНК продукту деградували і зникли згодом. Для Db-23, приблизно 8% було розщепленню після 1 години, і були утворені дволанцюжкові РНК довжиною в 20 основ. Було підтверджено, що із збільшенням довжини стебла, швидкість розщеплення після 1 години збільшується на 10% і 20% в Db-27 і Db-31, відповідно. Після 18 годин приблизно 75% Db-19 залишаються без змін, тоді як Db-31 повністю зникала. На основі цих результатів встановили, що РНК в формі гантелі з більш короткою довжиною стебла є більш стійкою проти ферментів. Приклад 3: ефект інтерференції РНК для РНК в формі гантелі Ефект інтерференції РНК для вищезгаданої РНК в формі гантелі (Db-19, Db-23, Db-27 і Db31) оцінювали за допомогою експерименту по інгібуванню експресії репортерного гена люциферази світляка pGL3. Клітини NIH 3T3 (Riken Cell Bank) культивували в середовищі DMEM (GIBCO), що містить 10% ФТС при 37°С в 5% CO2, і аліквоту культури в 100 мкл інокулірували в кожнуямку 964 ямкового планшета при концентрації 1,6×10 клітин/ямку. Зразок додатково інкубували при 37°С в 5% CO2 протягом 39 годин, щоб одержати приблизно 70% міру змикання моношару. Потім клітини котрансфекували 2 типами плазмідних векторів (pGL3-Control і pRL-TK (для внутрішнього стандарту), з Promega Corp.) і кожний тип РНК, з використанням реактиву для трансфекції GeneSilencer (Genlantis Inc.) відповідно до протоколу приєднали до реактиву для трансфекції. Стан концентрацій в момент трансфекції був наступним. 0,2 мкг pGL3-Control/0,02 мкг pRL-TK/25 нМ РНК (кінцевий об'єм мкл GeneSilencer 1 мкл Середовище DMEM 25 мкл Розбавлений розчин міРНК 2,5 мкл Середовище DMEM 15 мкл РНК (5 пмоль/мкл) 0,5 мкл pGL3-Control (1 мкг/мкл) 0,2 мкл pRL-TK (0,1 мкг/мкл) 0,2 мкл 44,4 мкл Після трансфекции культуру інкубували при 37°С в 5% CO 2 протягом 4 годин. 100 мкл середовища DMEM, що містить 20% сироватки, додавали в кожну ямку. Після додаткового інкубування при 37°С протягом 20 годин, клітини розчиняли для вимірювання рівня експресії люциферази з використанням Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega Corp.) відповідно до прикладеного протоколу (Умови: кількість реактиву 30 мкл, час затримки 2 секунди, час прочитання 10 секунд. Обладнання: Wallac ARVO SX 1420 Multilabel Counter). 7 UA 101806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Для порівняння, контроль (тільки буфер) оцінювали тим же способом. Інтенсивність флуоресценції люциферази світляка була скорегована по інтенсивності флуоресценції люциферази renilla як внутрішній стандарт. Результати показані на фігурі 5. Після 24 годин, серед РНК в формі гантелі, Db-23 показала саму високу активність, і виявила ефект інгібування, що дорівнював всього лише 0,24. Виходячи з цих результатів, найбільш переважною довжиною подвійного ланцюга вважають 23 основи. Приклад 4: Стійкість ефекту інтерференції РНК Порівнювали стійкість ефекту інтерференції РНК для Db-23 і міРНК-1. Клітини NIH 3T3 культивували в Dulbeco's Modified Eagles Medium (DMEM, Gibco) з добавкою 10% фетальної телячої сироватки (ФТС, Invitro/Gibco) в 5% CO 2-зволоженій камері. За 40 годин до трансфекції при 70% мірі змикання моношару, клітини розсіяли в 96-ямкові планшети при 4 густині 1,6×10 клітин на ямку (100 мкл). Котрансфекцію репортерними плазмідами і РНК проводили з використанням GeneSilencer (Gene Therapy systems, Inc.) відповідно до розпоряджень виробника для прилипаючих клітинних ліній. На ямку використовували 16 нг/мкл або 1,6 нг/мкл pGL3-Control (Promega Corp.), 1,6 нг/мкл pRL-TK (Promega Corp.) і 25 нМ РНК, змішаних з реактивом для трансфекції (100 мкл). Після 4 годин інкубації додали 100 мкл 20% ФТС в DMEM. При тривалій інкубації, що перевищує 3 дні, середовище замінювали з потреби. Експресію люциферази спостерігали після 24 годин, 72 годин і 120 годин з допомогою Dualluciferase Reporter Assay System (Promega Corp.) відповідно до інструкцій, наданих з Wallac ARVO SX 1420 Multilabel Counter (Perkin-Elmer, Inc.) (фіг. 6). Зразок без РНК використовували як контроль. Db-23 і міРНК-1 показали майже однакові рівні активності люциферази після 24 годин. Однак, після 120 годин, Db-23 показала більш виражений ефект придушення експресії гена. Виходячи з цих результатів, були показані як ефект, що повільно вивільняється, так і ефект тривалої активації РНК в формі гантелі. Приклад 5: Стабільність РНК в формі гантелі в сироватці людини Порівнювали стабільність Db-23 і міРНК в сироватці людини. 