Спосіб пригнічення віл-інфікованих клітин ссавця, трансформована клітина, білковий рекомбінантний рецептор, днк, вектор

1 Способ подавления ВИЧ-инфицированных клеток млекопитающего, который предусматривает введение указанному млекопитающему эффективного количества терапевтических клеток, причем указанные терапевтические клетки экспрессируют мембраносвязанный белковый рекомбинантный рецептор, содержащий внеклеточный участок, который содержит фрагмент CD4, включающий, по крайней мере, аминокислоты 1200 последовательности № 31 KNKCVPI-RHL LLVLOIAI-LP AATQSHKWL -•{WKIiSNQIX l i / ^ Q C S F L T KGFSKDTORA EEDSDTYICE VSD0KEEVQL LVFGLTANSD PSVQCHSPRG m t J C C S T L S VSQLEWDSG V1_A j П о с л е д о в а т е л ь н о с т ь H З і ) > GKKGDTVELT HSKRShVQQC TKLWGOSLT TWTCTVLCTO CTASQKZSIQ NSTLIIKNbX LTLESFPG3S KXVEFXIDIV 51 101 151 2D1 который способен специфично распознавать и связывать ВИЧ или ВИЧ-инфицированную клетку, но который не опосредует ВИЧ-инфекцию 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанный фрагмент CD4 состоит из аминокислот 1-394 последовательности № 29 LLVWLAIiP AAMGNSWL ILGHQaSFLT KGPSKLTORA IEDSDTYICE VEDQKEEVQL LWGLTANSD PSVCGRSPRG KNIOGGraxS VSQLEI^BSG IVT FSFPLAFTVE IDP KLQMGKKLPL LEAKTGKLHO JVVLWMRAT QLQSNLTCEV LKFEXCNWQC LLSOSGQVLL і е л ь в о с т ь 11 2Э; 1 GXKCDTVELT DSRRSLWDQG IHLLQGQSI.T TWTCTVXOlia KMGSGEbWH HLTWQAWQ HCPTSPKUO, ESillKVXJ^W CTASOKKEIQ HFPLIXKHIjt LTLEEPPGSS KKVEFKIOIV QAEPASSSKS YkGSG14-?Lk SLKLEHXEAK STPVHADP КЛІТИНА, 3 Способ по п 1, отличающийся тем, что фрагмент CD4 отделен от мембраны указанной терапевтической клетки расстоянием, по крайней мере, в 48 ангстрем или, по крайней мере, в 72 ангстрема 4 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанный рецептор дополнительно включает трансмембранный участок CD7, имеющий аминокислотную последовательность PRASALPAPP TGSALPDPQT ASALPDPPAA SALPAALAVI SFLLGLGLGV ACVLARTR, трансмембранный участок CD5, имеющий аминокислотную последовательность AGLAAGTVASIILALVLLVVLLVVCGPLAY, или трансмембранный участок CD34, имеющий аминокислотную последовательность LIALVTSGALLAVLGITGYFLM 5 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанный фрагмент CD4 отделен от мембраны указанной терапевтической клетки одной или несколькими белковыми альфа-спиралями 6 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанные терапевтические клетки выбраны из группы, состоящей из Т-клеток, В-клеток, нейтрофилов или дендритных клеток 7 Трансформированная клетка, экспрессирующая белковый, связанный с мембраной рекомбинантный рецептор, содержащий внеклеточный участок, который содержит фрагмент CD4, включающий, по крайней мере, аминокислоты 1 - 200 последовательности № 31 MHRCVPFRHL LLVLQLAIXP AATQCHKWL FKWKNSHQIX ILCNOGSST.T KGPSKLNDHA : E D S D ? * : C S VEDQKEZVQL LVTCLTAHSQ PSVQCRSPHG railQGCKTLS VSQLfXQDSG VIA { П о с л е д о в а т е л ь н о с т ь № 3 1 ) CKKGDTVELT DSKSSLHTJOC THLLQGQSLT TWTCTVLQNQ CTASQKKSIQ KFPLIIKNLK LTLEEPPGES >GWEnaDIV 51 101 151 201 который способен специфично распознавать и связывать ВИЧ или ВИЧ-инфицированную клетку, но который не опосредует ВИЧ-инфекцию 8 Клетка по п 7, отличающаяся тем, что указанный фрагмент CD4 состоит из аминокислот 1-394 последовательности № 29 MKEGVPFSHL raHKSSNQIK ІЕОЗСТЇХСЕ PSVQCHSPRC VtA?OKASSI HiT^DLxma: LEAKTGKLKO VSKREKPVKV LLVLQIALU ILGMQGSFLT VEDQKEEVQL RNIQGGKnLS VYKKEGEQVT VSVOTVTODP SVKLWMSAT LKTEAGmQC AATQGNXWL КСРЕКШКЛ l-VFCLTAIISD VSGt-EMDSG FSFPLAFTVE KLQMCXXLPL QLOKHLTCEV LLSDSGQVU, CKKGDTVELT DSSHSLKDOG THXXCGOSLT TWTCTVbOHO KLTCSCEbWW KLTI-PQAI-PQ WCPTSPKUC ESNIKVbPTW СТЛЗОККЗІО NFPLXI»iLK LTX-EEPPCS5 KKVEfKICIV OAIERASSSKS YS-CSGNLTLA SLKLESKEAS STPVHADP О a> со ю 45349 9 Клетка по п 7, отличающаяся тем, что указанно который не опосредует ВИЧ-инфекцию ный фрагмент CD4 отделен от мембраны клетки 14 Рецептор по п 13, отличающийся тем, что расстоянием, по крайней мере, в 48 ангстрем или, указанный фрагмент CD4 состоит из аминокислот по крайней мере, в 72 ангстрема 1-394 последовательности № 29 CTASORKSIQ 10 Клетка по п 7, отличающаяся тем, что укангастапж. LLVKJIALLP AATQGNXWL GKXGDTVELT NFPLIIKNLK ILGNOGSFLT KGPSXLNDRA FHHXHSNQIK VEDQKEEVQL LVFGLTAN5D THLLQCQSLT LTLESPPGSS занный рецептор дополнительно включает трансTEDSDTYICE KHIQGGXTLS VSQLELQDSG TWTCrVLQliQ KKTOFKIDIV PSVQCRSPRG VYKKEGEQVE KLTGSGELW» QAERA5S5KS мембранный участок CD7, имеющий аминокислотVIAFQKAESI VSVKHVTQDF FSFPIAFTVE 4LTLPQALPQ YACSGNLTIA WITFDLJOaOS BVNLWKRAT KLQKGKKLPL HGPTSPKbWL SLKLEHKEAK ную последовательность PRASALPAPP QLCKHLTCEV LEAXTGKLHQ LHPEAGHWQC STPVHAGP 1X.SDSGQVU, ESHIKVLT-ГЯ VSKREKPWV TGSALPDPQT ASALPDPPAA SALPAALAVI 29} Посгедоаа SFLLGLGLGV ACVLARTR, трансмембранный уча15 Рецептор по п 13, отличающийся тем, что сток CD5, имеющий аминокислотную последовауказанный фрагмент CD4 отделен от мембраны тельность AGLAAGTVASIILALVLLVVLLVVCGPLAY, клетки-хозяина расстоянием, по крайней мере, в или трансмембранный участок CD34, имеющий 48 ангстрем или, по крайней мере, в 72 ангстрема аминокислотную последовательность LI16 Рецептор по п 13, отличающийся тем, что ALVTSGALLAVLGITGYFLM дополнительно содержит трансмембранный уча11 Клетка по п 7, отличающаяся тем, что укасток CD7, имеющий аминокислотную последовазанный фрагмент CD4 отделен от мембраны укательность PRASALPAPP TGSALPDPQT занной клетки одной или несколькими белковыми ASALPDPPAA SALPAALAVI SFLLGLGLGV ACVал ьфа-сп и раля м и LARTR, трансмембранный участок CD5, имеющий аминокислотную последовательность 12 Клетка по п 7, отличающаяся тем, что она AGLAAGTVASIILALVLLVVLLVVCGPLAY, или выбрана из группы, состоящей из Т-клеток, Втрансмембранный участок CD34, имеющий аминоклеток, нейтрофилов или дендритных клеток кислотную последовательность LIALVTSGAL13 Белковый рекомбинантный рецептор, содерLAVLGITGYFLM жащий внеклеточный участок, который содержит фрагмент CD4, включающий, по крайней мере, 17 Рецептор по п 13, отличающийся тем, что аминокислоты 1 - 200 последовательности № 31 указанный фрагмент CD4 отделен от мембраны KNRGWFRHL LLVLGLAJXP AATQGKXWL GKXGDTVELT CTASQKKSIQ 51 указанной терапевтической клетки одной или неT-tfKNSNQIK ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSHRSLWSJQG MFPLIIKMbX 1CJ IEDSDTYICE VEDQKEFVQL LVFGLTJUJED TKLLQGQSLT LTLXSPPG5S 151 сколькими белковыми альфа-спиралями PSVQCRSPRG SHIQGGKTLS VEOLELQDSG WTCTVbQNQ KKVEFKIDIV 301 VXA l Спел є д о з а т е л ь н о с ^ ь T ' 31) L 18 ДНК, кодирующая связанный с мембраной белковый рекомбинантный рецептор по п 13 19 Вектор, содержащий ДНК по п 18 который способен специфично распознавать и связывать ВИЧ или ВИЧ-инфицированную клетку, 1 Настоящее изобретение относится к рецепторам, содержащим фрагменты CD4, связывающие ВИЧ, но не делающие клетку-хозяина восприимчивой к ВИЧ-инфекции Таким образом, настоящее изобретение дает новое и эффективное средство против ВИЧ-инфекции Предшествующий уровень В основе ряда иммунных явлений лежит распознавание Т-клетками антигенов при помощи Тклеточных рецепторов с Т-клетки управляют системой, которая называется клеточным иммунитетом Ее действие состоит в том, что клетки иммунной системы уничтожают чужеродные ткани или зараженные клетки Существуют различные типы Т-клеток хелперы и суппрессоры, которые модулируют иммунный ответ, и цитотоксические клетки (или киллеры), которые уничтожают аномальные клетки непосредственно Т-клетка, распознавшая и связавшая уникальный антиген, проявившийся на поверхности другой клетки, становится активной, она приобретает способность размножаться и, если это цитотоксическая клетка, она может уничтожить связанную клетку ВИЧ и иммунопатогенез В 1984 году было выяснено, что ВИЧ является этиологическим фактором СПИДа С тех пор определение СПИДа несколько раз пересматривалось в отношении того, какие критерии следует включать в диагноз Однако, несмотря на непостоянство диагностических параметров, простым общим знаменателем СПИДа является заражение ВИЧ с последующим развитием стойких генерализованных симптомов и болезней, определяющих СПИД вторичных инфекций, новообразований и неврологических расстройств Harrison's Principles of Internal Medicine, 12thed , McGraw Hill (1991) ВИЧ - это ретровирус человека из группы лентивирусов Четыре известных ретровируса человека принадлежат к двум различным группам, это Т-лимфотропные (лейкозные) ретровирусы человека HTLV-1 и HTLV-2 и вирусы иммунодефицита человека, ВИЧ-1 и ВИЧ-2 Вирусы первой группы трансформирующие, а вирусы второй группы цитопатические ВИЧ-1 считается наиболее распространенным причинным фактором СПИДа в мире Гомология последовательностей между ВИЧ-2 и ВИЧ-1 составляет около 40%, ВИЧ-2 состоит в более тесном родстве с некоторыми членами группы вирусов иммунодефицита обезьян (SIV) См Curran, J et al , Science, 329 1357 - 1359 (1985), Weiss, R et al , Nature, 324 572 - 575 (1986) В репликации и других биологических действиях ВИЧ участвуют обычные ретровирусные гены (env, gag и рої) и еще шесть генов Как сказано выше, общим знаменателем СПИДа является сильное подавление иммунитета, преимущест 45349 венно, клеточного Это подавление иммунитета приводит к возникновению различных заболеваний - к поражению условно-патогенными микроорганизмами и развитию новообразований Основной причиной ослабления иммунитета при СПИДе является количественный и качественный дефицит в подгруппе Т4 лимфоцитов вилочковой железы (Т-лимфоцитов) Фенотипически клетки этой подгруппы определяются как клетки с поверхностной молекулой CD4, которая как оказалось, является клеточным рецептором ВИЧ Dalgleish et al , Nature 312 763 (1984) Вирус иммунодефицита человека поражает в основном клетки типа Т4, но в принципе любая клетка, на поверхности которой экспрессируется молекула CD4, способна связаться с ВИЧ и заразиться им Обычно клеткам CD4+ T приписывают роль хелперов/индукторов, так как они подают сигнал об активации клеткам В или побуждают клетки Т с соответственным маркером CD8 к цитотоксическому/супрессорному действию Reinherz and Schlossman, Cell 19 821 - 827 (1980), Goldstein et al , Immunol Rev 68 5 - 42 (1982) ВИЧ связывается специфически и с высокой аффинностью, при помощи последовательности аминокислот вирусной оболочки (др120), с частью фрагмента VI молекулы CD4, расположенного у ее аминоконца После связывания вирус сливается с мембраной клетки-мишени и интернализируется Оказавшись внутри клетки, он при помощи фермента обратной транскриптазы проводит транскрипцию своей геномной РНК в ДНК, которая интегрируется в ДНК клетки, где существует на протяжении жизни клетки как "провирус" Провирус может оставаться в латентном состоянии, но может активироваться, транскрибировать мРНК и геномную РНК, синтезировать и собрать белок, образовать новый вирион и размножиться на поверхности клетки Хотя точный механизм уничтожения клетки вирусом неизвестен, считается, что основным механизмом ее уничтожения является активное размножение вируса на ее поверхности, приводящее к разрушению плазматической мембраны и нарушению осмотического равновесия В ходе заражения организм-хозяин вырабатывает антитела к вирусным белкам, в том числе к главным гликопротеинам оболочки др120 и др41 Несмотря на действие гуморального иммунитета, болезнь прогрессирует и заканчивается летальным подавлением иммунитета, которое характеризуется множественными вторичными инфекциями, паразитемией, слабоумием и гибелью Неспособность антител хозяина остановить прогрессирование болезни является самой досадной и грозной ее особенностью и не дает оснований надеяться на успех вакцинации, проводимой с использованием традиционных способов Действенность гуморального ответа на заражение вирусами иммунодефицита может зависеть от двух факторов Во-первых, как и другие РНКвирусы (в частности, как ретровирусы), вирусы иммунодефицита сильно мутируют в ответ на иммунный контроль со стороны хозяина Во-вторых, гликопротеины вирусной оболочки сами по себе являются сильно гликозилированными молекула ми и на них мало эпитопов, подходящих для высокоаффинного связывания с антителами Таким образом, оболочка вируса представляет собой плохую антигенную мишень, и хозяин не имеет возможности ограничить распространение вирусной инфекции за счет выработки специфических антител Клетки, зараженные вирусом иммунодефицита человека, экспрессируют на поверхности гликопротеин gp120 Gp120 опосредствует слияние клеток CD4+, происходящее аналогично слиянию вируса с клеткой и приводящее к образованию недолговечных многоядерных гигантских клеток Образование синцитиев зависит от непосредственного взаимодействия гликопротеина оболочки др120 и белка CD4 Dalgleish et al , там же, Klatzman, D etal , Nature 312 763 (1984), McDougal, J S et al , Science 231 382 (1986), Sodroski, J et al , Nature 322 470 (1986), Lifson, J D et al , Nature 323 725 (1986), Sodroski, J et al , Nature 412 (1986) К сведениям, говорящим в пользу того, что заражение вирусом клеток-носителей антигена CD4 обусловлено связыванием CD4-gp120, относится то обстоятельство, что между др120 и CD4 образуется специфический комплекс McDougal et al , там же Другие исследователи утверждают, что клеточные линии, невосприимчивые к ВИЧинфекции, были преобразованы в восприимчивые к ней линии путем трансфекции геном человека кДНК CD4 с последующей экспрессией этого гена Maddon et al, Cell 46 333 - 348 (1986) Несколько исследовательских коллективов (Deen et al , Nature 331 82 - 84 (1988), Fisher et al , Nature 331 76 - 78 (1988), Hussey et al , Nature 331 78 - 81 (1988), Smith et al , Science 238 1704 1707 (1987), Traunecker et al , Nature 331 84 - 86 (1988)) предложили и успешно продемонстрировали в лабораторных условиях ряд терапевтических программ, предусматривающих использование растворимого CD4 в качестве пассивного средства противодействия адсорбции вируса и передаче его через синцитии, впоследствии были получены слитые белки из иммуноглобулина CD4 с более продолжительным временем полужизни и скромной биологической активностью (Capon et al , Nature 337 525 - 531 (1989), Traunecker et al , Nature 139 68 - 70 (1989), Byrn et al , Nature 344 667 - 670 (1990), Zettlmeissl et al , DNA Cell Biol 9 341 -353(1990) Хотя конъюгаты, или слитые белки, иммунотоксина CD4 в лабораторных условиях обладают сильной цитотоксичностью в отношении зараженных клеток (Chaundhary et al , Nature 5 369 - 372 (1988), Till et al , Science 242 1166 - 1168 (1988)), скрытый характер синдрома иммунодефицита не позволяет надеяться на то, что какое-то одно лекарственное средство будет эффективным в облегчении бремени инфекции, а антигенные свойства чужеродных слитых белков, скорее всего, ограничат их приемлемость для стратегий лечения, требующих их неоднократного применения Исследования с обезьянами, пораженными вирусом иммунодефицита обезьян, показали, что растворимый CD4, если вводить его обезьянам, у которых не наблюдается явный дефицит клеток 45349 CD4, может снизить титр вируса иммунодефицита (SIV) и улучшить миелоидный потенциал в лабораторных условиях (Watanabe et al, Nature 337 267 - 270 (1989)) Однако, по окончании лечения количество вирусов быстро восстанавливалось, а это говорит о том, что для предотвращения выхода иммунной системы из строя может потребоваться пожизненное применение лекарства Т-клеточные рецепторы и рецепторы Fc Экспрессия на поверхности клетки наиболее распространенной формы Т-клеточных антигенных рецепторов (TCR) возможна за счет совместной экспрессии по меньшей мере 6 различных полипептидных цепей (Weiss et al , J Exp Med 160 1284 - 1299 (1984), Orloffhashi et al , Nature 31 606 - 609 (1985), Berkhout et al , J Biol Chem 263 8528 - 8536 (1988), Sussman et al , Cell 52 85 95 (1988)), цепей, связывающих антигены а/р, трех полипептидов комплекса CD3 и £ Если одна из этих цепей отсутствует, стабильная экспрессия остальных составляющих комплекса не состоится, £ является критическим полипептидом для поверхностной экспрессии всего комплекса (Sussman et al , Cell 52 85-95 (1988)) и считается, что она опосредствует хотя бы часть программ клеточной активации, запускаемых в результате распознавания лиганда рецептором (Weissman et al , EMBO J 8 3651-3656 (1989), Frank et al , Science 249 174 - 177 (1990)) £ - это интегральный полипептид мембраны, гомодимер I типа с молекулярной массой 32 килодальтона, имеющий внеклеточный домен из 9 остатков, на котором нет участков для присоединения N-связанного гликана, и внутриклеточный домен из 112 (у мышей) или 113 (у человека) остатков (Weissman et al , Science 2 1018 -1020 (1988), Weissman et al , Proc Natl Acad Sci USA 5 9709 - 9713 (1988)) В клетках, экспрессирующих упомянутый антигенный рецептор, в небольших количествах присутствует изоформа полипептида £, названная п (Baniyash et al , J Biol Chem 263 9874 - 9878 (1988), Orloff et al , J Biol Chem 264 14812 - 14817 (1989)), которая образуется при изменении порядка сплайсинга мРНК (Jin et al , Proc Natl Acad Sci USA 87 3319 - 3233 (1990)) Считается, что гетеродимеры £-п опосредствуют образование инозитфосфатов, а также провоцируемую рецептором, программируемую гибель клеток, называемую апоптозом (Mercep et al , Science 242 571 - 574 (1988), Mercep et al , Science 246 1162 - 1165 (1989) Подобно цепям С и п, Цепь у, связанная с рецептором Fc, экспрессируется на поверхности клеток в комплексе с дополнительными полипептидами, часть которых опосредствует распознавание лиганда, а функция другой части не установлена Гомодимерная структура цепи у (гамма) и вся ее организация имеет сильное сходство со структурой £ и является составной частью как высокоаффинного рецептора IgE тучных клеток/базофилов - рецептора FceRI,- который состоит по меньшей мере из трех различных полипептидных цепей (Blanket al , Nature 337 187 189 (1989), Ra et al , Nature 241 752 - 754 (1989)), так и одного из низкоаффинных рецепторов IgG, 8 представленного у мышей типом FcyRlla (Ra et al , J Biol Chem 24 15323-15327 (1989)), а у человека подтипом CD16, который экспрессируется макрофагами и естественными клетками-киллерами, CD16TM (CD16, трансмембранный) (Lamer et al , Nature 342 803 - 805 (1989), Anderson et al , Proc Natl Acad Sci USA 87 2274 - 2278 (1990)) и полипептидом с неустановленной функцией (Anderson et al , Proc Natl Acad Sci USA 87 2274 - 2278 (1990)) Недавно появилось сообщение о том, что у экспрессируется линией мышиных Т-клеток (CTL) и образует гомодимеры и гетеродимеры у-£ и у-п (Orloff et al , Nature 347 189 -191 (1990)) Рецепторы Fc опосредствуют фагоцитоз иммунных комплексов, трансцитоз и серологически типируемую клеточную цитотоксичность (Ravetch and Kmet, Annu Rev Immunol 9 457-492(1991), Unkeless et al , Annu Rev Immunol 6 251 - 281 (1988), Mellman, Curr Qpm Immunol 1 16 - 25 (1988)) Недавно обнаружилось, что одна из изоформ мышиного низкоаффинного рецептора Fc, FcRylllBI, опосредствует интернализацию покрытых Ig мишеней в покрытые клатрином ячейки и что другой низкоаффинный рецептор, FcRylllA, опосредствует серологически