Спосіб лікування естрогенстимульованого раку

1. Спосіб профілактики або лікування естрогенстимульованого раку у сса вця, який включає введення згаданому ссавцю певної кількості сполуки Формули І: 2 (19) 1 3 70925 Ця заявка претендує на пріоритет за Тимчасовою Заявкою №60/055,881; згадану заявку у повному об'ємі включено до цього опису як посилання. Цей винахід було частково здійснено з фінансуванням з боку Національного Інституту Здоров'я (США), грант № NCI P50 С А68438. Уряд США може мати певні права на цей винахід. Цей винахід, взагалі, має відношення до лікування естрогензалежних захворювань та. розладів і, зокрема, до способу лікування естрогензалежних різновидів злоякісних пухлин, зокрема, раку грудної залози, за допомогою антиестрогенів. Рецептор людського естрогену (ER) є членом суперсімейства ядерних рецепторів транскрипційних факторів (Еванс (Evans), Science 240:889-895 (1988)). У разі відсутності гормону згаданий рецептор знаходиться у ядрі клітин-мішеней у транскрипційно пасивному стані. Після зв'язування з лігандом ER зазнає інформаційної зміни, яка ініціює каскад явищ, кінцевим наслідком яких є зв'язування згаданого рецептору зі специфічними регуляторними ділянками у межах генів-мішеней (О'Маллі (O'Malley) та інші, Hormone Research 47:1-26 (1991)). Наслідковий ефект на транскрипцію опиняється під впливом клітинного та промоторного контексту ДНК-зв'язаного рецептору (Тора (Тога) та інші, Cell 59:477-487 (1989); Тассет (Tasset) та інші, Cell 62:1177-1187 (1990); МакДоннелл (McDonnell) та інші, Моl. Endocrinol. 9:659-669 (1995); Цукерман (Tzukerman) та інші, Моl. Endocrinol. 8:21-30 (1994)). Саме таким чином фізіологічний агоніст ЕЖ, естрадіол, здійснює свою біологічну активність у репродуктивній, кістковій та серцево-судинній системах (Кларк (Clark) та Пек (Peck), Female Sex Steroids:Receptors and Functions (eds) Monographs on Endocrinology, видавництво Springer-Verlag, Нью-Йорк (1979); Чоу (Chow) та інші, J. Clin. Invest. 89:74-78 (1992); Ікер (Eaker) та інші, Circulation 88:1999-2009 (1993)). Було показано, що, на додаток до цих активностей, естроген функціонує як мітоген у більшості ER-позитивних клітин ракових пухлин гр удної залози. Завдяки цьому схеми лікування, які залучали антиестрогени, тобто синтетичні сполуки, які протидіють діям естрогену, виявились клінічно ефективними відносно призупинення або уповільнення прогресування згаданої хвороби (Джордан (Jordaji) та Мерфі (Murphy), Endocrine Reviews 11:578-610 (1990); Паркер (Parker), Breast Cancer Res. Treat. 26:131-137 (1993)). Доступність згаданих синтетичних ER-модуляторів та подальше вивчення механізму(-ів) їхньої дії забезпечили корисне розуміння та правильне уявлення про дію ER. Однією з найбільш вивчених сполук у цьому відношенні є тамоксифен (Джордан (Jordan) та Мерфі (Murphy), Endocrine Reviews 11:578-610 (1990)). Ця сполука функціонує як антагоніст у більшості ER-позитивних пухлин грудної залози, однак демонструє парадоксальну агоністичну активність у кістковій тканині та серцево-судинній системи та часткову агоністичну активність у матці 4 (Кедар (Kedar) та інші, Lancet 343:1318-1321 (1994); Лав (Love) та інші, New Engl. J. Med. 326:852-856 (1992); Лав (Love) та інші, Ann. Intern. Med. 115:860-864 (1991)). Таким чином, згадана