Протираковий злитий протеїн

Реферат: Винахід належить до злитого протеїну, що містить домен (а), яким є функціональний фрагмент послідовності розчинного протеїну hTRAIL, причому даний фрагмент починається амінокислотою в позиції не нижче ніж hTRAIL95 і закінчується амінокислотою в позиції hTRAIL281, або гомолог згаданого функціонального фрагменту, і принаймні один домен (b), яким є послідовність цитолітичного ефекторного пептиду, що утворює пори в клітинній мембрані, при цьому послідовність домену (b) приєднана в точці С-кінця і/або точці N-кінця домену (а). UA 115436 C2 (12) UA 115436 C2 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід відноситься до області терапевтичних злитих протеїнів, зокрема, рекомбінантних злитих протеїнів. Більш конкретно, винахід відноситься до злитих протеїнів, що містять фрагмент послідовності розчинного людського протеїну TRAIL і послідовність пептиду, що формує пори в клітині або мітохондріальній мембрані, до фармацевтичних композицій, що їх містять, їх застосування в терапії, зокрема, в якості протиракових речовин, і до полінуклеотидних послідовностей, що кодують злиті протеїни, векторів експресії, які включають полінуклеотидні послідовності, і до клітин-хазяїв, що містять зазначені вектори експресії. Протеїн TRAIL, що належить до сімейства цитокінів (ліганд, який індукує апоптоз, який має відношення до фактору некрозу пухлини), також відомий як Apo2L (Apo2-ліганд), є потужним активатором апоптозу в пухлинних клітинах і в клітинах, інфікованих вірусами. TRAIL є лігандом, що виникає в організмі природним шляхом. Протеїн TRAIL, його амінокислотна послідовність, кодуючі послідовності ДНК SEQ. No.s (№№) та системи експресії протеїну, були вперше розкриті в EP0835305A1. Протеїн TRAIL проявляє свою протиракову активність, зв'язуючись з проапоптотичними поверхневими TRAIL рецепторами 1 і 2 (TRAIL-R1/R2) і забезпечуючи наступну активацію даних рецепторів. Дані рецептори, відомі також як DR4 і DR5 (рецептор загибелі 4 і рецептор загибелі 5), належать до сімейства рецептора TNF (фактора некрозу пухлини) і піддаються гіперекспресії з боку різних типів ракових клітин. Активація даних рецепторів може індукувати зовнішній сигнальний шлях апоптозу, незалежно від супресорного гену р53, який, завдяки активованій каспазі-8, призводить до активації виконавчих каспаз і тим самим - до деградації нуклеїнових кислот. Каспаза-8, вивільнена після активації TRAIL, може також спричинювати вивільнення усіченого Bid протеїну, який переміщають до мітохондрії, де він стимулює вивільнення цитохрому С, і, таким чином, опосередковано посилює апоптотичний сигнал від рецепторів загибелі . TRAIL вибірково впливає на пухлинні клітини, по суті, не спричинюючи появи апоптозу в здорових клітинах, які стійкі до цього протеїну. Таким чином, в силу свого величезного потенціалу, TRAIL був визнаний протираковим засобом, який впливає на широкий діапазон різних типів пухлинних клітин, в тому числі гематологічних злоякісних новоутворень і щільних пухлин, і в той же час є щадним по відношенню до нормальних клітин, і таким, що, потенційно, має відносно невеликі побічні ефекти. Протеїн TRAIL представляє собою протеїн мембранного типу II, що має довжину з 281 амінокислот, при цьому його позаклітинна область, яка включає амінокислотні залишки 114-281, після розщеплення протеазами утворює розчинну молекулу sTRAIL розміром 20 кДа, яка також є біологічно активною. Обидві форми TRAIL і sTRAIL здатні запустити апоптоз через взаємодію з рецепторами TRAIL, присутніми на клітинах-мішенях. Сильна протипухлинна активність і дуже низька системна токсичність розчинної частини молекули TRAIL була продемонстрована із застосуванням тестування клітинних ліній. Крім того, попередні клінічні дослідження людини на рекомбінантний людський розчинний TRAIL (rhTRAIL), що має амінокислотну послідовність, відповідну амінокислотам 114-281 з hTRAIL, відомий під назвою INN dulanermin (міжнародне непатентоване найменування - дуланермін), показали його хорошу переносимість та відсутність токсичності, що обмежує дозування. Відома на сьогоднішній день інформація про токсичний вплив рекомбінаногого протеїну TRAIL на клітини печінки, цілком ймовірно, пов'язана з наявністю модифікації, тобто маркувань полігістидину, при цьому, немарковані TRAIL не виявляють системної токсичності. Як нещодавно було розкрито відносно рекомбінантного мутанту з кільцевою перестановкою генів, що має відношення до 122-281hTRAIL, наприклад, в патентному документі EP 1688498, фрагменти TRAIL, коротші за 114 - 281, здатні також зв'язуватися з мембранними рецепторами загибелі і індукувати апоптоз через ці рецептори. Однак у подальших клінічних випробуваннях на пацієнтах фактична ефективність TRAIL як монотерапевтичного засобу виявилася низькою. Проблематичним також виявилось те, що багато ракових клітин проявляють первинну або надбану резистентність до TRAIL (див., наприклад, WO2007/022214). Резистентність може бути спричинена різними механізмами і може набувати специфічного виду, залежно від типу раку і/або від особливостей пацієнта (Thorburn A, Behbakht K, Ford H. TRAIL receptor-targeted therapeutics: resistance mechanisms and strategies to avoid them. (TRAIL рецептор-цільова терапія: механізми резистентності і стратегії її уникнення. Drug Resist Updat 2008; 11: 17-24). Хоча механізм резистентності до TRAIL не є повністю зрозумілим, вважається, що вона може проявлятися на різних рівнях TRAIL-індукованого шляху апоптозу, починаючи від рівня рецепторів клітинної поверхні до виконавчих каспаз в межах сигнального шляху. 1 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Щоб подолати таку низьку ефективність і резистентність пухлин до TRAIL, були розроблені різні комбіновані лікувальні методики із застосуванням радіо-і хіміотерапевтичних засобів, у результаті яких досягався синергічний апоптотичний ефект. (WO2009/002947; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews (Про цитокінові фактори росту) 14 (2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis (Неоплазія), Vol 3, No 6, 2001, 535-546, Soria JC et al., J. Clin. Oncology (Клінічна онкологяя), Vol 28, No 9 (2010), p. 1527-1533). Використання rhTRAIL для лікування раку в поєднанні з вибраними звичайними хіміотерапевтичними препаратами (паклітаксел, карбоплатин) і моноклональними антитілами «анти-VEGF» (антитіло відносно судинного ендотеліального фактора росту) - описані в документі WO2009/140469. Проте, таке поєднання обов'язково супроводжується добре відомими недоліками, що властиві традиційній хіміотерапії або променевій терапії. Однак, з рівня техніки невідомо жодної інформації, в якій би була запропонована відміна резистентності клітини до TRAIL за рахунок злиття протеїну TRAIL з іншими протеїнами або їх фрагментами. Крім того, існуючою проблемою, пов'язаною з TRAIL-терапією, є його низька стабільність і швидке виведення з організму після прийому. Відомий ефект руйнування ракових клітин і інгібування проліферації пухлини як результат роздроблення (переривчастості) клітинної мембрани або мітохондріальної мембрани. Відомі також спроби застосування речовин з цитолітичним ефектом, здатних забезпечити роздроблення мембрани, як безпосереднього засобу протиракової терапії, так і допоміжного засобу терапії проти раку. Відома велика кількість природних і синтетичних пептидів і протеїнів, що мають цитолітичну активність. Цитолитичні пептиди описані також в якості пороутворюючих пептидів або цитолізинів. Взаємодія пороутворюючих пептидів з поверхнею мембрани може бути заснована на неспецифічній електростатичній взаємодії позитивно зарядженого пептиду з негативно зарядженою клітинної мембрани. Дані пептиди, як правило, катіонного характеру, так що вони здатні електростатично взаємодіяти з поверхнями з переважно негативно зарядженими частинками. При контакті і взаємодії цитолітичного пептиду з ліпідами на поверхні клітини і після проникнення всередину клітини з ліпідами на поверхні мітохондріальної мембрани відбувається переривання безперервності клітинної мембрани з наступним утворенням трансмембранних пір невеликого розміру, через які проходить витік вмісту цитоплазми, в тому числі іонів, за межі клітини, що призводить до швидкого і необоротного електролітного дисбалансу в клітині, лізису клітини і її загибель. Взаємодія пороутворюючих пептидів з поверхнею мембрани може також включати взаємодію з присутніми на поверхні специфічними рецепторами. Відомі природним шляхом утворювані цитолітичні пептиди бактеріального, рослинного або ссавцевого походження, що здатні утворювати пори в клітинній мембрані, часто називають гемолізинами, тому що вони спричинюють лізис клітин еритроцитів і інших еукаріотичних клітин. Ці токсини включають цекропін А і В, ауреїн 1, 2, цитропін 1,1, дефензин (HNP-2), лактоферицин B, тачіплезин, PR-39, цитолізини з Enterococcus faecalis, дельта гемолізин, дифтерійний токсин, цитолізин холерного вібріону (Vibrio cholerae), токсин з (Actinia equina), гранулізин, літичні пептиди з Streptococcus intermedius,, лентівірусні літичні пептиди, лейкотоксин з Actinobacillus actinomycetemcomitans, магаїнін, мелітин, лімфотоксин, енкефалін, парадаксин, перфорин (зокрема, N-кінцевого фрагменту), перфріголізин O (PFO/тетатоксин) з Clostridium perfringens і стрептолізини. Їх корисність в якості лікарських засобів обмежено їх здатністю викликати гемоліз. Природні цитолітичні пептиди описані, наприклад, в роботі R. Smolarczyk et al., Postępy Hig. Med. Dośw., 2009; 63: 360-368 Також відомі синтетичні цитолітичні пороутворюючі пептиди. Метою їх створення являлася задача одержання пептидів, які були б позбавлені гемолітичних властивостей, були б менш імуногенними, або б мали поверхні, які були б здатні демонструвати високу специфічність зв'язування з клітинними мішенями, наприклад рецептори сімейства VEGFR (рецептор судинного ендотеліального фактора росту), а також рецептори сімейства EGFR (рецептор епідермального фактора росту). Вони часто являються гібридами фрагментів природних цитолітичних пептидів, наприклад гібридом фрагменту цекропіну А і фрагменту магаїніну 2 CA (1-8) MA (1-12) або гібридом фрагменту цекропіну А і фрагменту мелітину CAMEL (CA (1-7) MEL (2-9)) Відомі також синтетичні цитолітичні пептиди D-K4-L2-R9 і D-K6-L9, що складаються з амінокислотного лізину, аргініну і лейцину, частина з яких представлена у формі D-амінокислот. Відомі також синтетичні химерні пептиди RGD-4CD(KLAKLAK)2, які включають мотив RGD 2 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язування з інтегрином ανβ3 та ефекторний домен, що складається з D-амінокислот KLAKLAKKLAKLAK, і PTD-5D(KLAKLAK)2, що містить мотив PTD-5, який забезпечує проникнення в клітини, і еффекторний домен, що складається з D-амінокислот KLAKLAKKLAKLAK (див., наприклад, R. Smolarczyk et al., Postępy Hig. Med. Dośw., 2009, 63: 360-368). Інші відомі цитолітичні синтетичні пептиди описані, наприклад, в роботі Regen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 566-571, 1989. Руйнування мембрани, яке відбувається після приєднання пептиду до мембрани, може виникати за механізмом "бочарної клепки" (моделі бочарної клепки), за механізмом "пампушкоподібної форми" (моделі пір тороїдальної форми) або за механізмом типу "килим" (див., наприклад, R. Smolarczyk et al., Postępy Hig. Med. Dośw., 2009; 63: 360-368). Механізм "бочарної клепки" спостерігається для амфіпатичних пептидів з альфа-спіральною конформацією, що має довжину, принаймні, 23 амінокислот. Наприклад, пептидами, які спричинюють руйнування мембрани за механізмом "бочарної клепки", є граміцидин A, аламетицин, перфорин, пілосулін, синтетичні пептиди з повторними KLAK-мотивами, кателіцидин, пептиди, виділені з Entamoeba histolytica, параспорини і цекропіни. Пептиди, які призводять до руйнування мембрани по моделі пір тороїдальної форми, включають в себе, наприклад, мелітин і магаїнін. Наприклад, пептиди, які забезпечують руйнування мембрани відповідно до моделі типу "килиму" є цекропіни А і В. Розпад клітинної мембрани з утворенням пір може бути також спричинений взаємодією пептидів високого позитивного заряду з негативно зарядженими компонентами мембран. Такі властивості, зокрема, проявляють гранулізини, аналоги і похідні мелітину, пептиди, що містять мотив K(L)xR, тачіплезин, бомбезин, магаїнін і віскотоксин. Формування пір в мембрані клітини-мішені також може бути пов'язано з ферментативною активністю пептидів. Ферментативна активність фосфоліпази А продемонстрована, наприклад, фосфоліпазами зі специфічною фосфодіестеразною активністю щодо фосфатидилхоліну і сфінгоміеліну, гемолізинів і цитолізинів, що проявляють неспецифічну цитолітичну активність, або гемолізинів і цитолізинів, що проявляють цитолітичну активність проти біологічних мембран, які містять, наприклад, холестерин. Такий тип ферментативної активності, що призводить до утворення пір в клітині або мітохондріальній мембрані, проявляє лістеріолізин, eхінатоксин, фосфоліпази PC-PLC і альфа-токсин із Clostridium perfringens. Відомі також кон'югати і химери пороутворюючих пептидів з доменами, здатними до націлювання на пухлинні клітини. Для націлювання застосовуються антигени, частки вуглеводнів або рецептори фактору росту, надлишково експресовані на поверхні пухлинних клітин. Цільова доставка забезпечує високі рівні пороутворюючого пептиду на клітинній поверхні, яка необхідна для цитолітичної активності. Застосування націлених пороутворюючих актинопоринів описано в роботі Panchal RG. et al., Poreforming proteins and their application in biotechnology.