типируемую клеточную цитотоксичность за счет связи с одним или несколькими членами небольшого семейства молекул - "инициаторов" (Miettmen et al , Cell 513 317 - 327 (1989), Hunziker and Mellman, J Cell Biol 109 3291 - 3302 (1989)) Эти молекулыинициаторы, Т-клеточный рецептор, цепь £, цепь п Т-клеточного рецептора и цепь у рецептора Fc взаимодействуют с доменами распознавания лиганда, принадлежащими различным рецепторам иммунной системы, и при агрегации могут самостоятельно запускать клеточные процессы, в том числе лизис клеток (Samelson et al , Cell 43 223 231 (1985), Weissman et al , Science 239 1018 1020 (1988), Jin et al , Proc Natl Acad Sci USA ET7 3319 - 3323 (1990) Blank et al , Nature 337 187 - 189 (1989), Lamer et al , Nature 32 805 - 807 (1989), Kurosaki and Ravetch, Nature 342 805 - 807 (1989), Hibbs et al , Scmce 246 1608-1611 (1989), Anderson et al , Proc Natl Acad Sci USA 8 2274 2278 (1990), and Irving and Weiss, Cell 164 891 901 (1991)) При проведении параллелей между семействами рецепторов Fc человека и мышей стало ясно, что изоформы FcRyllA и С человека не имеют мышиных аналогов Отчасти поэтому их функция еще не определена Поскольку гуморальные агенты, основанные только на CD4, в живом организме могут оказаться лишь ограниченно полезными, изучалась возможность усиления клеточного иммунитета к ВИЧ Были получены препараты белковых химер, в которых внеклеточный домен CD4 был слит с трансмембранными и/или внутриклеточными доменами Т-клеточного рецептора, рецептора IgG Fc или элементами В-клеточного рецептора, проводящими сигналы (U S S N 07/847566 и 07/665961, включенные в настоящий документ посредством ссылки) Цитолитические Т-клетки, экспрессирующие химеры, в которых присутствует внеклеточный домен CD4, оказывают сильное, не зависящее от главного комплекса гистосовместимости, 45349 10 почтительно по меньшей мере в 72 ангстрема) В разрушительное воздействие на клеточные мипредпочтительном варианте осуществления першени, экспрессирующие белки оболочки ВИЧ Исвого аспекта внутриклеточная часть - это часть ключительно важным и новым компонентом этого белка Т-клеточного рецептора (например, Q, Вподхода явилось выделение отдельных цепей Тклеточного рецептора или рецептора Fc, способклеточного рецептора, рецептора Fc и Вная проводить сигналы, лечебные клетки выбираклеточного рецептора, агрегации которых достаются из числа (а) Т-лимфоцитов, (Ь) цитотоксичеточно, чтобы инициировать клеточный ответ Одских Т-лимфоцитов, (с) естественных клетокним из особенно полезных вариантов осуществкиллеров, (d) нейтрофилов, (е) гранулоцитов, (f) ления этого подхода явилось изобретение химер макрофагов, (д) тучных клеток, (п) клеток HeLa и CD4 с £, п или у, которые направляют цитолитиче(і) стволовых клеток зародыша (ES) ские Т-лимфоциты на распознавание и уничтожение клеток, экспрессирующих др120 ВИЧ (U S S N В других соответствующих аспектах настоя07/847566 и 07/665961, включенные в настоящий щего изобретения рассматривается ДНК, кодидокумент посредством ссылки) рующая химерный рецептор, соответствующий настоящему изобретению, и вектор, содержащий Сущность изобретения эту ДНК химерного рецептора В целом настоящее изобретение представляВ приведенном варианте осуществления нает собой способ нацеливания клеточного иммунстоящего изобретения речь идет о химере CD4 и ного ответа на ВИЧ-инфицированную клетку в дзета, но для достижения упомянутых здесь целей организме млекопитающего Этот способ предуможет быть использована любая рецепторная сматривает введение в организм млекопитающего цепь, действие которой сходно с действием этих эффективного количества лечебных клеток, эксмолекул, например, цепь из гранулоцитов или Впрессирующих связанный с мембраной белковый лимфоцитов К характерным признакам молекулыхимерный рецептор, который включает (а) внеклеинициатора деятельности иммунной клетки отноточную часть, содержащую фрагмент CD4, спосятся способность экспрессироваться самостоясобный специфически распознавать и связывать тельно (т е в виде отдельной цепи), способность ВИЧ-инфицированные клетки, но неспособный сливаться с внеклеточным доменом CD4 таким опосредствовать ВИЧ-инфекцию, и (Ь) внутриклеобразом, чтобы полученная химера находилась на точную часть, которая способна подать лечебной поверхности лечебной клетки, и способность заклетке сигнал уничтожить связанную с рецептором пускать клеточные эффекторные процессы при ВИЧ-инфицированную клетку встрече и агрегации с лигандом-мишенью Один из аспектов настоящего изобретения В настоящее время наиболее удобным спосорассматривает клетку, экспрессирующую связанбом доставки химер к клеткам иммунной системы ный с мембраной белковый химерный рецептор, является использование приемов генотерапии включающий (а) внеклеточную часть, содержащую Однако, достройка клеток иммунной системы хифрагмент CD4, который способен специфически мерными рецепторами за счет смешивания клеток распознавать и связывать ВИЧ-инфицированную с подходящим образом растворенным и очищенклетку, но не опосредует ВИЧ-инфекцию, и (Ь) ным химерным белком приведет также к образовнутриклеточную часть, способную подать лечебванию популяции сконструированных клеток, споной клетке сигнал уничтожить связанную с рецепсобных реагировать на ВИЧ-инфицированные тором ВИЧ-инфицированную клетку мишени Подобные подходы использовались, наВторой аспект освещает способ лечения ВИЧ пример, для введения молекулы CD4 в эритроциу млекопитающего, предусматривающий введение ты в лечебных целях В этом случае популяция млекопитающему эффективного количества лесконструированных клеток неспособна к самочебных клеток, экспрессирующих связанный с стоятельному воспроизведению мембраной белковый химерный рецептор, включающий внеклеточную часть, содержащую фрагНастоящее изобретение относится к функциомент CD4, который способен специфически раснальным и упрощенным химерам фрагментов CD4 познавать и связывать ВИЧ-инфицированную с подъединицами Т-клеточного рецептора, Вклетку, но не опосредует ВИЧ-инфекцию клеточного рецептора и рецептора Fc, способным нацеливать иммунные клетки на распознавание и Еще один аспект, связанный с предыдущими, лизис ВИЧ-инфицированных клеток Способ освещает клетку, экспрессирующую связанный с управления клеточным ответом в организме млемембраной белковый химерный рецептор, вклюкопитающего включает введение в организм млечающий внеклеточную часть, содержащую фрагкопитающего эффективного количества лечебных мент CD4, который способен специфически расклеток (например, цитотоксичных Т-лимфоцитов), познавать и связывать ВИЧ-инфицированную способных распознавать и уничтожать ВИЧклетку, но не опосредует ВИЧ-инфекцию инфицированные клетки В предпочтительных вариантах осуществлеНастоящее изобретение также касается белния обоих (первого и второго) аспектов фрагмент ков химерных рецепторов, направляющих цитоCD4 образован аминокислотами 1 - 394 или 1 токсичные Т-лимфоциты на распознавание и ли200 последовательности CD4, этот фрагмент CD4 зис ВИЧ-инфицированных клеток, клеток, отделен от внутриклеточной части трансмембрантрансформированных при помощи вектора, соным доменом CD7, изображенным на фиг 26, или держащего химерные рецепторы, и антител к хицентральным доменом и доменами СН2 и СНЗ мерным рецепторам молекулы IgGI человека, показанными на фиг 25, и фрагмент CD4 отделен от лечебной клетки расЭти и другие варианты осуществления настоянием по меньшей мере в 48 ангстрем (и предстоящего изобретения, не исчерпывающие его 11 45349 12 сущности, станут очевидными для специалистов можно воспроизводство клонированной по прочтении нижеследующего подробного описапоследовательности Так, под "вектором экспресния изобретения сии ДНК' подразумевается любой самостоятельВ нижеследующем подробном описании мы ный элемент, способный управлять синтезом ребудем ссылаться на различные методики, известкомбинантного пептида К таким векторам ные специалистам в области молекулярной биоэкспрессии ДНК относятся бактериальные плазлогии и иммунологии Публикации и другие матемиды и фаги, а также плазмиды и вирусы млекориалы, в которых изложены эти известные питающих и насекомых методики и на которые мы будем ссылаться, Под "практически чистым" подразумевается включаются в настоящий документ посредством соединение, например, белок, полипептид или ссылки во всей своей полноте, как если бы привоантитело, которое практически не содержит комдились целиком понентов, которые характерны для него в естественных условиях Обычно вещество считается К общеизвестным работам, в которых изложепрактически чистым, если по меньшей мере 60%, ны общие принципы технологии рекомбинантных а предпочтительно по меньшей мере 75%, и наиДНК, относятся Watson et al , Molecular Biology of более предпочтительно по меньшей мере 90% the Gene, Volumes I and II, the Benjamm/Cummings материала, взятого в качестве образца, - это треPublishing Company, Inc , publisher, Menlo Park, CA буемое соединение Чистоту можно определить (1987), Darnell et al, Molecular Cell Biology, Scienлюбым подходящим способом, например, при поtific American Books, Inc , Publisher, New York, N Y мощи хроматографии на колонке, электрофореза (1986), Lewm, Genes II, John Wiley & Sons, publishна полиакриламидном геле или жидкостной хроers, New York, N Y (1985), Old et al , Principles of матографии высокого разрешения Если речь идет Gene Manipulation An Introduction to Genetic Engiо нуклеиновых кислотах, то "практически чистыми" neering, 2d edition, University of California Press, называются последовательности, сегменты или publisher, Berkeley, CA (1981), Maniatis et al , Moфрагменты, не сопряженные непосредственно lecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed Cold (т е не связанные ковалентнои связью) ни с одной Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring из кодирующих последовательностей, с которыми Harbor, NY (1989), and Ausubel et al , Current Protoони непосредственно сопряжены (те связаны с cols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY одной на конце 5', ас другой на конце 3') в естест(1989) венных условиях в геноме организма, из которого ОПРЕДЕЛЕНИЯ получена ДНК, соответствующая настоящему изоПод "клонированием" подразумевается исбретению пользование в лабораторных условиях методов рекомбинации для осуществления вставки опре"Фрагментом" молекулы, такой как любая из деленного гена или другой последовательности последовательностей кДНК, соответствующих ДНК в векторную молекулу настоящему изобретению, называется любая подгруппа нуклеотидов молекулы, связанных друг с Под "кДНК" подразумевается комплементардругом "Аналогом" молекулы называется искусстная ДНК, или ДНК-копия, собранная на матрице венная молекула, в основном подобная исходной РНК за счет действия зависящей от РНК ДНКмолекуле или ее фрагменту Молекула называетполимеразы (обратной транскриптазы) Так "клон ся "в основном подобной" другой молекуле, если кДНК" обозначает двойную последовательность последовательности аминокислот в обеих молеДНК, комплементарную нужной молекуле РНК, кулах в основном одинаковы В частности, "в оссодержащуюся в векторе клонирования новном подобная" последовательность аминокисПод "библиотекой кДНК" подразумевается лот по меньшей мере на 50%, предпочтительно на коллекция рекомбинантных молекул ДНК, содер85% и наиболее предпочтительно на 95% совпажащих вставки кДНК, включающие ДНК-копии дает с природной или эталонной последовательмРНК, экспрессируемых клеткой в период созданостью аминокислот и/или отличается от природния библиотеки кДНК Такую библиотеку кДНК ной или эталонной последовательности лишь можно получить при помощи способов, известных незначительными заменами аминокислот В осспециалистам и описанных, например, у Ausubel новном подобные аминокислотные молекулы обet al , смотри выше и Maniatis et al, смотри выше ладают подобной биологической активностью В Обычно сначала из организма, из генома конастоящем документе молекула называется "хиторого нужно клонировать какой-либо ген, выдемическим производным" от другой молекулы, если ляют РНК Для достижения целей настоящего содержит химические группы, не содержащиеся в изобретения лучше использовать линии лимфоисходной молекуле в естественных условиях Эти цитов млекопитающих, в частности, человека В группы могут повышать растворимость молекулы, настоящее время предпочтительным вектором абсорбцию, продлевать время полужизни и т д для этого является штамм WR вируса осповакциИногда такие группы уменьшают токсичность моны лекулы, устраняют или ослабляют нежелательные Под "вектором" подразумевается молекула побочные действия и т д Группы, обладающие ДНК, полученная, например, из плазмиды, бактетакими свойствами, описаны в Remington's Pharриофага, вируса млекопитающих или насекомых, maceutical Sciences/ 16th ed , Mack Publishing Co , в которую могут быть вставлены, или клонироваEaston, Penn (1980) ны, фрагменты ДНК Вектор содержит один или несколько сайтов рестрикции и может быть спо"Функциональное производное" гена химернособным к самостоятельной репликации в опредего рецептора, предложенного настоящим изобреленном организме-хозяине (носителе), тогда возтением, должно содержать "фрагменты" или "ана 13 45349 логи" этого гена, "в основном подобные" ему по последовательности нуклеотидов "В основном подобные" нуклеиновые кислоты кодируют в основном подобные последовательности аминокислот (определенные выше) и могут также включать любую последовательность нуклеиновых кислот, способную к гибридизации с природной или эталонной последовательностью нуклеиновых кислот при соответствующих условиях гибридизации (см , напр , Ausubel et al , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989), о подходящих условиях жесткости для гибридизации) "В основном подобный" химерный рецептор обладает активностью, подобной активности Тклеток дикого типа, В-клеток или химер рецептора Fc Предпочтительно, производное сохраняет 40%, более предпочтительно - 70% и наиболее предпочтительно 90% активности химеры рецептора дикого типа Активность функционального производного от химерного рецептора состоит в специфическом связывании (при помощи внеклеточного участка CD4) с ВИЧ-инфицированной клеткой и в последующем разрушении этой клетки, кроме того, химерный рецептор не сообщает несущей его клетке восприимчивость к заражению ВИЧ Активность химерного рецептора можно протестировать любым из описанных в настоящем документе способов Последовательность ДНК, кодирующая химеру рецептора CD4, соответствующую настоящему изобретению, или функциональные производные этой химеры, может быть рекомбинирована с векторной ДНК в соответствии с традиционной технологией, предусматривающей сшивание по тупым или ступенчатым концам, переваривание рестрикционными ферментами для получения соответствующих концов, осуществление вставки "липких" концов в нужные места, обработку щелочной фосфатазой для предупреждения возникновения нежелательных связей и использование для сшивания соответствующих лигаз Технология проведения таких процедур описана у Mamatis et al , см выше, и хорошо известна специалистам Молекула нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, считается "способной экспрессировать" полипептид, если она содержит последовательности нуклеотидов, в свою очередь содержащие информацию, необходимую для управления транскрипцией и трансляцией, и эти последовательности "оперативно связаны" с последовательностями нуклеотидов, кодирующими полипептид Оперативная связь - это связь, при которой управляющие последовательности ДНК и те последовательности, которые нужно экспрессировать, соединены таким образом, что экспрессия гена является возможной Характер управляющих участков, необходимых для экспрессии гена, изменяется от организма к организму, но в общем случае к ним относится промоторный участок, в который в прокариотических организмах включается и промотор (инициирующий транскрипцию РНК), и последовательности ДНК, которые после транскрипции в РНК подают сигнал о начале синтеза белка Обычно на таких участках находятся 5'некодирующие последовательности, участвующие в запуске транскрипции и трансляции, такие как 14 блок ТАТА, кэп, последовательность СААТ и т п Если нужно, то при помощи описанных выше способов можно получить некодирующий участок 3' для генной последовательности, кодирующей белок Этот участок может быть сохранен с целью использования последовательностей, управляющих окончанием транскрипции, например, терминацией и полиаденилированием Так, сохранение 31-конечного участка, в естественных условиях примыкающего к последовательности ДНК, кодирующей белок, обеспечивает сигналы терминации Если эти сигналы терминации трансляции неудовлетворительно работают в клетке-хозяине, то можно заменить функциональный З'-участок в клетке-хозяине Две последовательности ДНК (такие как последовательность промоторного участка и последовательность, кодирующая химеру рецептора CD4) считаются оперативно связанными, если характер связи между этими двумя последовательностями ДНК (1) не приводят к мутации со сдвигом рамки, (2) не ослабляет способность последовательности промоторного участка управлять транскрипцией генной последовательности химерного рецептора и (3) не ослабляет способность генной последовательности химерного рецептора транскрибироваться под управлением последовательности промоторного участка Промоторный участок будет оперативно связан с последовательностью ДНК, если промотор будет способен осуществить транскрипцию этой последовательности ДНК Таким образом, чтобы экспрессировать белок, необходимы сигналы транскрипции и трансляции, распознаваемые соответствующим хозяином Настоящее изобретение предусматривает экспрессию белка химеры рецептора CD4 (или его функционального производного) в прокариотических или эукариотических клетках, хотя предпочтительной является экспрессия в эукариотических клетках (в частности, в лимфоцитах человека) Антитела, соответствующие настоящему изобретению, могут быть приготовлены различными способами Например, клетки, экспрессирующие белок химеры рецептора CD4 или функциональное производное этого белка, можно ввести животному, чтобы спровоцировать выработку сыворотки, содержащей политональные антитела, способные связывать химеру В предпочтительном случае антитела, соответствующие настоящему изобретению, являются моноклопальными Такие моноклональные антитела можно приготовить, используя технологию гибридом (Kohler et al , Nature 256 495 (1975), Kohler et al , Eur J Immunol 65511 (1976), Kohler et al , Eur J Immunol 6 292 (1976), Hammering et al , в книге Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybndomas, Elsevier, N Y , pp 563 - 684 (1981)) В общем случае такая процедура предусматривает иммунизацию животного антигеном химеры рецептора CD4 У животного изымают спленоциты и сливают их с подходящей миеломной клеточной линией В рамках настоящего изобретения может быть использована любая подходящая миеломная клеточная линия Полученные в