4 мкл попередньо ренатурованої дцРНК (міРНК-1, 20 мкМ) або РНК в формі гантелі (Db-23, 20 мкМ) в буфері для ренатурації (100 мМ ацетату калію, 30 мМ HEPES-KOH (pH7,4), 2 мМ ацетату магнію) змішували з 32 мкл PBS, 4 мкл сироватки здорової людини (Chemicon International, Inc.), інкубували при 37°С. Аліквоту (5 мкл) забирали після 0,5, 1, 1,5, 3, 8 і 20 годин. Реакцію аналізували з допомогою 15% нативного електрофорезу в поліакриламідному гелі, забарвленому SYBR Green I, і візуалізували з допомогою MolecularImager FX (BioRad Laboratories, Inc.). У результаті до 50% міРНК деградувало після 3 годин, тоді як 80% або більше Db-23 все ще зберігалося після 3 годин, і 70% або більше навіть після 8 годин. Тому можна чекати високу стабільність Db-23 in vivo. Промислова застосовність Даний винахід можна використовувати як молекулу нуклеїнової кислоти, що застосовується до живих організмів, і можна проводити молекулу з високим виходом. 8 UA 101806 C2 9 UA 101806 C2 10 UA 101806 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 1. Одноланцюжкова кільцева РНК, що має тривалий або повільно вивільнюваний ефект інтерференції РНК, яка відрізняється тим, що одноланцюжкова кільцева РНК містить послідовність смислового ланцюга, послідовність антисмислового ланцюга, комплементарну послідовність смислового ланцюга, однакові або відмітні дві послідовності петлі між смисловим ланцюгом і антисмисловим ланцюгом, що з'єднують обидва ланцюги, де смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг спарені з утворенням стебла, де послідовності петлі ідентичні або відрізняються і їх довжина складає 6-9 нуклеотидів, які не містять послідовності 5'-UUYG-3'. 2. Одноланцюжкова кільцева РНК за п. 1, де експресія цільової РНК становить 0,4 або відбувається менше ніж через 24 години після введення одноланцюжкової кільцевої РНК в еукаріотичні клітини, в порівнянні з контрольними клітинами, в яких рівень експресії цільової РНК взятий за 1. 3. Одноланцюжкова кільцева РНК за п. 1 або 2, де 70 % або більше її зберігається після 8 годин в сироватці людини. 4. Одноланцюжкова кільцева РНК за будь-яким з пп. 1-3, де довжина стебла становить 19-31 нуклеотид. 5. Одноланцюжкова кільцева РНК за будь-яким з пп. 1-4, де щонайменше одна з петель хімічно модифікована поліетиленгліколем (PEG). 11 UA 101806 C2 5 10 15 20 25 6. Спосіб одержання одноланцюжкової кільцевої РНК за будь-яким з пп. 1-5, який включає синтез смислового ланцюга і антисмислового ланцюга, що містять нуклеотидну послідовність з неспареними нуклеотидами на 5'-кінці і 3'-кінці, і одночасно лігування нуклеотиду на 5'-кінці нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в смисловому ланцюзі з нуклеотидом на 3'-кінці нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в антисмисловому ланцюзі, і навпаки, з використанням лігази, де нуклеотидна послідовність з неспареними нуклеотидами на 5'-кінці смислового ланцюга і нуклеотидна послідовність з неспареними нуклеотидами на 3'-кінці антисмислового ланцюга зв'язані одна з одною з утворенням петлі, яка має 6-9 нуклеотидів у довжину, які не містить послідовності 5'-UUYG-3', нуклеотидна послідовність з неспареними нуклеотидами на 3'-кінці смислового ланцюга і нуклеотидна послідовність з неспареними нуклеотидами на 5'-кінці антисмислового ланцюга зв'язані одна з одною з утворенням петлі, і смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг спарені з утворенням стебла. 7. Спосіб за п. 6, який додатково включає фосфорилування кожного 5'-кінця нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в смисловому ланцюзі і нуклеотидної послідовності з неспареними нуклеотидами в антисмисловому ланцюзі. 8. Спосіб за п. 6 або 7, де послідовності петлі є однаковими або відмінними одна від одної. 9. Спосіб за будь-яким з пп. 6-8, де довжина стебла становить від 19 до 31 нуклеотиду. 10. Спосіб пригнічення експресії гена, що кодує білок in vitro, який включає введення одноланцюжкової кільцевої РНК за будь-яким з пп. 1-4 у виділені з людини клітини, і ослаблення цільової РНК за допомогою одноланцюжкової кільцевої РНК для тривалого інгібування трансляції цільової РНК в білок. 11. Спосіб пригнічення експресії гена, що кодує білок, який включає в себе введення одноланцюжкової кільцевої РНК за будь-яким з пп. 1-4 в тварину, що не належить до людського виду, рослини або її клітини, і ослаблення цільової РНК за допомогою одноланцюжкової кільцевої РНК для тривалого інгібування трансляції цільової РНК в білок. 12. Фармацевтична композиція, яка містить одноланцюжкову кільцеву РНК за будь-яким з пп. 14 як активний інгредієнт. 12 UA 101806 C2 13 UA 101806 C2 14 UA 101806 C2 Комп‟ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 15