агоністична/антагоністична активність комплексу ЕК-тамоксифен знаходиться під впливом клітинного контексту. Це важливе спостереження знаходиться у явному протиріччі до довготривалих моделей, які стверджують, що лише ER існує у клітині у активному або пасивному стані (Кларк (Clark) та Пек (Peck), Female Sex Steroids:Receptors and Functions (eds) Monographs on Endocrinology, видавництво Springer-Verlag, Нью-Йорк (1979)). Замість цього згадане спостереження вказує на те, що різноманітні ліганди, які діють через той же самий рецептор, можуть демонструвати різну біологічну поведінку у різних клітинах. Визначення механізму згаданої вибірковості буде сприяти розумінню таких процесів, як стійкість до тамоксифену, яка спостерігається у більшості ракових пухлин грудної залози, які мають ER, де припускаються аномалії у ER-сигналізуванні (Тонетті (Tonetti) та Джордан (Jordan), Anti-Cancer Drugs 6:498-507 (1995)). За допомогою підходу in vitro було визначено імовірний механізм клітинно-вибіркової агоністичної/антагоністичної активності тамоксифену (Тора (Тога) та інші, Cell, 59:477-487 (1989); Тассет (Tasset) та інші, Cell 62:1177-1187 (1990); МакДоннелл (McDonnell) та інші, Моl. Endocrinol 9:659-669 (1995); Цукерман (Tzukerman) та інші, Моl. Endocrinol. 8:21-30 (1994)). Важливо те, що було показано, що тамоксифен індукує конформаційну зміну ER, яка відрізняється від відповідної зміни, індукованої естрадіолом (МакДоннелл (McDonnell) та інші, Моl. Endocrinol. 9:659-669 (1995); Бікмен (Beekman) та інші, Molecular Endocrinology 7:12661274 (1993)). Більше того, визначення Послідовностей ER, необхідних для транскрипційної активності, вказує на те, яким чином здійснюється диференційоване розпізнавання згаданих специфічних комплексів ліганду-рецептору клітинним транскрипційним механізмом. Було показано, зокрема, що ER вміщує дві активаційні ділянки, AF-1 (Активаційна Функція-1) та AF-2, які забезпечують можливість його взаємодії зі згаданим транскрипційним апаратом. Відносний вклад згаданих активаційних функцій до загальної ефективності ER є різним у різних клітин (Тора (Тога) та інші, Cell 59:477-487 (1989); МакДоннелл (McDonnell) та інші, Моl. Endocrinol. 9:659-669 (1995); Цукерман (Tzukerman) та інші, Моl. Endocrinol. 8:21-30 (1994)). Було визначено, що естрадіол функціонує як агоніст як AF-1, так AF-2, оскільки він демонструє максимальну активність незалежно від того, яка AF домінує у даному клітинному середовищі. Тамоксифен, з іншого боку, функціонує, як антагоніст AF-2; він пригнічує активність ER у клітинах, де необхідною є AF-2, або де вона є домінуючим активатором (Тора (Тога) та інші, Cell 59:477-487 (1989); МакДоннелл (McDonnell) та інші, Моl. Endocrinol. 9:659-669 5 70925 6 (1995); Цукерман (Tzukerman) та інші, Моl. де Endocrinol. 8:21-30 (1994)). ί, навпаки, тамоксифен R1 - -(CH2)nCR5=CR6R7, -(CH2) mC(X)NR8R9; або функціонує як агоніст у випадках, коли необхідною є лише AF-1 (МакДоннелл (McDonnell) та інші, Моl. Endocrinol. 9:659-669 (1995); Цукерман (Tzukerman) та інші, Моl. Endocrinol. 