Гонадотропіни для стимулювання фолікулогенезу

1. Фармацевтична композиція, яка містить препарат рекомбінантного FSH, причому число Z цього препарату дорівнює щонайменше або приблизно 200. 2. Фармацевтична композиція за п. 1, причому число Z дорівнює щонайменше або приблизно 210. 3. Фармацевтична композиція за п. 1, причому число Z дорівнює щонайменше або приблизно 220. 4. Фармацевтична композиція за п. 1, причому число Z дорівнює щонайменше або приблизно 230. 5. Фармацевтична композиція за п. 1, причому число Z дорівнює щонайменше або приблизно 240. 6. Фармацевтична композиція за п. 1, причому число Z дорівнює щонайменше або приблизно 250. 7. Фармацевтична композиція за п. 1, причому число Z дорівнює щонайменше або приблизно 260. 8. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 1-7 для застосування при регульованій гіперстимуляції яєчників. 9. Застосування фармацевтичної композиції за будь-яким із пп. 1-7 при фолікулогенезі. 10. Застосування фармацевтичної композиції за будь-яким із пп. 1-7 для виготовлення лікарського засобу для застосування при фолікулогенезі. 11. Спосіб одержання фармацевтичної композиції за будь-яким із пп. 1-7, який включає проведення реакції FSH із донором сіалової кислоти у присутності 2,3-сіалілтрансферази. 12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що донором сіалової кислоти є СМР-сіалова кислота. 13. Спосіб за будь-яким із пп. 11-12, який відрізняється тим, що сіалілтрансферазою є ST3Gal III пацюків. 14. Спосіб одержання фармацевтичної композиції за будь-яким із пп. 1-7, який включає стадію іонообмінного хроматографування. (19) (21) 20040402998 (22) 15.10.2002 (24) 27.07.2009 (86) PCT/EP02/11501, 15.10.2002 (31) 60/338,088 (32) 22.10.2001 (33) US (46) 27.07.2009, Бюл.№ 14, 2009 р. (72) ЛУМЕ ЕРНЕСТ, FR, ДЖАРТОЗІО КАРЛО ЕМАНУЕЛЕ, IT (73) ЕПЛАЙД РІСЬОРЧ СИСТЕМЗ ЕРС ХОЛДІНГ Н.В., AN (56) STANTON P. G. et al.: "Structural and functional characterization of hFSH and hLH isoforms" MOLECULAR AND CELLULAR ENDOCRINOLOGY (1996), 125(1,2, GONADOTROPINS AND THEIR RECEPTORS: STRUCTURE, FUNCTION AND MOLECULAR FORMS), 133-141. ZAMBRANO E. et al.: "Studies on the relative in vitro biological potency of the naturally-occurring isoforms of intrapituitary follicle stimulating hormone" MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION (1996), 2(8), 563-571. TIMOSSI C. M. et al.: "Differential effects of the charge variants of human follicle -stimulating hormone" JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY, 2000, 165(2), 193-205. ZAMBRANO E. et al.: "Receptor binding activity and in vitro biological activity of the human FSH charge isoforms as disclosed by heterologous and homologous assay systems implications for the structure-function relationship of the FSH variants" ENDOCRINE, 1999, 10(2), 113-121. Olijvel W. at al. Recombinant hormones: Molecular biology and biochemistry of human recombinant follicle stimulating hormone (Puregon®). 1996, Mol.Hum.Reproduction, Vol.2, N 5, P.371-382. C2 2 UA 1 3 Передумови створення винаходу Гонадотропіни являють собою групу гетеродимерних глікопротеїнів, до якої належать фолікулостимулювальний гормон (FSH), лютеїнізуючий гормон (LH) та хоріонічний гонадотропін (CG). Ці гормони регулюють функцію статевих залоз чоловіка та жінки. Кожен із цих гормонів складається з двох нековалентно зв'язаних субодиниць: α-субодиниці, яка є спільною для FSH, LH та hCG, і βсубодиниці, яка є інакшою для кожного з них і яка наділяє кожен із цих гормонів біологічною специфічністю. Кожна субодиниця усіх гонадотропінів має зв'язані з аспарагіном (N-зв'язані) бічні олігосахаридні ланцюги. У однакової α-субодиниці згаданих людських гормонів згадані бічні олігосахаридні ланцюги приєднані у положеннях 52 та 78. У людських FSH та CG два N-зв'язані бічні олігосахаридні ланцюги приєднані до β-субодиниці у положеннях 7 та 24 у FSH та у положеннях 13 та 30 у hCG. У людського LH один олігосахарид є приєднаним до β-субодиниці у положенні 30. hCG додатково має чотири зв'язані із серином (О-зв'язані) бічні олігосахаридні ланцюги, які знаходяться на карбоксильній кінцевій ділянці (СТР). Як і в усіх глікопротеїнів, у гонадотропінів також відбуваються зміни у структурі олігосахаридів, наслідком чого є сукупність ізоформ, що знаходяться у гіпофізі та у системі кровообігу. Крім того, можливі різні ступені "покриття" (блокування) кінцевого вуглеводу сіаловою кислотою. Ізоформи можуть розрізнятися виходячи з їхнього заряду, що значною мірою визначається кількістю та розподілом сіалілованих N-зв'язаних олігосахаридів. Високосіаліловані форми будуть мати більш кислу, аніж середня, рl, і їх називають "кислими". Менш сіаліловані форми мають порівняно вищі рl, і їх називають "основними". Як наслідок їхніх структурних відмінностей, ізоформи гонадотропінів різняться за їхньою здатністю до зв'язування з рецепторами клітинмішеней. Ступінь сіалілування впливає на їхню здатність до виживання у системі кровообігу. У разі FSH, декілька груп дослідників продемонстрували, що ізоформи високого ступеня кислотності/сіалілування мають значно довші періоди напіввиведення з плазми у тваринних моделей, наприклад, мишей та пацюків [1]. Відомо, що профіль ізоформ ендогенного FSH у людей змінюється. Кислі ізоформи з тривалими періодами напіввиведення in vivo та відносно низькою біологічною активністю in vitro переважають у сироватці дітей передпубертатного віку, пацієнтів, хворих на гіпогонадизм, та у жінок на фолікулярній стадії. У протилежність до цього, менш сіаліловані, більш основні ізоформи з короткими періодами напіввиведення in vivo та порівняно високою біологічною активністю in vitro виявляються у період статевого дозрівання, лікування із застосуванням GnRH (гонадотропінвивільнювального гормону) та приблизно на середині циклу секреції гонадотропіну у жінок [2]. Ізоформи FSH, що мають більший вміст сіалової кислоти, циркулюють у системі кровообігу 87433 4 впродовж довших періодів часу, оскільки кінцеві залишки сіалової кислоти "покривають" (блокують) залишки галактози, завдяки чому запобігається взаємодія з асіало-глікопротеїновими рецепторами печінки та видалення з кровообігу [3]. Олігосахаридні (гліканові) складові, приєднані до білків, є розгалуженими, і кожен кінцевий залишок цукру називають антеною. Параметр зарядове число Ζ" є критерієм того, яка частка антен вуглеводних складових глікопротеїну несе заряджені залишки, наприклад, сіалову кислоту. Число Ζ десіалілованого FSH дорівнює 0. Число Ζ повністю сіалілованого FSH може знаходитись у межах від приблизно 230 до 280. Активність препаратів FSH визначають in vitro за допомогою аналізу Стілмена-Полі (SteelmanPohley) шляхом порівняння, за визначених умов, здатності препарату до збільшення маси яєчників нестатевозрілих пацюків зі здатністю міжнародного стандартного/еталонного препарату, відкаліброваного у Міжнародних Одиницях (IU) [4]. Багато груп досліджували роль глікозилування та сіалілування щодо впливу на біологічний профіль FSH. Д'Антоніо (D'Antonio) та інші визначали у пацюків-самиць швидкість метаболічного очищення (MCR) кислих (рІ4,8) ізоформ rhFSH (рекомбінантний людський фолікулостимулювальний гормон), які були одержані шляхом хроматофокусування. Як і очікувалось, було встановлено, що основні ізоформи мають більш високу швидкість очищення, аніж кислі ізоформи (t1/2=0,4год для основних, 0,9год для кислих). Під час порівняння кислих та основних форм (на масовій основі) у аналізі Стілмена-Полі було встановлено, що основна ізоформа є значно менш активною, аніж кисла ізоформа (ED50=0,9 мкг/пацюка для основної, 0,3 мкг/пацюка для кислої). У разі порівняння ізоформ на основі IU, різниці між двома ізоформами виявлено не було [5]. Вітт (Vitt) та інші провели in vitro дослідження, у якому чотири препарати рекомбінантного людського FSH з різними рl порівнювали за їхньою здатністю до спричинення збільшення розміру та підвищення продукування естрадіолу (Е2) ізольованими мишачими фолікулами. Було встановлено, що основний FSH (pl 5,0-5,6) викликав швидший ріст фолікулів, наслідком чого був їхній найбільший максимальний розмір; слідом за ним йшов нефракціонований рекомбінантний FSH. Препарати FSH із середнім значенням ізоелектричної точки (рl 4,5-5,0) та кислі (рl 3,6-4.6) залишались позаду як за швидкістю росту, так і за максимальним розміром фолікулів. Було показано, що основний FSH індукував секрецію Е2 раніше та у меншій дозі, аніж інші ізоформи. Фолікули, культивовані з кислим FSH, незалежно від концентрації, секретували концентрації Е2, що піддавались визначенню, лише після тривалого інкубування [6]. Тімоссі (Timossi) та інші застосовували хроматофокусування для розподілу людського гіпофізарного FSH на сім різних фракцій різного ступеня глікозилування/кислотності. Одержані фракції перевіряли на їхню здатність до спричинення активації експресії ароматази (необхідної для продуку 5 вання естрадіолу) та тканинного активатора плазміногену (tPA) in vitro у зернистих клітинах яєчника пацюків. Було встановлено, що відношення біоактивності до імунореактивності (В/І) зменшувалось зі зниженням значення рН елюйованих ізоформ. Автори дійшли висновку, що основні ізоформи демонстрували більшу здатність до індукування експресії мРНК як ароматази, так і tPA, та білків, аніж кислі варіанти [7]. Замбрано (Zambrano) та інші фракціонували людський гіпофізарний FSH на 9 фракцій з різними рl за допомогою хроматофокусування і випробували кислі та основні ізоформи за допомогою трьох імуноаналізів та двох аналізів in vitro: продукування естрадіолу зернистими клітинами яєчника пацюків та продукування цАМФ лінією клітин людського зародка, що експресує рецептор FSH. Відношення активності у біоаналізах до імунореактивності (В/І) зменшувалось зі зниженням рl ізоформ в усіх біоаналізах [8]. Під час проведення додаткового дослідження Замбрано (Zambrano) та інші порівнювали спорідненість семи різних фракцій кислих та основних ізоформ людського гіпофізарного FSH до зв'язування з гетерологічною рецепторною системою (зернисті клітини яєчника пацюка) та гомологічною рецепторною системою (лінія людських рекомбінантних клітин НЕК-293 (культура клітин нирки людського ембріона), що експресує рецептор людського FSH). Гетерологічний рецептор продемонстрував підвищення спорідненості до зв'язування у разі зростання рl ізоформ, у той час як у гомологічного рецептора подібного не спостерігалось. Продукування цАМФ клітинами НЕК-293 також зростало при підвищенні рі лізоформ [9]. Дослідження показали, що кисліші форми FSH демонструють найвищу біоактивність in vivo (на масовій основі) у разі її визначення за допомогою класичних тестів на зростання маси яєчників [1011]. Тімоссі (Timossi) та інші висунули припущення, яке полягає у тому, що основні форми можуть бути більш активними in vivo, однак із причини коротшого періоду напіввиведення цей ефект не може спостерігатись на прирості маси яєчників пацюків. Вони досліджували ефект двох препаратів на системі швидкого реагування: позитивна регуляція активності tPA [12]. Автори дійшли висновку, що rhFSH, який має менш кислий профіль розподілу зарядів, демонструє вищу біоактивність in vitro, більшу швидкість плазмового кліренсу і індукує активність ферменту tPA швидше, аніж препарат FSH високого рівня кислотності. Гонадотропіни відіграють вирішальну роль у репродуктивному циклі, і їх застосування є незамінним у разі методик допоміжної репродукції (ART), наприклад, запліднення in vitro (IVF), IVF у поєднанні з інтрацитоплазматичним введенням сперми (IVF/ICSI) та трансплантацією ембріона (ЕТ), а також для індукції овуляції (01) у ановуляторних пацієнтів, що піддаються заплідненню in vivo природним шляхом або шляхом внутрішньоматкового запліднення (IUI). ART, за типовим варіантом, здійснюють із застосуванням регульованої гіперстимуляції яєчників (СОН) для збільшення кількості жіночих гамет [13]. 87433 6 Стандартні режими [14] СОН включають фазу регуляції за типом негативного зворотного зв'язку, впродовж якої секреція ендогенних гонадотропінів пригнічується шляхом введення агоніста гонадотропін-вивільнювального гормону (GnRH) з подальшою стимулювальною фазою, під час якої розвиток фолікулів (фолікулогенез) індукується щоденним введенням фолікулостимулювального гормону (FSH), як правило, у дозі приблизно 150225 МОд на добу. За альтернативним варіантом стимулювання розпочинають після спонтанної або індукованої менструації із запобіганням явища несвоєчасного викиду LH шляхом введення антагоніста GnRH (із започаткуванням, як правило, приблизно на шостий день стимулювальної фази). У разі утворення щонайменше 3 фолікулів >16мм (одного 18мм), вводять одноразову ударну дозу hCG (людського хоріонічного гонадотропіну) (510000 МОд) для імітування викиду природного LH та індукування овуляції. Виділення овоцитів здійснюють через 36-38год після ін'єкції hCG. Індукцію овуляції (ОІ), за типовим варіантом, здійснюють шляхом щоденного введення FSH у дозі приблизно 75-150 МОд на добу. Може застосовуватись регуляція за типом негативного зворотного зв'язку за допомогою агоністів або антагоністів GnRH, хоча і з меншою частотою, аніж у тому разі, коли показаною є методика допоміжної репродукції (ART). hCG вводять для імітування викиду LH перед заплідненням in vivo, яке досягається шляхом звичайного статевого акту або шляхом