результате слияния гибридомные клетки избирательно выдерживают в 15 45349 16 среде ГАТ (гипоксантин-аминоптеринтимидиновой или "сэндвич-анализ" подразумевается одновресреде), а затем клонируют путем предельного менный, прямой и обратный сэндвич-анализ Сперазбавления, как описано у Wands et al , (Gastroциалисты хорошо понимают эти термины Спеenterology 80 225 - 232 (1981)) Гибридомные клетциалисты поймут также, что антитела, ки, полученные в результате такого отбора, подсоответствующие настоящему изобретению, будут вергаются анализу с целью выявления клонов, полезными для проведения других видов и форм вырабатывающих антитела, способные связывать анализов, известных в настоящее время или тех, химеру что будут разработаны в дальнейшем Они также будут отнесены к настоящему изобретению Антитела, соответствующие настоящему изобретению, могут также быть политональными Выражение "специфически распознает и свяили, предпочтительно, регион-специфическими зывает" означает, что антитело распознает и свяполитональными антителами зывает полипептид химерного рецептора, но практически не распознает и не связывает не Антитела против химеры рецептора CD4, соотносящиеся кнему молекулы препарата, наприответствующие настоящему изобретению, можно мер, биологического препарата использовать для определения количества химерных рецепторов (количества клеток-носителей Выражение "лечебная клетка" обозначает химерных рецепторов) в организме Такие антитеклетку, трансформированную химерой рецептора ла очень удобны для использования в стандартCD4, соответствующей настоящему изобретению, ном иммунодиагностическом анализе, хорошо и благодаря этому способную распознавать и известном специалистам и включающим такие уничтожать ВИЧ-инфицированные клетки, предиммунеметрические приемы, или приемы сэндвичпочтительными лечебными клетками являются анализа, как прямой, обратный и одновременный клетки кроветворной системы сэндвич-анализ Антитела можно использовать в Выражение "внеклеточный" означает, что хотя любом количестве комбинаций Специалист сумебы часть молекулы выступает на поверхность ет это определить и без излишнего экспериментиклетки Термин "внутриклеточный" означает, что рования провести иммуноанализ приемлемой хотя бы часть молекулы находится в цитоплазме специфичности, чувствительности и точности лечебной клетки Термин "трансмембранный" означает, что хотя бы часть молекулы пронизывает К общеизвестным работам, в которых изложеплазматическую мембрану Под "внеклеточной ны общие принципы иммунологии, относятся Roitt, частью", "внутриклеточной частью" и "трансмемEssential Immunology, 6th ed , Blackwell Scientific бранной частью" могут подразумеваться и бокоPublications, Publisher, Oxford (1988), Kimball, Introвые аминокислотные последовательности, котоduction to Immunology, 2d ed , Macmillan Publishing рые заходят в прилегающие отделы клетки Co , Publisher, New York (1986), Roitt et al , Immunology, Gower Medical Publishing Ltd , Publisher, Слово "олигомеризовать" означает соединять London, (1985), Campbell, "Monoclonal Antibody с другими белками с целью получения димеров, Technology," в Burdon et al , eds , Laboratory Techтримеров, тетрамеров или олигомеров более выniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volсокого порядка Эти олигомеры могут быть гомоume 13, Elsevier, Publisher, Amsterdam (1984), или гетероолигомерами "Олигомеризующий учаKlein, Immunology The Science of Self-Nonself Disсток" - это участок молекулы, управляющий обраcrimination, John Wiley & Sons, Publisher, New York зованием комплекса (олигомера) (1982), и Kennett et al , eds , Monoclonal Antibodies, Слово "цитолитический" означает способный Hybndoma A New Dimension In Biological Analyses, уничтожать клетки (например, ВИЧPlenum Press, Publisher, New York (1980) инфицированные клетки) или способный уничтоПод "регистрацией" подразумевается устажать возбудителей инфекции (например, вирусы новление наличия или отсутствия вещества или иммунодефицита человека) определение количества вещества Таким обраПод "вирусом иммунодефицита" подразумезом, этот термин относится к использованию мавается ретровирус, который в форме дикого типа териалов, составов и способов, предлагаемых способен поражать клетки Т4 в организме хозяинастоящим изобретением для качественных и на-примата и характеризуется морфогенезом и количественных оценок морфологией, свойственными подсемейству лентивирусов Этот термин относится, без каких-либо Антитела и практически чистый антиген, предограничений, ко всем разновидностям вирусов лагаемые настоящим изобретением, идеально иммунодефицита человека и обезьян, втом числе подходят для оформления в набор Такой набор к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и к вирусам иммунодефицита может состоять из упаковки, поделенной на отсеобезьян SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, ки, в которые впритирку входят сосуды (флаконы, SIVman, SIVmand и SIVspz ампулы и т п ) с материалами для анализа Типы анализов, материалы для которых можВыражение "независимый от ГКГС" означает, но оформить в виде набора, многочисленны К что клеточный цитолитический ответ имеет место ним относятся, например, конкурентный и некони в отсутствие антигена ГКГС класса II на поверхкурентный типы анализа Типичными примерами ности клетки-мишени анализа, в котором можно использовать антитела, Выражение "функциональное производное, предложенные настоящим изобретением, служат способное проводить цитолитический сигнал" оборадиоиммуноанализ, иммуноферментный анализ, значает функциональное производное (см опретвердофазный иммуноферментный анализ и имделение, данное выше), способное осуществить мунометрический, или сэндвич-анализ по меньшей мере 40%, более предпочтительно 70% и наиболее предпочтительно по меньшей Под терминами "иммунометрический анализ" 17 45349 18 мере 90% биологической активности молекулы тые точки) или CD16TM совместно с вирусом, эксдикого типа Объекты, называемые в настоящем прессирующим CD4 у (штрихи) или CD4 £ документе "функциональными производными,(непрерывная линия) Редкие точки соответствуют способными проводить цитолитический сигнал", клеткам, зараженным только CD4 £ и окрашенным могут действовать путем непосредственной пода3G8 (Fleit et al , Proc Natl Acad Sci USA 7 3275 чи лечебной клетке сигнала об уничтожении свя3279 (1982)) (антитела MAb к CD16) занной с рецептором клетки или агента (напр , как Фиг 3 показывает поверхностную экспрессию в случае внутриклеточной части химерного рецепCD16TM после заражения вирусом, экспрессируютора) или косвенно - тогда они способствуют олищим CD16TM, совместно с вирусами, экспрессигомеризации с белками лечебной клетки, проворующими следующие химеры £ CD4 £ (жирная дящими цитолитический сигнал (как в случае линия), CD4 £ C11G (непрерывная линия), CD4 £ трансмембранного домена) Эффективность таких (штриховая линия), CD4 £ C11G/D15G (частые производных можно испытать при помощи опиточки), и после заражения только CD16TM (редкие санных в настоящем документе способов лабораточки) Клетки были выдержаны с антителами к торного анализа CD16 MAb 3G8) и козьими антителами Fab'2 к мышиному IgG, конъюгированными с фикоэритрином Под выражением "функциональное производУровень экспрессии химер £ был практически ное, связывающее оболочку ВИЧ" подразумеваетидентичным для различных мутантов, а совместся функциональное производное (см определеное заражение клеток вирусами, эспрессирующиние, данное выше), способное связать любой ми CD16TM И химеры £, не повлияло в значительбелок оболочки ВИЧ Функциональные производной степени на экспрессию химер ные могут быть идентифицированы при помощи описанных в настоящем документе способов лаФиг 4A-D показывает повышение внутриклебораторного анализа точной концентрации свободных ионов кальция ПРИМЕНЕНИЕ В ЛЕЧЕБНЫХ ЦЕЛЯХ после перекрестного связывания мутантных химер Трансформированные клетки, предложенные £ в Т-клеточной линии Клетки Jurkat Еб (Weiss et настоящим изобретением, используются в лечебal , J Immunol 133 123 - 128 (1984)) были зараженых целях при заражении вирусом иммунодефины рекомбинантными вирусами осповакцины и цита К способам применения таких трансформипроанализированы методом проточной цитометрованных клеток, практикуемым в настоящее рии Результаты, отображенные на фигуре, отновремя, относятся адоптивная терапия или терапия сятся только к популяции CD4+, прошедшей диспереносом клеток Эти способы позволяют возкриминацию, т е к тем клеткам, которые вращать трансформированные клетки иммунной экспрессируют соответствующий химерный белок системы в кровь Rosenberg, Sci Am 2 (May 1990), Среднее отношение фиолетовой к голубой (красиRosenberg et al ,N Engl J Med 323(9)570(1990) тель Индо-1) флуоресценции отражает внутриклеточную концентрацию свободного кальция в попуФармацевтические составы, соответствующие ляции в целом, а процентная доля ответивших настоящему изобретению, можно вводить любому клеток показывает у какой части клеток это отноживотному, которому могут принести пользу сошение превышает заранее заданный порог (устаединения, предложенные настоящим изобретениновленный таким образом, что 10% необработанем На первом месте среди таких животных стоит ных клеток дают положительный результат) человек, хотя возможность применения настоящего изобретения не ограничивается человеком Фиг 4А и 4В представляют экспрессию в клетПодробное описание ках Jurkat белков CD4 £ (непрерывная линия) или Сначала дадим пояснение к фигурам CD16£ (штриховая линия), обработанных антитеКраткое описание иллюстративных материалами MAb Leu3a к CD4 (конъюгат с фикоэритрилов ном), с последующим перекрестным связыванием с козьими антителами к мышиному IgG ПунктирФиг 1А - изображение аминокислотной поной линией обозначен ответ незараженных клеток следовательности в окрестности участка слияния на MAb ОКТЗ к CD3 На фиг 4С и 4D показана между CD4 (остатки 1 - 369) и различными рецепэкспрессия в клетках Jurkat белков CD4 £ D15G торными цепями (последовательности № 38 - 41) (непрерывная линия), CD4 £C11G/D15G (штрихи) Подчеркнутая последовательность - это место или CD4 £ C11G (точки) в результате обработки и расположения аминокислот, закодированных учаанализа, описанных в пояснении к фиг 4А и 4В стком BamHI и участвующих в слиянии Начало трансмембранного домена отмечено вертикальФиг 5А-С показывает, что рецепторы CD4 £, ной чертой Последовательность п на аминоконце CD4 п и CD4 у позволяют цитолитическим Тидентична последовательности £, но отличается лимфоцитам уничтожать мишени, экспрессируюот нее на карбоксильном конце (Jin et al , Proc щиедр120/41 ВИЧ-1 Фиг 5А закрашенные кружки Natl Acad Sci USA 87 3319 - 3323 (1990)) - цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD4 £ и выдержанные с клетками HeLa, экспресФиг 1В представляет данные проточного цисирующими др120/41, незакрашенные кружки тометрического анализа поверхностной экспресцитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие сии CD4, CD4 С CD4 у и CD4 г) в клетках CV1 CD4 £ и выдержанные с незараженными клетками Клетки были заражены вирусом, экспрессируюHeLa, закрашенные квадраты - незараженные цищим химеры CD4 или CD16PI, выдержаны 9 часов толитические Т-лимфоциты, выдержанные с клетпри 37°С и окрашены антителами MAb Leu3A к ками HeLa, экспрессирующими др120/41, незаCD4, конъюгированными с фикоэритрином крашенные квадраты незараженные Фиг 2 представляет поверхностную экспресцитолитические Т-лимфоциты, выдержанные с сию CD16TM после заражения только CD16TM (час 19 45349 20 незараженными клетками HeLa Фиг 5В закраклеток Jurkat на антитела MAb OKT3 к CD3, зашенные кружки - цитолитические Т-лимфоциты, крашенные треугольники - ответ CD16£ на антиэкспрессирующие CD4 п, и выдержанные с клеттела MAb 3G8 к CD16 с перекрестным связываниками HeLa, экспрессирующими др120/41, незаем в мутантных клетках REX33A TCR, крашенные кружки -цитолитические Т-лимфоциты, незакрашенные квадраты - ответ на перекрестное экспрессирующие CD4 у и выдержанные с клеткасвязывание CD16£ в мутантной линии JRT3 ТЗ 5 ми HeLa, экспрессирующими др120/41, незакраклеток Jurkat TCR , незакрашенные треугольники шенные квадраты - цитолитические Т-лимфоциты, ответ на перекрестное связывание CD16 £ в клетэкспрессирующие химеру CD4 £ с двойной мутаках Jurkat, крестики - ответ на нехимерные CD16 в цией С11G/D15G и выдержанные с клетками клетках Jurkat, точки -ответ на нехимерные CD16 в HeLa, экспрессирующими др120/41 Фиг 5С проклеточной линии REX33ATCR точный цитометрическии анализ экспрессии CD4 в Фиг 8А-В иллюстрирует делеционный анализ цитолитических Т-лимфоцитах, упомянутых в свяцитолитического потенциала Фиг 8А иллюстризи с фиг 5В Для коррекции отношений мишеньрует расположение конечных точек делеции £ эффектор, процентные доли клеток, экспрессиЗдесь, как и везде, мутации £ представлены форрующих химеру CD4, определяли путем вычитамулой исходный остаток-место-мутантный остания отрицательной (незараженной) популяции, ток, так что D66*, например, обозначает замещепредставленной в соответствующем масштабе, ние Asp-66 стоп-кодоном На фиг 8В при помощи наложения гистограмм, для сравнепредставлены результаты оценки цитолиза для ния на этой фигуре незараженным клеткам понеделетированного CD16£ и характерных делеставлен в соответствие произвольный порог, ции £ Гибридомные клетки, экспрессирующие на дающий приблизительно те же доли положительповерхности антитела к CD16, были нагружены ных ответов в других популяциях, что и вычитание 51 сг и выдержаны с различным (возрастающим) гистограмм количеством цитолитических Т-лимфоцитов человека, зараженных рекомбинантами осповакцины, Фиг 6А-В иллюстрируют специфичность циэкспрессирующими химеры CD16 £ Процентная толиза, управляемого CD4 Фиг 6А закрашенные доля высвобожденного 51 a вычерчена как функкружки - цитолитические Т-лимфоциты, экспресция отношения эффектора (цитолитических лимсирующие CD4 £ и выдержанные с клетками HeLa, фоцитов) к мишени (гибридомным клеткам) Заэкспрессирующими CD16PI, незакрашенные кружкрашенные кружки - цитолиз, опосредствованный ки - цитолитические Т-лимфоциты, экспрессируюклетками, экспрессирующими CD16 £ (среднещие CD4 и выдержанные с клетками HeLa, экскратный прирост 18,7), закрашенные квадраты прессирующими др120, закрашенные квадраты цитолиз, опосредствованный клетками, экспресцитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие сирующими CD16 £ Asp66* (среднекратный приCD16 £ и выдержанные с клетками HeLa, экспресрост 940,2), Незакрашенные квадраты - цитолиз, сирующими др120/41, незакрашенные квадраты опосредствованный клетками, экспрессирующими цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD16£Glu60* (среднекратный прирост 16,0), незаCD16PI и выдержанные с клетками HeLa, экспрескрашенные кружки - цитолиз, опосредствованный сирующими др120/41 Фиг 6В закрашенные кружклетками, экспрессирующими CD16£Tyr51* (средки - цитолитические Т-лимфоциты, экспрессируюнекратный прирост 17,4), закрашенные треугольщие CD4 £ и выдержанные с клетками Raji (ГКГС, ники - цитолиз, опосредствованный клетками, экскласс ІҐ), незакрашенные кружки - незараженные прессирующими CD16 £Phe34* (среднекратный цитолитические Т-лимфоциты, выдержанные с прирост 17,8), незакрашенные треугольники - циклетками RJ2 2 5 (Raji - мутанты, класс II ГКГС), толиз, опосредствованный клетками, экспрессизакрашенные квадраты - незараженные цитолитирующими нехимерный CD16 (среднекратный прические Т-лимфоциты, выдержанные с клетками рост 591) Хотя в этом эксперименте экспрессия Raji (класс 11 + ГКГС), незакрашенные квадраты CD16 £Asp66* не соответствовала экспрессии цитолитические Т-лимфоциты, экспрессирующие других слитых белков, цитолиз, опосредствованCD4 £ и выдержанные с клетками RJ2 2 5 (класс II ный клетками, экспрессирующими CD16 £ на эквиГКГС) Шкала на ординате растянута валентных уровнях, в том же эксперименте дал результаты, практически идентичные тем, которые Фиг 7А-В - характеристика химерного рецепбыли получены для клеток, экспрессирующих тора CD16^ Фиг 7а - схематическое изображение CD16^Asp66* слитого белка CD16 Внеклеточная часть фосфатид ил инозит-связанной формы мономерного CD16 была присоединена к димерному £ сразу за Фиг 9A-D показывает, что элиминация потентрансмембранным доменом Последовательность циала трансмембранных взаимодействий открыаминокислот на месте слияния приведена внизу вает короткий сегмент £, способный опосредство(последовательности № 42, 43) Фиг 7В предвать цитолиз Фиг 9А - это схематическое ставляет проточный цитометрическии анализ моизображение мономерных двухчастных и трехчабилизации кальция после перекрестного связывастных химер Сверху изображена конструкция ния химеры CD16 в клеточных линиях, CD16 £, усеченная на остатке 65, в которой отсутположительных или отрицательных в отношении ствуют трансмембранные остатки Cys и Asp Ниже Т-клеточных рецепторов Показано среднее отноизображены конструкции CD16CD5^ и шение фиолетовой к голубой флуоресценции (меCD16CD7£ и соответствующие контрольные конра относительной концентрации ионов кальция) в струкции Пептидные последовательности внутрипопуляциях клеток, обработанных антителами в клеточных доменов приведены внизу (последовамомент времени 0 Закрашенные квадраты - ответ тельности № 45 - 47) Фиг 9В иллюстрирует 21 45349 22 цитолитическую активность делеционных мутаций - клетки, экспрессирующие CD16 7 £(48 - 65) мономерных химер Цитолитическая активность (среднекратныи прирост D-31,3, E-179), закраклеток, экспрессирующих CD16 £ (закрашенные шенные треугольники - CD16 7 £(48 - 65)Asn48Ser кружки, среднекратныи прирост 495), сравнива(среднекратныи прирост D - 22,4, Е - 209), незалась с активностью клеток, экспрессирующих крашенные квадраты - CD16 7£(48 - 65)l_eu50Ser CD16 £Asp66* (закрашенные квадраты, средне(среднекратныи прирост D - 25,0, Е - 142), незакратный прирост 527), или мутантов CD16 £ крашенные треугольники - CD16 7 £(48 Cys11Gly/Asp15Gly/Asp66* (незакрашенные квад65)Tyr51Phe (среднекратныи прирост D - 32,3, Е раты, среднекратныи прирост 338) и 294) CD16Cys11Gly/Asp15Gly/Gly60* (закрашенные На фиг 11А-В дан сравнительный анализ треугольники, среднекратныи прирост 259), Фиг структуры внутренних повторов £ и сравнение их 9С иллюстрирует цитолитическую активность, способности обеспечивать цитолиз Фиг 11А-это опосредствованную трехчастными слитыми белсхематическое изображение химер, образованных ками Закрашенные треугольники CD16 £Asp66*, путем деления внутриклеточного домена £ на тренезакрашенные квадраты - CD16 5£(48 - 65), зати и присоединения их к трансмембранному домекрашенные квадраты - CD16 7 £(48 - 65), незакрану химеры CD16 7 Последовательности внутришенные треугольники - CD16 7£(48 - 59), незаклеточных доменов приведены ниже крашенные кружки - CD16 5, закрашенные кружки (последовательности № 48 - 50), общие остатки CD16 7 Фиг 9D иллюстрирует мобилизацию заключены в рамки, а родственные остатки отмекальция мутантными