(Пороутворюючі протеїни та їх застосування в біотехнології) Curr Pharm Biotechnol 2002, 3:99-115; в роботі Panchal RG: Novel therapeutic strategies to selectively kill cancer cells (Нові терапевтичні стратегії для вибіркового знищення ракових клітин.). Biochem Pharmacol 1998, 55:247-252. Biochem Pharmacol 1998, 55:247-252, і в роботі Hoskin DW, Ramamoorthy А: Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides (Дослідження протипухлинної діяльності антимікробних пептидів). Biochim Biophys ActaBiomembr 2008, 1778:357-87. Биохим Biophys Acta-Biomembr 2008, 1778:357-87. Також відомо, що пороутворюючі пептиди і протеїни можуть бути наділені здатністю скеровувати в пухлину асоційованих антигенів і рецепторів шляхом відповідної генетичної модифікації, а також шляхом хімічного приєднання до відповідних лігандів або антитіл. Такі модифікації описані відносно d-ендотоксину Bacillus thuringiensis, ендотоксину II від Actinia equina, стіхолізину I (sticholysin I)з Stichodactyla Helianthus і токсину дифтерії з Corynebacterium diphtheriae (Soletti RC., Potentiation of anticancer-drug cytotoxicity by sea anemone pore-forming proteins in human glioblastoma cells. (Потенціювання протиракової медикаментозної цитотоксичності пороутворюючих протеїнів актинії в клітинах гліобластоми людини). Anti-Cancer Drugs 2008, 19:517-525; Pederzolli C,: Biochemical and cytotoxic properties of conjugates of transferrin with equinatoxin-II, a cytolysin from a sea anemone.(Біохімічні і цитотоксичні властивості кон'югатів трансферину з еквінатоксином-II, цитолізину з актинії) Bioconjugate Chem 1995, 6:166173, van der Spek JC.: Fusion protein toxins based on diphtheria toxin: Selective targeting of growth factor receptors of eukaryotic cells. (Токсини злитих протеїнів, засновані на дифтерійному токсині: селективне націлювання рецепторів фактора росту еукаріотичних клітин) Appl Chimeric Genes Hybrid Proteins Pt B 2000, 327:239-249). Також описано злитий протеїн, що складається з токсину стіхолізину I (sticholysin I) і моноклонального антитіла, спрямований проти пухлинного специфічного антигену С2, і його 3 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 корисність у лікуванні моделі клітинної лінії раку товстої кишки (Tejuca M. et al., Construction of an immunotoxin with the pore forming protein St1 and/or C5, a monoclonal antibody against a colon cancer cell line (Конструювання імунотоксину з пороутворюючим протеїном St1 та / або C5, моноклональне антитіло проти клітинної лінії раку товстої кишки), Int. Immunopharmacol. 2004, 4:731-744). Також розкрито ряд злитих протеїнів, що містять дифтерійний токсин та інтерлейкін-2 або EGF(епідермальний фактор росту), а також їх потенційну здатність руйнувати клітину, піддаючи гіперекспресії цільові рецептори (Murphy JR, van der Spek JC, Targeting diphtheria-toxin to growthfactor receptors (Націлювання дифтерійного токсину на рецептори фактора росту), Semin Cancer Biol 1995, 6:259-267). Також відоме застосування сайтів розщеплення, які розпізнаються специфічними протеазами в молекулах злитих протеїнів, що містять цитолітичні пептиди, з тим щоб забезпечити вивільнення ефекторних пептидів в середовищі пухлини, а отже, їх інтерналізацію в клітини пухлини. Наприклад, Panchal R. і співавтори (Nat Biotechnol 1996, 14:852-856) розкрили альфа-гемолізини, що включають в свою послідовність сайт розщеплення, розпізнаний катепсина В, який активується протеазою, присутньою в середовищі пухлини. Також відомі модифіковані проаеролізини (PA), неактивні попередники (прекурсори) бактеріальних цитолітичних пороутворюючих протеїнів, що активуються, коли розщеплюються протеазою клітин раку простати (PSA) (Williams S.A. et al., JNCI J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (5): 376-385). Патентний документ US5817771B1 розкриває кон'югати, включаючи злиті протеїни, пороутворюючих цитолітичних пептидів з антитілом або антигеном, як елементом селективного зв'язування на пухлинній клітині, і лінкери, що забезпечують селективну активацію цитолітичного пептиду в пухлинному середовищі, такі як, наприклад, сайт розщеплення, розпізнаний ферментами, такими як протеази, зокрема протеази, піддані гіперекспресії, зокрема, в середовищі пухлини. В інформаційному науковому виданні (Cancer Letters 293 (2010) 240–253) автори Barua et al. повідомили, що клітинні лінії раку простати, резистентні до TRAIL і нечутливі до лікування антитілами DR4 і DR5 агоністів рецептора загибелі стають чутливими до цих антитіл після попередньої обробки цих клітин синтетичним катіонним амфіпатичним литичним пептидом KLA, що містить послідовності KLAK. Даний винахід забезпечує злиті протеїни з протираковими властивостями, які містять домен, похідний від TRAIL і домен цитолітичного ефекторною пептиду з пороутворюючими властивостями проти клітинних і / або мітохондріальних мембран клітин ссавців. Кожен з двох доменів протеїну за винаходом має різні функції. Завдяки наявності домену, отриманого з hTRAIL, протеїни, згідно з винаходом, селективно спрямовані до ракових клітин, де елементи протеїну проявляють свою дію. Зокрема, домен TRAIL після зв'язування з клітиною може чинити свою активність активізації апоптозу, а ефекторний пептид – пороутворюючу активність в клітині і / або мітохондріальній мембрані і здійснювати лізис ракових клітин. Доставка протеїну, згідно з винаходом, в середовище пухлини дозволяє мінімізувати токсичність і побічні ефекти щодо здорових клітин в організмі, а також скоротити частоту введення лікарського засобу. Крім того, цільова терапія із застосуванням протеїнів за винаходом дозволяє уникнути проблеми низької ефективності відомих раніше неспецифічних терапевтичних методів, заснованих на пороутворенні в клітині і/або мітохондріальній мембрані з використанням рослинних або бактеріальних токсинів, яка пов’язана з високою токсичністю і необхідністю введення високих доз. Виявилося, що в багатьох випадках злиті протеїни за даним винаходом є більш потужним, ніж розчинний hTRAIL і його варіанти, включаючи фрагмента послідовності. Досі ефекторні пептиди, що застосовуються в злитому протеїнові за даним винаходом, не використовувалися в медицині як лікувальний засіб через несприятливі кінетики, швидке розкладання неспецифічними протеазами і накопичення в організмі, викликане відсутністю належної послідовності активації шляхів, яка необхідна, щоб надати можливості ефекторному пептиду належно діяти на цільовому сайті. Включення ефекторних пептидів у злитий протеїн забезпечує їх селективну доставку до місця її бажаної дії. Крім того, приєднання ефекторного пептиду збільшує масу протеїну, що призводить до більш тривалого періоду напіврозпаду, підвищеного терміну затримки протеїну в пухлині і підвищення його ефективності. Нові злиті протеїни мають також, принаймні, знижену або обмежену, або навіть по суті анульовану гемолітичну активність, в порівнянні з їх окремими природними цитолітичними пептидами. 4 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Крім того, у багатьох випадках нові злиті протеїни також здатні подолати природну або набуту резистентність стійкість до TRAIL. Швидше за все, подолання резистентності обумовлено дестабілізацією мембранного потенціалу клітини, в результаті зв’язування злитих протеїнів з ліпідами клітини або мітохондріальної мембрани і утворення пір, що спричинює витік двовалентних іонів за межі клітини. У наслідок зв'язування з ліпідами мітохондріальної мембрани, відбувається вивільнення цитохрому С, SMAC / Diablo протеїну (мітохондріального протеїну, який виходить з мітохондрій в цитозоль під час апоптозу, зв’язуючись з протеїнами сімейства IAP(інгібіторів апоптозу)) і фактора AIF(індукуючого апоптоз) в цитоплазму, що викликає активацію проапоптотичної каспази в ураженій клітині. Руйнування мітохондріальних мембран призводить також до активації каспази-9, в результаті чого індукується апоптоз. Опис ілюстрацій Фіг. 1 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Cby.Cgfoxn1(nu)/J, хворих на рак легені A549, що одержали лікування злитим протеїном, відповідно a прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 2 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Cby.Cg-foxn1(nu)/J, хворих на рак легені A549, що одержали лікування злитим протеїном, a відповідно прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 3 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, хворих на рак легені A549, що одержали лікування злитим протеїном, відповідно a прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 4 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на рак легені A549, що одержали лікування злитим протеїном, a відповідно прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 5 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, хворих на рак легені NCI-H460-Luc2, що одержали лікування злитим протеїном, a відповідно прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 6 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на рак легені NCI-H460-Luc2, що одержали лікування злитим a протеїном, відповідно прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 7 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Cby.Cgfoxn1(nu)/J, хворих на рак простати PC3 що одержали лікування злитим протеїном, відповідно a прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 8 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Cby.Cg-foxn1(nu)/J mice, хворих на рак простати PC3, що одержали лікування злитим протеїном, a відповідно прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 9 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, хворих на рак підшлункової залози PANC-1 що одержали лікування злитим a протеїном, відповідно прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 10 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr mice, хворих на рак підшлункової залози PANC-1, що одержали лікування a злитим протеїном, відповідно прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 11 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, хворих на рак товстої кишки HCT116, що одержали лікування злитим протеїном, a відповідно прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 12 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на рак товстої кишки HCT116, що одержали лікування злитим a протеїном, відповідно прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 13 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, хворих на рак товстої кишки SW620, що одержали лікування злитим протеїном, a відповідно прикладу 16 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 14 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на рак товстої кишки SW620, що одержали лікування злитим a протеїном, відповідно прикладу 16 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 15 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, хворих на рак товстої кишки Colo205, що одержали лікування злитим протеїном, a відповідно прикладу 16 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 16 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на рак товстої кишки Colo205, що одержали лікування злитим a протеїном, відповідно прикладу 16 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. 