внутрішньоматкового запліднення (IUI). Типові режими ART та OI, опис яких було наведено вище, вимагають щоденних ін'єкцій гонадотропінів впродовж тривалого періоду часу, тобто у середньому впродовж 10 днів, а у деяких пацієнтів до 21 дня. Розробка препаратів FSH підвищеної ефективності надала б можливість зниження щоденної дози та/або забезпечила б можливість скорочення періоду лікування (тобто здійснення меншої кількості ін'єкцій) та/або дозволила б робити ін'єкції не так часто. Завдяки цьому режими ART та OI стали б зручнішими та більш прийнятними для пацієнтів. Крім того, ART із застосуванням запліднення in vitro пов'язуються із можливими невдачами. Наприклад, не кожен фолікул дасть життєздатний овоцит, не кожен життєздатний овоцит буде успішно заплідненим і деякі ембріони можуть виявитись нежиттєздатними. Більше того, після завершення відбирання життєздатних ембріонів, невдалими можуть бути перенесення до матки та імплантація. З метою підвищення до максимального рівня шансів народження живої дитини, бажано було б стимулювати ріст та визрівання декількох фолікулів для забезпечення можливості збирання численних овоцитів. У протилежність до цього,у разі, коли показаною є OI, ціль полягає у одержанні не більше трьох, і за варіантом, якому віддають перевагу, одного основного фолікула (для запобігання багатоплідної вагітності). Деякі пацієнти, що піддаються ART та OI, у разі лікування стандартними препаратами FSH дають зменшену кількість фолікулів, що ростуть. Це 7 обмежувальний фактор для досягнення успіху у разі здійснення ART, оскільки він обмежує кількість ембріонів, доступних для перенесення та/або кріоконсервування. Це може бути також обмежувальним фактором для досягнення успіху у пацієнтів, що піддаються IUI, де важливим моментом є одержання більше одного фолікула. До пацієнтів, що демонструють реакцію такого типу, належать пацієнти віком понад 33-35 років, пацієнти з підвищеним вихідним рівнем FSH, підвищеним вихідним рівнем естрадіолу або зниженим вихідним рівнем інгібіну b. У чоловіків сперматогенез залежить від стимулювання клітин Сертолі FSH. Наслідком недостатності FSH є олігоспермія і, звідси, безплідність. Лікування чоловічої безплідності стандартними препаратами FSH вимагає ін'єкцій FSH тричі на тиждень впродовж періоду часу до 18 місяців. Розробка препаратів FSH із підвищеною здатністю до стимулювання фолікулогенезу є нагальною необхідністю. Існує також потреба у нових препаратах FSH для лікування пацієнтів зі зниженою реакцією на FSH. Бажаними є також препарати FSH підвищеної ефективності, що надають можливість скорочення тривалості лікування та/або зниження сумарних доз та/або більш рідкого введення доз у разі ART, ΟΙ або чоловічої безплідності. Короткий виклад суті винаходу Ціль цього винаходу полягає у наданні гонадотропінового препарату для застосування у індукції овуляції та СОН, зокрема, у поєднанні із ART. За першим аспектом, цей винахід пропонує препарат FSH, де число Ζ згаданого препарату дорівнює щонайменше або приблизно 200. За другим аспектом, цей винахід пропонує препарат FSH, де середнє значення рI згаданого препарату дорівнює щонайбільше або приблизно 3,4. За третім аспектом, цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, що містить FSH, де число Ζ FSH дорівнює щонайменше або приблизно 200. За четвертим аспектом, цей винахід пропонує застосування FSH для стимулювання фолікулогенезу, де число Ζ FSH дорівнює щонайменше або приблизно 200. За п'ятим аспектом, цей винахід пропонує застосування FSH для одержання лікарського засобу для застосування з метою стимулювання фолікулогенезу, де число Ζ FSH дорівнює щонайменше або приблизно 200. За шостим аспектом, цей винахід пропонує спосіб індукування фолікулогенезу у пацієнталюдини, де згаданий спосіб включає введення FSH пацієнту, де число Ζ FSH дорівнює щонайменше або приблизно 200. За сьомим аспектом, цей винахід пропонує спосіб одержання препарату FSH, число Ζ якого дорівнює щонайменше або приблизно 200, де згаданий спосіб включає стадію, вибрану з наведених нижче: - реагування FSH із донором сіалової кислоти у присутності 2,3-сіалілтрансферази; 87433 8 - вибір клітини відповідного типу для експресії рекомбінантного FSH; - культивування клітини, за варіантом, якому віддають перевагу, рекомбінантної, що експресує FSH, за умов, що сприяють високим рівням сіалілування; та - виділення ізоформ FSH, що мають високе число Z, за допомогою хроматографічних методів. За восьмим аспектом, цей винахід пропонує застосування FSH для лікування чоловічої безплідності, де число Ζ FSH дорівнює щонайменше або приблизно 200. За дев'ятим аспектом, цей винахід пропонує застосування FSH для одержання лікарського засобу для застосування з метою лікування чоловічої безплідності, де число Ζ FSH дорівнює щонайменше або приблизно 200. За десятим аспектом, цей винахід пропонує спосіб лікування чоловічої безплідності у пацієнталюдини, де згаданий спосіб включає введення FSH пацієнту, де число Ζ FSH дорівнює щонайменше або приблизно 200. Короткий опис фігур На Фіг.1 показана хроматограма елюювання гліканів, вивільнених із rFSH, через колонку GlycoSep® С; колонка 4,6мм×100мм, заповнена дивінілбензольною смолою, покритою полімером (5м), із рухомою фазою ацетонітрил:вода (20:80), з лінійним градієнтом (0,25%/хв) ацетату амонію (500мМ) з 5хв до 21хв із подальшим застосуванням лінійного градієнта (0,525%/хв) ацетату амонію (500мМ) з 21хв до 61хв. На осі X показано час утримання у хвилинах, на осі Υ показано інтенсивність сигналу у мВ. На Фіг.2 показана кількість фолікулів на розмірну категорію на 8 день (по осі Υ) у пацієнтів, що одержують кислу та основну ізоформи FSH до дня 7. Хвилясті лінії зображають результат із кислими ізоформами, навскісні лінії зображають результат з основними ізоформами. На Фіг.3 показана кількість фолікулів на розмірну категорію на 10 день (по осі Υ) у пацієнтів, що одержують кислу та основну ізоформи FSH до дня 7. Хвилясті лінії зображають результат з кислими ізоформами, навскісні лінії зображають результат з основними ізоформами. На Фіг.4 показані середні сироваткові рівні FSH у пацієнтів після останньої дози кислої та основної ізоформ FSH. По осі X представлено час у годинах з моменту здійснення першої ін'єкції FSH, по осі Υ представлено сироваткову концентрацію у імунореактивних міжнародних одиницях/л (IU/L). Квадратами ( ) позначено сироваткову концентрацію після ін'єкції кислих ізоформ; ромбами (♦)позначено сироваткову концентрацію після ін'єкції основних ізоформ FSH. Сироваткові концентрації визначали імуноаналізом, наприклад, радіоімуноаналізом, із застосуванням набору, який постачається фірмою Daiichi Isotope