и трехчастными химерами в чены звездочками На фиг 11В проиллюстриромутантной клеточной линии Jurkat JRT3 ТЗ 5, отвана цитолитическая способность этих трех субрицательной в отношении Т-клеточных рецептодоменов £ Закрашенные кружки - клетки, ров Незакрашенные кружки - ответ клеток, эксзкспрессирующие CD16£ (среднекратныи прирост прессирующих димерные CD16 £Asp66*, 476), закрашенные квадраты - клетки, зкспрессизакрашенные квадраты - ответ клеток, экспрессирующие CD16 7 £(33 - 65) (среднекратныи прирост рующих CD16£ Cys11Gly/Asp15Gly/Asp66*, неза68), незакрашенные квадраты - CD16 7 £(71 - 104) крашенные квадраты - ответ клеток, экспресси(среднекратныи прирост 114), закрашенные трерующих CD16Cys11 Gly/Asp15Gly/Glu60*, угольники - CD16 7£(104 - 138) (среднекратныи закрашенные треугольники - ответ клеток, эксприрост 104) прессирующих CD16 7£(48 - 65), незакрашенные Фиг 12 - схематическое изображение химер треугольники - CD16 £(48 - 59) CD16 FcRyll Фиг 10A-F иллюстрирует вклад отдельных Фиг 13А-В иллюстрируют мобилизацию кальаминокислот в активность участка из 18 остатков, ция после перекрестного связывания химер проводящего цитолитический сигнал Фиг 10А и CD4 FcRyll и CD16 FcRyll Фиг 13А представляет 10В иллюстрируют цитолитическую активность, а соотношение фиолетовой и голубой флуоресценфиг ЮС - мобилизацию ионов кальция, опосредции клеток, нагруженных чувствительным к кальствованную химерами с точечными мутациями в цию красителем Индо-1, в виде функции от вреокрестности карбоксиконечного тирозина (Y62) мени, прошедшего с момента перекрестного Фиг 10А и 10В представляют данные о клетках, связывания внеклеточного домена CD16 с антитеэкспрессирующих малые и большие количества, лами На фиг 13В приведены результаты подобсоответственно, слитых белков CD16£ На обоих ного анализа роста отношения фиолетовой флуофигурах использованы одинаковые обозначения и ресценции к голубой для клеток, несущих химеры буквенные коды, помещенные справа ЗакрашенCD4 FcRyll, после перекрестного связывания с ные кружки - клетки, экспрессирующие CD16 £ антителами (среднекратныи прирост А - 21, В - 376), закраФиг 14А-В иллюстрируют анализ цитолитичешенные квадраты -клетки, экспрессирующие ских свойств химер CD4 FcRyll и CD16 FcRyll На CD16 7 £(48 - 65) (среднекратныи прирост А - 31, фиг 14А показана процентная доля 51Сг, высвоВ - 82), незакрашенные квадраты - CD16 7£(48 божденного гибридомными противо-СО16 клетка65)Glu60Gln (среднекратныи прирост А - 33, В ми (мишенями) при их взаимодействии с возрас92), крестики - CD16 7 £(48 - 65)Asp63Asn (среднетающим количеством цитотоксических Ткратный прирост А - 30, В - 74), закрашенные трелимфоцитов, экспрессирующих химеры угольники - CD16 7£(48 - 65)Tyr62Phe (среднеCD16 FcRyll (эффекторов) На фиг 14В проиллюкратный прирост А - 24, В - 88), незакрашенные стрирован аналогичный анализ цитотоксичности, кружки - CD16 7 £(48 - 65)Glu61Gln (среднекратныи опосредствованной химерами CD4 FcRyll, по отприрост А - 20, В - 62), незакрашенные треугольношению к клеткам-мишеням, экспрессирующим ники - CD16 7£(48 - 65)Tyr62Ser (среднекратныи гликопротеины оболочки ВИЧ прирост В - 64) Фиг 10D и 10Е иллюстрируют цитолитическую активность, а фиг 10F - мобилиНа фиг 15А-Е показана идентификация остатзацию ионов кальция, опосредствованную химеков в хвосте A FcRyll, которые имеют большое рами с точечными мутациями в окрестности амизначение для цитолиза Фиг 15А - это схематиченоконечного тирозина (Y51) На графиках ское изображение делеционных конструкций Фиг цитолитической активности и мобилизации каль15В и 15С иллюстрируют мобилизацию кальция и ция использованы одинаковые обозначения, расцитолиз, опосредствованные вариантами химеры шифрованные справа Закрашенные кружки CD16 FcRyllA с делециями на карбоксильном конклетки, экспрессирующие CD16£ (среднекратныи це Фиг 15D и 15Е иллюстрируют мобилизацию прирост D - 21,2, Е - 672), закрашенные квадраты кальция и цитолиз, опосредствованные трехчаст 23 45349 24 ными химерами, у которых постепенно укорачиПеред использованием в анализе цитотоксичновался аминоконец внутриклеточного хвоста сти клетки выращивали не менее 10 дней Клетки CD16 FcRyll A были заражены соответствующими рекомбинантными вирусами осповакцины, как описано в наФиг 16 (последовательность № 24) представстоящем документе для VPE16 Инфекцию осталяет последовательность аминокислот белка ревили развиваться в полной среде в течение 3 - 4 цептора СОЗ-дельта, в рамку заключен предпоччасов, после чего клетки отобрали путем центритительный участок для передачи цитолитического фугирования и снова взвесили в концентрации 1 х сигнала 107мл В каждую ячейку U-образного титрационноНа фиг 17 (последовательность № 25) предго микропланшета, содержащую ЮОмкл полной ставлена последовательность аминокислот белка среды, добавили по ЮОмкл и разбавили в 2 раза рецептора ТЗ-гамма, в рамку заключен предпочпоследовательными шагами Две ячейки для кажтительный участок для передачи цитолитического дого образца не содержали лимфоцитов, чтобы сигнала можно было измерить спонтанное высвобождение На фиг 18 (последовательность № 26) предхрома и суммарное поглощение хрома Клетки, ставлена аминокислотная последовательность служащие мишенями, сублинию S3 HeLa (HeLaбелка рецептора mb1, в рамку заключен предпочS3, Американская коллекция типовых культур) тительный для передачи цитолитического сигнала заразили vPE16 в 10-сантиметровых чашках, как участок описано выше 106 зараженных клеток отделили На фиг 19 (последовательность № 27) предпри помощи фосфатно-солевого буфера и 1мМ ставлена аминокислотная последовательность этилендиаминтетрауксусной кислоты, центрифубелка рецептора В29, в рамку заключен предпочгировали и взвесили в ЮОмкл натрия хромата тительный для передачи цитолитического сигнала (51Сг, 1мКи/мл в фосфатно-солевом буфере) на 1 участок час при 37°С, затем три раза промыли фосфатноНа фиг 20 дано схематическое изображение солевым буфером В каждую ячейку добавили химер CD4 Молекула А - CD4(D1 - D4) Ig CD7, ЮОмкл меченых клеток-мишеней Титрационный молекула В - CD4(D1, D2) Ig CD7, молекула С микропланшет вращали в течение 1 минуты при CD4 (D1 - D4) Ig CD7, молекула D - CD4 (D1, D2) 750 х g и в течение 4 часов выдерживали при Ig CD7 £ и молекула Е - CD4 £ Внеклеточный до37°С После этого клетки в каждой ячейке снова мен молекулы CD4 человека, соответствующий взвесили путем осторожного пипетирования, один аминокислотам 1 - 394 предшественника, был сообразец отобрали, чтобы определить общее колиединен через сайт BamHI к центральному домену чество клеток, и вращали планшет при 750 х g в и доменам СН2 и СНЗ IgGI человека, как описано течение минуты Порции (ЮОмкл) супернатанта ранее (Zettlmeissl et al , DNA Cell Biol 9 347 отбирали и анализировали в счетчике гамма(1990)), стой лишь разницей, что для экспрессии в сцинтилляций К отношению эффектор мишень рекомбинантных вирусах осповакцины использобыла сделана поправка на процент зараженных валась кДНК последовательностей Ig человека клеток, определенный при помощи проточной циДвухдоменные версии химер CD4 получили путем тометрии осуществления вставки "переходника" BamHI в уникальный сайт Nhel (соответствующий аминоФиг 22 иллюстрирует репликацию ВИЧ-1 в кислоте 200) кДНК предшественника CD4 Послетрансфицированных клеточных линиях Клеточдовательности связывания с мембраной состояли ные линии, стабильно экспрессирующие CD4 дииз 22 остатков из первого экзона IgGI человека, кого типа и различные рекомбинантные химеры, связанного с мембраной, за которыми следовали были получены из сублинии линии 293 почечных остатки 146 - 203 CD7 Аминокислоты 55 - 163 ^ клеток зародыша человека Штамм культуры NIB служили в четырехчастных конструкциях (С и D) ВИЧ-1 был приготовлен с титром инфицирующих инициирующим участком В четырехчастных кончастиц «106/мл, измеренным при помощи титроваструкциях, содержащих цепь £, внутриклеточная ния в конечной точке с использованием Тэкспрессия £ регистрировалась при помощи антиклеточной линии С8166 в качестве индикатора тел к внутриклеточному домену, имеющихся в Заражение проводилось с множественностью запродаже (Coulter) ражения около 1 в течение 8 - 1 2 часов при 37°С На фиг 21 проиллюстрирован лизис клетокмишеней, экспрессирующих гликопротеин оболочки ВИЧ-1, опосредствованный Т-клеточным клоном WH3, экспрессирующим различные химеры CD4 в качестве эффекторных молекул Для испытания цитотоксичности линию WH3 Т-клеток человека с рестрикциями CD8+ CD4 HLA B44 выдержали в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков (IMDM), дополненной 10% человеческой сывороткой, как описано выше Клетки подвергли стимуляции при помощи гаммаоблученных (3000 рад) одноядерных клетокносителей В44 и фитогемагглютинина в концентрации 1мкг/мл Через день фитогемагглютинин развели до 0,5мкг/мл путем добавления свежей среды, через 3 дня среду полностью заменили На следующий день клетки трижды промыли фосфатно-солевым буфером, обработали трипсином, пересадили в другие чашки, а супернатант культуры проверили на титр р24 (результат датировали днем 0) После этого с промежутками в 3 4 дня отбирали супернатанты клеточной культуры для анализа на р24 Клеткам давали свежую среду, содержащую гигромицин В в концентрации 100мкг/мл Анализ супернатантов культуры проводили с использованием серийного набора для регистрации антигена р24 ВИЧ-1, основанного на твердофазном иммуноферментном анализе (Coulter), в соответствии с инструкцией изготовителя Представлены результаты двух независимых экспериментов одинаковой длительности На фиг 23 приведены последовательности 25 45349 26 нуклеиновых (последовательность № 28) и аминовысокий уровень экспрессии детерминант антител кислот (последовательность № 29) для доменов для клеток, дополнительно зараженных плазмиD1 - D4 CD4 (CD4 Ват) дами, кодирующими кДНК легкой цепи, и умеренНа фиг 24 приведены последовательности ную экспрессию детерминант антител для клеток, нуклеиновых (последовательность № 30) и аминов которых не было плазмид, экспрессирующих кислот (последовательность № 31) для доменов легкую цепь D1 - D2 CD4 (CD4 Nhe) Подобные химеры, состоящие из IgGI человеНа фиг 25 приведены последовательности ка, слитого с п или у (см ниже) или с любым друнуклеиновых (последовательность № 32) и аминогим участком белка Т-клеточного рецептора или кислот (последовательность № 33) центрального Fc-рецептора, способным проводить сигнал, могут домена и доменов СН2 и СНЗ lgGI(lgh23 Bam) чебыть сконструированы в общем как описано выше, ловека с использованием стандартных методов молекулярной биологии На фиг 26 приведены последовательности нуклеиновых (последовательность № 34) и аминоЧтобы получить единый блок транскрипции, кислот (последовательность № 35) для трансмемкоторый обеспечивал бы экспрессию и тяжелой, и бранного домена CD7 (ТМ7 Bam Mlu) легкой цепей из одного промотора, создали плазНа фиг 27 приведены последовательности миду, кодирующую двухцистронную мРНК, из понуклеиновых (последовательность № 36) и аминоследовательностей, кодирующих тяжелую и легкислот (последовательность № 37) для внутриклекую цепи, и нетранслированного 5'-конечного точного домена дзета (Zeta Mlu Not) участка мРНК, кодирующей белок в 78 килодальтонов, регулируемый глюкозой, известный также На фиг 28 приведены последовательность как grp78, или BiP Последовательности grp78 быДНК (последовательность № 51) и первичная поли получены при помощи цепной полимеразной следовательность аминокислот (последовательреакции с геномной ДНК человека и с затравками, ность № 52) для синтетической альфа-спирали имеющими такие последовательности Пример 1 Конструирование химер IgGI и рецептора чеCGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG ССА ловека AGA CAG САС (последовательность № 9) и Последовательности тяжелой цепи IgGI челоCGC GTT GAG GAG CAG CCA GTT GGG CAG века получили путем присоединения последоваCAG CAG (последовательность № 10) тельности домена СНЗ к фрагменту кДНК, полуна концах 5' и 3', соответственно Цепные поченному из конца 3' трансмембранной формы лимеразные реакции с этими олигонуклеотидами мРНК антител Фрагмент конца 3' был получен проводились в присутствии 10% диметилсульфокпосредством цепной полимеразной реакции с иссида Фрагмент, полученный в результате цепной пользованием в качестве субстрата библиотеки полимеразной реакции, переварили при помощи кДНК миндалин и олигонуклеотидов, имеющих Notl и Hindi и вставили между сайтами Notl и Hpal такие последовательности вслед за последовательностями, кодирующими IgGI человека Затем, вслед за лидерной последоCGC GGG GTG ACC GTG ССС ТСС AGC AGC вательностью grp78, используя сайт Hindi и еще TTG GGC (последовательность № 7) и один сайт вектора, вставили последовательности, CGC GGG GAT CCG TCG ТСС AGA GCC CGT кодирующие кДНК легкой цепи каппа IgG человеCCA GCT ССС CGT ССТ GGG ССТ СА (последока Полученная в результате этих процедур эксвательность № 8), прессионная плазмида состояла из полусинтетикоторые соответствовали концам 5' и 3' нужческого гена тяжелой цепи, за которыми ных фрагментов ДНК, соответственно Олигонукследовали лидерные последовательности grp78, леотид 5' комплементарен одному из сайтов дозатем последовательности кДНК легкой цепи капмена CHI IgGI человека, а олигонуклеотид 3' па, затем сигналы полиаденилирования, полученкомплементарен сайту, следующему в направленые из фрагмента ДНК SV40 Трансфекция клеток нии 5' сразу за последовательностями, кодируюCOS такими плазмидами дала заметное усиление щими домен, пересекающий мембрану Продукт экспрессии детерминант тяжелой цепи по сравнецепной полимеразной реакции переварили при нию с трансфекцией плазмидами, кодирующими помощи BstXI и BamHI и вшили между сайтами детерминанты только тяжелой цепи BstXI и BamHI полусинтетического гена антитела IgGI, имеющего переменные и постоянные участДля получения двухцистронного гена, вклюки После осуществления вставки фрагмента мечающего в себя химеру тяжелая цепь/рецептор и жду BstXI и BamHI амплифицированные части легкую цепь, передние последовательности тяжеконструкции были заменены до сайта Smal в долой цепи можно заменить любым геном химеры мене СНЗ путем обмена рестрикционными фрагтяжелая цепь/рецептор из описанных в настоящем ментами, так что из продуктов цепной полимераздокументе ной реакции остался только участок между сайтом Пример II Smal и олигонуклеотидом 3' Конструирование химер рецептора CD4 Чтобы получить химерный рецептор IgGI чеКДНК £ человека (Weissman et al , Proc Natl ловека, ген тяжелой цепи, заканчивающийся на Acad Sci USA 8 9709 - 9713 (1988b)) и у (Kuster et сайте BamHI, присоединили к сайту BamHI химеal , J Bid Chem 265 6448 - 6452 (1990)) были ры £, описанной ниже, так что последовательности выделены при помощи цепной полимеразной реантитела оказались во внеклеточной части Проакции из библиотек, приготовленных из опухолеточная цитометрия клеток COS, трансфицированвой клеточной линии НРБ-ALL (Aruffo et al , Proc ных плазмидами, кодирующими химеру, показала Natl Acad Sci USA 84 8573 - 8577 (1987b)) и из 27 45349 28 естественных клеток-киллеров человека, а кДНК п, нативный CD4 не усиливал поверхностную экс(Jin etal , Proc Natl Acad Sci USA 87 3319-3323 прессию CD16TM (1990)) была выделена из библиотеки мышиных Пример IV тимоцитов КДНК £, п и у присоединяли к внеклеАспарагиновые мутанты £ не соединяются с точному домену перестроенной формы CD4, в Fc-рецептором которой сайт BamHI располагался непосредственДля получения химер, которые не соединяютно перед доменом, пересекающим мембрану ся с существующим антигеном, или рецептором (Aruffo et al , Proc Natl Acad Sci USA 84 8573 Fc, были приготовлены мутантные слитые белки £, 8577 (1987b)), Zettlmeissl et al , DNA Cell Biol 347 в которых отсутствовал либо внутримембранный 353 (1990)), внеклеточный домен был присоедиостаток Asp, либо внутримембранный остаток Cys, нен к сайту BamHI, в естественных условиях раслибо оба эти остатка Проточная цитометрия поположенному в кДНК ( и г | В подобной позиции - на казала, что интенсивность экспрессии на поверхнесколько остатков впереди домена, пересекаюности клеток для различных мутантных химер защего мембрану (последовательности №№ 1, 3, 4, метно не отличалась от экспрессии свободного от и 6) Для получения белков, слитых с у, сайт мутаций предшественника, а эксперименты по BamHI вставляли в последовательность приблииммунопреципитации показали, что общая эксзительно в том же месте (Фиг 1, последовательпрессия химер сходна Как и ожидалось, мутантности № 2 и № 5) Слитые гены вводили в эксные химеры, в которых отсутствовал трансмемпрессионные плазмиды вируса осповакцины с бранный цистеиновый остаток, не образовывали геном gpt E соїі в качестве селектируемого маркедимеров с дисульфидными связями Две мутантра и вставляли в геном штамма WR осповакцины ные химеры, в которых отсутствовал Asp, были путем гомологичной рекомбинации и селекции по неспособны обеспечить поверхностную экспресросту в микофенольной кислоте (Falkner et al , J сию CD16TM, а мономерные химеры без Cys, но с Virol 62 1849 - 1854 (1988), Bayle et al , Gene Asp, допускали одновременную экспрессию 65 123 - 128 (1988)) Проточный цитометрический CD16TM, НО не такую эффективную, как родительанализ показал, что рекомбинанты осповакцины ский димер (фиг 3) вызывают обильную выработку слитых белков Пример V CD4 £ и CD4 у на поверхности клеток, а экспресМутантные рецепторы сохраняют способность сия CD4 п происходит значительно слабее (фиг вызывать кальциевый ответ 1В) Последнее наблюдение подкреплено недавЧтобы определить, приводит ли перекрестное ним сообщением о том, что трансфекция линии связывание слитых белков к накоплению свободмышиных гибридомных клеток плазмидами эксного кальция в клетке, которое происходит в слупрессии кДНК п дает гораздо менее сильную эксчае Т-клеточного антигенного рецептора, линию прессию, чем трансфекция сравнимыми плазмиклеток Т-клеточного лейкоза человека, Jurkat E6 дами экспрессии £ (Clayton et al, J Exp Med (АТСС Accessior Number TIB 152, American Type 172 1243 - 1253 (1990)) Иммунопреципитация клеCulture Collection (Американская коллекция типоток, зараженных рекомбинантами осповакцины, вых культур), Rockville, MD), заразили рекомбипоказала, что слитые белки образуют ковалентнантами осповакцины и измеряли относительную ные димеры, в отличие от антигена CD4 в естестконцентрацию кальция в цитоплазме после перевенном виде Были определены молекулярные крестного связывания внеклеточного домена с массы мономерных слитых белков CD4 £ и CD4 у антителами Клетки нагрузили чувствительным к и нативного CD4 63, 55 и 53 килодальтонов, сооткальцию красителем Индо-1 и провели проточный ветственно Большие массы слитых белков прицитометрический анализ (Grynkiewicz et al , J Biol близительно соответствуют большим длинам Chem 260 3340 - 3450 (1985), Rabmovitch et al , J внутриклеточной части, которая длиннее, чем у Immunol 137 952-961 (1986)) На фиг 4A-D преднативного