8:21-30 (1994)). Унаслідок цього, виходячи з їхньої відносної AF-1/AF-2 активності, було визначено чотири R2 та R3 незалежно є Н, -СН3, -ОН, -ОСН3, механістично різні групи ER-модуляторів: повні ОСН2СН3 або -СН(СН3)2; агоністи (наприклад, естрадіол), два різні класи R4 - -CN, -NO2, -СН3, -СН2СН3, -CH2CH2-Y або часткових агоністів, представлених тамоксифеном Y; та ралоксифеном, а також чисті антагоністи, реR5 та R6 незалежно є Н, -С1-С4алкіл, -С2презентативним членом яких є ІСІ182,780 (МакС4алкеніл, -С2-С4алкініл, -Х-С1-С3алкіл, -Х-С2Доннелл (McDonnell) та інші, Моl. Endocrinol. С4алкеніл, -Х-С2-С4алкініл або -Y; 9:659-669 (1995); Цукерман (Tzukerman) та інші, R7--CN, -С1-С4алкіл-ОН, -C(O)NR10R11, Моl. Endocrinol. 8:21-30 (1994)). Ці результати наC(O)NR12R13, -С1-С4алкіл-NR10R11, -C(O)R12, дають механістичне пояснення різницям, які споC(O)OR 12, -C(O)NR 12OR13, -C(O)NHC(O)R 12, стерігались у біологічних активностях деяких ERC(O)NHCH2R12, -C(NH2)(NOR12), -S(O)R12, модуляторів, та вказують на те, що механізм дії S(O)(O)(OR12), S(O)(O)(NHCO2R12), PO3R12, ER у різних тканинах не є ідентичним. Цікаво те, P(O)(NR12R13)(NR12R 13), -P(O)(NR12R13)(OR14), що агоністична активність, яку демонструють ERCONR12(CH2)q OCH3, -CONR12(CH2)q NR8R9 оксадіамодулятори, наприклад, естроген та тамоксифен, зол, заміщений метилом; у згаданих системах in vitro, відбиває їхню активR8 та R9 незалежно є водень, -С1-С7алкіл, -С3ність у статеви х шля ха х тварин у цілому. Ця кореС7циклоалкіл, -О-С1-С7алкіл, -С1-С7 алкіл-Y або ляція, однак, не поширюється на кісткову тканину, феніл; де естрадіол, тамоксифен та ралоксифен, які деR10 та R11 незалежно є метил або етил, або, монструють різний ступінь AF-1/AF-2 агоністичної взяті разом, утворюють морфолінову гр упу, зв'яактивності, усі ефективно захищають модель, роль зану через атом азоту; якої відіграють оваріоектомізовані пацюки, проти R12, R13 та R14 незалежно є Н, -С1-С12алкіл, остеопорозу. Таким чином, видається, що ERС2-С12алкеніл, -С2-С12алкініл, -О-С1-С12алкіл, -Омодулятори усіх відомих класів, за виключенням С2-С12алкеніл, -О-С2-С12алкініл, -С3стероїдно чистих антиестрогенів (наприклад, С7циклоалкеніл, -С3-С7циклоалкеніл нерозгалужеІСІ182780), забезпечують захист людей та відповіний або циклічний гетероалкіл, арил, гетероарил дних тваринних моделей проти остеопорозу, у той або - Y; час як у інши х тканинах вони демонструють різні X - кисень або сірка; рівні естрогенної активності (Чоу (Chow) та інші, J. Υ - водень; Clin. Invest. 89:74-78 (1992); Лав (Love) та інші, n - ціле число, яке вибирають з-посеред 0, 1 New Engl. J. Med. 326:852-856 (1992); Дрепер або 2; (Draper) та інші, Biochemical Markers of Bone and m - ціле число, яке дорівнює 1 або 2; Lipid Metabolism in Helalthy Postmenopausal ρ - ціле число, яке вибирають у межах від 1 до Women. У: K. Крістіансен (С. Christiansen) та Б. Біс 4; (В. Biis) (редактори) Proceedings 1993. Fourth Interq - ціле число у межах від 1 до 12; national Symposium on Osteoporosis and Consensus або фармацевтично прийнятних солей цех Development Conference, Handelstrykkeriet, Aalborg; сполук. Вагнер (Wagner) та інші, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Цілі та переваги цього винаходу стан уть зро93:8739-8744 (1996); Блек (Black) та інші, J. Clin. зумілими з опису, який наведено далі. Invest. 