Laboratory (Японія). На Фіг.5 показана амінокислотна послідовність альфа-субодиниці зрілого людського FSH. На Фіг.6 показана амінокислотна послідовність бета-субодиниці зрілого людського FSH. 9 Докладний опис винаходу Винахідники несподівано виявили, що ізоформи FSH із високим рівнем сіалілування мають більшу ефективність щодо індукування фолікулогенезу у пацієнтів-людей, аніж менш сіаліловані ізоформи. Застосування препарату FSH за цим винаходом надає можливість застосування менших сумарних доз FSH для досягнення такого самого або кращого клінічного результату. Винахідники встановили, що у разі лікування пацієнтів однаковими кількостями (виміряними в міжнародних одиницях (IU)) кислого FSH та основного FSH, за результатами стандартного аналізу виявляється, що кількість фолікулів, що ростуть, у пацієнтів, яких лікують кислим FSH, є значно більшою. Коли пацієнтів лікують однаковими кількостями (вимірянами як маса) кислого FSH та основного FSH, кількість фолікулів у пацієнтів, яких лікують кислим FSH, також є значно більшою. Деякі пацієнти дають зменшену кількість фолікулів, що ростуть, у разі лікування стандартними препаратами FSH. Це обмежувальний фактор для успіху, у разі застосування методик допоміжної репродукції (ART). До пацієнтів, що демонструють реакцію такого типу, належать пацієнти віком понад 33-35 років, пацієнти з підвищеним вихідним рівнем FSH, підвищеним вихідним рівнем естрадіолу або зниженим вихідним рівнем інгібіну b. Препарат FSH за цим винаходом може впорскуватись один раз на добу або через день для одержання кращої реакції яєчників, аніж зі стандартними препаратами. Це підвищує шанси запліднення яйцеклітини у цих пацієнтів. Винахідники також несподіяно виявили, що препарати FSH, які мають більшу ефективність, уможливлюючи рідше введення дози, можуть бути одержані при використанні FSH, що має число Z, яке дорівнює щонайменше або приблизно 200, за варіантом, якому віддають перевагу, дорівнює або приблизно дорівнює 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 та 290 із порядком переваги, що зростає зі збільшенням числа Ζ (числа Ζ, які знаходяться між цими значеннями, входять, звичайно, до обсягу цього винаходу). Для індукування фолікулогенезу звичайні препарати FSH, взагалі, вводять кожного дня у дозі приблизно 75-600 МОд на добу. У більшості пацієнтів така сама сумарна доза звичайного препарату FSH може вводитись через два дні із досягненням такого самого клінічного результату, який забезпечується щоденними ін'єкціями [15]. Вираз "рідше введення дози" у відношенні препаратів FSH означає, що вони можуть вводитись рідше, аніж через два дні, із досягненням такого самого клінічного результату, з точки зору загального фолікулярного об'єму, який забезпечується звичайними препаратами, що вводяться кожного дня або через два дні. Терміни "кислий" та "основний" широко застосовуються у відношенні препаратів FSH, які мають різні ступені сіалілування. Оскільки сіалова кислота є кислою, молекули більш високого ступеня сіалілування будуть мати нижчі рl. За допомогою ізоелектричного фокусування, хроматофокусування або інших способів розподілу, наприклад, іоно 87433 10 обмінної хроматографії, рідинної хроматографії швидкого розділення (FPLC) та високоефективної рідинної хроматографії (HPLC) [16], суміш ізоформ може бути розділена на фракції, які можуть бути віднесені до кислих або основних, за варіантом, якому віддають перевагу, на основі числа Ζ. Термін "сіалова кислота" означає будь-який член сімейства карбоксилованих цукрів із дев'ятьма атомами вуглецю. Найвідомішим членом сімейства сіалових кислот є N-ацетилнейрамінова кислота (2-кето-5-ацетамідо-3,5-дидезокси-Dгліцеро-D-галактононулопіраноз-1-онова кислота, назва якої часто скорочується, як Neu5Ac, NeuAc або ΝΑΝΑ). Другим членом сімейства є Nгліколілнейрамінова кислота (Neu5Gc або NeuGc), де N-ацетильна група NeuAc є гідроксилованою. Третім членом сімейства сіалових кислот є 2-кето3-дезоксинонулозонова кислота (KDN) [17]. До цього сімейства входять також 9-заміщені сіалові кислоти, наприклад, 9-О-С1-С6-ацил-Neu5Ac, наприклад, 9-О-лактил-Neu5Ас або 9-О-ацетилNeu5Ас, 9-дезокси-9-фтор-Neu5Ас та 9-азидо-9дезокси-Neu5Ас. Огляд сімейства сіалових кислот дивись, наприклад, у Варкі (Varki); Glycobiology 2 1992; 25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). Вуглеводні (за альтернативним варіантом, "гліканові") складові приєднуються до пептидного остову через простий цукор за допомогою О- або N-зв'язаного глікозидного зв'язку. У міру того як вуглеводна складова стає складнішою, може відбуватись розгалуження, унаслідок чого вуглеводна складова має один, два, три або чотири (іноді більше) кінцеві цукрові залишки або "антени". Такі вуглеводні складові називають моно-, ди-, три- або тетрарозгалуженими. Параметр "показник розгалуженості, (АІ)" є критерієм ступеня розгалуженості вуглеводних залишків, а також мірилом об'ємного розміру вуглеводних залишків. Для визначення цього параметра глікопротеїн піддають хімічній обробці для вивільнення усіх вуглеводних залишків, наприклад, шляхом нагрівання з гідразином, або вуглевод може піддаватись розщепленню ферментативними засобами, наприклад, за допомогою ендоглікозидази (N-гліканази) [18]. Суміш вуглеводів виділяють. У разі потреби, суміш вуглеводів реагує з міткою, наприклад, радіоактивною міткою, хромофорною міткою (тобто, міткою, активною у разі опромінення ультрафіолетом), флуорофорною міткою, імунореактивною міткою тощо. Після цього мічена суміш вуглеводів десіалілується за допомогою ферменту сіалідази з одержанням міченої нейтральної суміші вуглеводів. (За альтернативним варіантом стадії мічення та десіалілування можуть здійснюватись у зворотному порядку). Після цього мічена нейтральна суміш вуглеводів розподіляється на складові за допомогою хроматографічного методу, який може розрізнювати різні різновиди (моно-, ди-, три- та тетрарозгалужені). Хроматографування (нормальне або оберненофазове) може здійснюватись по суті за будь-яким методом, у тому числі, наприклад, товсто-або тонкошарове хроматографування або високоефективне рідинне хроматографування 11 (HPLC). За альтернативним варіантом виділена нейтральна суміш вуглеводів може реагувати з агентом для перетворення складових на леткі, і суміш може піддаватись газофазовому хроматографуванню (GC). Візуалізація може здійснюватись за методом, відповідним до мітки та застосованого хроматографічного методу. Наприклад, якщо у ролі мітки було використано флуорофор, для детектування буде застосовуватись флуориметр; якщо у ролі мітки використовується хромофор, для детектування буде застосовуватись УФспектрофотометр. У разі, якщо мітка не