5 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фіг. 17 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, хворих на саркому матки MES-SA/Dx5, що одержали лікування злитим протеїном, a відповідно прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 16 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на саркому матки MES-SA/Dx5, що одержали лікування злитим a протеїном, відповідно прикладу 11 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 19 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, хворих на карциному підшлункової залози MIA Paca-2 MIA Paca-2, що одержали b лікування злитим протеїном, відповідно прикладу 16 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 20 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на карциному підшлункової залози MIA Paca-2 MIA Paca-2, що b одержали лікування злитим протеїном, відповідно прикладу 16 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 21 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, хворих на рак товстої кишки HCT116, що одержали лікування злитим протеїном, b відповідно прикладу 16 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 22 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на рак товстої кишки HCT116, що одержали лікування злитим b протеїном, відповідно прикладу 16 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 23 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, хворих на гепатоцелюлярну карциному HepG2, що одержали лікування злитим b протеїном, відповідно прикладу 16 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 24 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на гепатоцелюлярну карциному HepG2, що одержали лікування b злитим протеїном, відповідно прикладу 16 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 25 представляє зміни обсягу пухлини (у % від початкової стадії) у мишей Crl:SHOPrkdcscidHrhr, хворих на гепатому PLC/PRF/5, що одержали лікування злитим протеїном, b відповідно прикладу 16 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Фіг. 26 представляє значення показників уповільнення росту пухлини (% TGI) у мишей Crl:SHO-PrkdcscidHrhr, хворих на гепатому PLC/PRF/5, що одержали лікування злитим b протеїном, відповідно прикладу 16 даного винаходу, у порівнянні з rhTRAIL114-281. Детальний опис винаходу Винахід відноситься до злитого протеїну, що містить: домен (а), який є функціональним фрагментом послідовності розчинного протеїну hTRAIL, при цьому даний фрагмент починається амінокислотою у позиції не нижче, ніж hTRAIL95, і закінчується амінокислотою hTRAIL281, або гомологом зазначеного функціонального фрагмента, який має, щонайменше, 70% ідентичність послідовності, переважно, 85% ідентичність, і, принаймні, один домен (b), що є послідовністю цитолітичного ефекторного пептиду, що утворює пори у клітинній мембрані, при цьому послідовність домену (b) приєднана в точці C закінчення і / або точці N закінчення домену (а), Термін «пептид» у контексті даного винаходу слід розуміти як молекулу, сконструйовану з безлічі амінокислот, з'єднаних разом за допомогою пептидного зв'язку. Таким чином, термін "пептид" у контексті даного винаходу включає в себе поняття олігопептидів, поліпептидів і протеїнів. У даному винаході амінокислотні послідовності пептидів будуть представлені звичайним способом, прийнятнимдля рівні техніки, в напрямку від точки N закінчення (N-кінця) пептиду в бік точки С його закінчення (C-кінця). Таким чином, будь-яка послідовність має свою точку N закінчення з лівого боку і точку С закінчення з правого боку її лінійного зображення. Термін "функціональний розчинний фрагмент послідовності розчинного hTRAIL" слід розуміти як назву, що вказує на будь-який такий фрагмент розчинного hTRAIL, який здатний індукувати апоптотичний сигнал у клітинах ссавців після зв'язування з рецепторами на поверхні клітин. Кваліфікованому фахівцю слід взяти до уваги, що наявність щонайменше 70% або 85% гомології TRAIL - послідовності відома з рівня техніки в даної області. Слід розуміти, що доменом (b) ефекторного пептиду в злитому протеїні за даним винаходом не є а ні протеїн hTRAIL, а ні частина або фрагмент протеїну hTRAIL. Злитий протеїн за даним винаходом включає в себе принаймні один домен (б) ефекторною пептиду, приєднаний на С-кінці і / або на N-кінці домену (а). 6 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Під послідовністю hTRAIL слід розуміти відому послідовність hTRAIL, що опублікована (депонована) в базі даних ГенБанку (GenBank) с реєстраційним номером P50591, а також у патентному документі EP0835305A1 і представлена в переліку послідовностей за даним винаходом як SEQ. No. 90. У конкретному прикладі здійснення, домен (а) є фрагментом послідовності TRAIL, починаючи з амінокислоти в діапазоні від hTRAIL95 до hTRAIL121 включно, і завершаючи амінокислотою hTRAIL 281. Зокрема, домен (a) може бути вибраний з групи, до складу якої входять послідовності, що відповідають hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL119-281 і hTRAIL121-281. Спеціалісту в даній області техніки має бути очевидним, що hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281 і hTRAIL121-281 представляють собою фрагмент TRAIL протеїну людини, який починається амінокислотою, позначеною номером 95, 114, 115, 116, 119 і 121, відповідно, і закінчується останньою амінокислотою 281, у відомій послідовності TRAIL. В іншому конкретному прикладі здійснення домен (а) є гомологом функціонального фрагмента послідовності розчинного TRAIL - протеїну, починаючи з позиції аміно кислоти не нижче hTRAIL95 і закінчуючи амінокислотою hTRAIL281, послідовність якої, щонайменше, на 70%, переважно на 85% ідентична вихідній послідовності. В окремих варіантах даного прикладу здійснення домен (а) є гомологом фрагменту, вибраного з групи, що складається з послідовностей, які відповідають hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL115-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281 і hTRAIL121-281. Слід розуміти, що гомолог фрагменту TRAIL є варіацією/модифікацією амінокислотної послідовності даного фрагменту, при цьому, щонайменше, одна амінокислота замінена, включаючи 1 амінокислоту, 2 амінокислоти, 3 амінокислоти, 4 амінокислоти, 5 амінокислот, 6 амінокислот і не більше 15% амінокислот, при цьому фрагмент модифікованої послідовності зберігає функціональні ознаки послідовності TRAIL, тобто здатність зв'язуватися з рецепторами загибелі на клітинній поверхні і індукувати апоптоз у клітинах ссавців. Модифікація амінокислотної послідовності може включати, наприклад, заміщення, делецію та / або додавання амінокислот. Переважно, гомолог фрагменту hTRAIL, що має модифіковану послідовність, демонструє модифіковану афінність до рецепторів загибелі DR4 (TRAIL-R1) або DR5 (TRAIL-R2) у порівнянні з нативним фрагмент TRAIL. Термін "модифікована афінність" відноситься до підвищеної афінності та / або афінності зі змінною селективністю рецептора. Переважно, гомолог фрагменту TRAIL, що має модифіковану послідовність, проявляє підвищену афінність до рецепторів загибелі DR4 і DR5, у порівнянні з нативним фрагментом TRAIL. Особливо переважним є той факт, що гомолог фрагменту TRAIL, який має модифіковану послідовність, проявляє більш високу афінність до рецептора загибелі DR5, у порівнянні з рецептором загибелі DR4, тобто підвищену селективність DR5/DR4. Також переважним є те, що гомолог фрагменту TRAIL, який має модифіковану послідовність, проявляє підвищену селективність відносно рецепторів загибелі DR4 і / або DR5 щодо афінності до рецепторів DR1 (TRAIL-R3) та / або DR2 (TRAIL-R4). Модифікації TRAIL, результатом яких є підвищення ступеню спорідненості (афінності) та / або селективності відносно рецепторів загибелі DR4 і DR5, відомі кваліфікованим фахівцям в даній галузі техніки, наприклад, з публікації Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. (Варіанти DR4-селективного апоптозіндукуючого ліганду (TRAIL), що має відношення до фактору некрозу пухлини, отримані на основі структурного конструювання) J. Biol. Chem. 2008 Jul 18; 283 (29) :20560-8, в якій описана мутація D218H, що володіє підвищеною селективністю по відношенню до DR4, або з публікації Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. (Генерування нових TRAIL мутантів DR5-А і DR5-B з поліпшеною селективністю відносно рецептора загибелі 5, апоптоз.) 2009 Jun; 14 (6) :778-87, в якій описана мутація D269H із зниженим показником афінності до DR4. Мутанти hTRAIL, які призводять до збільшеної афінності до одного з рецепторів DR4 або DR5, порівняно з рецепторами DR1 і DR2, і підвищеної афінності до рецептора DR5, в порівнянні з DR4, описані також в патентних документах WO2009077857 і WO2009066174. 7 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Підходящими мутаціями є одна або декілька мутацій в позиціях нативного hTRAIL, вибраних з групи, що складається з амінокислот 131, 149, 159, 193, 199, 201, 204, 204, 212, 215, 218 і 251, зокрема, мутації, що залучають заміщення амінокислоти основною амінокислотою, такою як лізин, гістидин або аргінін, або такою кислою амінокислотою, як глутамінова кислота або аспарагінова кислота. Зокрема, можуть бути зазначені одна або декілька мутацій, вибраних з групи, що складається з G131R, G131K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K201R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251D, K251E і K251Q, як описано в патентній публікації WO2009066174. Прийнятними мутаціями є також одна або декілька мутацій в позиціях нативного hTRAIL, вибраних з групи, що складається з 195, 269 і 214, зокрема, мутацій, які передбачають заміщення амінокислоти основною амінокислотою, такою як лізин, гістидин або аргінін. Зокрема, можуть бути зазначені одна або декілька мутацій, вибраних з групи, що складається з D269H, E195R, і T214R, як описано в патентній публікації WO2009077857 В конкретному прикладі здійснення домен (а), який являється гомологом фрагменту hTRAIL, вибирають із мутанта D218H нативної послідовності TRAIL, як описано в WO2009066174 або мутанта Y189N - R191K - Q193R - H264R - I266R - D269H нативної послідовності TRAIL, як описано в роботі Gasparian ME et al. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. (Генерування нових TRAIL мутантів DR5-А і DR5-B з поліпшеною селективністю відносно рецептора загибелі 5, апоптоз.) 