93:63-69 (1994). Фігури 1А та IB. GW5638 механістично відрізОснову цього винаходу становить ідентифікуняється від ER-модуляторів відомих класів. Людвання ER-модуляторів, які механістично відрізняський промотор С3 (від -1807 до +58), злитий з ються від таких модуляторів, як тамоксифен. Ці геном-сигналізатором люциферази світлячків, модулятори знаходять застосування під час лікутрансфектували разом з плазмідою експресії, яка вання різноманітних естрогензалежних захворювміщувала (Фіг.1А) рецептор людського естрогену вань та розладів, у тому числі раку грудної залози. дикого типу (Erwt) або (Фіг.1В) мутований ER, AF-2 Ці модулятори мають особливе значення при лікуякого було пошкоджено (ER-TAF1), до клітин вання різновидів злоякісних пухлин гр удної залози, HepG2 та випробували на транскрипційну активаякі є стійкими до тамоксифену de novo або які націю у присутності зростаючих концентрацій ERбули стійкості під час лікування. модулятору, як вказано. Трансфекції було нормаЗокрема, способами, запропонованими цим лізовано за ефективністю та кількістю клітин шлявинаходом, передбачено застосування сполуки хом котрансфектування плазміди експресії, яка Формули І: вміщувала β-галактозидазу. Нормалізовану реакR цію було одержано шляхом ділення світлових одиниць на активність β-галактозидази, яку було R визначено за допомогою ферментативного методу R аналізу. Було здійснено потрійні трансфекції. Наведені дані є репрезентативними для численних R експериментів, які було здійснено за подібних 1 2 3 4 7 70925 8 умов. ваних контрольних пацюків (n=7), пацюків, яких Фігури 2 А-2С. GW5638 та GW7604 протидіють було піддано обробці естрадіолом (n=7) та агоністичній активності естрадіолу, частковій агоGW5638 (n=7), як зазначено. Зірочками помічено ністичній активності тамоксифену та зворотній групи, які мають статистично значущу різницю поагоністичній активності ІСІ182780. Фіг.2А. Здатрівняно до оваріоектомізованих контрольних тваність GW5638 або GW7604 до пригнічення агонісрин. Зазначено діапазон рівню вмісту холестерину у сироватці оваріоектомізованих тварин (пробільтичної активності 10-8М 17-b-естрадіолу або часткової агоністичної активності, яку демонструє 10ний стовпчик). 8 Фігура 5. GW5638 не демонструє ER-агоністиМ тамоксифен, оцінювали на клітинах HepG2, які чної активності у матках нестатевозрілих пацюків. було трансфектовано ERwt. Фіг.2В. Здатність Групи пацюків 21-денного віку обробляли перораGW5638 або GW7604 до пригнічення агоністичної льно лише носієм, GW5638 або тамоксифеном, активності 10-8М 17-b-естрадіолу або часткової поодинці, GW5638 або тамоксифеном у присутноагоністичної активності, яку демонструє 10-8М 4сті естрадіолу. Наведені дані представляють соОН тамоксифен, оцінювали на клітинах HepG2, які бою середнє значення (±середня квадратична побуло трансфектовано ER-TAFI (МакДоннелл милка середнього). Зазначено діапазон вимірів, які (McDonnell) та інші, Моl. Endocrinol. 9:659-669 було здійснено на тваринах, які було піддано об(1995)) Фіг.2С. Як GW5638, так і GW7604 можуть робці естрадіолом (заштрихований стовпчик) та пригнічувати демонстрацію зворотної ER-агоністинесправжній оваріоектомії (пробільний стовпчик). чної активності ІСІ182780 (ІСІ) відносно СЗ промоФігура 6. Вплив GW5638 на масу матки оварітору у разі випробувань на клітинах HepG2 у заоектомізованих пацюків у вологому стані. Групи значених концентраціях. Трансфекції було нормапацюків 90-денного віку, які було піддано несправлізовано за ефективністю