використовувалась, для визначення піків та часу утримання можна вдаватись до мас-спектрометрії. Співвіднесення піків з моно-, ди-, три- або тетрарозгалуженими різновидами може здійснюватись за допомогою мас-спектрометрії або шляхом порівняння з відомими стандартами. Після цього хроматограма піддається аналізу шляхом інтегрування піків, що пов'язуються з ди-, три- та тетрарозгалуженими різновидами вуглеводів. Відсоток загального вуглеводу, представлений кожним різновидом, може у подальшому використовуватись для обчислення АІ за наведеним далі рівнянням: АІ = 2 Рdi + 3 Ptri + 4 Ptetra, де ΑΙ - показник розгалуженості, Pdi, Ptri та Ptetra - відсоток загального вуглеводу, що є ди-, три- або тетрарозгалуженим, відповідно. Можуть бути присутніми слідові кількості інших складових (наприклад, монорозгалужених), однак суттєвого внеску до значення АІ вони не додають. Високий індекс розгалуженості вказує на те, що вуглеводні складові є високорозгалуженими, з багатьма "антенами". Рекомбінантний людський FSH має, як правило, АІ у межах від приблизно 220 до 280 або дорівнює у середньому приблизно 255. Параметр "число Z" є мірилом того, скільки "антен" вуглеводних складових глікопротеїну несе заряджені залишки, наприклад, сіалову кислоту. Для визначення числа Z, вуглеводні складові вивільнюють із пептиду, як вказувалось вище, і мітять, у разі потреби. Суміш після цього розділяють шляхом іонообмінного хроматографування, яке надає можливість розділення різновидів на основі заряду. Візуалізація елюйованих піків може здійснюватись за допомогою мітки, як згадувалось вище, або для цього може застосовуватись якийсь інший метод, наприклад, мас-спектрометрія. Після цього хроматограма піддається аналізу шляхом інтегрування піків, що пов'язуються з моно-, ди-, три- та тетразарядженими різновидами вуглеводів. Відсоток загального вуглеводу, представлений кожним різновидом, може у подальшому використовуватись для обчислення числа Ζ за наведеним далі рівнянням: Ζ = P'mono + 2 P'di + 3 P'tri + 4 P'tetra, де Ζ - число Ζ, P'mono, P'di P'tri, P'tetra - відсоток загального вуглеводу, що є моно-, ди-, три- або тетразарядженим, відповідно. Високе число Ζ вказує на те, що велика кількість антен несе заряджені залишки, і що глікопротеїн, завдяки цьому, буде сильно зарядженим, а у разі залишків сіалової кислоти, кислим. Рекомбі 87433 12 нантний людський FSH має, як правило, значення числа Ζ у межах від приблизно 150 до приблизно 190, або дорівнює у середньому приблизно 184. Винахідники з подивом встановили, що ізоформи FSH, число Ζ яких перевищує або становить приблизно 200, демонструють підвищену ефективність із точки зору кількості фолікулів, у разі порівняння (на основі IU) з "еквівалентною дозою" ізоформ FSH, числа Ζ яких є меншими за 200. Термін "еквівалента доза" означає, що у разі, коли кількість FSH різних ізоформ визначається за допомогою стандартного аналізу in vivo шляхом порівняння, за визначених умов, їхньої здатності до збільшення маси яєчника у пацюків, доза у міжнародних одиницях (Ш) є такою самою. Іншими словами, еквівалентні дози (у міжнародних одиницях) різних ізоформ, за визначенням на пацюках, мають різну клінічну ефективність у разі введення людям. Препарати FSH, які мають підвищені числа Z, можуть виділятись будь-якими способами. Наприклад, партія рекомбінантного FSH може піддаватись ізоелектричному фокусуванню або хроматофокусуванню, як описано, наприклад, у будь-якій з робіт (Мюлдерс (Mulders) та інші [19], Замбрано (Zambrano) та інші [20], та Тімоссі (Timossi) та інші [21]). Можуть бути виділені фракції, що мають різні рl. Препарати FSH за цим винаходом, яким віддають перевагу, мають середні значення рl, що дорівнюють щонайбільше або приблизно 3,4, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, дорівнюють щонайбільше або приблизно 3,3, за варіантом, якому віддають особливу перевагу, дорівнюють щонайбільше або приблизно 3,2, із порядком переваги, що зростає зі зменшенням середнього значення рl. Параметр "число Z" відображує середній ступінь сіалілування групи різновидів FSH. Можливо, що препарат FSH, який має високе число Z, може, разом з тим, мати значну частку основних (менш сіалілованих) різновидів. Такі основні різновиди можуть відігравати роль антагоністів на рецепторі FSH і є, таким чином, небажаними. "Поширення" присутніх різновидів може визначатись шляхом ізоелектричного фокусування або хроматофокусування. Аналіз числа Ζ може також дати уявлення про поширення різновидів. Перевага віддається тому, щоб препарат мав менше за або приблизно 4% нейтральних різновидів вуглеводів (тобто гліканових складових, що не несуть заряду), та менше за або приблизно 16% моносіалілованих різновидів, та за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щоб препарат мав менше за або приблизно 3%, 2% або 1% нейтральних різновидів та менше за або приблизно 15%, 12%, 10%, 8% або 5% моносіалілованих різновидів, де порядок переваги зростає зі зменшенням відсотків. До обсягу цього винаходу входять препарати FSH, що мають підвищену ефективність при фолікулогенезі, що є наслідком підвищеного ступеня сіалілування на одному або декількох додаткових сайтах глікозилування білка. Такі сайти можуть вводитись шляхом заміни залишків у білковому остові FSH на серинові, треонінові, лізинові або аспарагінові залишки, за допомогою, наприклад, 13 мутагенезу. Приклад способу, який може застосовуватись для одержання таких мутантних форм FSH, наведено у Прикладі 7. Для глікозилування in vivo, введені сайти повинні бути такими, щоб утворювати "сайт N-глікозилування" такої послідовності: N-X'-S/T/C-X", де X' - будь-який амінокислотний залишок, за виключенням проліну, X" - будь-який амінокислотний залишок, який може бути/не бути ідентичним до X' і який, за варіантом, якому віддають перевагу, відрізняється від проліну, N - аспарагін та S/T/C представляє залишок, який може бути серином, треоніном або цистеїном, за варіантом, якому віддають перевагу, серином або треоніном, та за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, треоніном. Кислі ізоформи (рІ≤3,4) таких молекул FSH входять до обсягу цього винаходу. Опис таких модифікованих молекул FSH, що несуть додаткові сайти глікозилування, наведено, наприклад, у WO 01/58493 (Maxygen). Особливу перевагу віддають таким мутаціям: У β-субодиниці: E4N, A70N, L73N, V78N, G100N, Y103N, F19N/I21T, L37N/Y39T, D41N/A43T, E55N/A43T, E59N/V61T та R97N/L99T. У α-субодиниці: E9N, F17T, F17N, R67N, V68T, E56N, H83N, та F33N/R35T; де А - аланін, D - аспарагінова кислота, Ε - глутамінова кислота, F фенілаланін, G - гліцин, Η - гістидин, І - ізолейцин, L - лейцин, N - аспарагін, R - аргінін, Τ - треонін, V валін, Υ - тирозин і умовне позначення "E4N" представляє заміну глутамінової кислоти "Е" у положенні 4 на аспарагін (N). Щодо нумерації послідовностей, амінокислотна послідовність людського FSH-альфа нумерується відповідно до зрілої послідовності, показаної на Фіг.5 або Послідовності №1. Амінокислотна послідовність людського FSH-бета нумерується відповідно до зрілої послідовності, показаної на Фіг.6 або Послідовності №2. До обсягу цього винаходу входять також препарати FSH, що мають підвищену ефективність при фолікулогенезі, що є наслідком підвищеного ступеня сіалілування на одному або декількох додаткових сайтах глікозилування білка, присутніх на доданому пептиді. Термін "доданий пептид" означає будь-який пептид, що включає сайт глікозилування і який може приєднуватись до аміно- та/або карбоксикінця α- та/або β-субодиниці FSH без негативного впливу на активність FSH одержаної молекули. Наприклад, β-субодиниця hCG є значно більшою, аніж β-субодиниці інших гонадотропінів завдяки приблизно 34 додатковим амінокислотам на С-кінці, які у цьому описі називають карбоксильною кінцевою ділянкою (СТР). СТР сечового hCG містить чотири муциноподібні О-зв'язані олігосахариди. Ця СТР може бути зв'язаною з βсубодиницею FSH, за варіантом, якому віддають перевагу, на карбоксикінці β-субодиниці FSH, унаслідок чого утворюється молекула, що має активність FSH та чотири додаткові сайти глікозилування. Кислі ізоформи (рІ≤4,4) таких молекул FSH входять до обсягу цього винаходу. Такі молекули розкриті у WO 93/06844 (Washington University), а також у Бойм (Воіmе) та інших [22]. Інші молекули FSH, що мають модифіковані сайти глікозилування, розкриті у WO 90/09800 (Washington University). 87433 14 Для цілей цього опису, препарати FSH, що мають додаткові сайти глікозилування, будуть позначатись FSHgly+. У разі додання додаткових сайтів глікозилування, параметр "число Z" більше не може застосовуватись для порівняння з "нормальними" препаратами FSH (тобто препаратами, що мають чотири сайти глікозилування), оскільки цей параметр є нормалізованим (це сума відсотків). Коли препарат FSHgly+ піддається аналізу на гліканові різновиди, параметр "число Z+" може обчислюватись у спосіб, аналогічний обчисленню числа Z. Препарати FSHgly+ за цим винаходом мають числа Z+ більші за або приблизно рівні 200, за варіантом, якому віддають перевагу, більші за або приблизно рівні 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, із порядком переваги, що зростає із зростанням числа Z+. Препарати FSHgly+ за цим винаходом мають значно нижчі профілі рl, аніж нормальний FSH. Особлива перевага, завдяки їх підвищеній ефективності, віддається тим препаратам FSHgly+, середнє значення рl яких дорівнює щонайбільше або приблизно 4,4, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, тим препаратам, середнє значення рl дорівнює щонайбільше або приблизно 4,2, 4,0, 3,8, 3,6, 3,4, 3,3 та 3,2, із порядком переваги, що зростає зі зниженням середнього значення рl. За всіма варіантами втілення цього винаходу, перевага віддається рекомбінантному FSH. Для лікування пацієнтів-людей, перевага віддається людському рекомбінантному FSH. Препарати за цим винаходом можуть виділятись із традиційного рекомбінантного FSH або вони можуть виділятись із препаратів FSHgly+. Аспектом цього винаходу є також надання способу збагачення вмісту сіалової кислоти за допомогою способу, який винахідники називають "підсиленням сіалілування". Препарати рекомбінантного FSH (за варіантом, якому віддається перевага) або рекомбінантного FSHgly+ (також за варіантом, якому віддається перевага) чи сечового FSH можуть піддаватись підсиленню сіалілування шляхом обробки ферментом, наприклад, глікозилтрансферазою, зокрема, сіалілтрансферазою, у присутності донора сіалової кислоти, наприклад, СМР-сіалової кислоти (цитидин-5'-монофосфат-Nацетилнейрамінової кислоти), за описом, який наведено у WO 98/31826 (Cytel Corporation). Приклади рекомбінантних сіалілтрансфераз, а також способів одержання рекомбінантних сіалілтрансфераз, наведені, наприклад, у патенті США №5,541,083 (University of California; Amgen). Задокументовано щонайменше 15 різних сіалілтрансфераз ссавців і кДНК тринадцяти з них були клоновані. Ці кДНК можуть застосовуватись для рекомбінантного продукування сіалілтрансфераз, які у подальшому можуть застосовуватись у способах за цим винаходом. Сіалілтрансферази, що застосовуються, будуть здатними до перенесення сіалової кислоти до послідовностей Ga1β1, 4G1cNAc, що є найпоширенішими передостанніми складовими, які знаходяться під кінцевою сіаловою кислотою на сіалілованих глікопротеїнах. Прикладом сіалілтрансферази, що може застосовуватись, є 15 ST3Ga1 III, яку також називають (2,3)сіалілтрансферазою (EC (європейська колекція) 2.4.99.6). Цей фермент каталізує перенесення сіалової кислоти до Ga1 з Ga1-β-1,3-глікозилNac або Ga1-β-1,4-глікозилNac глікозиду [23]. Сіалова кислота зв'язується із залишком галактозилу (Ga1) з утворенням α-зв'язку між двома сахаридами. Зв'язок сахаридів знаходиться між 2 положенням NeuAc та 3 положенням Ga1. Цей конкретний фермент може виділятись із печінки пацюків [24]; відомими є послідовності людської кДНК [25] та геномної [26] ДНК, що полегшує продукування цього ферменту шляхом рекомбінантної експресії. За варіантом втілення, якому віддають перевагу, у способах сіалілування застосовують ST3Ga1 III (за варіантом, якому віддають перевагу, від пацюків), ST3Ga1 IV, ST3Ga1 I, ST6Ga1 I, ST3Ga1 V, ST6Ga1 II, ST6Ga1NAc I або ST6Ga1NAc II, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, ST3Ga1 III, ST6Ga1 I, ST3Ga1 IV, ST6Ga1 II або ST3Ga1 V, за варіантом, якому віддають більшу особливо перевагу, ST3Ga1 III від пацюків. Кількість сіалілтрансферази буде, за варіантом, якому віддають перевагу, дорівнювати або приблизно дорівнювати 50 мОд на мг FSH або менше, за варіантом, якому віддають перевагу, буде дорівнювати або приблизно дорівнювати 525 мОд на мг FSH. За умов, яким віддають перевагу, концентрація сіалілтрансферази буде дорівнювати або приблизно дорівнювати 10-50 мОд/мл, а концентрація FSH буде дорівнювати або приблизно дорівнювати 2мг/мл. FSH, збагачений кислими ізоформами, можна одержувати також шляхом трансфікування клітини, рекомбінантної або іншої, що експресує FSH, геном, що кодує сіалілтрансферазу, де згаданий ген експресується клітиною. Цей ген може включати геномні кодувальні послідовності (тобто з інтронами) або він може включати кДНК кодувальні послідовності. За альтернативним варіантом, якщо геном клітини включає ендогенні послідовності, що кодують сіалілтрансферазу, до геному клітини може вставлятись генно-інженерна конструкція, що