2009 Jun; 14(6): 778-87. Домен (а), тобто фрагмент TRAIL, є областю, яка відповідає за зв'язування конструкції злитого протеїну з рецепторами загибелі на поверхні клітини. Крім того, домен (а) при зв'язуванні проявляє свою відому агоністичну активність, тобто здійснює активацію зовнішнього шляху апоптозу. Домен (b) злитого протеїну даного винаходу є доменом ефекторною пептиду з цитолітичною активністю проти еукаріотичної клітини. В конкретних прикладах здійснення злитого протеїну за даним винаходом ефекторним пептидом домену (b) злитого протеїну є пептид, що має пороутворюючу активність відносно ракових клітин, вибраний з групи, що складається з послідовностей від SEQ. No. 34 до SEQ. No. 56, і від SEQ. No. 125 до SEQ. No. 132. Відносно пептиду з цитолітичною активністю, мається на увазі пептид, що здатний утворювати пори в клітинній мембрані і після проникнення в клітину, також і в мітохондріальній мембрані, тим самим руйнуючи цілісність мембрани. В результаті руйнування мембрани, відбувається витік вмісту цитоплазми, в тому числі іонів, поза межі клітини, що призводить до швидкого і необоротного електролітичного дисбалансу в клітині і її руйнування (лізису клітини). Здатність пептиду утворювати пори в клітинній або мітохондріальній мембрані і тим самим спричинювати лізис клітини може бути визначена за методом тестування проникності клітинних мембран, відомим фахівцям у даній галузі, наприклад шляхом вимірювання інтенсивності вивільнення з клітини внутрішньоклітинних речовин, які раніше були введені в клітину, наприклад (ATP)АТФ або міченого маркера, або шляхом вимірювання інтенсивності поглинання барвника, такого як трипанового синього, чого (поглинання) не відбувається, коли клітини неушкоджені. Цитолітичний ефекторний пептид за винаходом може бути або природним пептидом, або синтетичним пептидом. Природним цитолітичним пороутворюючим пептидом може бути бактеріальний екзотоксин, такий як альфа–HL, аеролізин, перфрінголізин, пневмолізин, стрептолізин O, лістеріолізин, токсин Bacillus thuringensis , параспорин з Bacillus thuringensis, літичні молекул из E.coli, наприклад, гемолізин або коліцин. Природним цитолітичним пороутворюючим пептидом може бути еукаріотичних пептид, наприклад, людський гранулізин, сімейство пілозулінів, включаючи, пілозулін 1 і пілозулін-5 з яду австралійських мурашок Myrmecia Pilosula, магаінін, наприклад, магаінін-2 зі шкіри африканської жаби Xenopus laevis, ауреїн 1.2 зі шкіри африканської жаби Litoria raniformis, цитропін 1.1 зі шкіри деревної жаби Litoria citropa, мелітин з яду медоносної бджоли Apis mellifera, дефензини, наприклад, альфа-дефензин і бета-дефензин, виділені з клітин людини, лактоферіцини, наприклад, лактоферіцин B з коров’ячого молока, тахіплезин (tachyplesin) з лейкоцитів краба Tachypleus tridentatus, цекропіни A і B або плеуроцидіни, виділені з Pleuronectes americanus. Синтетичним цитолітичним пороутворюючим пептидом може бути відомий цитолітичний пептид, такий як гібрид фрагменту цекропіну А і фрагменту CA (1-8) мА (1-12) магаїніну 2, гібрід фрагменту цекропіну А і фрагменту мелітіну CAMEL (CA(1-7)MEL(2-9)), синтетичні цитолітичні 8 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пептиди, що складаються з позитивно заряджених амінокислотних лізину, аргініну і лейцину, частина з яких представлена у вигляді D-амінокислот, таких як D-K4-L2-R9 і D-K6-L9, і пептиди, що містять домен, який складається з D-амінокислотного мотиву KLAKLAK або його повторів, наприклад, (KLAKLAK)2, синтетичні гібридні пептиди з двох літичних пептидів, таких як гібридні магаїнін-бомбезин і цекропін-мелітин, синтетичні злиті пептиди, що містять синтетичний цитолітичний пептид і домен зв'язування з рецептором, присутнім на поверхні клітини, крім TRAIL-рецептора, або домен, що дозволяє проникнення в клітину, або літичні пептиди на основі амфіпатичної спіральної моделі, що складається з KLLLK і KLLK серій, або модифікованого та / або усічених пептидів (переважно у вигляді злиття з доменами трансдукції (передачі регуляторного сигналу) або націлювання) ссавцевого походження. Еффекторний пептид домену (б) злитого протеїну за даним винаходом може являти собою пептид, що формує пори в клітинній або мітохондріальній мембрані шляхом прямої взаємодії пептидів, що мають високий позитивний заряд, з негативно зарядженою мембраною. Типовими послідовностями ефекторного пептиду в даному прикладі здійснення визначені SEQ. No. 34 (активна форма людського гранулізину), SEQ. No. 35 (15-амінокислотний синтетичний літичний пептид), SEQ. No. 38 (пептид з тахіплезину (tachyplesin)), SEQ. No. 39 (злитий пептид бомбезин-магаїнін 2), SEQ. No. 40 (магаїнін-2), SEQ. No. 42 (26-амінокислотний гібридний пептид цекропін-мелітин), SEQ. No. 53 (віскотоксин A3 (VtA3)), і SEQ. No. 56 (злитий пептид, що містить інгібітор EGF (епідермального фактора росту) і синтетичний літичний пептид), SEQ. No. 132 (мелітин), SEQ. No. 129 і SEQ. No. 131 (злитий пептид, що містить бомбезин і усічені версії BMAP27 (B27) або BMAP28 (B28), SEQ. No. 130 (17- амінокислотний синтетичний пептид). Еффекторний пептид домену (b) злитого протеїну за даним винаходом може бути пороутворюючим пептидом, що володіє амфіпатічною альфа-спіральною конформацією, що дозволяє взаємодіяти з біологічними мембранами. Типовими послідовностями ефекторного пептиду в даному прикладі здійснення визначені SEQ. No. 36 (пілосулін-1), SEQ. No. 37 (пілосулін-5), SEQ. No. 41 (14-амінокислотний синтетичний ліричний пептид), SEQ. No. 43 (27-амінокислотний пептид FF/CAP-18), SEQ. No. 44 (BAMP-28 пептид), SEQ. No. 45 (аналог ізоформи C літичного пептиду з Entamoeba histolytica), SEQ. No. 46 (аналог ізоформи А літичного пептиду з Entamoeba histolytica), SEQ. No. 47 (аналог ізоформи В літичного пептиду з Entamoeba histolytica), SEQ. No. 48 (фрагмент домену HA2 гемаглютиніну вірусу грипу), SEQ. No. 54 (активний фрагмент людського перфорину), SEQ. No. 55 (параспорин-2 з Bacillus thuringensis), SEQ. No. 125 синтетичний злитий пептид з мотивом KLLK, SEQ. No. 126, і SEQ. No. 127 (аналоги плеуроцидину), SEQ. No. 128 синтетичний пептид з мотивом KLLK. Еффекторним пептидом домену (b) злитого протеїну за даним винаходом може бути пороутворюючий пептид з ферментативною активністю, вибраної з групи фосфоліпаз, гемолізинів або цитолізинів. Типовими послідовностями ефекторного пептиду в даному прикладі здійснення визначені SEQ. No. 49 (N-кінцевий домен альфа-токсину із Clostridium perfringens з активністю фосфоліпази С), SEQ. No. 50 (лістеріолізин O), SEQ. No. 51 (фосфоліпаза PC-PLC), і SEQ. No. 52 (еквінатоксин (ехіна токсин) EqTx-II). Ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю проти еукаріотичної клітини може бути пептид, який є активною формою людського гранулізину, що належить до сапонінподібного сімейства, демонструю чого сильну здатність до зв’язування з мембранними ліпідами (P. M. Lydyard, A. Whelan, M. W. Fanger, "Krótkie wykłady: Immunologia", Wydawnictwo Naukowe PWN 2001). Завдяки можливості зв'язуватися з мембранами, гранулізин здатний руйнувати мітохондріальні мембрани. Цей процес призводить до вивільнення в цитоплазму цитохрому С, протеїну Smac / Diablo і фактора AIF, що спричинює активацію каскаду апоптозу і активацію каспази-9, також призводить до індукування апоптозу. Гранулізин також активує Bid – протеїни до досягнення виду tBid, який безпосередньо бере участь у формуванні пір в мембранах мітохондрій (Zhang et al, The Journal of Immunology, 182: 6993-7000, 2009). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 83-амінокислотний пептид, що представлено в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 34. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини може бути синтетичний цитолітичний пептид, що складається з лейцину (L) і лізину (K) і структурно нагадує природні літичні пептиди з яду бджоли або пептид з Ameba histolitica (Makovitzki, A., Suppression of Human Solid Tumor Growth in Mice by Intratumor and Systemic Inoculation of Histidine-Rich and pH-Dependent Host Defense–like Lytic Peptides (Пригнічення росту людської щільної пухлини у мишах методом внутрішньопухлинного і 9 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 системного щеплення літичними пептидами, багатими на гістидин, активність яких при цьому подібна активності і pH-залежного природного імунітету), cancer Research, 2009). У зв'язку з високим вмістом вказаних амінокислот, вказаний пептид має сильний позитивний заряд, що забезпечує його селективну взаємодію з мембранами трансформованих клітин пухлини і проникнення в їх структурі з утворенням пір у відповідності з механізмом «бочарної клепки». Зокрема, таким ефекторним пептидом є 15-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 35. Ще одним ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини може бути пептидний полісулін-1, який є катіонною молекулою, похідною від яду австралійської мурахи Myrmecia Pilosula. Пілосулін 1 являє собою пептид з високим вмістом лізину і аргініну, що регулярно повторюються в послідовності. Завдяки високому вмісту даних амінокислот, пептид має сильний позитивний заряд, що забезпечує його селективну взаємодію з мембранами ракових клітин та формування пір у відповідності з механізмом «бочарної клепки» (Kourie et al., Am J Physiol Cell Physiol, 278: 1063 – 1087, 2000). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 56-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 36. Ще одним ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини може бути пептидний полісулін-5, який є відповідальним за іонну взаємодію з клітинною мембраною, що спричинює формування пір і, як результат, пригнічення росту клітини. Пілосулін 5 являє собою пептид, що належить до сімейства пілосулінів, похідних від яду австралійської мурахи Myrmecia Pilosula. Даний пептид має у своїй структурі циклічно повторюваний зразок (шаблон) амінокислотного лізину, аланіну і аспарагінової кислоти, надаючи позитивного заряду, який може потенціювати взаємодію з поверхнею пухлинних клітин. Зокрема, таким ефекторним пептидом є 100-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 37. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини може бути тачіплезин (tachyplesin), катіонний пептид, виділений з лейкоцитів краба Tachypleus Tridentatus. Після проникнення всередину еукаріотичних клітин тачіплезин проявляє високу спорідненість до мітохондріальних мембран і спричинює їх дестабілізацію через механізм «бочарної клепки» і витік з мітохондрій в цитоплазму факторів, таких як цитохром С, протеїн Smac / DIABLO і фактор AIF, що призводить до загибелі клітини (Chen, Y., et al., RGD-Tachyplezin inhibits tumor growth (Тачіплезин, за відомостями бази даних дослідів над щурами, пригнічує ріст пухлини). Cancer Res, 2001. 61(6): p. 2434-8; Ouyang, G.L., et al., Effects of tachyplesin on proliferation and differentiation of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells (Вплив тачіплезину на проліферацію та диференціювання клітин гепатоцелюлярної карциноми людини SMMC-7721). World J Gastroenterol, 2002. 8(6): p. 1053-8.). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 17-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 38. Іншим ефекторним пептидом домену (b) може бути злитий пептид бомбезин-магаїнін з цитолітичною активністю відносно еукаріотичної клітини. Сімейство магаїнінів складається з 21 - 27 амінокислотних поліпептидів, виділених зі шкіри африканської жаби Xenopus Laevis. Амфіпатична альфа-спіральна структура пептидів дозволяє їм утворювати пори в клітинній мембрані через механізм "бочарної клепки" (Matsuzaki et al, Biochim Biophys Acta, 1327:119-130, 1997). Бомбезин, 14-амінокислотний пептид з високим позитивним зарядом, виділений зі шкіри жаби, належить до групи пептидів самонаведення на пухлини, і як такий проявляє високу афінність до поверхні деяких видів щільних пухлин і раку крові, які характеризується сильним негативним зарядом клітинної мембрани (Moody et al, Peptides, 1983; volume 4: 683-686). Бомбезин здатний зв'язуватися з клітинними рецепторами для отримання нейромедину В, близького гомолога бомбезину, існуючого в організмі людини, які на високому рівні експресуються на поверхні пухлинних клітин. Це значно підвищує рівень специфічності бомбезину і його накопичення в тканинах, вражених пухлиною, при мінімізації системної токсичності. Кон'югати токсичних пептидів з бомбезином проявляють підвищену протипухлинну активність, порівняно з окремими протеїнами (Huawei et al, Mol. Pharmaceutics, 2010; 2:586-596). Магаїнін характеризується обмеженими зв'язувальними властивостями у відношенні рецепторів пухлинних клітин і, отже, його цитотоксичність проявляється тільки при високих концентраціях. Було показано, що злитий пептид, що містить магаїнін і бомбезин, дозволяє підвищити специфічність і цитотоксичність проти пухлинних клітин (Liu S. et al., Enhancement of cytotoxicity of antimicrobial peptide magainin II in tumor cells by bombesin-targeted 10 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 delivery. (Підвищення цитотоксичності протимікробного пептидного магаїніну II в пухлинних клітинах шляхом бомбезин-націленої доставки). Acta Pharmacol Sin. 2011 Jan;32(1):79-88) Зокрема, таким ефекторним пептидом є 40-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 39. Іншим ефекторним пептидом домену (b) може бути також злитий пептид, що містить бомбезин і усічені варіанти BMAP27 (B27) або BMAP28 (B28) з цитолітичною активністю відносно еукаріотичної клітини. Такий химерний пептид проявляє цитотоксичну активність і зниження системної токсичності (Cai H. et al., Selective apoptotic killing of solid and hematologic tumor cells by bombesin-targeted delivery of mitochondria-disrupting peptides (Селективне апоптотичне знищення щільних і гематологічних пухлинних клітин шляхом бомбезин-цільової доставки пептидів, руйнуючих мітохондрії), Mol. Pharmaceutics, 2010, 7(2), pp. 586–596). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 31-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 129, і 29-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 131. Ще одним ефекторним пептидом домену (b) може бути пептид магаїніну-2 з цитолітичною активністю відносно еукаріотичної клітини, який утворює пори в клітинній і мітохондріальній мембрані. Зокрема, таким ефекторним пептидом є 23-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 40 Іншим цитолітичним ефекторним пептидом домену (b) з активністю щодо еукаріотичної клітини може бути синтетичний литичний пептид. Синтетичні пептиди формули (KLAKKLA)n (де n представляє собою число повторів мотиву) як амфіпатичні і альфа-спіральні протеїни після проникнення в клітину вибірково накопичуються в негативно зарядженій мітохондріальної мембрані, спричинюючи утворення пір і дестабілізацію електростатичного потенціалу мітохондрій, тим самим вибірково усуваючи клітини обраних ракових клітинних ліній (Javadpour та ін, J Med Chem, 39:3107-13, 1996). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 14-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 41. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з цитолітичною активністю відносно еукаріотичної клітини може бути інший синтетичний літичний пептид, який руйнує клітинну мембрану по типу дії миючого засобу. (Papo N, Shai Y. New lytic peptides based on the D,L-amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells. (Нові литичні пептиди, засновані на D, Lамфіпатичному спіральному мотиву, що, переважно, руйнує пухлинні клітини, в порівнянні з нормальними клітинами.) Biochemistry. 2003 Aug 12;42(31):9346-54). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 17-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 128. Ще одним ефекторним пептидом домену (b) з цитолітичною активністю відносно еукаріотичної клітини може бути цекропін-мелітин - гібридний пептид, який спричинює утворення пір в клітинній мембрані і, отже, призводить до інгібування росту пухлини. Цекропін містить у своєму складі велику кількість позитивно заряджених амінокислот, таких як лізин, лейцин і аланін (Quellette, A., J. і Selsted, M., E., 1996, FASEB. J., 10(11), 1280-9), за рахунок чого утворює пори в мембрані еукаріотичних клітин. Крім того, цекропін проявляє токсичну активність, руйнуючи структуру цитоскелету клітини через дестабілізацію структури мікротрубочок (Jaynes, J. et al., 1989, Peptide Res., 2 (2), 157-60). Мелітин являє собою пептид, сконструйований з 25 амінокислот, що мають високий позитивний заряд і альфа-спіральну структуру, і, отже, потужно взаємодіє з мембранами пухлинних клітин і утворює пори у відповідності з механізмом структурування по типу «бочарної клепки» (Smolarczyk, R. et al Peptydy – nowa klasa leków przeciwnowotworowych, Postępy Hig і Med. Doświadczalnej, 2009, 63: 360-368). Крім того, мелітин стимулює мембранну ферментативну фосфоліпазу А2, відповідальну за розкладання мембранних фосфоліпідів, що призводить до вивільнення жирних кислот, які є компонентами ліпідний бішар клітинної мембрани. Синтетичний химерний пептидний цекропін A \ мелітин, отриманий у результаті генетичного злиття позитивно зарядженого N - кінця пептиду цекропіну з гідрофобним N-кінцем пептиду мелітину, проявляє більш інтенсивну цитотоксичну активність відносно клітин-мішеней і позбавлений гемолітичної активності, характерної для цекропіну і мелітину (Boman, H., G. et al (1989) FEBS (Реферати Федерації європейських біохімічних товариств). Lett 259, 103-106; Andreu, D. et al (1992) FEBS Lett. 296, 190-194). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 26-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 42. 11 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ще одним ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю є пептид FF/CAP18, описаний автором Isogai E. В роботі “Antimicrobial and Lipopolysaccharide-Binding Activities of C-Terminal Domain of Human CAP18 Peptides to Genus Leptospira” (Антибактеріальна і ліпосахарид – зв’язувальна активність C-кінцевого домену пептидів CAP18 людини до бактерій роду лептоспір), The Journal of Applied Research, Vol. 4, No. 1, 2004, 180-185). FF/CAP18 є аналогом 27-амінокислотної С-кінцевої послідовності людського кателіцидину hCAP18109-135, який був модифікований шляхом заміщення 2 амінокислотних залишків фенілаланінами. FF/CAP18 має потужні катіонні характеристики, підвищені по відношенню до нативної послідовності через інкорпоровану модифікацію, і потужні зв’язки з еукаріотичними клітинними мембранами. Будучи зв’язаним з поверхнею мембрани, FF/CAP18 формує канали і іонні пори, що спричинюють дестабілізацію електростатичного балансу клітин. Крім того, після проникнення всередину клітини, аналог взаємодіє з мітохондріальною мембраною, утворюючи іонні канали і тим самим дестабілізуючи електростатичний потенціал мітохондрій, що і призводить до вивільнення з мітохондрій в цитозоль таких факторів, як цитохром С, SMAC / Diablo або AIF- фактора, який ініціює процес апоптозу. Зокрема, таким ефекторним пептидом є 27-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 43. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю є пептид BAMP-28 з сильним позитивним зарядом, що належить до сімейства кателіцидинів. Даний пептид також є структурним аналогом людських гістидинів, групою з 12 пептидів з масою нижче 4 кДа, вироблених з клітин слинних залоз і таких, що володіють антибактеріальними і протигрибковими властивостями (W. Kamysz et al., Histatyny - białka liniowe bogate w histydynę, Nowa Stomatologia 2004). N-кінцевий домен пептиду BAMP-28 має потужний позитивний заряд і відповідає за стикування з клітинною мембраною, тоді як C-кінцевий участок відповідає за цитотоксичну активність. (Hugosson, M., D. et al., 1994). Антибактеріальні пептиди і мітохондріальні препослідовності впливають на мітохондріальний звязок, респірацію та імпорт протеїну. Eur. J. Biochem. 223:1027-1033.). Механізм активності пептиду ВМАР-28 базується, передусім, на формуванні пір в клітинних і мітохондріальних мембранах (A. Risso et al., BMAP-28, an Antibiotic Peptide of Innate Immunity, Induces Cell Death through Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore (Пептид ВМАР-28, антибактеріальний пептид вродженого імунітету, що індукує клітинну загибель через відкривання пір переходу мітохондріальної проникності), MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Mar. 2002, p. 1926–1935). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 27-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 44. Ще одним ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю є аналог ізоформи А литичного пептиду з Entamoeba histolytica, відповідальний за процес накопичення на поверхні клітин, що призводить до утворення пір, які, в результаті, забезпечують придушення росту пухлини. Були ідентифіковані три ізоформи A, B і C пептидів Entamoeba histolytica, розташовані в гранульованій цитоплазмі паразита. Існують 77-амінокислотні поліпептиди, стабілізовані трьома сульфідними мостиками, що містять у вторинній структурі чотири амфіпатичні спіралі Leippe, M. і Müller-Eberhard, H.J. Toxicology 87, 5-18, 1994). Ці пептиди мають літичні властивості відносно еукаріотичних клітин (Leippe М., Мюллер-Еберхард, HJ токсикології 87, 5-18, 1994). Третя спіраль в структурі даних пептидів має довжину, прийнятну для проникнення через клітинну мембрану і утворення пір. Базуючись на амінокислотних послідовностях, що містять домен тільки третьої спіралі всіх трьох ізоформ, була сконструйована серія аналогових синтетичних пептидів (A3, B3 і C3), що має пороутворюючу і цитотоксичну активність відносно клітинних ліній раку людини і характеризується низькою гемолітичною активністю (Andrä et al., FEBS Letters 385: 96-100, 1996). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 24-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 45. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є аналог ізоформи B літичного пептиду від Entamoeba histolytica. Зокрема, таким ефекторним пептидом є 24-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 46. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є аналог ізоформи С літичного пептиду від Entamoeba histolytica. Зокрема, таким ефекторним пептидом є 24-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 47. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є гомолог 20-амінокислотного N-кінцевого фрагменту, так званий "злитий 12 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пептид", домену HA2 гемаглютиніну вірусу грипу, що відповідає за взаємодію вірусного капсиду з мембраною клітини-хазяїна (інтеркаляцію), яка призводить до утворення пір в клітинній мембрані клітини-хазяїна. Гемаглютинін (HA) вірусу грипу є гомотримерним глікопротеїном, відповідальним за злиття вірусного капсиду з мембраною клітини-хазяїна. В структурі протеїну можуть бути виділені два домени: домен HA1, що відповідає за зв'язування рецептора, і домен H2, який відповідає за взаємодію з клітинної мембраною. В структурі домену HA2 тільки Nкінцева частина (20 амінокислот), так званий "злитий пептид", безпосередньо вбудовується в структуру клітинної мембрани (Dürrer P et al., J Biol Chem 271:13417–13421, 1996). Структурний аналіз гомологів злитого пептиду показав, що його активність пов'язана з конформаційною зміною, що веде до утворення амфіпатичних альфа-спіралей, які здатні виконати перфорації в мембрані (Takahashi S., Biochemistry 29: 6257-6264, 1990). Таким чином, похідні "злитого пептиду" можуть бути застосовані в якості ефективних носіїв біологічно активної речовини, що забезпечує ефективне і швидке "витікання" з ендосом. Зокрема, таким ефекторним пептидом є 12-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 48. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є N-кінцевий домен альфа-токсину Clostridium perfringens з активністю фосфоліпази С відносно фосфатидилхоліну і сфінгомієліну з клітинних мембран, що забезпечує формування пір. N-кінцевий домен альфа-токсину Clostridium perfringens включає активний центр фосфоліпази С Зокрема, таким ефекторним пептидом є 247-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 49. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є фрагмент лістеріолізину O, холестерин-залежний пороутворюючий пептид, що належить до групи гемолізинів, секретованих патогеном і активованих після окислення середовища ендосоми (Schnupf P, Portnoy DA. Listeriolysin O: a phagosome-specific lysine (Лістеріолізин: фагосома-специфічний лізин). Microbes Infect. 2007 Aug; 9(10): 1176-87. Epub 2007 May 7).