CD4, на 75 (CD4 Q или на 5 (CD4 у) осставлены результаты измерений переноса кальтатков ция в клетках, зараженных CD4 £ и мутантами £ Asp и Cys Перекрестное связывание химер с хоПример III рошей воспроизводимостью давало повышение Химеры CD4 могут соединяться с цепями друвнутриклеточной концентрации кальция CD4 п и гих рецепторов СО4утакже вызывали накопление кальция внутри Экспрессии рецептора FcyRIII (CD16TM) макзараженных клеток Клетки Jurkat слабо экспресрофагов/естественных клеток-киллеров человека сируют CD4 на поверхности, но перекрестное свяна поверхности трансфектантов способствует созывание нативного CD4 в присутствии CD16 £ или путствующая трансфекция мышиными (Kurosaki et в его отсутствие не влияет на уровень внутриклеal , Nature 342 805 - 807 (1989)) или человеческиточного кальция (фиг 4А-В) ми (Hibbs et al , Science 246 1608 -1611 (1989)) у, а Пример VI также £ человека (Lamer et al , Nature 342 803 - 805 Химеры CD4 £, п и у опосредствуют лизис ми(1989)) шеней, экспрессирующих др120/41 ВИЧ Этим сообщениям не противоречит то обстояЧтобы определить, способны ли химерные тельство, что экспрессия химер также способствурецепторы запускать эффекторные цитолитичеет экспрессии CD16TM при одновременной трансские программы, создали модель системы мифекции клеток-мишеней или одновременном шень эффектор, основанной на распознавании заражении рекомбинантными вирусами осповакрецептором CD4 комплекса др120/41 оболочки цины (фиг 2) Дзета более выраженно, чем гамма, ВИЧ Клетки HeLa заразили рекомбинантными способствовала поверхностной экспрессии вирусами осповакцины, экспрессирующими CD16TM В исследуемой клеточной линии (Фиг 2), а 29 45349 30 gp120/41 (Chakrabarti et al , Nature 30 535 - 537 Пример VII (1986), Earl et al, J Virol 64 2448 - 2451 (1990)), и Клетки-носители молекул II класса главного пометили 51Сг Меченые клетки выдержали с клеткомплекса гистосовместимости не подвергаются ками линии аллогенных (CD8+, CD4) цитотоксичевоздействию химер ских Т-лимфоцитов человека, зараженными реСчитается, что CD4 взаимодействует с непокомбинантами осповакцины, экспрессирующими лиморфной последовательностью, экспрессируехимеры CD4 £, CD4 п или CD4 у или химеру с мой антигеном II класса главного комплекса гистодвойной мутацией CD4Cys11Gly Asp15Gly На совместимости (ГКГС) (Gay et al , Nature 328 626 фиг 5А-С показано, что клетки HeLa, экспресси629 (1987), Sleckman et al , Nature 328 351 - 353 рующие др120/41, подверглись специфическому (1987)) Хотя специфическое взаимодействие мелизису со стороны цитотоксических Тжду CD4 и антигеном класса II в очищенном виде лимфоцитов, экспрессирующих химеры CD4 Неникогда не наблюдалось, при определенных услозараженные клетки HeLa не подверглись воздейвиях можно продемонстрировать склеивание клествию цитотоксических Т-лимфоцитов, вооруженток, экспрессирующих CD4, с клетками, экспресных химерами CD4, а клетки HeLa, сирующими молекулы класса II (Doyle et al , Nature экспрессирующие др120/41, не были распознаны 330 256 - 259 (1987), Clayton et al , J Exp Med незараженными цитотоксическими Т172 1243 - 1253 (1990), Lamarre et al , Science 245 743 - 746 (1989)) Затем проверили, возможно лимфоцитами Чтобы сравнить эффективность ли уничтожение клеток-носителей молекул класса действия различных химер, к отношениям эффекII На фиг 6В видно, что CD4 £ не осуществляет тор мишень были сделаны поправки на долю циспецифического лизиса клеток В-клеточной линии тотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих Raji, в изобилии экспрессирующих антиген класса химеры CD4, и на долю клеток HeLa, экспрессиII Хотя наблюдается умеренный лизис (« 5%), рующих др120/41, определенные при помощи проRJ2 2 5 - мутант Raji, отрицательный по классу II точной цитометрии На фиг 5С проиллюстрирован (Accolla, J Exp Med 157 1053 - 1058 (1983)), цитометрический анализ экспрессии CD4 цитотокпроявляет подобную восприимчивость, как и клетсическими Т-лимфоцитами, использованными в ки Raji, выдержанные с незараженными Тэксперименте по цитолизу, проиллюстрированном клетками на фиг 5А и 5В Хотя средняя плотность поверхностной CD4 £ значительно превышала среднюю плотность поверхностной CD4 п, цитолитическая активность клеток, экспрессирующих эти формы, была одинаковой С учетом поправки на долю мишеней, экспрессирующих др120, эффективность цитолиза, опосредствованного белками CD4 £ и CD4 п. сравнима с лучшими результатами, отмеченными для пар мишень эффектор со специфическим участием Т-клеточного рецептора (среднее отношение эффектор мишень для 50% высвобождения Т-клетками, экспрессирующими CD4 £, составило 1,9 ± 0,99, п=10) Слитый белок CD4 у был менее активным, как и слитый белок CD4 £, в котором отсутствовали трансмембранные остатки Cys и Asp Однако, в обоих этих случаях наблюдался достаточно эффективный цитолиз (Фиг 5В - 5С) Для исключения возможности того, что заражение осповакциной способствует ложному распознаванию мишеней цитотоксическими Тлимфоцитами, подобные цитолитические эксперименты были проведены в таких условиях клетки-мишени были заражены рекомбинантами осповакцины, экспрессирующими фосфатидилинозитсвязанную форму CD16 (CD16PI), и помечены 51Сг, а цитотоксические Т-лимфоциты были заражены контрольными рекомбинантами, экспрессирующими либо CD16PI, либо CD16 £ На фиг 6А показано, что Т-клетки, экспрессирующие химеры без CD4, не распознают нативные клетки HeLa или клетки HeLa, экспрессирующие др120/41, и что Тклетки, экспрессирующие химеры CD4, не распознают клетки HeLa, экспрессирующие другие поверхностные белки, закодированные в вирусах осповакцины Кроме того, цитотоксические Тлимфоциты, экспрессирующие нехимерные CD4, не осуществляют в значительной степени лизис клеток HeLa, экспрессирующих др120/41 (фиг 6А) Пример VIII Требования к структуре цепи дзета Тклеточного антигена/Рс-рецептора, вызывающей цитолиз Хотя химеры CD4 и £ сообщают цитотоксическим Т-лимфоцитам способность убивать клеткимишени, экспрессирующие др120 ВИЧ, нужно было найти альтернативу CD4, чтобы недвусмысленно сравнить свойства химер дзета, вводимых в Т-клеточные линии человека Такие линии могут экспрессировать CD4, затрудняя точное определение соотношения между характером или степенью мобилизации кальция и цитотоксическим потенциалом различных химер Поэтому были созданы химеры из £ и CD16, в которых внеклеточный домен CD16 присоединяется к трансмембранной и внутриклеточной последовательностям £ (фиг 7А) Слитые гены вводились в экспрессионную плазмиду вируса осповакцины, снабженную геном gpt E соїі в качестве селектируемого маркера, и вставлялись в геном штамма WR осповакцины путем гомологичной рекомбинации и селекции по росту в микофенольной кислоте (Falkner and Moss, J Virol 2 1849 (1988), Boyle and Coupar, Gene 65 123 (1988)) Т-клеточные линии были заражены рекомбинантами осповакцины и после перекрестного связывания внеклеточных доменов с антителами была измерена относительная концентрация свободных ионов кальция в цитоплазме Клетки, меченные красителем Индо-1, подвергли и спектрофлуориметрии (всю популяцию), и проточной цитометрии (отдельные клетки) (Grynkiewicz et al , J Biol Chem 260 3440 (1985)), Rabmovitch et al , J Immunol 137 952(1986)) На фиг 7В проиллюстрирован анализ данных, полученных для линии Jurkat клеток Т-клеточного лейкоза человека, зараженных рекомбинантами осповакцины, экспрес 31 45349 32 сирующими слитый белок CD16£ Перекрестное ли вплоть до трансмембранного "якоря", состоясвязывание химер с хорошей воспроизводимощего из трех остатков (фиг 8В) стью повышало внутриклеточную концентрацию Поскольку £ - это димер с дисульфидной свякальция, тогда как аналогичная обработка клеток, зью, одна из причин сохранения цитолитической экспрессирующих нехимерные CD16, не давала активности состоит в том, что эндогенные £ обраэффекта или давала незначительный эффект зовывали гетеродимеры с урезанными последоваКогда химера экспрессировалась в мутантных тельностями £, тем самым восстанавливая их акклеточных линиях, в которых отсутствовал антитивность Для проверки этого предположения генный рецептор, например, в REX33A (Breitmeyer остатки 11 и 15 в последовательности £ (Asp и et al , J Immunol 138 726 (1987), Sancho et al , J Cys, соответственно) заменили на Gly Biol Chem 264 20760 (1989)) или в Jurkat (Cys11Gly/Asp15Gly) и провели иммунопреципитаJRT3T3 5(Weissetal , J Immunol 135 123(1984)), цию следующим образом Приблизительно 2 х 106 наблюдался сильный ответ на перекрестное свяклеток CV1 инфицировали в течение одного часа зывание антителами CD16 Подобные результаты в бессывороточной среде Игла, модифицированбыли получены для мутантной линии REX20A ной по способу Дульбекко (DME), рекомбинантами (Breitmeyer et al , там же (1987), Blumberg et al , J осповакцины с множественностью заражения не Biol Chem 26514036 (1990)) и для мутантной лименее десяти Через шесть - восемь часов после нии клеток Jurkat, отрицательной по CD3/Ti, полузаражения клетки отобрали из чашек фосфатноченной в нашей лаборатории Заражение рекомсолевым буфером/1 мМ этилендиаминтетрауксусбинантами, экспрессирующими CD16 £, не ной кислотой и пометили их поверхность 1 5 J восстанавливает ответ на антитела против CD3, 0,2мКи на 2 х 106 клеток по способу Кларка и следовательно, слитый белок действует не за Эйнфельда (Clark, Emfeld) с использованием лаксчет спасения внутриклеточных цепей комплекса топероксидазы и Н2О2 (Leukocyte Typing II, рр 155 CD3 167, Spnnger-Verlag, NY, 1986) Меченые клетки собрали посредством центрифугирования и подДля оценки способности химер управлять клевергли лизису в 1% NP-40, 0,1% д од еци л сульфате точным иммунитетом цитотоксические Тнатрия, 0.15М NaCI, 0.05M трис, рН 8,0, 5мМ лимфоциты были заражены рекомбинантами осMgCI2, 5мМ KCI, 0,2М иодацетамиде и 1мМ феповакцины, экспрессирующими химеры CD16, и нилметилсульфонилфториде Ядра отобрали поиспользованы для специфического лизиса гибрисредством центрифугирования и провели реакции домных клеток, экспрессирующих связанные с иммунопреципитации белка CD16 при помощи мембраной антитела к CD16 Эта реакция предантител 3G8 (Fleit et al , см выше, 1982, Medarex) ставляет собой расширение реакции цитотоксичи агарозы с мышиным анти-lgG (Cappel, Durham, ности для гибридом, первоначально разработанNC) Образцы подвергли электрофорезу в 8% геле ной для анализа эффекторных механизмов из полиакриламида/додецилсульфата натрия в клеток-носителей рецепторов Fc (Graziano and невосстанавливающих условиях или в 10% геле в Fanger, J Immunol 138 945, 1987, Graziano and восстанавливающих условиях Эти реакции иммуFanger, J Immunol 139 35 - 36, 1987, Shen et al , нопреципитации подтвердили, что химера Мої Immunol 26 959, 1989, Fanger et al , Immunol CD16 £Cys11Gly/Asp15Gly не образует димерных Today 10 92, 1989) Фиг 8В показывает, что эксструктур с дисульфидной связью прессия CD16£ в цитотоксических Т-лимфоцитах позволяет "вооруженным" лимфоцитам уничтоПроверялась также цитолитическая активжать гибридомные клетки 3G8 (анти-СО16, Fleit et ность мутантных рецепторов Мутантная химера, al , Proc Natl Acad Sci USA 7 3275, 1982), а цитоусеченная до остатка 65 токсические Т-лимфоциты, экспрессирующие (CD16^Cys11Gly/Asp15Gly/ Asp66*) была, в завифосфатидилинозит-связанную форму CD16, оссимости от условий эксперимента, в 2 - 8 раз метаются неактивными Цитотоксические Тнее активной цитолитически, чем сравнимая хилимфоциты, вооруженные CD16£, также не уничмера без мутаций (CD16 £ Asp66*), которая тожают гибридомные клетки, экспрессирующие обычно также активна, как CD16 £, или в 1 - 2 раза антитела к другим антигенам менее активна (фиг 9В) Снижение активности мутантных химер сравнимо со снижением активЧтобы определить минимальную последованости химер CD4 аналогичной структуры (см вытельность £, необходимую для цитолиза, приготоше) и, скорее всего, объясняется тем, что моновили ряд делеционных мутантов, в которых от меры £ действуют менее эффективно, чем карбоксильного конца (фиг 8А) отнимали все димеры Химера с мутациями Asp и Cys , усеченбольшие участки внутриклеточного домена £ (поная до остатка 59, вообще не проявляла цитолиследовательность № 44) Можно удалить больтической активности (фиг 9В), что служит подшую часть внутриклеточного домена £ без значитверждением гипотезы о том, что именно связь с тельных последствий для цитотоксического другими цепями, опосредствованная трансмебпотенциала, химера CD16 полной длины была ранными остатками Cys и/или Asp, была причиной настолько же активной, насколько химера, усенеустойчивой цитолитической активности при деченная до остатка 65 - CD16^Asp66* (фиг 8В) лециях, расположенных ближе к аминоконцу, чем Существенное ослабление цитотоксичности наостаток 65 блюдалось при укорочении £ до остатка 59 (химера CD0016 £Glu60*), дальнейшее усечение до осПроточный цитометрический анализ показал, татка 50 ослабило активность еще немного что делеционные мутанты, в которых недостает Однако полной потери активности не произошло, даже когда внутриклеточный домен усек трансмембранных остатков Asp и Cys, все же способствуют увеличению внутриклеточной концен 33 45349 34 трации свободных ионов кальция в ответ на переспособность к опосредствованию значительного крестное связывание с антителами в мутантной повышения внутриклеточной концентрации сво(без Т-клеточных рецепторов) клеточной линии бодных ионов кальция в течение более длительJurkat (фиг 9D) Подобные результаты были поного времени, которое затрачивается на цитолилучены для химер, экспрессированных родительтический анализ Однако, в некоторых линиях ской линией Jurkat В случае цитолитических Т-клеток наблюдалась нечувствиCD16£Cys11Gly/Asp15Gly/Glu60* эти результаты тельная к кальцию цитолитическая активность, и говорят о том, что способность опосредствовать мы не исключаем возможности, что подобное явкальциевую чувствительность можно при помощи ление обусловило полученный результат Замена мутации отделить от способности обеспечивать Asn48 на Ser частично ослабила цитотоксичность цитолиз в нескольких экспериментах и не дала значительного эффекта в остальных Чтобы полностью исключить возможность участия трансмембранных остатков £, трансмемДля изучения потенциальной роли избыточбранные остатки и 17 первых цитоплазматических ных элементов последовательности £ внутриклеостатков £ заменили последовательностями, коточный домен £ был разбит на три сегмента осдирующими трансмембранные остатки и первые татки 33 - 65, 71 - 104 и 104 - 138 Каждый из этих 14 или 17 цитоплазматических остатков антигенов сегментов присоединяли к химере CD16CD7 при CD5 или CD7, соответственно (фиг 9А) Полученпомощи сайта Mlul, вводимого у дистального конные трехчастные слитые белки CD16 5 £(48 - 65) и ца последовательности мембранного якоря внутCD16 7 £(48 - 65) не образовывали димеров с дириклеточного домена CD7 (см ниже, фиг 11 А) сульфидными связями, в отличие от более проСравнение цитолитической активности трех элестых химер CD16 £, так как не имели остатка цисментов показало, что их активность практически теина в трансмембранном домене £ Обе одинакова (фиг 11В) Сравнение последовательтрехчастные химеры были способны мобилизоностей (фиг 11 А) показывает, что во втором отвать кальций в клетках Jurkat и в клетках Jurkat резке между тирозинами находится одиннадцать без Т-клеточных рецепторов (фиг 9D) и вызывать остатков, а в первом и третьем - по десять цитолитический ответ в цитотоксических ТХотя точное объяснение процесса активации лимфоцитах (фиг 9С и не представленные данТ-клеток не найдено, ясно, что агрегация антигенные) Однако, отсечение части £ до остатка 59 в ных рецепторов, или химерных рецепторов, вклюхимере CD16 7 £(48 - 59) лишает трехчастный чающих в себя внутриклеточные последовательслитый белок способности управлять чувствиности £, инициирует мобилизацию кальция, тельностью кальция в клетках Jurkat (с Твысвобождение цитокинов и гранул и появление клеточными рецепторами или без них) или цитона поверхности клеток маркеров активации При литической активностью в зрелых цитотоксических опосредствовании активации клетки активный Т-лимфоцитах (фиг 9С и 9D и не представленные сайт £, короткая линейная пептидная последоваданные) тельность, скорее всего, слишком маленькая для Для изучения роли отдельных остатков в активности цепи из 18 остатков мы приготовили несколько мутантных вариантов путем сайтнаправленного мутагенеза и оценили их способность опосредствовать направляемое рецептором уничтожение в условиях слабой (фиг 10А и 10D) или сильной экспрессии (фиг 10В и 10Е) химерного рецептора На фиг 10А - F видно, что хотя ряд относительно консервативных замен (например, замещений кислотных остатков родственными им амидами или тирозина фенилаланином) на участке между остатками 59 - 63 привел к умеренному ослаблению цитолитической активности, варианты в общем сохранили способность мобилизовать кальций Однако, в совокупности эти остатки представляют собой важный участок, так как их делеция приводит к потере цитолитической активности Замена Туг 62 на Phe или Ser приводила и к потере цитолитической активности, и к утрате кальциевой чувствительности На аминоконце сегмента из 18 остатков замена Туг 51 на Phe делала невозможной как мобилизацию кальция, так и цитолитическую активность, а замена Leu в позиции 50 на Ser делала невозможной мобилизацию кальция и лишь частично ослабляла цитолитическую способность Не ограничивая себя рамками определенной гипотезы, мы предполагаем, что неспособность мутанта Leu50Ser мобилизовать кальций в коротких проточных цитометрических анализах не полностью отражает его того, чтобы обладать собственной ферментной активностью, вероятно, взаимодействует с одним или, самое большое, с несколькими белками Ясно также, что мобилизации свободного кальция как таковой недостаточно для активации клетки, поскольку способность к опосредствованию цитолиза можно при помощи мутации отделить от способности к опосредствованию накопления кальция Как показано в настоящем документе, добавление 18 остатков из внутриклеточного домена £ к трансмембранному и внутриклеточному домену двух других белков приводит к созданию химер, способных направлять цитолитическую активность против клеток-мишеней, которые связываются с внеклеточной частью слитых белков Хотя химеры, имеющие в своем составе отрезок из 18 остатков, приблизительно в восемь раз менее активны, чем химеры, содержащие £ целиком, уменьшение активности можно приписать потере трансмембранных взаимодействий, за счет которых обычно £ дикого типа образует димеры с дисульфидной связью То есть, делеционные конструкции с £, имеющие тот же карбоксильный конец, что и отрезок, и не имеющие трансмембранных остатков Cys и Asp, обычно проявляют несколько меньшую активность, чем химеры, содержащие только отрезок из 18 остатков В элементе, обеспечивающем цитолитическую компетентность, на котором мы сосредото 35 45349 36 чились, содержится два тирозина и не содержится клона РС23 или из библиотеки кДНК миндалин ни серии, ни треонин, которые ограничивают возчеловека (составленной стандартными способаможный вклад фосфорилирования в активность ми) с использованием следующих олигонуклеоМутация любого из тирозинов приводит к утрате тидных затравок активности, и хотя предварительные эксперименССС GGA ТСС CAG CAT GGG CAG СТС ТТ ты не указывают на существенное фосфорилиро(последовательность № 18, FcRII А прямая), вание тирозина после перекрестного связывания CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT химерных поверхностных антигенов, содержащих GTT GAG ATG GTC GTT (последовательность № участок из 18 остатков, нельзя исключать возмож19, FcRII А обратная), ность участия такого фосфорилирования на низGCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC ком уровне В дополнение к эффектам, отмеченCAG CTC TTC ACC G (последовательность № 20, ным для двух тирозиновых остатков, ряд замен FcRII B1 и FcRII B2 прямые), аминокислот на карбоксильном конце и аминоконGCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC це отрезка ослабляют активность в условиях низTGG ТС (последовательность № 21, FcRII B1 и кой плотности рецепторов FcRII B2 обратные) Последовательности, подобные активному отЭти затравки содержали сайты расщепления резку £, встречаются в цитоплазматических домедля ферментов BamHI и Notl, соответственно, нах некоторых других трансмембранных белков, в отстоящие на б остатков от конца 5' Сразу же за том числе, в молекулах 5 и у CD3, в белках mbl и сайтом Notl следовал антисмысловой стоп-кодон, В29, связанных с поверхностным IgM, в цепях р и либо СТА, либо ТТА Все затравки состояли из 18 у высокоаффинного рецептора IgE, FcsRI (Reth, или более остатков, комплементарных концам 5' Nature 338 383, 1989) Хотя функция этих послеили 3' нужных фрагментов Фрагмент кДНК, соотдовательностей точно не установлена, в случае ветствующий цитоплазматическому домену эффективной экспрессии любая из них способна FcRllyC, который отличается от изоформы IIA самостоятельно активировать Т-клетку, и это мотолько одним аминокислотным остатком (L или Р жет быть причиной остаточной чувствительности в позиции 268), был получен при помощи сайтТ-клеточных рецепторов, наблюдаемой в £направленного мутагенеза путем цепной полимеотрицательной мутантной клеточной линии разной реакции с перекрыванием, с использова(Sussman et al , Cell 52 85, 1988) нием таких затравок Сама последовательность £ включает в себя три таких последовательности, приблизительно одинаковой длины, и грубое разбиение внутриклеточного домена на три части показывает, что каждая способна инициировать цитолитический ответ В последовательности п. сплайсинговой изоформе £ (Jin et al, см выше, 1990, Clayton et al , Proc Natl Acad Sci USA 88 5202, 1991), отсутствует карбоксильная половина третьего отрезка Поскольку удаление карбоксильной половины первого отрезка приводит к утрате активности, кажется вероятным, что биологическая активность П определяется в основном первыми двумя отрезками Хотя при различных способах измерения п также активно, как £, способствует антигензависимой выработке цитокинов (Bauer et al , Proc Natl Acad Sci USA 88 3842, 1991) или нацеливанию цитолиза (см выше), п н е фосфорилируется в ответ на стимуляцию рецептора (Bauer et al , см выше, 1991) Таким образом, либо для фосфорилирования требуется присутствие всех трех отрезков, либо третий отрезок служит излюбленным субстратом для неизвестной тирозин киназы Пример IX Передача цитолитического сигнала Fcрецептором человека Для оценки действия различных подтипов рецептора Fc человека были созданы химерные молекулы, в которых внеклеточный домен антигенов CD4, CD5 или CD16 человека присоединялся к трансмембранным и внутриклеточным доменам подтипов FcRllyA, B1, В2 и С (номенклатура авторов Ravetch and Kmet, Ann Rev Immunol 9 457, 1991) Говоря точнее, последовательности кДНК, соответствующие трансмембранным и цитоплазматическим доменам ранее описанных изоформ FcRIIA, В1 и В2, были амплифицированы из уже существующего ТСА GAA AGA GAC AAC CTG AAG ААА ССА АСА А (последовательность № 22) и TTG TTG GTT TCT ТСА GGT TGT GTC TTT CTG А (последовательность № 23) Фрагменты - продукты реакции были вставлены в векторы экспрессии на основе вируса осповакцины, содержащие внеклеточные домены CD16 или CD4, соответственно, а затем - в вирусы осповакцины дикого типа путем рекомбинации в локусе тимидин киназы, с отбором для одновременного встраивания гена gpt E coh, облегчающего идентификацию нужных рекомбинант Подлинность всех изоформ (фиг 12) была подтверждена дидезокси методом установления первичной структуры ДНК Получение белков химерных рецепторов было подтверждено экспериментами по иммунопреципитации Приблизительно 10 клеток JRT3 ТЗ 5 инфицировали в течение одного часа в бессывороточной среде IMDM, рекомбинантами осповакцины со множественностью заражения не менее 10 Через 12 часов после заражения клетки собрали и пометили их поверхность 1 2 5 J, 0,5мКи на 10 клеток, по способу Кларка и Эйнфельда - с использованием лактопероксидазы/глюкозооксидазы (Clark and Emfeld, см выше) Меченые клетки собрали посредством центрифугирования и подвергли лизису в 1% NP-40, 0,1мМ MgCI2, 5мМ KCI, 0.02М иодацетамиде и 1мМ фенилметилсульфонилфториде Ядра отобрали посредством центрифугирования и провели иммунопреципитацию слитых белков CD16 с помощью антител 4G8 и агарозы с мышиным анти-lgG Образцы подвергли электрофорезу в восстанавливающих условиях Все молекулы преципитированных химерных рецепторов имели ожидаемую молекулярную массу Для проверки способности химерных рецепто 37 45349 38 ров к опосредствованию роста внутриклеточной ле и с членами общего семейства FcRy/TCR^ Для концентрации свободных ионов кальция мутантвыделения элементов последовательности, вызывающих цитолиз, были приготовлены 5'- и 3'ную (без Т-клеточных рецепторов) линию клеток концевые делеции последовательностей, кодиJurkat - линию JRT3 ТЗ 5 заразили рекомбинантрующих внутриклеточный домен (описанные ниже ными вирусами (как описано в настоящем докуи представленные на фиг 15А), которые были менте) и измеряли концентрацию свободного испытаны на эффективность мобилизации калькальция в цитоплазме клеток (как описано в нация и цитолитическую активность (как описано в стоящем документе) после перекрестного связынастоящем документе) В экспериментах, в котования внеклеточных доменов рецепторов монорых удалялась аминоконечная часть внутриклеклональным антителом 3G8 или Leu-ЗА (как точного домена, трансмембранный домен FcRyll описано в настоящем документе) Эти эксперизаменяли на трансмембранный домен чужеродноменты показали, что внутриклеточные домены го антигена CD7 - для исключения возможного FcRyll А и С способны опосредствовать рост конвлияния взаимодействий, опосредствованных центрации свободных ионов кальция в цитоплазтрансмембранным доменом ме после перекрестного связывания внеклеточных доменов, а внутриклеточные домены FcRyll B1 и На фиг 15В и 15С показано, что удаление 14 остатков с карбоксильного конца, в числе которых В2 в подобных условиях остаются неактивными тирозин 298, приводит к полной потере цитолити(фиг 13А и 13В) Гибриды FcRyll А с CD4, CD5 и ческой активности и к значительному снижению CD16 проявляли в основном одинаковую способпотенциала мобилизации кальция Дальнейшее ность к возбуждению кальциевого ответа (фиг усечение - вплоть до тирозина 282 - дало такой же 13А - В) Другие клеточные линии, полученные как фенотип (фиг 15В и 15С) Усечение внутриклеиз моноцитов, так и из лимфоцитов, были способточного домена со стороны N-конца до остатка ны отвечать на сигнал, подаваемый при перекре268 не повлияло в значительной мере ни на простном связывании внеклеточных доменов филь кальция, ни на цитолитическую активность, Для исследования участия внутриклеточных а делеция до остатка 275 заметно ослабила выдоменов различных форм FcRyll в цитолизе цитосвобождение кальция, но не оказала значительнотоксические Т-лимфоциты человека были заражего влияния на цитолиз (Фиг 15D и 15Е) Дальнейны рекомбинантами осповакцины, экспрессируюшее усечение, до остатка 282, дало хвосты FcRyll, щими химеры CD16 FcRyll А, В1, В2 и С не способные ни к мобилизации кальция, ни к Зараженные клетки культивировали совместно с обеспечению цитолиза (фиг 15D и 15Е) "Актив51 гибридомными клетками, нагруженными Сг ( т е , ный элемент", выявленный при помощи этих груклетками 3G8 10-2) и экспрессирующими поверхбых мер, оказался относительно большим (36 ностные антитела к GDI 6 В этом эксперименте аминокислот) Он содержит два тирозина, раздецитотоксические Т-лимфоциты с химерами CD16 ленных 16 остатками уничтожали гибридомные клетки-мишени (тем Пример X самым способствуя высвобождению 51Сг), если Направленный цитолиз, осуществляемый внеклеточный домен CD16 химеры был присоедилимфоцитами с химерными рецепторами CD4, не нен ко внутриклеточному сегменту, способному способствующими дальнейшему заражению активировать эффекторную программу лимфоциКак сказано выше, существует возможность та, этот эксперимент подробно описан ниже На построения эффекторных молекул, направляющих фиг 14А видно, что цитотоксические Тцитолитическую активность цитотоксических Тлимфоциты, вооруженные CD16 FcRyll А или С, но лимфоцитов и делающих ее независимой от главне FcRyll В1 или В2, способны осуществить лизис ного комплекса гистосовместимости Например, клеток-мишеней, экспрессирующих поверхностхимера, состоящая из внеклеточного домена CD4, ные антитела к CD16 слитого с цепью £ в клоне цитотоксических ТЧтобы исключить возможность того, что спелимфоцитов человека WH3, специфически уничцифический цитолиз в какой-то мере объясняется тожает клетки-мишени, на поверхности которых взаимодействием с группой CD16, мы провели проявляется гликопротеин оболочки ВИЧ-1, др120 цитолитические эксперименты, в которых внутриПоскольку внеклеточный домен молекулы CD4 клеточные домены FcRII были соединены с внесообщает клетке восприимчивость к ВИЧ, вооруклеточным доменом CD4 В этом случае мишеняженные цитотоксические Т-лимфоциты могут ми служили клетки HeLa, экспрессирующие белки стать мишенями для вируса, что снижает их эфоболочки ВИЧ др120/41 (а именно, клетки HeLa, фективность (Dalgleish et al , Nature 312 767 зараженные вектором осповакцины VPE16 (из (1984), Klatzmann et al, Nature 312 767 (1984)) СПИД-хранилища Национального института по Чтобы этого не случилось, на основе CD4 были изучению аллергических и инфекционных заболеразработаны химерные эффекторные молекулы, ваний - National Institute of Allergy and Infections которые специфически связываются с ВИЧDisease AIDS Depository, Bethesda, MD) Как и в инфицированными клетками для их уничтожения, системе CD16, клетки-мишени, экспрессирующие но не сообщают своей клетке восприимчивости к оболочку ВИЧ, были восприимчивы к лизису со ВИЧ стороны Т-клеток, экспрессирующих химеру Был создан трехчастный слитый белок - поCD4 FcRyll А, но не FcRyll В1 или В2 (фиг 14В) средством генного соположения внеклеточного Внутриклеточные домены FcRyll А и С не обдомена CD4 (фиг 23) и центрального, второго и ладают значительной гомологией последовательтретьего константных доменов тяжелой цепи IgGI ностей с какими-либо другими белками, в том чисчеловека (Zettlmeissl et al , DNA Cell Biol 9 347 39 45349 40 (1990)) (фиг 25), которые в этом случае присоеопосредствованному образованию синцитиев динялись к части первого трансмембранного экзоЭксперименты по связыванию с растворимой на IgGI человека, связанного с мембраной, за кодр120, меченной 1 2 5 J, показали, что и CD4(D1 торым следовала часть антигена человека CD7, D4) Ig CD7, и CD4(D1, D2) Ig CD7 сохранили афсодержащая последовательности, расположенные финность к др120 в CD7 между единственным lg-подобным доменом Затем мы проверили, будут ли химерные мои последовательностью остановки переноса, раслекулы, противодействующие образованию синположенной за трансмембранным доменом (Aruffo цитиев, способны направлять процесс уничтожеand Seed, EMBO J 3313 (1987)) (фиг 26) Первичния клеток, если ввести в эти молекулы группуная последовательность аминокислот внеклеточинициатор, как описано в настоящем документе ной группы сегмента CD7 включала богатый проМы слили внутриклеточный домен £ (фиг 27) с лином участок, стоящий торчком и отодвигающий концом З1 CD4(D1 - D4) Ig CD7 и CD4(D1, lg-подобный домен от поверхности клетки (AruFFo D2) Ig CD7 и приготовили соответствующие реand Seed EMBO J 6 3313 (1987)) (фиг 26) Были комбинантные вирусы осповакцины Эти конструкприготовлены рекомбинантные вирусы осповакции - CD4(D1 - D4) Ig CD7 и CD4 (D1, D2) Ig CD7 С цины для экспрессии этой и родственных химер (фиг 20, молекулы "С" и "D") -экспрессировались (как описано в настоящем документе) В частнов клоне WH3 цитотоксических Т-лимфоцитов чести, рекомбинантные вирусы осповакцины были ловека и проверялись на способность связывать и получены путем гомологичной рекомбинации в уничтожать клетки HeLa, экспрессирующие поклетках CV-1 Перед приготовлением высоких титверхностный гликопротеин оболочки ВИЧ (спосоров каждого штамма в клетках CV-1 для каждого бы проверки описаны в настоящем документе) На штамма выполнили не менее двух циклов визуафиг 21 показано, что внутриклеточный домен £, лизации бляшек при помощи ОКТ4 или LeuSA с слитый с CD4(D1 - D4) Ig CD7 или с CD4(D1, последующей очисткой бляшек D2) Ig CD7, сообщает клетке способность убивать мишень, конструкции, в которых нет цепи £, неспоТрехчастная химера CD4(D1 - D4) Ig CD7 (фиг собны опосредствовать такую активность CD4 £, 20, молекула "А") эффективно экспрессировалась положительный контрольный объект, опосредстна поверхности клеток и была испытана на спововал несколько более сильную цитотоксичность, собность выступать в качестве рецептора ВИЧ - в a CD4(D1, D2) Ig CD7 - несколько менее сильную ходе эксперимента по образованию синцитиев на цитотоксичность, чем CD4(D1 - D4) Ig CD7 £ (фиг основе осповакцины (Lifson et al , Nature 33 725 21), Однако понятно, что обе химеры CD4(D1 (1986), Ashorn etal , J Virol 64 2149(1990)) КлетD4)lgCD7C и CD4(D1, D2) Ig CD7 С обладают ки HeLa, зараженные рекомбинантным вирусом способностью опосредствовать специфическое осповакцины (vPE16), кодирующим гликопротеин уничтожение клеток, экспрессирующих на поверхоболочки ВИЧ-1 (Earl et al , J Virol 64 2448 (1990) ности белки оболочки ВИЧ В эксперименте с оскультивировали совместно с клетками HeLa, заповакциной четырехчастные химеры проявили раженными либо CD4, CD4 £, либо CD4(D1 стойкую неспособность к опосредствованию обраD4) Ig CD7 Шестисантиметровые чашки с клетказования синцитиев Мы также продемонстрировами HeLa (ATCC, Rockville, MD - Американская колли, что одного отрезка £, подобно представленнолекция типовых культур) при 50% слиянии инфиму на фиг 11 А, достаточно для сообщения цировали в течение 1 часа в бессывороточной химере CD4(D1 - D4) цитолитической способности среде с приблизительной множественностью заражения 10 Клетки выдержали еще 5 - 6 часов в Радиоиммунопреципитационный анализ покаполной среде, затем отобрали в фосфатнозал, что слитые молекулы -это преимущественно, солевой буфер, содержащий 1мМ этилендиаминесли не полностью, димеры В ходе этого анализа тетрауксусную кислоту Клетки, экспрессирующие для преципитации растворенного экстракта метаоболочку и химеру CD4, смешали в соотношении болически меченных клеток HeLa, зараженных 1 1 и посеяли в 6-сантиметровые чашки с полной рекомбинантами осповакцины, экспрессирующими средой Синцитии подсчитали и сфотографировахимеры CD4(D1 - D4)lgCD7 и CD4(D1, ли через 6 - 8 часов совместного культивироваD2) Ig CD7 £, использовались шарики протеин-А ния агарозы Преципитированный материал разделили на фракции посредством электрофореза на Совместное культивирование CD4 и vPE16 ттолиакриламидном геле в восстанавливающих и привело к образованию легко обнаружимых гиневосстанавливающих условиях В частности, гантских многоядерных клеток Кроме того, химеприблизительно 5 х 106 клеток HeLa-S3 заразили, ра, состоящая из внеклеточного домена CD4, сликак описано выше, vPE16 - через соответствуютого с цепью £ Т-клеточного рецептора (фиг 27) щий штамм вируса осповакцины Клетки метабо(CD4 Q оказалась способной опосредствовать лически пометили меткой TranS-Label (ICN Radioобразование синцитиев, а клетки, экспрессируюchemicals, Irvine, CA), 200мкКи/мл, выдержав 6 - 8 щие CD4(D1 - D4) Ig CD7, не проявляли признаков часов в цистеин- и метионин-дефицитной среде, и слияния Мы испытали также конструкцию, экссобрали в фосфатно-солевой буфер, содержащий прессирующую только первый и второй домены 1мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту Затем CD4 (фиг 24), CD4(D1, D2) Ig CD7 (фиг 20, молеклетки центрифугировали и подвергли лизису в кула "В"), поскольку в другом контексте эти два 150мМ NaCI, 50мМ трис рН 7,5, 5мМ этилендиааминоконечных домена были необходимы для минтетрауксусной кислоте, 0,5% NP-40, 0,1% досоздания восприимчивости к ВИЧ (Landau et al , децилсульфате натрия, 5мМ этилендиаминтетраNature 334 159 (1988)) Эта молекула также оказауксусной кислоте, 1 мМ лась невосприимчивой к ВИЧ 41 45349 42 фенил метилсульфонил фториде сию CD4 Плотность поверхностных эпитопов CD4 значительно снизилась в зараженных культурах, После того, как были отцентрифугированы экспрессирующих CD4, что соответствует харакядра, одну пятую каждого клеточного экстракта теру вирусной модуляции, но не изменилась в адсорбировали в течение 2 часов при 4°С в прокультурах, экспрессирующих CD4(D1 - D4) Ig CD7 мытые шарики агарозы, конъюгированной с прои CD4(D1, D2) Ig CD7 Эти эксперименты показытеином А Затем шарики промыли фосфатновают, что существует возможность создавать хисолевым буфером, содержащим 1% NP-40, и мерные молекулы, содержащие два верхних доэлюировали в буфере для образца, содержащем мена CD4, которые, слившись с цепью £ Тдодецилсульфат натрия, в присутствии или в отклеточного рецептора, приобретают способность сутствие меркапто-этанола Результаты этих эксспецифически связывать и уничтожать ВИЧпериментов показали, что большая часть иммуноинфицированные клетки, но не являются восприпреципитированных химер CD4(D1 - D4) Ig CD7 и имчивыми к ВИЧ-инфекции, опосредствуемой CD4(D1, D2) Ig CD7 £ при невосстанавливающих CD4 условиях мигрирует в виде димеров с ожидаемой молекулярной массой Дополнительные исследования позволяют Чтобы непосредственно оценить способность клеток, экспрессирующих слитые молекулы с CD4, к воспринятию ВИЧ-инфекции, мы провели длительное исследование заражаемости с трансфицированными клетками, экспрессирующими CD4(D1 - D4)lgCD7 и CD4(D1, D2) Ig CD7 Стабильные трансфектанты, экспрессирующие CD4(D1 - D4) Ig CD7, CD4(D1, D2) Ig CD7 и CD4, были приготовлены в сублинии клеток 293, легко трансфицируемой линии почечных клеток зародыша человека Химерные молекулы субклонировали в двунаправленные векторы, в которых ген В гигромицина находился под управлением промотора тимидин киназы симплексного