спричинює експресію FSH. Експресія сіалілтрансферази може підсилюватись шляхом введення ненативних регуляторних послідовностей, активних у клітині, у функціональному зв'язку з ендогенними послідовностями, що кодують сіалілтрансферазу. Можна також вставляти ген, що піддається ампліфікації, у функціональному зв'язку до послідовностей, що кодують сіалілтрансферазу, щоб викликати ампліфікацію геном них послідовностей, що кодують сіалілтрансферазу. Ці маніпуляції можуть здійснюватись шляхом гомологічної рекомбінації, наприклад, як описано у ЕР 0505500 (Applied Research Systems ARS Holding N.V.). Ступінь сіалілування препарату FSH може також підвищуватись шляхом відбору клітини для експресії рекомбінантного FSH, що сприяє сіалілуванню. До таких клітин належать вибрані гіпофізарні клітини та клітини яєчника китайського хом'ячка, що експресують високі рівні сіалілтрансфераз. Препарат FSH, одержаний у такій клітині, може додатково піддаватись способу виділення, як зга 87433 16 дується у цьому описі, для виділення ізоформ, що мають високий ступінь сіалілілування. Ступінь сіалілування препарату FSH може підвищуватись також шляхом культивування клітини, що експресує FSH, за варіантом, якому віддають перевагу, рекомбінантний FSH, за умов, що сприяють високому рівню сіалілування. Сіалілуванню може сприяти доповнення культуральних середовищ інгібіторами нейрамінідази та/або безпосередніх внутрішньоклітинних попередників синтезу сіалової кислоти, наприклад, ацетилманозаміну. Препарати FSH, одержані за таких умов культивування, можуть додатково піддаватись способу виділення, як згадується у цьому описі, для виділення ізоформ, що мають високий ступінь сіалілування. У разі застосування способу підсилення сіалілування, бажано, щоб перед ферментативним сіалілуванням препарат FSH мав високий АІ, щоб надати багато антен для приєднання залишків сіалової кислоти. За варіантом, якому віддають перевагу, FSH повинен мати АІ, що щонайменше або приблизно дорівнює 220, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, він повинен мати АІ, що дорівнює щонайменше або приблизно 240, і за варіантом, якому віддають особливо більшу перевагу, він повинен мати АІ, що дорівнює щонайменше або приблизно 270. FSH, що має підвищені АІ, може виділятись, наприклад, за допомогою афінної хроматографії на сефарозі, дериватизованій конканаваліном-А (Con-Α), з елююванням градієнтом метилу-глюкози, або препаративної HPLC. Спосіб підсилення сіалілування за цим винаходом може переважно застосовуватись до препаратів FSH, що були модифіковані для введення одного або декількох додаткових сайтів глікозилування (препарати FSHgly+). Такі препарати FSHgly+ можуть розділятись на фракції, що мають високий АІ, перед застосуванням способу підсилення сіалілування. Цей винахід охоплює препарати FSH, одержані шляхом експресії FSH у клітинах, які є нездатним до сіалілування, з подальшим підданням FSH підсиленню сіалілування. Наприклад, у WO 99/13081 (Akzo Nobel N.V.) описують експресію FSH дикого типу та мутеїнів у одноклітинному еукаріотному організмі Dictyostelium, де, зокрема, мутеїни мають додаткові сайти глікозилування. Dictyostelium є нездатним до сіалілування гліканів. Цей винахід включає препарати FSH, одержані шляхом піддання FSH дикого типу або мутеїнів, експресованих Dictyostelium, підсиленню сіалілування. Після підсилення сіалілування, препарати FSH, що мають бажаний ступінь сіалілування, можуть виділятись за допомогою іонообмінного хроматографування, ізоелектричного фокусування, хроматофокусування або хроматографування на конканаваліні-А (Соn-А). Число Ζ FSH за цим винаходом дорівнює щонайменше або приблизно 200, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, дорівнює щонайменше або приблизно 210, за варіантом, якому віддають особливу перевагу, щонайменше становить приблизно 220, за варіантом, якому віддають особли 17 во більшу перевагу, становить щонайменше приблизно 230, 240, 250, 260 або 270, зі ступенем переваги, що зростає зі збільшенням числа Z. Число Ζ повністю сіалілованого FSH дорівнює від щонайменше або приблизно 230 до щонайменше або приблизно 280, у залежності від показника розгалуженості. Число Ζ препаратів FSH, яким віддають більшу перевагу, за цим винаходом дорівнює від приблизно 230 до приблизно 280. Препарати FSH за цим винаходом одержують таким чином, щоб вони послідовно мали число Ζ, яке дорівнює щонайменше або приблизно 200, або згадані вище числа Ζ, яким віддають перевагу. FSH за цим винаходом може виділятись із суміші ізоформ за допомогою цілого ряду способів, відомих фахівцю у цій галузі. Для розділення ізоформ на основі рl може застосовуватись, наприклад, ізоелектричне фокусування, хроматофокусування або іонообмінна хроматографія. Різні фракції можуть аналізуватись на вміст сіалової кислоти і необхідні фракції вибиратись для застосування. Приклад придатних умов для іонообмінного хроматографування наведено у Прикладах. Такі способи розділення можуть застосовуватись для виділення FSH за цим винаходом із rFSH, який одержують традиційним шляхом, або сечового FSH (uFSH), або вони можуть застосовуватись для виділення необхідних ізоформ з FSH, підданого обробці сіалілтрансферазою, або іншими рекомбінантними методами, які згадувались вище. За одним з аспектів, цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, що містить FSH за цим винаходом (тобто такий, що має число Z, яке дорівнює щонайменше або приблизно 200, де значення мінімальних чисел Z, яким віддають перевагу, відповідають наведеним вище). Такі фармацевтичні композиції можуть застосовуватись для стимулювання фолікулогенезу, наприклад, у поєднанні з індукцією овуляції або методиками допоміжної репродукції (ART). Оскільки FSH за цим винаходом є особливо ефективним щодо індукування численних фолікулів для розвитку та визрівання, він є особливо придатним для застосування у ART, у яких бажано збирати численні овоцити. За альтернативним варіантом, у разі ретельного визначення дози, FSH за цим винаходом може застосовуватись для індукування монофолікулогенезу для індукції овуляції (OI) або нечисленного фолікулогенезу (до приблизно трьох фолікулів для IUI), для запліднення in vivo. Монофолікулогенез може також забезпечуватись зниженою дозою FSH або рідшим введенням дози, порівняно зі звичайними препаратами FSH. У разі індукції овуляції, препарат FSH за цим винаходом може вводитись у дозі 225-400 МОд через три дні або у менших дозах, у залежності від реакції пацієнта. Реакція пацієнта може відслідковуватись за допомогою ультразвукової ехографії. FSH за цим винаходом буде, за типовим варіантом, вводитись до складу фармацевтичної композиції, яка, додатково, буде містити розріджувач або наповнювач. Фахівцю у цій галузі є відомим цілий ряд таких розріджувачів або наповнювачів, придатних для одержання фармацевтичної композиції. 