Було показано, що лістеріолізін O у вигляді злитого протеїну з цільовим протеїном може специфічно знешкоджувати пухлинні клітини (Bergelt S, Frost S, Lilie H. Listeriolysin O as cytotoxic component of an immunotoxin (Лістеріолізин О як цитотоксичний компонент імунотоксину). Protein Sci. 2009 Jun;18(6):1210-20). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 468-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 50. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є активний фрагмент фосфоліпази PC-PLC. Фосфоліпаза PC-PLC відповідає за ефективний лізис вакуолей в первинних ендотеліальних клітинах і діє синергічно з лістеріолізином у лізису первинної та вторинної вакуолі. Субстратом для PC-PLC є фосфатидилхолін (Smith GA, Marquis H, Jones S, Johnston NC, Portnoy DA, Goldfine H. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread (Два різних фосфоліпази С з Listeria monocytogenes відіграють ролі, що перекриваються при виході з вакуолі і поширенні від клітини до клітини). Infect Immun. 1995 Nov;63(11):4231-7). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 288-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 51. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є протеїн еквінатоксин. Еквінатоксин EqTx-II є пороутворюючим цитолізином, виділеним з анемони Actinia equine, що характеризується високою неспецифічною токсичністю по відношенню до клітин ссавців. Зокрема, таким ефекторним пептидом є 179-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 52. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є віскотоксин A3 (VtA3). Віскотоксін A3 є одним з тіонінів, отриманих з омели (Viscum album). Структурно він складається з 46-амінокислотного ланцюга з трьома дисульфідними мостиками, що є типовим для даного сімейства (Coulon A. et al., Comparative membrane interaction study of viscotoxins A3, A2 and B from mistletoe (Viscum album) and connections with their structures (Порівняльні дослідження мембранної взаємодії віскотоксинів А3, А2 і В з омели (Viscum album) та зв'язків з їх структурами).. Biochem J. 2003 Aug 15;374(Pt 1):71-8). Відомі токсичні властивості віскотоксину на клітинних лініях раку (Tabiasco J. et al Mistletoe viscotoxins increase natural killer cell-mediated cytotoxicity (Віскотоксини омели 13 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підвищують клітинно-опосередковану токсичність природного кілера). Eur J Biochem. 2002 May;269(10):2591-600). Точний молекулярний механізм функціонування не описаний відносно VtA3. Відомо, однак, що він включає формування іонних каналів і пошкодження мембранних структур за рахунок пермеабілізації. Потужний позитивний заряд молекули сприяє зв’язуванню як з нуклеїновими кислотами, так і з фосфоліпідами (Giudici M, Pascual R, de la Canal L, Pfüller K, Pfüller U, Villalaín J. Interaction of viscotoxins A3 and B with membrane model systems: implications to their mechanism of action(Взаємодія віскотоксинів А3 і В з системами мембранної моделі: вплив на їх механізм дії ). Biophys J. 2003 Aug;85 (2):971-81). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 46-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 53. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є фрагмент людськогоперфорину. Застосування протеїнів людського походження, які є "невидимими" для імунної системи, у тому числі людського перфорину, може вирішити проблему обмеженої клінічної корисності протеїнових химер, що містять токсини бактеріального, тваринного або рослинного походження через високу генеровану імуногенність (Frankel AE. Reducing the immune response to immunotoxin (Зниження імунної відповіді на імунотоксин.) Clin Cancer Res. 2004 Jan 1;10(1 Pt 1):13-5). N-кінцевий 34-амінокислотний фрагмент людського перфорин, що неспецифічно формує пори в клітинній мембрані, зберігає селективну цитотоксичну активність всього протеїну (Liu CC, Walsh CM, Young JD. Perforin: structure and function (Перфорин: структура і функція). Immunol Today.1995 Apr;16(4):194-201). Фрагмент перфорину, злитий з антитілом, націленим на ракові клітини, зберігає селективну цитотоксичну активність всього протеїну (Wan L. Expression, purification, and refolding of a novel immunotoxin containing humanized single-chain fragment variable antibody against CTLA4 and the Nterminal fragment of human perforin (Експресія, очищення і повторне укладання нового імунотоксину, що містить гуманізоване варіабельне антитіло одноланцюгового фрагменту CTLA4 і N-кінцевого фрагменту людського перфорину). Protein Expr. Purif. 2006 Aug;48(2):30713. Epub 2006 Mar 9). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 33-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 54. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є параспорин-2 з Bacillus thuringensis. Сімейство параспоринів складається з 13 різних токсинів, що належать до підгруп PS1, PS2- PS3, PS4 (Ohba M. Parasporin, a new anticancer protein group from Bacillus thuringiensis (Параспорин, нова група протиракового протеїну з Bacillus thuringiensis). Anticancer Res. 2009 Jan;29(1):427-33). Параспорин-2 проявляє специфічність відносно ракових клітин (MOLT-4, Jurkat, HL60, HepG2, CACO-2) і існує у формі 37-кДа протоксину, активованого відсіканням протеїназою К частини N і C-кінцевих фрагментів, відповідно, 51 і 36 амінокислот. Основною функцією параспорину-2 являється олігомеризація в межах клітинної мембрани, з метою формування пір, які мають діаметр близько 3 нм, що призводить до підвищення її проникності. Ефекти активності параспорину-2 залежать від типу випробуваних клітинних ліній і включають утворення так званих "blebbs (пухирів)" або опуклостей, спричинених витоком цитоплазми з клітин та їх лізис (клітин HepG2 і NIH-3T3), або формування вакуолі-подібних структур, що призводить до «вибуху» клітин (MOLT-4) (Kitada S. Cytocidal actions of parasporin-2,an anti-tumor crystal toxin from Bacillus thuringiensis (Цитоцидальна активність параспорину-2, протираковий кристалічний токсин з Bacillus thuringiensis). J. Biol. Chem. 2006 Sep 8;281(36):26350-60). Крім того, активність параспорину-2 призводить до руйнування структури мікротрубочок, заплутаності актинових філаментів, фрагментації мітохондрій і ендоплазматичного ретикулуму (Akiba T. Crystal structure of the parasporin-2 Bacillus thuringiensis toxin that recognizes cancer cells (Кристалічна структура токсину параспорину-2 з Bacillus Thuringiensis, здатного розпізнавати ракові клітини). J. Mol. Biol. 2009 Feb 13;386(1):121-33). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 251-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 55. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є злитий протеїн, що містить синтетичний літичний пептид і пептидний інгібітор рецептора EGF (епідермального фактора росту) на клітинній поверхні. Зв'язування інгібітора EGFR на поверхні клітин дозволяє забезпечити розташування литичного пептиду на поверхні клітини і додатково інгібує локалізовану всередині клітини рецепторну тирозинкіназу. Інгібування кіназної активності призводить до відсутності каскаду біохімічних сигналів, 2+ результатом чого є вивільнення цитоплазматичних іонів Ca та активації сигнальних шляхів 14 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 RAS (сімействак генів, а також протеїнів, які вони кодують), що спричинює підсилення активації шляхів гліколізу, синтез протеїну і, таким чином викликає зниження проліферації клітин і обмежує прогресію пухлини (Carpenter G, Cohen S., (May 1990). "Epidermal growth factor"(Епідермальний фактор росту). The Journal of Biological Chemistry 265 (14): 7709–12). Синтетичні пептиди, що містять повтори залишків лейцину і лізину в якості амфіпатичних спіральних протеїнів, селективно знищують вибрані ракові клітинні лінії (Javadpour et al., J. Med. Chem., 39:3107–13, 1996). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 32-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 56. Злитий пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No.56, що містить інгібітор EGF і синтетичний литичний пептид, є новим і досі ніде не був описаний. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є злитий протеїн, що містить синтетичний литичний пептид з мотивом KLLK і пептид, який є антагоністом рецептора PDGF (рецептора фактора росту) на клітинній поверхні. Зв'язування інгібітора PDGF на поверхні клітини забезпечує розташування литичного пептиду на поверхні клітини, при цьому таке зв'язування додатково негативно впливає на клітинну проліферацію і ангіогенез (Ostman A. et al., PDGF Receptors as Targets in Tumor Treatment (Рецептори PDGF в якості мішеней в лікуванні пухлини), Adv. Cancer Res., 2007;97:247-74.) Зокрема, таким ефекторним пептидом є 39-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 125. Злитий пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No.125, і злитий варіант антагоніста PDGF і синтетичного літичного пептиду послідовності SEQ. No. 125 є новим і досі ніде не був описаний. Іншим ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є протеїн, який є аналогом плейуроцидину (Pleurocidin). Плейуроцидини є катіонними α-спіральними протеїнами, які взаємодіють з клітинної мембраною (Cole AM et al., Isolation and characterization of pleurocidin, an antimicrobial peptide in the skin secretions of winter flounder(Виділення і характеристика плейуроцидину, антимікробний пептид в секреціях шкіри зимової камбали). J Biol Chem.1997 May 2;272(18):12008-13). Плейуроцидин-подібні пептиди проявляють активність проти клітин карциноми молочної залози, у тому числі повільно зростаючих клітин раку молочної залози з лікарською стійкістю. (Hilchie AL et al., Pleurocidinfamily cationic antimicrobial peptides are cytolytic for breast carcinoma cells and prevent growth of tumor xenografts (Pleurocidin сім'ї (Катіонні антимікробні пептиди сімейства плейуроцидину являються цитолитичними відносно клітин карциноми молочної залози і запобігають росту пухлинних ксенотрансплантатів). Breast Cancer Res. 2011 Oct 24;13(5):R102). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 25-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 126 і 26-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 127. Ще одним ефекторним пептидом домену (b) з пороутворюючою активністю відносно еукаріотичної клітини є пептид В27 – усічена версія протеїну BMAP27, виділеної форми з бичачих мієлоїдних клітин, що належать до сімейства кателіцидину. (Donati M. et al., Activity of Cathelicidin Peptides against Chlamydia spp. (Активність пептидів кателіцидину проти Chlamydia spp (хламідіозу)), Antimicrob Agents Chemother. 