вируса герпеса Десятисантиметровую чашку клеток со слиянием 60 - 70% трансфицировали Юмкг ДНК этой плазмиды посредством совместной преципитации с фосфатом кальция Перед трансфекцией плазмиды привели к линейной форме на уникальном сайте Sfil, а концы выровняли ДНК полимеразой Т4 Через 24 часа после заражения клетки разделили на четыре части, а через 48 часов после заражения их подвергли селекции с гигромицином В (Sigma, St Louis, Mo), 400мкг/мл Каждые 3 - 4 дня клеткам добавляли свежей среды с гигромицином Резистентные колонии отбирали, размножали и оценивали их экспрессию посредством непрямой иммунофлуоресценции с использованием анти-lgG Fc человека, конъюгированных с флуоресцеином (Organon Tekmka, West Chester, PA), или Q4120 - антител, реагирующих с CD4 человека (Sigma), с последующей проточной цитометрией (Coulter, Hialeah, FL) Для анализов отобрали по два отдельных клона каждой конструкции, уровень поверхностного CD4 в которых был сравним с уровнем в других клеточных линиях На фиг 22 видно, что после взаимодействия с ВИЧ р24 обнаруживался в культурах, стабильно трансфицированных CD4, уже через три дня после заражения Появление многоядерных гигантских клеток и характерное вспучивание наблюдалось в этих культурах через пять дней после заражения В нетрансфицированной родительской клеточной линии и ни в одном из двух отдельно приготовленных изолятов трансфектантов CD4(D1 D4) Ig CD7 и CD4(D1, D2) Ig CD7 через 32 дня после заражения не было зарегистрировано ни присутствие р24 в значительном количестве, ни появление многоядерных гигантских клеток (фиг 22) После исследования заражаемости клетки подверглись анализу на поверхностную экспрес предположить, что способность сопротивляться ВИЧ-инфекции объясняется пространственным расстоянием между внеклеточным доменом молекулы CD4 и двойным липидным слоем В первом эксперименте мы сконструировали химерную молекулу с делецией "стебля" CD7 и трансмембранного домена, за счет этой делеции был устранен богатый пролином отрезок трансмембранной части CD7 Когда этот домен соединили с внеклеточным доменом CD4, он сохранил свою способность эффективно связываться с внеклеточным доменом молекулы CD4, как показало измерение поверхностной экспрессии молекулы CD4 (описанное в настоящем документе) Однако, способность сопротивляться образованию синцитиев, вызванному действием гликопротеина оболочки ВИЧ, была утрачена Так, делеция богатого пролином участка молекулы CD7, участка, которому свойственно иметь а-спиральную структуру, значительно сократила расстояние между внеклеточным доменом CD4 и двойным липидным слоем, тем самым лишив химеру способности сопротивляться образованию синцитиев Во втором эксперименте мы продемонстрировали, что способностью сопротивляться образованию синцитиев, вызванному ВИЧ-инфекцией, можно наделить химеру CD4/CD5, ранее выступавшую в роли трансмембранного якоря для внеклеточного домена CD4, но неспособную сопротивляться образованию синцитиев, вызванному ВИЧ-инфекцией В этом эксперименте центральный домен и домены СН2 и СНЗ тяжелой цепи IgGI человека были вставлены в молекулу CD4/CD5, полученная химера противодействовала образованию синцитиев, что снова позволяет предположить, что расстояния, равного длине иммуноглобулиновых доменов, достаточно для обеспечения сопротивляемости образованию синцитиев, вызванному ВИЧ-инфекцией В третьем эксперименте домен CD4 отодвигали на различные расстояния от клеточной мембраны при помощи синтетических а-спиралей различной длины В частности, были разработаны синтетические олигонуклеотиды, соответствующие повторяющимся а-спиральным участкам из остатков лизина и глутаминовой кислоты, окаймленным двумя остатками аланина (первичные последовательности нуклеотидов и аминокислот приведены на фиг 28) В ходе предшествующих исследований выяснилось, что такие аминокислотные последовательности часто встречаются в 45349 44 43 а-спиралях, а значит, можно предположить, что спирального сегмента, мы определили (на оснотакие повторяющиеся участки принимают авании известных величин подъема и поворота спиральную структуру и что помещение таких спирали) вынос, необходимый для обеспечения альфа спиралей между трансмембранным домесопротивляемости к проникновению ВИЧном и внеклеточным доменом CD4 отодвигает инфекции Эти результаты представлены в ТабCD4 от клеточной мембраны Изменяя длину алице 1 Таблица 1 A CD4 + Н + СН2 + СНЗ + CD7tm + stk В CD4 (D1, D2) + Н + СН2 + СНЗ + CD7tm + stk С CD4 + CD7tm + stk D CD4 + CD7tm (длинная версия) E CD4 + CD7tm (короткая версия) F CD4 + CD5tm G CD4 + CH2 + CH3 + CD5tm H CD4 + CH3 + CD5tm I CD4 + CD34tm J CD4 + синтетическая а-спираль (24 ангстрем) + CD34tm К CD4 + синтетическая а-спираль (48 ангстрем) + CD34tm L CD4 + синтетическая а-спираль (72 ангстрем) + CD34tm а - значительное уменьшение количества синцитиев или клеток, экспрессирующих Thy-1 В этой таблице "CD4" обозначает CD4(D1 D4), если не указано иное, "Н", "СН2", и "СНЗ" обозначают центральный домен и домены СН2 и СНЗ тяжелой цепи IgGI человека, соответственно, CD7tm+stk обозначает "стебель" и трансмембранный домен CD7, "CD7tm (длинная версия)" и "CDVtra (короткая версия)" обозначают, соответственно, трансмембранный участок CD7 и трансмембранный участок CD7 без богатого пролином домена (см выше), "CDStm" обозначает трансмембранный участок CD5, "CD34tm" обозначает трансмембранный участок CD34 В позициях J-L указана длина а-спирального участка в ангстремах, эти значения выведены на основании того, что на 1 виток а-спирали приходится 3,6 остатка, что соответствует 5,4 А (или 1,5 А на остаток) Следовательно, а-спираль из 16 остатков вынесет внеклеточный домен CD4 на 24 ангстрема Альфа-спирали высотой в 48 и 72 ангстрема были получены путем последовательной конкатемеризации фрагмента BstYl в уникальный сайт BamHI на этом участке (см фиг 28), с последующим отбором клонов нужной ориентации Количество образовавшихся синцитиев подсчитывали в экспериментах с совместной культивацией, в которых использовались клетки HeLa, экспрессирующие гликопротеин оболочки ВИЧ-1 из конструкции vPE16 на основе вируса осповакцины (см выше) Экспрессию Thy-1 измеряли следующим образом Был сконструирован живой ретровирусный вектор на основе клона hxb 2 ВИЧ-1 В этом векторе второстепенный ген net заменили последовательностью, кодирующей крысиный thy-1 - эффективно экспрессируемую молекулу, соединенную с мембраной фосфатидилинозитной связью Вирус, полученный из этого молекулярного клона и обозначенный hxb/thy-1, был заразным, так как давал цитопатологические эффекты и способствовал выработке р24 в супернатантах куль Образование синцитиев Экспрессия Thy-1 + + /-(а) + + + + + + данных нет + + + данных нет данных нет + /-(а) данных нет туры зараженных клеток С8166 (линия Тклеточного лейкоза человека, Т-клетки CD4+) Кроме того, после обработки вирусом hxb/thy-1 и преходящей трансфекции CD4 клетки HeLa проявляли признаки экспрессии thy-1 уже через 18 часов после заражения, как и следовало ожидать для объекта, управляемого по образцу net Сообщения, кодируемые геном net, обычно относятся к классу вирусных регуляторных белков, в которых происходит множественный сплайсинг и отсутствует элемент ответа rev Эти сообщения могут накапливаться в цитоплазме в значительном количестве в виде ранних генов Ожидалось, что сообщения thy-1 будут вести себя подобным образом, т е встречаться на ранних стадиях жизненного цикла вируса Говоря вкратце, эта система облегчила проверку проникновения ВИЧ, так как экспрессия thy-1 служила его суррогатом Проводилась преходящая трансфекция клеток HeLa различными химерами CD4 при помощи стандартных способов с использованием диэтиламиноэтил-декстрана Трансфицированные клетки подвергали обработке hxb/thy-І через 48 часов после трансфекции и измеряли экспрессию thy-1 через 24 - 48 часов после заражения Результаты, представленные в Таблице 1, относятся к эспрессии thy-1, измеренной через 24 часа после заражения при помощи стандартного моноклонального антитела к thy-1 (Accurate) На основании результатов, приведенных в Таблице 1, мы заключили, что внеклеточные домены CD4 лучше всего отодвигать от поверхности клетки по меньшей мере на 48 ангстрем, а предпочтительно по меньшей мере на 72 ангстрема, чтобы клетка могла сопротивляться ВИЧинфекции При использовании стратегии, подобной генеральной стратегии, описанной в настоящем документе, можно конструировать химеры на основе антител к оболочке БИЧ, которые будут специфически связывать ВИЧ-инфицированные клетки Примеры таких антител описаны у Corny et al , 45 45349 46 Proc Natl Acad Sci USA 6 1624 (1989) и Marasco ски пометили 200мкКи/мл S-метионина и цисetal , J Clm Invest 90 1467 (1992) теина (метка Tran S-label, ICN, Costo Mesa, СА) в среде Игла, модифицированной по Дульбекко и не Пример XI содержащей метионина и цистеина (DMEM) Использование вынесенных молекул CD4 в (Gibco, Grand Island, NY) Обработка продолжакачестве приманки для ВИЧ лась шесть часов Меченые клетки отделили при Как показано в настоящем описании, клетки, помощи фосфатно-солевого буфера, содержащесекретирующие домены CD4, удаленные от пого 1мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту, соверхности клетки, противостоят инвазионной спобрали посредством центрифугирования и подсобности ВИЧ Следовательно, эти клетки, секревергли лизису в 1% NP-40, 0,1% д од еци л сульфате тирующие CD4, могут быть применены в качестве натрия, 0.15М NaCI, 0.05M трис рН 8,0, 5мМ этиприманки для связывания ВИЧ, находящегося в лендиаминтетрауксусной кислоте и 1мМ фенилкрови, и снижения титра вируса у ВИЧметилсульфонилфториде Ядра отобрали посрединфицированных лиц В предпочтительном случае ством центрифугирования, а белки CD4 домен CD4 представляется на клетках, в естестиммунопреципитировали при помощи антител венных условиях проходящих через лимфатичеОКТ4 и агарозы с мышиным анти-lgG (Cappel, ские узлы, можно использовать любые клетки, Durham, NC) Образцы подвергли электрофорезу играющие какую-либо роль в клеточном иммунном в 8% полиакриламидном геле с додецилсульфаклиренсе, а также любые другие клетки, в естесттом натрия при невосстанавливающих (NR) и восвенных условиях присутствующие в фолликулах станавливающих (R) условиях Гели, содержащие лимфатических узлов Примерами могут служить образцы, меченные 3 S, перед авторадиографией следующие, но не исключительно следующие пропитали составом En-Hance (New England Nuклетки макрофаги, Т-клетки (например, Тclear, Boston, MA) Облегченную экспрессию хелперы), В-клетки, нейтрофилы, дендритные трансмембранной формы CD16, CD16TM измеряли клетки и фолликулярные дендритные клетки путем сравнения ее экспрессии в клетках CV1, В соответствии со способом, предложенным зараженных только CD16TM, С экспрессией в клетнастоящим изобретением, можно использовать ках, зараженных вирусами, кодирующими CD16TM, любой домен CD4, способный связывать ВИЧ, в и химерами £ или у После заражения и выдержки том числе описанные в настоящем документе дов течение б или более часов клетки отбирали из мены D1 - D4 и D1, D2 Хотя бы в некоторых варичашек в фосфатно-солевой буфер с 1мМ этиленантах осуществления изобретения (например, в диаминтетрауксусной кислотой и проводили измеописанных выше) части внутриклеточного и/или рение экспрессии CD16TM И химер способом нетрансмембранного домена можно выбрать из люпрямой иммунофлуоресценции и проточной бого белка или любой последовательности аминоцитометрии кислот Пример XII Анализ переноса кальция Другие белки-инициаторы, полученные из ТСублинию Е6 клеток Jurkat (Weiss et al , J Imклеточного и В-клеточного рецептора munol 133 123 - 128 (1984)) инфицировали рекомИз белков Т-клеточного рецептора CD3 дельбинантными вирусами осповакцины в течение та и ТЗ гамма и белков В-клеточного рецептора одного часа в бессывороточной среде IMDM со mbl и В29 можно получить другие внутриклеточмножественностью заражения 10 и выдерживали ные и трансмембранные домены, проводящие от трех до девяти часов в среде IMDM с 10% фосигнал и соответствующие настоящему изобретесфатно-солевого буфера Клетки отбирали ценнию Аминокислотные последовательности этих трифугированием и взвешивали в концентрации 3 белков приведены на фиг 16 (CD3 дельта, послех 106клеток/мл в полной среде, содержащей 1мМ довательность № 24), фиг 17 (ТЗ гамма, последоИндо-1 ацетометоксиэфир (сложный) (Grynkiewicz вательность № 25), фиг 18 (mbl, последовательet al , J Biol Chem 260 3340 - 3450 (1985)) (Moность № 26) и фиг 19 (В29, последовательность lecular Probes), затем выдерживали 45 минут при № 27) Участки последовательностей, которых 37°С Клетки, нагруженные Индо-1, центрифугиродостаточно для передачи цитолитического сигнавали, взвешивали в количестве 1 х 106/мл в бесла (и поэтому их желательно включать в химерсывороточной среде IMDM и хранили в темноте ные рецепторы, соответствующие настоящему при комнатной температуре Анализ на свободные изобретению), отмечены скобками Химерные реионы кальция проводили путем одновременного цепторы, содержащие эти белковые домены, конизмерения голубой и фиолетовой флуоресценции струируются и используются для осуществления при проточной цитометрии (Rabinovitch et al , J способов лечения, предложенных настоящим изоImmunol 137 952-961 (1986)) Для запуска перебретением, в общем как описано выше носа кальция к суспензии клеток в момент времени 0 добавляли либо конъюгированные с фикоПример XIII эритрином (РЕ) антитела Leu-ЗА (против CD4) Экспериментальные методы (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) в концентрации Заражение осповакциной и радиоиммунопре1мкг/мл, затем неконъюгированные козьи антитеципитация ла к мышиному IgG в концентрации 10мкг/мл, либо 6 Приблизительно 5 х 10 клеток CV1 инфицинеконъюгированные моноклональные антитела ровали в течение одного часа в бессывороточной 3G8 (против CD16) в концентрации 1 мкг/мл, а среде DME рекомбинантами осповакцины со мнозатем козьи антитела Fab2' к мышиному IgG, жественностью заражения не меньше десяти (титр конъюгированные с фикоэритрином, в концентраопределялся по клеткам CV1) После заражения ции 10мкг/мл Были собраны гистограммы отноклетки поместили в свежую среду и метаболиче 47 45349 48 шения фиолетового излучения к голубому для солевым буфером Сто мкл меченых клеток снова популяции РЕ-положительных (зараженных) клевзвесили в среде с плотностью 10клеток/мл и доток, которые обычно составляли 40 - 80% от всех бавили в каждую ячейку Клетки Raji и RJ2 2 5 меклеток Ответ Т-клеточного антигенного рецептора тили также, как и клетки HeLa Микропланшет в незараженных клетках запускался антителами вращали в течение 1 минуты при 750 х g и выдерОКТЗ без перекрестного связывания В экспериживали 4 часа при 37°С В конце периода инкубаментах с химерными рецепторами CD16 образцы, ции клетки в каждой ячейке осторожно взвешивав которых наблюдался исходный сдвиг в сторону ли посредством пипетирования, отбирали образец снижения внутриклеточной концентрации кальция для подсчета и вращали микропланшет в течение (без антител), исключались из анализа ГистоI минуты при 750 х g Порции по ЮОмкл супернаграммы анализировали путем перевода двоичных танта отбирали и проверяли в гаммаданных в коды ASCII при помощи программы Write сцинтилляционном счетчике К проценту уничтоHand Man (Cooper City, FL) и последующей ображения была сделана поправка на долю инфициботки при помощи ряда программ на ФОРТРАНе рованных клеток-мишеней (обычно 50 - 90%), оп(FORTRAN) Для определения исходного нормаределенную посредством проточной цитометрии лизованного отношения фиолетового излучения к К отношению эффектор мишень для инфицироголубому (приравниваемого к единице) использованных эффекторных клеток была сделана повали отношение, наблюдаемое перед добавлениправка на процент зараженных клеток (обычно 20 ем второго реагента-антитела Его же использо- 50% для экспериментов с химерным рецептором вали для определения порогового отношения в CD4 и > 70% для экспериментов с химерным репокое, которое установили так, чтобы 10% попуцептором CD16) ляции в покое находилось над порогом Мутагенез последовательности £ in vitro Анализ цитолитической активности Для получения точечных мутаций в позициях Т-клеточную линию WH3 человека, цитолити+ II и/или 15 аминокислотной последовательности ческую линию с рестрикциями CD8 , CD4, HLA £ были приготовлены синтетические олигонуклеоВ44, выдерживали в среде IMDM с 10% человечетидные затравки-последовательности от сайта ской сыворотки и с 100Ед/мл IL-2 и периодически BamHI у начала трансмембранного домена £, престимулировали либо неспецифически, облученобразующие остаток 11 нативной £ из Cys в Gly ными (ЗОООрад) не соответствующими по HLA (C11G), или остаток 15 из Asp в Gly (D15G), или лимфоцитами периферийной крови и фитогемаггоба остатка (C11G/D15G), которые были испольлютинином в концентрации 1мкг/мл, либо специзованы в цепных полимеразных реакциях для пофически, облученными одноядерными клетками с строения фрагментов с мутациями, которые затем В44 Через день неспецифической стимуляции вставлялись в конструкции CD4 £ дикого типа фитогемагглютинин разбавили до 0,5мкг/мл свеДля получения делеций в последовательности жей средой, а через три дня среду сменили Меж£ кДНК £ были амплифицированы посредством ду стимуляцией и анализом цитотоксичности клетцепных полимеразных реакций, в которых были ки культивировали не менее 10 дней Клетки использованы синтетические олигонуклеотидные инфицировали рекомбинантами осповакцины со затравки, сконструированные для создания стопмножественностью заражения не менее 10 в течекодона (UAG) после остатков 50, 59 или 65 Зание одного часа в бессывороточной среде, затем травки содержали сайт расщепления для ферменвыдерживали три часа в полной среде Клетки та Notl, отстоящий на 5 или 6 остатков от конца 5', отбирали центрифугированием и взвешивали с обычно в последовательности вида CGC GGG плотностью 1 x 1 0 клеток/мл В U-образной титраCGG CCG СТА (последовательность № 11), где ционный микропланшет, в каждой ячейке которого три последних остатка соответствуют стопсодержалось по ЮОмкл полной среды, добавляли антикодону За последовательностями Notl и стоппо ЮОмкл взвеси, затем разбавляли вдвое послеантикодона шли 18 или более остатков, компледовательными шагами Две ячейки на каждый обментарных требуемому концу 3' фрагмента Полуразец не содержали лимфоцитов, чтобы можно ченные химеры были обозначены CD16 £Y51 *, было измерить спонтанное высвобождение хрома CD16£E60* и CD16 5D66*, соответственно Сайт и его суммарное поглощение Клетки-мишени, BamHI у начала трансмембранного домена и сайт взятые из сублинии HeLa S3, инфицировали в 6Notl использовались для генерации фрагментов, или 10-сантиметровых чашках, с приблизительной которые вставлялись в конструкции CD16 £ дикого множественностью заражения 10, в течение однотипа Мономерные химеры £ строились путем выго часа в бессывороточной среде, затем выдерсвобождения трансмембранной и примембранной живали