та кількістю клітин шляжній оваріоектомії або оваріоектомізованих, оброхом котрансфектування плазміди експресії, яка бляли впродовж 28 днів лише носієм, естрадіолом вміщувала b-галактозидазу. Нормалізовану реакабо GW5638. Наведені результати представляють цію було одержано шляхом ділення світлових середню масу матки у вологому стані (±середня одиниць на активність b-галактозидази, яку було квадратична помилка середнього) для 7 пацюків визначено за допомогою ферментативного методу на групу. Зазначено діапазон вимірів, які було аналізу. Наведено результати репрезентативних здійснено на тваринах, які було піддано несправжвипробувань, під час проведення яких було здійсній оваріоектомії (заштрихований стовпчик), та нено потрійні трансфекції. Стовпчиками помилок оваріоектомізованих (пробільний стовпчик) тварипредставлено середню квадратичну помилку сенах. реднього. Фігури 7A-7F. Вплив GW5638 на гістологію маФігури ЗА та ЗВ. GW5638 захищає оваріоектки оваріоектомізованих пацюків. Порівняльна гітомізованих пацюків проти остеопорозу. Фіг.3 А. стологія (слабке збільшення) маток пацюків 90Вплив GW5638 на мінеральну густин у кісткової денного віку, які було піддано несправжній оваріотканини (BMD) поперекового відділу хребту (L1-L4) ектомії (Фіг.7А), оваріоектомізованих (Фіг.7В), які визначали за допомогою подвійної рентгенівської було піддано оваріоектомії плюс обробці естрадіоабсорбціометри. Статистичну значущість різниці лом (Фіг.7С) або піддано оваріоектомії плюс обропоказників мінеральної густини кісткової тканини бці GW5638 у дозі 1мкг/кг (Фіг.7D), у дозі 3мкг/кг між оваріоектомізованими пацюками та пацюками, (Фіг.7Е) або у дозі 10мкг/кг (Фіг.7F). які було піддано обробці, визначали за допомогою Фігури 8A-8D. Вплив GW5638 на гістологію макритерію Даннету (Punnets's test) (*р£0,005). Затки оваріоектомізованих пацюків. Порівняльна гізначено діапазон показників мінеральної густини стологія маток пацюків 90-денного віку, яких було кісткової тканини, які спостерігались у пацюків, піддано несправжній оваріоектомії (Фіг.8А), оваріяких було піддано несправжній оваріоектомії (заоектомізованих (Фіг.8В), яких було піддано оваріоштри хований стовпчик), та у оваріоектомізованих ектомії плюс обробці естрадіолом (Фіг.8С) або підтварин (пробільні стовпчики). Фіг.3В. Вплив дано оваріоектомії плюс обробці GW5638 у дозі GW5638 на мінеральну густину кісткової тканини 10мкг/кг (Фіг.8D). Фотографії було зроблено зі проксимального метафізу великогомілкової кістки 150´збільшенням з подальшим доведенням до у оваріоектомізованих пацюків визначали за допо600´збільшення. могою кількісної комп'ютеризованої томографії Фігура 9. Вплив антиестрогенної обробки на (QCT). Статистичн у значущість різниці показників ракові пухлини MCF-7 грудної залози "голих" мимінеральної густини кісткової тканини між оваріоешей. День 0 означає перший день обробки; через ктомізованими пацюками та пацюками, яких було 2 тижні після інокуляції пухлин статистичним анапіддано обробці (позначено зірочками), визначали лізом було виявлено, що кожна експериментальна за допомогою критерію Теркі-Крамеру (Turkeyгрупа демонструвала статистично значущий вплив Kramer test) (р£0,05). порівняно до контрольної групи (дисперсійний Фігура 4. GW5638 пригнічує підвищення рівня аналіз, р