2005 March; 49(3): 1201–1202). Зокрема, таким ефекторним пептидом є 25-амінокислотний пептид, представлений в доданому списку послідовностей як SEQ. No. 130 Після зв'язування з TRAIL-рецепторами, присутніми на поверхні ракових клітин, злитий протеїн надаватиме подвійної дії. Домен (а), що є функціональним фрагментом TRAIL або його гомологом із збереженням функціональності, буде проявляти свою відому агоністичного активність - тобто зв'язуватися з рецепторами загибелі на поверхні клітини і здійснювати активацію зовнішнього шляху апоптозу. Ефекторний пептид домену (b) злитого протеїну потенційно буде здатний надавати позаклітинного або внутрішньоклітинного впливу паралельно з діяльністю домену TRAIL. У злитого протеїну за винаходом, протипухлинна активність TRAIL посилюється за рахунок формування пір в клітинній або мітохондріальній мембрані, що призводить до порушення електростатичного заряду клітини, витоку іонів з цитоплазми або дестабілізації електростатичного потенціалу мітохондрій і вивільнення в цитоплазму факторів, таких як цитохром С, Smac / DIABLO або фактора AIF, що, в свою чергу, активує внутрішньо індукований апоптоз, синергічний з сигналом від приєднання TRAIL до функціональних рецепторів серії DR. 15 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Нові злиті протеїни також володіють, принаймні, зниженою або обмеженою, або навіть суттєво усуненою гемолітичною активністю, що є характерною для окремих природних цитолітичних пептидів. В одному з прикладів здійснення винаходу домен (а) і домен (b) зв'язані між собою, принаймні, одним доменом (с), що містить послідовність сайту розщеплення, розпізнаного протеазами, присутніми в клітинному середовищі, особливо в середовищі пухлинної клітини, наприклад, такими як металопротеаза, урокіназа або фурин. Послідовності, розпізнані протеазою можуть бути вибрані з наступного переліку, що включає: - послідовність, розпізнану металопротеазою MMP, Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP або її фрагмент, що з останньою амінокислотою послідовності, до якої його приєднано, формує послідовність, розпізнану металопротеазою ММР, - послідовність, розпізнану урокіназою uPA Arg Val Val Arg/RVVR, або її фрагмент, що з останньою амінокислотою послідовності, до якої його приєднано, формує послідовність, розпізнану урокіназою, і їх комбінацію, або - послідовність, розпізнану фурином Arg Gln Pro Arg/RQPR, Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG,Arg Lys Lys Arg/RKKR) або інші атипічні послідовності, розпізнані фурином, що розкрито у роботі M. Gordon et all. InInf. and Immun,1995, 63, No. 1,p. 82–87, або нативну послідовність, розпізнану фурином Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu/RHRQPRGWEQL, або HisArgGlnProArgGlyTrpGluGln / HRQPRGWEQ), або фрагмент, який з останньою кислотою, до якої він приєднаний, формує послідовність, розпізнану фурином. В одному прикладі здійснення винаходу сайт розщеплення протеазою являє собою комбінацію послідовності, розпізнаної металопротеазою ММР, і/або послідовності, розпізнаної урокіназою uPA, і/або послідовності, розпізнаної фурином, розташованими поряд у будь-якому порядку. Переважно, в одному з прикладів здійснення домен (с) являє собою послідовність, розпізнану фурином, вибраним з Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Leu Ala Gly/ rvvrplglag і Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Arg/plglagrvvr. Такі протеази, як металопротеаза MMP, урокіназа uPA і фурин піддаються гіперекспресіі в пухлинному середовищі. Наявність послідовності, розпізнаної протеазою, забезпечує відщеплення домену (а) від домену (b), тобто вивільнення функціонального домену (b) і, отже, його прискорену активацію. Активація ефекторного пептиду - функціонального домену (b) після інтерналізації злитого протеїну в клітину може відбуватися не специфічно, за допомогою відщеплення домену (а) від домену (b) злитого протеїну за винаходом за допомогою лізосомальних ферментів (неспецифічних протеаз). Наявність протеазного сайту розщеплення, завдяки забезпеченню швидкого вивільнення ефекторного пептиду, підвищує можливості перенесення пептиду до місця дії, відрізавши його від фрагменту hTRAIL, за допомогою протеази, підданої гіперекспресії в пухлинному середовищі, ще до того моменту, коли може відбутися випадкова деградація злитого протеїну не специфічними протеазами. Крім того, транспортуючий домен (d) може бути приєднаний до домену (b) ефекторного пептиду злитого протеїну за даним винаходом. Домен (d) може бути вибраний з групи, до складу якої входять: - (d1) послідовність полігістидину, транспортуюча через клітинну мембрану, що складається з 6, 7 , 8, 9, 10 або 11 залишків гістидину (His/H); і - (d2) послідовність поліаргініну, транспортуюча через клітинну мембрану, що складається з 6, 7, 8, 9, 10 або 11 залишків аргініну (Arg/R) - (d3) PD4 транспортуюча послідовність (домен 4 трансдукції протеїну) Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala /yaraaarqara, - (d4) транспортуюча послідовність, що складається з рецептора трансферину, звязуючого послідовність Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro /thrppmwspvwp, (d5) PD5 транспортуюча послідовність (домен 5 трансдукції протеїну, TAT protein) Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg /YGRKKRRQRRR, або її фрагменти, які з останньою амінокислотою послідовності, до якої вони приєднані, утворюють послідовності транспортування доменів (d1) або (d2); і - їх комбінації. 16 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Комбінація доменів, наприклад, (d1) і (d2), може включати, зокрема, комбінацію (d1)/(d2) і (d2)/(d1). Крім того, комбінація доменів, наприклад (d1) і (d2), може включати в себе домени, розташовані поруч один з одним і приєднані до одного кінця домену (b) та / або домени, зв'язані з різними кінцями домену (b). Слід розуміти, що у разі, коли злитий протеїн має транспортуючий домен (d), приєднаний до домену (b), а домен (с) сайту розщеплення між доменами (а) і (b), то домен (с) розташований таким чином, що після розщеплення конструкції транспортуючий домен (d) залишається приєднаним до домену (b). Іншими словами, якщо злитий протеїн має як транспортуючий домен (d), так і домен (с) сайту розщеплення, то домен (d) знаходиться між доменом (b) і доменом (с), або він розміщується на кінці домену (b), навпроти місця приєднання домену (d). Винахід також включає варіант, при якому домен (d) знаходиться між двома доменами (с), тобто приклад здійснення, при якому після розщеплення конструкції, транспортуючий домен, переважно, домен транслокації, не прикріплений а ні до домену TRAIL, а ні до домену ефекторного пептиду. Винахід не поширюється на варіант, при якому домен (d) розташований між доменом (с) і доменом (а), тобто на випадок, коли після розщеплення конструкції транспортуючий домен залишається приєднаним до домену TRAIL. Ще в одному прикладі здійснення між доменом (a) і доменом (b) додатково розміщено домен (e), що включає послідовність, здатну приєднати PEG-молекулу до злитого протеїну (так званий лінкер пегилювання). Таким лінкером може бути відома послідовність Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ASGCGPEG або її фрагменти, які з останньою амінокислотою послідовності, до якої його приєднано, утворює послідовність, прийнятну для приєднання PEG-молекули . Лінкер пегилювання також може бути вибраний з наступної групи: Ala Ala Cys Ala Ala/AACAA, Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser/SGGCGGS, і Ser Gly Cys Gly Ser/SGCGS, або їх фрагмент, що з останньою амінокислотою послідовності, до якої його приєднано, формує послідовність, прийнятну для приєднання PEG молекули Переважно, послідовністю лінкера пегилювання є Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ ASGCGPEG. Крім основних функціональних елементів злитого протеїну і домену (доменів) сайту розщеплення, злиті протеїни, згідно винаходу, можуть включати нейтральну послідовність / послідовності гнучкого стеричного лінкера. Такі стеричні лінкери добре відомі і описані в літературі. Їх включення в послідовність злитого протеїну призначено для забезпечення коректного укладання протеїнів, що продукуються в процесі його гіперекспресії в клітинахгосподарях. Зокрема, стеричним лінкером може бути гліциновий, гліцин-сериновий або гліцинцистеїн-аланіновий лінкер. Зокрема, стеричним лінкером може бути комбінація гліцинових і серинових залишків, наприклад, Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS або будь-який її фрагмент, що функціонує як стеричний лінкер, наприклад, такий фрагмент, як Gly Gly Gly Ser/GGGS, Gly Gly Gly/GGG або Gly Gly Gly Gly/GGGG, Gly Gly Ser Gly Gly, Gly Gly Ser Gly/GGSG, Gly Ser Gly/GSG або Ser Gly Gly/SGG, або їх комбінації. У іншому прикладі здійснення стеричним лінкером може бути будь-яка комбінація гліцинових, серинових і аланінових залишків, наприклад, Ala Ser Gly Gly/ASGG, або будь-який її фрагмент, що функціонує як стеричний лінкер, наприклад, Ala Ser Gly/ASG. Також існує можливість застосування комбінації стеричних лінкерів, наприклад, послідовності Gly Gly Gly Ser Gly / GGGGS або будь-якого її фрагменту, що діє як стеричний лінкер, наприклад, фрагмент Gly Gly Gly/GGG, з іншим фрагментом, що діє як стеричний лінкер. У такому разі, стеричним лінкером може бути комбінація гліцинових, серинових і алані нових залишків, наприклад, Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly/GGGSASGG, Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly /GGSGGGSGGG, Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGSGGGGGS або Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser/ GGGGGGS. Ще в одному прикладі здійснення стеричним лінкером може бути комбінація серинових і гістидинових залишків Ser His His Ser/SHHS або Ser His His Ala Ser/SHHAS. В одному з прикладів здійснення стеричний лінкер може також бути обраний з одиночних амінокислотних залишків, таких як одиночний гліциновий або цистеїновий залишок, зокрема, один або два, десь до чотирьох гліцинових або цистеїновий залишків. В іншому варіанті лінкер може бути також утворений фрагментом стеричних лінкерів, описаних вище, який з кінцевою амінокислотою послідовності, до якої він приєднаний, формує послідовність стеричного лінкера. 17 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В іншому варіанті стеричний лінкер може сприяти формуванню та стабілізації структури тримера злитого протеїну за винаходом, таким чином збільшуючи його період напіврозпаду в системі кровообігу і попереджуючи дисоціацію, що може негативно вплинути на активність протеїну після введення в систему кровообігу. У цьому випадку лінкер являє собою комбінацію цистеїну і аланіну, наприклад, фрагмент Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys/ CAAACAAC або Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys / CAACAAAC, або їх фрагменти, що є кінцевою амінокислотною послідовністю, до якої його приєднано, і формує послідовність стеричного лінкера, стабілізуючу структуру тримера. Крім того, стеричний лінкер може бути також корисним для активації функціонального домену (b), що відбувається у неспецифічний (невизначений) спосіб. Активація домену (b) у неспецифічний спосіб може бути виконана шляхом відсікання домену (а) від домену (b) злитого протеїну за даним винаходом, через рН-залежний гідроліз стеричного лінкера. Окремі приклади здійснення злитого протеїну за винаходом являються злитими протеїнами, які включають пороутворюючий пептид, вибраний з групи пептидів, представлених наступним: SEQ. No. 34, SEQ. No. 35; SEQ. No. 36, SEQ. No. 37, SEQ. No. 38, SEQ. No. 39, SEQ. No. 40, SEQ. No. 41, SEQ. No. 42, SEQ. No. 43, SEQ. No. 44, SEQ. No. 45, SEQ. No. 46, SEQ. No. 47, SEQ. No. 48, SEQ. No. 49, SEQ. No. 50, SEQ. No. 51, SEQ. No. 52, SEQ. No. 53, SEQ. No. 54, SEQ. No. 55m SEQ. No. 56, SEQ. No. 125, SEQ. No. 126, SEQ. No. 127, SEQ. No. 128, SEQ. No. 129, SEQ. No. 130, SEQ. No. 131, і SEQ. No. 132. Детальний опис структури зазначених вище репрезентативних злитих протеїнів представлено в наведених нижче прикладах. Відповідно до даного винаходу, термін «злитий протеїн» означає одиночну молекулу протеїну, що містить два або більше протеїнів чи їх фрагментів, ковалентно зв'язаних за допомогою пептидного зв'язку в межах їх відповідних пептидних ланцюгів без додаткових хімічних лінкерів. В якості альтернативи, злитий протеїн може бути описаний як узагальнений образ структури протеїну або химерний протеїн. Відповідно до даного винаходу, терміни "узагальнений образ структури" або "химерний протеїн", якщо вони використовується, слід розуміти як такий, що відноситься до злитого протеїну, як визначено вище. Для фахівця, кваліфікованого в даній галузі техніки, є очевидним, що злитий протеїн, визначений таким чином, може бути синтезований відомими методами хімічного синтезу пептидів і протеїнів. Злитий протеїн може бути синтезований з використанням методів хімічного синтезу пептидів, зокрема, із застосуванням способів синтезу пептидів у твердій фазі, використовуючи відповідні смоли в якості носіїв. Такі методи є традиційними і відомі з рівня техніки, зокрема, вони описані в таких монографіях як, наприклад, Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis (Застосування пептидного синтезу на практиці), 