в полной среде в течение трех часов Завнутриклеточной последовательностей £ за счет тем их выделили при помощи фосфатно-солевого переваривания ферментами BamHI и Sad констбуфера с 1мМ этилендиаминтетрауксусной кислорукции CD4 £ Asp и Cys , описанной выше, и осутой и пересчитали Порцию в 106 клеток-мишеней ществления вставки этого фрагмента в конструк(HeLa, Raj і или RJ2 2 5 для экспериментов с хиции CD16 £Е60* и CD16 фбб*, соответственно мерным рецептором CD4 и клеток 3G8 1 0 - 2 , Shen et al , Мої Immunol 26 959 (1989) для экспеТрехчастные химерные конструкции риментов с химерным рецептором CD16) центриCD16 7^(48 - 65) и CD16 7^(48 - 59) Для пригофугировали и взвесили в 50 мкл стерильного натовления конструкции 0016 £066* последовательтрия хромата (51Сг, 1мКи/мл, Dupont Wilmington, ность кДНК £, соответствующую трансмембранноDE) на один час при 37°С, время от времени пему домену и 17 первым остаткам ремешивая, затем три раза промыли фосфатноцито плаз мати чес ко го домена, заменили соответствующими трансмембранным и цитоплазматиче 49 45349 50 ским доменами, полученными из кДНК CD5 и CD7 137, были получены при помощи цепной полимеФрагменты CD5 и CD7 были получены при поморазной реакции с использованием пар затравок, щи цепных полимеразных реакций с использовасодержащих сайты Mlul на конце 5' (прямые занием олигонуклеотидов прямой последовательнотравки) и стоп-кодоны, за которыми следуют сайсти, содержащих сайт рестрикционного ты Notl, также на конце 5' (обратные затравки) В расщепления BamHI и соответствующих участку, каждом случае сайты рестрикции отстояли на прилегающему "сверху" к трансмембранному дошесть остатков от конца 5' затравки, чтобы расмену CD5 и CD7, соответственно, и представленщепление рестрикционным ферментом было ганых ниже олигонуклеотидов обратной последоварантированным тельности, перекрывающихся с С, 33 CGC GGG SCG CGT ТТС ЯСС CGT ССТ CGC CAG CP.C ЙСА последовательностями CD5 и CD7, соответствен(последовательность № 15 но, и последовательности £, содержащей сайт С, 71: CGC GGG ACG CGT GAC ССТ GAG ATG GGG GGA AAG Sacl рестрикционного расщепления (последовательность № 16) и CD5-^: CGC GGG СТС GTT ДТА GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTX CTT CTG (последовательность № 12) CD7 С, CTT PTC CGC GGG GAG CTC 1 GT " Д Т Й GAG CTG G T TGC CGC CGA AT^ CCG (последовательность № 13 Продукты цепной реакции CD5 и CD7 переварили BamHI и Sacl и сшили с CD16 £Е60*, переваренной ферментами BamHI и Sacl Этим фрагментом CD7 была заменена последовательность цепи £ от BamHI до Sacl Для построения конструкций CD16CD5 и CD16CD7 фрагменты CD5 и CD7 готовили при помощи цепной полимеразной реакции с использованием олигонуклеотида, содержащего сайт Notl рестрикционного расщепления и кодирующий стоп-кодон (UAA) после остатков Gln416 и Ala193 CD5 и CD7 соответственно Фрагменты CD5 и CD7 переварили при помощи BamHI и Notl и вставили в конструкцию CD16 £Asp66* Мутагенез in vitro аминоконечных остатков отрезка £, проводящего цитолитический сигнал Были получены синтетические олигонуклеотидные затравки с началом с сайта Sad в упомянутом отрезке £, преобразующие остаток 48 нативной из Asn в Ser (N48S), остаток 50 из Leu в Ser(L50S) и остаток 51 из Туг в Phe (Y51F), и использованы в цепной полимеразной реакции для построения фрагментов, которые повторно вводились в конструкцию CD16 7 £(48 - 65) дикого типа Мутагенез in vitro С-конечных остатков отрезка £, проводящего цитолитический сигнал Были получены синтетические олигонуклеотидные затравки от З'-конечного сайта Notl до стоп-кодона, преобразующие остаток 60 нативі-£ из Glu в Gin (E60Q), остаток 61 из Glu в Gin (E61Q), остаток 62 из Туг в Phe или Ser (Y62F) или (Y62S) и остаток 63 из Asp в Asn (D63N) и использованы в цепной полимеразной реакции для построения фрагментов, которые были субклонированы в конструкцию CD16 £D66* дикого типа между сайтами BamHI и Notl Химерные конструкции CD16 7 £(33 - 65), CD16 7 £(71 -104) и CD16 7 £ (104 -137) Трансмембранный фрагмент CD7, содержащий сайты МЫ и Notl в месте соединения трансмембранного и внутриклеточного домена, был получен при помощи цепной полимеразной реакции с использованием олигонуклеотида такой последовательностью CGC GGG GCG GCC ACG CGT ССТ CGC CAG САС АСА (последовательность № 14) Полученный фрагмент переварили при помощі BamHI и Notl и повторно вставили в конструкцию CD16 7 £(48 - 65) Фрагменты £, кодирующие остатки с 33 по 65, с 71 по 104 и со 104 по С, 104 ; CGC GGG ACG CGT ЙТТ GGG ATG ЙАД GGC GAG CGC (последовательность № 17) Построение делеционных мутантов FcRyllA Мутанты FcRIIA с делециями на карбоксильном конце были сконструированы при помощи цепных полимеразных реакций тем же способом, что и конструкции полной длины, с преобразованием последовательностей, кодирующих тирозин в позициях 282 и 298, в стоп-кодоны (ТАА) Аминоконечные делеции были получены путем амплификации фрагментов, кодирующих все меньшие части внутриклеточного домена, при помощи цепных полимеразных реакций, с использованием олигонуклеотидов, позволяющих вставлять полученные фрагменты между рестрикционными сайтами Mlul и Notl ранее сконструированной экспрессионной плазмиды, кодирующей внеклеточный домен CD16, слитый с трансмембранным доменом CD7 (который заканчивается на сайте Mlul - в месте соединения трансмембранного и внутриклеточного доменов) ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ Приведенные выше примеры показывают, что агрегации химер £, п, или у, достаточно для запуска цитолитического эффекторного клеточного ответа в Т-клетках Известный диапазон экспрессии £, П и У. в который входят Т-лимфоциты, естественные клетки-киллеры, базофилы, гранулоциты, макрофаги и тучные клетки, позволяет предположить, что сохранившиеся отрезки последовательности могут взаимодействовать с сенсорным аппаратом, общим для клеток кроветворной системы, и что важная составляющая защиты, обеспечиваемой иммунной системой, может быть опосредствована агрегацией рецепторовСила цитолитического ответа и отсутствие ответа по отношению к клеткам-мишеням, несущим рецепторы класса II ГКГС, показывает, что химеры, основанные на £, п, или у, служат основой генетического вмешательства при СПИДе, которое осуществляется при помощи адоптивной иммунотерапии Широкое распространение эндогенных £ и у и данные о том, что Fc-рецепторы, связанные с у, опосредствуют цитотоксичность в клетках различных типов (Fanger et al , Immunol Today 10 92 99 (1989)), позволяет рассматривать возможность применения в этих целях различных клеток Например, нейтрофильные гранулоциты, которые очень недолго (и 4 часа) живут в системе кровообращения и обладают очень сильной цитолитической способностью, представляют собой при 45349 52 51 влекательное место экспрессии таких химер Зараспространяется на видоизменения, другие споражение нейтрофилов ВИЧ, скорее всего, не присобы использования или варианты адаптации наведет к высвобождению вируса, а обилие этих стоящего изобретения, предусматривающие такие клеток (они преобладают среди лейкоцитов) отклонения от изложенного выше, которые воздолжно облегчить организму-хозяину задачу заможны в этой области деятельности, допустимы в щиты Еще один привлекательный носитель хирамках настоящего изобретения и согласуются с мер - это зрелые Т-клетки, популяция, в настояего основными особенностями, определенными щее время доступная ретровирусной инженерии нижеследующей формулой (Rosenberg, S A Sci Am 262 62-69(1990)) При СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ помощи рекомбинантных IL-2 популяции Т-клеток (1) ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ сравнительно легко размножаются в культуре, и (і) ЗАЯВИТЕЛИ Сид, Брайен и др такие размноженные популяции, вернувшись в (м) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Направленорганизм, обычно живут недолго (Rosenberg et al , ный лизис ВИЧ-инфицированных клеток при поN Engl J Med 323 570-578(1990)) мощи клеток с химерными рецепторами CD4 При подходящих условиях распознавание ВИЧ (їм) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОклетками, экспрессирующими химеры CD4, должСТЕЙ 52 но служить также митогенным стимулом, чтобы (iv) АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ вооруженная популяция клеток могла динамиче(A) ПОЛУЧАТЕЛЬ Фиш энд Ричардсон П С ски отвечать на вирусную нагрузку Хотя здесь мы (B) УЛИЦА 225 Франклин Стрит сосредоточились на поведении слитых белков в (C) ГОРОД Бостон цитолитических Т-лимфоцитах, экспрессия этих (D) ШТАТ МА химер в лимфоцитах-хелперах могла бы стать (E) СТРАНА США ВИЧ-стимулируемым источником цитокинов, кото(F) ПОЧТОВЫЙ ИНДЕКС (ЗИП) 02110 - 2804 рые противодействовали бы уничтожению под(v) МАШИНОЧИТАЕМАЯ ФОРМА группы хелперов при СПИДе (A) ТИП НОСИТЕЛЯ дискета 3 5", 1 44 Mb Появившиеся недавно описания схем конст(B) КОМПЬЮТЕР IBM PS/2, модель 50Z or руирования сопротивления инфекции, проявляю55SX щегося на этапах, отличных от этапа проникнове(C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА IBM PC ния вируса (Friedman et al , Nature 335 452 - 454 DOS (Версия З ЗО) (1988), Green et al , Cell 58 215 - 223 (1989), Mahm (D) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ Wordet al , Cell 58 205 - 214 (1989), Trono et al , Cell perfect (Версия 5 0) 59 113 - 120 (1989), Buonocore et al , Nature (vi) СВЕДЕНИЯ О НАСТОЯЩЕЙ ЗАЯВКЕ 345 625 - 628 (1990)), позволяют предположить, (A) НОМЕР ЗАЯВКИ 08/394,388 что клетки с химерными рецепторами CD4 можно (B) ДАТА ПОДАЧИ 24 февраля 1995 г перестроить таким образом, что они будут препят(vii) СВЕДЕНИЯ О ПРЕДЫДУЩЕЙ ЗАЯВКЕ ствовать выработке вируса за счет экспрессии (A) НОМЕР ЗАЯВКИ 08/284,391 соответствующих агентов, действующих внутри (B) ДАТА ПОДАЧИ 2 августа 1994 г клетки (VII) СВЕДЕНИЯ О ПРЕДЫДУЩЕЙ ЗАЯВКЕ Способность передавать сигналы Т(A) НОМЕР ЗАЯВКИ 08/195,395 лимфоцитам через автономные химеры обеспе(B) ДАТА ПОДАЧИ 14 февраля 1994 г чивает также способность управлять лимфоцита(VII) СВЕДЕНИЯ О ПРЕДЫДУЩЕЙ ЗАЯВКЕ ми, подвергшимся ретровирусной инженерии, в (A) НОМЕР ЗАЯВКИ 07/847,566 живом организме Такой раздражитель как пере(B) ДАТА ПОДАЧИ 6 марта 1992 г крестное связывание, опосредствованное, напри(VIM) СВЕДЕНИЯ О ПОВЕРЕННОМ/АГЕНТЕ мер, специфическими антителами IgM, настроен(A) ИМЯ Karen F Lech, Ph D ными на удаление доменов, связывающих (B) РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР 35,238 комплемент, может позволить увеличивать коли(C) ССЫЛКА/НОМЕР ДЕЛА 00786/272001 чество таких лимфоцитов на месте, а лечение Ох) ТЕЛЕКОММУНИКАЦИОННЫЕ СВЕДЕНИЯ подобными специфическими антителами IgG (на(A) ТЕЛЕФОН (617)542-5070 пример, распознающими аминокислотную вариа(B) ТЕЛЕФАКС (617)542-8906 цию, вставленную в химерную цепь) могло бы из(C) ТЕЛЕКС 200154 бирательно истощать сконструированную (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ популяцию Кроме того, антитела IgM к CD4 не №1 требуют дополнительного перекрестного связыва(і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОния для мобилизации кальция в клетках Jurkat, СТИ экспрессирующих химеры CD4 Возможность ре(A) ДЛИНА 1728 пар оснований гулировать численность клеток в популяции, не (B) ТИП нуклеиновая кислота прибегая к неоднократной экстракорпоральной (C) Двуцепочечная амплификации, может значительно расширить (D) ТОПОЛОГИЯ линейная область и увеличить эффективность применения (м) ТИП МОЛЕКУЛЫ ДНК (геномная) Т-клеток, обработанных методами генной инжене(XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ № рии, по сравнению с настоящим моментом 1 Настоящее изобретение было описано лишь в связи с отдельными вариантами его осуществления, но следует понимать, что существует возможность его модификации, и настоящая заявка 53 54 45349 ATGAACCGGG GfiGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTCGTGC TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACftA AGTGGTGCTG GGCAAfiAAfiG 1 GGGATACAGT GtAACTGACC ТйТАСАССТ" CCCAGftAGAA GAGCATACM TTCCACTGGA ААЯАСТССАА CCAGATfeAAG ftTTCTGGGAH ATCAGGGCTC CTTCTTAftCT AAAGGTCCAT CCAAGC"CAa TGATCGCGCT GftCTCAAGaA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG ArAGAAGACT СЙЄАТАСТГА rATCTGTGAA GTGGAGGACC aGAAGGAGGA GGTGCAATTG „TAGTGTTCG GATTGACTGC CMCTCTGAC TTCAGGGGCA ^AGCCTGACC CTGACC1TGG AGAGCCCCCC CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT MAMCOTAG CAGCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGTAGTGGC GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGG1GG AGTTCAAAAT ACCCACCTGC 50 „00 150 200 250 300 3 0 400 TGGTAGTAGC 4 50 AGGGGGGGftA 500 ACCTGGACAT 550 GAGCCTGACC CTC&CCTTGG AGAGCCCCCC TGGIAGTAGC 450 AATGTAGGAG TCCAAGGCGT AA?AACATAC AGGGG^GGAA 500 GACCC^CTCC GTCTCTCAGC ^GGAGCTCCA GGA7AGTGGC ACrTCGACAT 550 G1.5.CTGTCTT GCAGAACCAG AAGftAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600 1С AGAAGGC СТССДССАГЛ GTCTATAAG1 AAGAGGGGGA 6Ь0 ACAGGTGGAG T T C T C C r f C CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700 GCACTGGCC1 GCTGTGG-GG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC C'CCAACCT 750 TCGATCPCC 1 TTGSCCTuAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGC"GGCT GTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 GTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGT3AT 950 GAGAGCCACT CAGCfCCAGA AAAATTTGfC CTGTGAGGTG 1GGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA G C T G A T G C G AGCTTGAAAC T G G A G A A C W GGAGGCAAAG 1050 AGACATCGTG 600 AAGAGGGGGA 650 CTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG AAGCTGACGG TOO GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTCCTG CTGCAAGTCT T50 1 fCAAGGT"C i GCCCACATGG TCCACCCCGC TGCACGCGCA AACGCGTTAC Й00 TGCTATATCC TGGA'i'GCCAT CCTGTTTTTC IATGGTATTG САССГСАССС Й50 GCTCTAC"GT CGACTCAAGA TCCAGGTCCG AAAGGCAGAC CACCCIGGCC a GTGAGAAATC AGATGCTGTC TaCACGGGCC TGAACACCCG TGGTGGTGAT 350 TGGGGACOCA 1000 GGAGGCAAAG 1050 A^GCGGGGAT GTG^TAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA G^CTATAAGA 1100 ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCT" TACAGTTGAA CTCAACCCTG GCAC^GGCGA GCTGTGGTGG CiGGCCGSGA GGGCTTCCTC TGGATCACCT TTGACGTGAA GAACRAGGAA GTG^CTGTAA CCAGGACCCT AAGGfCCAGA TGGGCMGAA GCTCCCGCTC TGCfCCUGGC CTTGCC'CAG ''ATGCTGGi? CTGGAAACC1 CTTGAAGCC? AAACPGGAAA CTTGCATCAG C\AGTGAACC GAGAGCCACT CAGCCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG ССТССССТЙА GCTGATGCTG AGCTTGftAPC TGGAGiiACM GTCTCGfiPGC GGGAGAAGGC CGrG^GGGTi. i^GAJWCCTG 00 GTGGCTG^Gr CTGCTGftGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 11^0 •'CAAGGTTCT GCC-OAtftTGG TCCPCCCCGC IGCACCCCGA ТСССАААСЇС 1?C3 TGCTACTTCC ТДСЙТССЙАТ сстстт^лтс TACGGAGTCA rCATCACAGC 1250 C C C - A C C T G AGAGCSAAAT TCAGCftGGA" TGCAGAGACT GCTGCCAACC 1300 TGCAGGfiCCC CAACCAGC1C TACAS"GAGC TCftATCTAGG GCGAAGAGAG ІЗЬО GAATA'^GA'-G TCTIGGAGAH GAAGCGGGCT CGGGAICCftG AGA1GGGAGG .100 CAAACAGCAG ACGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGGCGXATAC AATGCAC'GC 1450 ftGAAAGACAA GATGCCAGAA GCCTACAGTG AGATCGGCAC AAAAGGCSAG 500 PGGCGGAGAG GCAAUCGGCA CGATGGCCTT TACCAGGA^A СССАГТТССА 550 AGCAdTGCAG TTCGGGAAC? GAAGAGEIGAG AGAAGGTTCA t^iACTCACAA 1600 GGACCCTTGG G"1AAGAGCC CGCCCCAAAG GIGAAAGCAC CCAGCAGAGT 16зО AGCCAAICGT G^GCCAGCGT CTTCAGCATC CCCACTCTGT GGACTCCATG 1700 GCCACCGAGT AGCAGCTCCC A6CTCTBA 1728 №2 І (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ1 (A) ДЛИНА 1389 пар оснований (B) ТИП нуклеиновая кислота (C) Двуцепочечная (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ТИП МОЛЕКУЛЫ ДНК (геномная) (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ № ATGAACCGCG GAGTCCCTTT 1AGGCACTPG CTCTGGTGC TGCASCTGGC bG G^TCCTCCCA GCAGCCACT'' AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCiiAAAAAG 100 4G70 Gly Pro Ser Pro 335 Lys Val Eel 350 GlJ Ala Giy Met Trp 365 Led Glu Sei: AST lie Gil, •"•hr Ma 330 VaJ teu Pro Thr Trp Ser The Pio Jsl His Дій Rsp Pro 330 39b 385 Cys lyr Ге^ leu йчр Cly Tie Leu Phe H e Tyr Gl/ Val lie 405 410 Ala Leil Tyr Leu Rrg Ala Lys Phe Ser A-g Ser flla Glu Thr Ly5 425 420 40Ci Thr 415 Ala Ala lie -130 Gin Дчр Pro Asn Gxn Lea Гуг Asa Glu Leu Asn 435 йгд Glu Glu Tyr Йзр Val Leu G U Lys Lys Arg Ala Arg 46C Ksl Gly Gly L/s Gin Gil Arg йг-д Агд Asii Pio Glf Glu -170 lib 475 Asn Ala leu Gin Lys Asp Lys Ket Pro Glu йіа Tyv Sar 485 490 Ihr Lys Gly Gig Arg Arg Arg Gly Lys Gly HIE Asp Cly 500 505 Asp SBC riis Phe Gli Ala Val Gin Ph? Gly Asn Arg йсд 515 520 Ь25 Gly Ser Giu Leu Ibr Arg Thr Leu Gly Leu йгд A.a Arcs S3E 530 5^0 Glu Ser Thr Gin Gin Ser Ser Gin Se^ Cys Ala Ser Val 550 s65 °ro Thr L E U Trp Ser fro Trp Єго Pro Ser Ser Ser Ser AST Les. 5ЙЭ Lys Leu 5 0 Leu Gly Arg Asp Pro Glu Gly Val Tyr 430 Glu lie Gly 49b Leu Tyr Gin 510 Glu A rg Glv Pro Lys Gly Phe Sec H e SSO Gin bs,: 575 (2) СВЕДЕНИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ №5 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНО1 СТИ (A) ДЛИНА 462 аминокислот (B) ТИП аминокислота (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ТИП МОЛЕКУЛЫ белок (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ № Xet Азп &rg Gly Val I S A ? Leu Leu Pro Ala 20 i/js Gly йвр Tht Va. І5 1-е Gin ?he His Trp 50 G n Gly Se- Phe Leu 65 A^p Ssi Arg firg See Pro Phe Arg 4 i s Als m - G л Gly 2S Clu L e j Thr Cys ^0 Lys Asn Ssr Азт 55 Thr Lys Giy Pro 70 l e j Trp A50 Gl Leu Leu Leu Val .0 Asn Lys J a l / a l Leu ThL 4e Gin Ser Gly Leu G l i IS Leu Gly 30 Ala Ser Gin Lys Lys 45 H e Lys 11 a L P J G3> SO Lys Leti Д^п flsp йгд 7b Asn Phs Pie Leu H e ^ys АЗІ йіа SC He 57 Ljb Asn jfu ?sp Glr i,ys Lys Je 100 Glu Glu 115 ' e^ Asp Hxs Leu loO Ser Pro Pro Giy Ser Lys AST lie Gli Gly 165 Gin Asp Se™ Gly Thr 180 Jal Glu °he Lys L e 195 see He Val Tvr Lys Lys Glu гю t>he Thr Val Glu 215 Leu A a Lys 225 230 G 1 u Arg Ala Ser Set Gin A . B 245 Lys Asn Lys Glu Val ьег Val 2Є0 Gin Met Gly Lys Lys Leu Pro 27з Pro G] Туе ftla Gly Ser Gly 2S0 295 Thr Gly Lys Leu •Us Gin Glu 310 305 Gin Leu Gl" Lys Asn Leu Thr 325 „ys leu Met Leu Ser Leu Lys 340 u 45349 Asp Че"-" Asa Thr Tyr H e 0э а І G T Leu Leu /a' Phe Gly 120 Lej C o ^ У Gin Ser Leu Thr 1^5 40 Ser Pro Ser Val Gin Cys A-g 155 ISO Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser 170 Trp Thr Cys Thr Val Leo Gin 18е j>sp H e Vaj \а.Х ^eu Ala Pile 200 Git, Glv Glu Cln Val G.u 220 Leu Thr Gly Ser Gly 235 Ser Lys Ser Trp lie 250 Lys йгд Val "*ir Gin 265 Leu H;s Leii Thr „eti 230 AST Leu Thr Let Ala 300 Val Asn Leu Val Val І.Є1Д 75 Asn Gin Lys Lys 1Э0 '.Лп ys Ala Ser 58 Me С Й5П Arg Cli Val Pro Phe Leu Leu Val Leu Cln Lett 10 Iе Leu Leu Pro ftla Ala Thr Cln Gly Ачг Iys V3 Vai Lsu Gly Iys ?0 25 30 lys Gly Asp Th_ Vai Giu Lea Thr Cys Thr АІЙ Ser Gin Lys Lys Ser 5 1 ft g His bja 40 35 4J Trp Lys Asn Ser Asn Gin lie Lys He Leu Gil 55 60 Gill Glv Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro °sr Lys Leu Asi Asp Arg 70 75 65 Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Й Э О Gin Gly Аъ і Phe Pro Leu H e 95 SO E5 Ьу- Asn Leu Lys lie Glu Asp j e r flsp ?hr Tyr lie Cys Glu V