87433 18 FSH за цим винаходом може надаватись, як правило, у вигляді твердої дозованої лікарської форми, готової до розчинення з одержанням стерильного ін'єкційного розчину для внутрішньом'язового або підшкірного введення. Тверду речовину одержують, як правило, шляхом ліофілізації. До типових наповнювачів та носіїв належить цукроза, лактоза, хлорид натрію, буферні агенти, наприклад, монофосфат натрію та дифосфат натрію. Розчин можна одержати шляхом розбавлення водою для ін'єкцій безпосередньо перед застосуванням. FSH за цим винаходом може також надаватись форма розчину для ін'єкцій, що містить будьякий з наповнювачів та буферів, наведених вище, та інші, відомі фахівцю у цій галузі. FSH за цим винаходом може застосовуватись у режимі регульованої гіперстимуляції яєчників (СОН). Стандартні режими [27] СОН включають фазу регуляції за типом негативного зворотного зв'язку, впродовж якої секреція ендогенного лютеїнізуючого гормону (LH) пригнічується шляхом введення агоніста гонадотропін-вивільнювального гормону (GnRH) з подальшою стимулювальною фазою, під час якої розвиток фолікулів (фолікулогенез) індукується щоденним введенням фолікулостимулювального гормону (FSH), як правило, у дозі, що дорівнює або приблизно дорівнює 75-600 МОд на добу, за варіантом, якому віддають перевагу, у дозі, що дорівнює або приблизно дорівнює 150-225 МОд на добу. За альтернативним варіантом стимулювання розпочинають за допомогою FSH після природної або індукованої менструації, з подальшим введенням антагоніста GnRH (із започаткуванням, як правило, приблизно на шостий день стимулювальної фази). У разі утворення щонайменше 3 фолікулів >16мм (одного 18мм), вводять одноразову ударну дозу hCG (людського хоріонічного гонадотропіну) (5-10000 МОд) для імітування викиду природного LH та індукування овуляції. Ін'єкцію hCG здійснюють, як правило, у будь-який з 10 дня по 14 день, однак він може бути введеним і пізніше, у залежності від того, чи досягнуті вищезазначені параметри. Виділення овоцитів здійснюють через 36-38 год після ін'єкції hCG. FSH за цим винаходом може також застосовуватись для ОІ та IUI. Наприклад, стимулювання FSH за допомогою препарату за цим винаходом розпочинають після природної або індукованої менструації у дозі 75-150 МОд на добу. Коли 1 фолікул або 3 фолікули досягай діаметра щонайменше 16мм, для індукування овуляції вводять разову ударну дозу hCG. Запліднення здійснюють in vivo шляхом звичайного статевого акту або шляхом внутрішньоматкового запліднення (IUI). Оскільки FSH за цим винаходом має підвищену ефективність відносно відомих препаратів FSH, у режимах, подібних тим, опис яких наведено вище, можуть застосовуватись нижчі дози (МОд) FSH та/або ці режими можна модифікувати шляхом скорочення стимулювального періоду із застосуванням FSH із досягненням такої самої або кращої реакції з точки зору кількості та життєздатності фолікулів. Наприклад, у разі застосування препарату FSH за цим винаходом, адекватний 19 фолікулогенез може бути досягнутим за допомогою дози, що дорівнює або приблизно дорівнює 50-150 МОд FSH, за варіантом, якому віддають перевагу, за допомогою дози, що дорівнює або приблизно дорівнює 50-100 МОд FSH, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, за допомогою дози, що дорівнює або приблизно дорівнює 50-75 МОд FSH. Введення дози FSH здійснюється, як правило, на добовій або напівдобовій основі. Період введення доз може становити щонайбільше або приблизно 14 днів, за варіантом, якому віддають перевагу, він може становити щонайбільше або приблизно 12 днів, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, він може становити щонайбільше або приблизно 11 днів або 10 днів. Для ОІ, препарати FSH за цим винаходом можуть вводитись у дозах від 25-150 МОд FSH на добу, за варіантом, якому віддають перевагу, 50125 МОд FSH на добу. Для лікування чоловічої безплідності препарат FSH за цим винаходом може вводитись у дозі від 3×150 МОд на тиждень до 300 МОд на тиждень доти, доки сперматогенез не досягне рівнів, адекватних для запліднення шляхом звичайного статевого акту або за допомогою методик допоміжної репродукції. Винахідники додатково встановили, що, завдяки підвищеній ефективності, препарати FSH, число Ζ яких дорівнює щонайменше або приблизно 200, можуть вводитись рідше, аніж препарати FSH, число Ζ яких є меншим за 200. (Для цілей цього опису, терміни FSH+200, FSH+210, FSH+220 тощо будуть застосовуватись для представлення препаратів FSH, число Ζ яких знаходиться у діапазоні, що дорівнює або приблизно дорівнює 200210, 211-220, 221-230 тощо). Це означає, що пацієнти, які за нормальних умов будуть потребувати, наприклад, 150 МОд стандартного FSH кожного дня для досягнення адекватного фолікулогенезу, можуть досягти такого самого результату, наприклад, за допомогою 225 МОд FSH+200 через три дні або 300 МОд FSH+200 через чотири дні. Завдяки підвищеній ефективності FSH+200, порівняно зі звичайними препаратами FSH, вищезгадані дозиможуть бути зменшені у тих пацієнтів, що демонструють добру реакцію. У разі препаратів FSH за цим винаходом, число Ζ яких є не меншим за або становить приблизно 230, можливим є здійснення ін'єкцій через п'ять, шість або сім днів, у залежності від реакції пацієнта. Реакція може визначатись за допомогою ультразвукової ехографії та/або шляхом визначення сироваткових рівнів естрадіолу. Іншими придатними режимами є такі: 100 МОд FSH+210 через два дні; 200 МОд FSH+210 через три дні; 275 МОд або 300 МОд FSH+210 через чотири дні; 80-100 МОд FSH+220 через два дні; 180-200 МОд FSH+220 через три дні; 260-300 МОд FSH+220 через чотири дні; 75-100 МОд FSH+230 через два дні; 170-200 МОд FSH+230 через три дні; та 250-300 МОд FSH+230 через чотири дні; 275-400 МОд FSH+250 через п'ять днів; 375-450 МОд FSH+250 через шість днів; 450-525 МОд FSH+250 через сім днів. Термін "підвищена ефективність", який застосовують у цьому описі у зв'язку з впливом на фолі 87433 20 кулогенез, включає будь-яке поліпшення, що піддається визначенню, або збільшення кількості та/або підвищення життєздатності фолікулів у індивіда, наприклад, у разі порівняння з кількістю та/або життєздатністю фолікулів у одного або декількох пацієнтів, що піддавались лікуванню еквівалентною дозою (IU/IU), за визначенням стандартним аналізом збільшення маси яєчника у пацюків, FSH, що має число Ζ менше за 200. За варіантом, якому віддають перевагу, поліпшення або збільшення буде статистично значущим, за варіантом, якому віддають перевагу, у разі значення ймовірності