1984, Springer-Verlag, New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (Твердофазний пептидний синтез), 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company Злитий протеїн може бути синтезований із застосуванням методів хімічного синтезу пептидів як безперервний протеїн. Крім того, окремі фрагменти (домени) протеїну можуть бути синтезовані індивідуально, а потім об'єднані разом в один безперервний пептид за допомогою пептидного зв'язку шляхом конденсації аміно - кінця одного пептидного фрагмента із карбоксильного кінця другого пептиду. Такі методи є традиційними і добре відомі з рівня техніки. Однак, переважно, злитий протеїн за винаходом є рекомбінантним протеїном, отриманий методами генної експресії полінуклеотидної послідовності, що кодує злитий протеїн у клітинаххазяїнах. Для перевірки структури отриманого пептиду можуть бути використані відомі методи аналізу амінокислотного складу пептидів, наприклад, метод мас-спектрометрії високої роздільної спроможності для визначення молекулярної ваги пептидів. Для підтвердження пептидної послідовності можуть бути також застосовані секвенсори протеїну, які послідовно руйнують пептид і ідентифікують послідовність амінокислот. Ще одним аспектом винаходу є полінуклеотидна послідовність, зокрема, послідовність ДНК, що кодує злитий протеїн, як зазначено вище Переважно, полінуклеотидною послідовністю, зокрема ДНК, відповідно до винаходу, що кодує злитий протеїн, як зазначено вище, є послідовність, яка оптимізована для експресії в E. coli. Іншим аспектом винаходу є також вектор експресії, що містить полінуклеотидну послідовність, зокрема, послідовність ДНК за винаходом, як визначено вище. 18 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ще одним аспектом винаходу є також клітина - хазяїн, що містить вектор експресії, як описано вище. Переважною клітиною-хазяїном для експресії злитих протеїнів за винаходом є клітина E. coli (клітина кишкової палички). Способи генерування рекомбінантних протеїнів, у тому числі злитих протеїнів, добре відомі. Якщо говорити коротко, даний спосіб полягає в генеруванні полінуклеотидної молекули, наприклад молекули ДНК, що кодує амінокислотну послідовність цільового протеїну і спрямовує експресію цільового протеїну в клітині – хазяїні. Далі цільовий протеїн, що кодує полінуклеотидну молекулу, інкорпорують у відповідний вектор експресії, який забезпечує ефективну експресію поліпептиду. Далі рекомбінантний вектор експресії вводять в клітинихазяїни для трансфекції / трансформації, і, як наслідок, виробляють трансформовану клітинухазяїна. Після цього цільовий протеїн піддають гіперекспресії, застосовуючи культуру трансформованих клітин, забезпечують очищення отриманих протеїнів, і, за вибором, відділяють шляхом відщеплення марковані послідовності, застосовані для експресії або очищення протеїну. Прийнятні способи експресії і очищення описані, наприклад, в монографії Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology (Технологія генної експресії, методи ензимології) 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), and A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995. Косміди, плазміди або модифіковані віруси можуть бути використані як вектори експресії для введення і реплікації ДНК послідовностей в клітинах-господарях. Зазвичай плазміди використовують як векторів експресії. Відповідні плазміди добре відомі і комерційно доступні. Вектор експресії за винаходом включає полінуклеотидну молекулу, що кодує злитий протеїн за винаходом і необхідні регуляторні послідовності для транскрипції і трансляції кодуючої послідовності, інкорпорованої в підходящу клітину-хазяїна. Вибір регуляторних послідовностей залежить від типу клітин-хазяїнів і може бути легко здійснений кваліфікованим фахівцем в даній області. Прикладами таких регуляторних послідовностей є транскрипційний промотор і енхансер (підсилювач) або РНК - полімераза - зв’язувальна послідовність, рибосома зв’язувальна послідовність, що містить сигнал ініціації транскрипції, вбудований перед кодуючою послідовністю і послідовність закінчення транскрипції, вбудовану після кодуючої послідовності. Крім того, в залежності від клітини-хазяїна і застосованого вектора, в вектор експресії можуть бути введені інші послідовності, такі як джерело реплікації, додаткові сайти рестрикції ДНК, підсилювачі (енхансери) і послідовності, що забезпечують індукування транскрипції. Вектор експресії також буде включати послідовність маркерного гена, який надає визначеного фенотипу трансформованій клітині і створює можливість для специфічної селекції трансформованих клітин. Крім того, вектор може також містити другу маркерну послідовність, яка дозволяє відрізняти клітини, трансформовані рекомбінантною плазмідою, що містить вбудовану кодуючу послідовність цільового протеїну, від тих, які прийняли плазміду без інсерту (вставки). Найчастіше використовуються типові маркери стійкі до антибіотиків, однак, можуть бути використані будь-які інші репортерні гени, відомі з рівня техніки, чия присутність в клітині (in vivo) може бути легко визначена із застосуванням методів авторадіографіі, спектрофотометрії або біо-та хемілюмінесценції. Наприклад, в залежності від клітини-хазяїна, можуть бути використані такі репортерні гени, як β-галактозидаза, β-глюкуронідаза, люціфераза, хлорамфенікол ацетилтрансфераза або зелений флуоресцентний протеїн. Крім того, вектор експресії може містити сигнальну послідовність, транспортуючу протеїни у відповідний клітинний компартмент, наприклад, періплазму, де полегшується утворення складчастості. При цьому, може бути присутньою послідовність, яка кодує мітку / тег, така як HisTag, прикріплена до точки N закінчення, або GST, прикріплена до точки C закінчення, що полегшує подальше очищення протеїну, яке відбувається з використанням принципу афінності, за допомогою афінної хроматографії на нікелевій колонці Також можуть бути присутніми додаткові послідовності, які захищають протеїни від протеолітичної деградації в клітинаххазяїнах, а також послідовностей, які підвищують його розчинність. Допоміжний елемент, приєднаний до послідовності цільового протеїну, може блокувати його діяльність, або чинити несприятливий вплив з іншої причини, наприклад, через токсичність. Такий елемент повинен вилучатися, що може бути досягнуто шляхом ферментативного або хімічного розщеплення. Зокрема, шестигістидиновий маркер (тег) HisTag або інші маркери зазначеного типу, приєднані для забезпечення очищення протеїну за допомогою афінної хроматографії, повинні бути видалені, через уже описаний вплив на печінкову токсичність розчинного протеїну TRAIL. Можуть бути застосовані гетерологічні системи експресії на основі різних відомих клітин-хазяїнів, в тому числі прокаріотичних клітин: бактеріальних клітин, таких як 19 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кишкова паличка (Escherichia coli) або сінна паличка (Bacillus subtilis), дріжджі, такі як Saccharomyces cervisiae або Pichia pastoris (пекарські дріжджі), і еукаріотичні клітинні лінії (комах, ссавців, рослин) Переважно, у зв'язку з простотою культивування та генетичних маніпуляцій, а такожвеликою кількістю отриманого продукту, використовується система експресії E.coli (кишкової палички). Відповідно, полінуклеотидна послідовність, що містить цільову послідовність, яка кодує злитий протеїн за винаходом, буде оптимізована для експресії в E.coli, тобто в кодуючій послідовності вона буде містити кодони, оптимальні для експресії в E.coli, вибрані з можливих варіантів послідовностей, відомих з рівня техніки. Крім того, вектор експресії буде містити описані вище елементи, що підходять для E.coli, приєднані до кодуючої послідовності. Таким чином, у переважному прикладі здійснення винаходу полінуклеотидна послідовність, що містить послідовність, яка кодує злитий протеїн за винаходом, оптимізований для експресії в E.coli, вибрана з групи полінуклеотидних послідовностей, що складається з: SEQ. No. 57; SEQ. No. 58; SEQ. No. 59; SEQ. No. 60; SEQ. No. 61; SEQ. No. 62; SEQ. No. 63; SEQ. No. 64; SEQ. No. 65; SEQ. No. 66; SEQ. No. 67; SEQ. No. 68; SEQ. No. 69; SEQ. No. 70; SEQ. No. 71; SEQ. No. 72; SEQ. No. 73; SEQ. No. 74; SEQ. No. 75; SEQ. No. 76; SEQ. No. 77; SEQ. No. 78; SEQ. No. 79; SEQ. No. 80; SEQ. No. 81; SEQ. No. 82, SEQ. No. 83; SEQ. No. 84; SEQ. No. 85; SEQ. No. 86; SEQ. No. 87; SEQ. No. 88; SEQ. No. 89; SEQ. No. 108; SEQ. No. 109; SEQ. No. 110; SEQ. No. 111; SEQ. No. 112; SEQ. No. 113; SEQ. No. 114, SEQ. No. 115; SEQ. No. 116; SEQ. No. 117; SEQ. No. 118; SEQ. No. 119; SEQ. No. 120; SEQ. No. 121; SEQ. No. 122; SEQ. No. 123 і SEQ. No. 124, які кодують злиті протеїни, що мають амінокислотні послідовності, відповідні амінокислотним послідовностям, вибраним з групи, яка складається з амінокислотних послідовностей: SEQ. No. 1; SEQ. No. 2; SEQ. No. 3; SEQ. No. 4; SEQ. No. 5; SEQ. No. 6; SEQ. No. 7; SEQ. No. 8; SEQ. No. 9; SEQ. No. 10; SEQ. No. 11; SEQ. No. 12; SEQ. No. 13; SEQ. No. 14; SEQ. No. 15; SEQ. No. 16; SEQ. No. 17; SEQ. No. 18; SEQ. No. 19; SEQ. No. 20; SEQ. No. 21; SEQ. No. 22; SEQ. No. 23; SEQ. No. 24; SEQ. No. 25; SEQ. No. 26, SEQ. No. 27; SEQ. No. 28; SEQ. No. 29; SEQ. No. 30; SEQ. No. 31; SEQ. No. 32; SEQ. No. 33; SEQ. No. 91; SEQ. No. 92; SEQ. No. 93; SEQ. No. 94; SEQ. No. 95; SEQ. No. 96; SEQ. No. 97, SEQ. No. 98; SEQ. No. 99; SEQ. No. 100; SEQ. No. 101; SEQ. No. 102; SEQ. No. 103; SEQ. No. 104; SEQ. No. 105; SEQ. No. 106, і SEQ. No. 107. У переважному прикладі здійснення винахід також забезпечує вектор експресії, придатний для трансформації E.coli, що містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з групи полінуклеотидних послідовностей від SEQ. No. 57 до SEQ. No. 87 і від SEQ. No. 108 до SEQ. No. 124, зазначених вище, а також клітини E.coli, трансформовані таким вектором експресії. Трансформація, тобто введення послідовності ДНК в бактеріальні клітини-хазяїни, зокрема, E. coli (кишкову паличку), як правило, здійснюється на компетентних клітинах, приготованих для сприйняття ДНК, наприклад, шляхом обробки іонами кальцію при низькій температурі (4° С), з подальшим впливом із застосуванням теплового шоку (при 37-42° С), або методом електропорації. Такі способи добре відомі і, як правило, визначаються виробником системи експресії або описані в літературі або в навчальних посібниках для проведення лабораторних робіт, наприклад, Maniatis et al., Molecular Cloning (Молекулярне клонування). Cold Spring Harbor, N.Y., 1982. Процедура гіперекспресії злитих протеїнів за даним винаходом у системі експресії E.coli, буде описана нижче. Винахід також відноситься до фармацевтичної композиції, що містить злитий протеїн за винаходом, як визначено вище, в якості активного інгредієнта, а також відповідний фармацевтично прийнятний носій, розріджувач та звичайні допоміжні компоненти. Фармацевтична композиція має містити ефективну кількість злитого протеїну за винаходом і фармацевтично прийнятні допоміжні компоненти, розчинені або дисперговані у носії або розріджувачі, і бажано, фармацевтична композиція має бути представлена виконаною в стандартній лікарській формі у вигляді дозувальної одиниці або у вигляді препарату, що містить безліч доз. Фармацевтичні форми і методи їх приготування, а також інші компоненти, носії та розріджувачі відомі кваліфікованим фахівцям і описані в літературі. Наприклад, вони описані в монографії Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA. Термін "фармацевтично прийнятний носій, розріджувач та допоміжний інгредієнт" включає будь-які розчинники, дисперсійні середовища, поверхнево-активні речовини, антиоксиданти, стабілізатори, консерванти (наприклад, антибактеріальні засоби, протигрибкові препарати), 20 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ізотонічні агенти, відомі з рівня техніки. Фармацевтична композиція за винаходом може містити різні типи носіїв, розріджувачів та наповнювачів, в залежності від обраного способу введення і бажаних лікарських форм, таких як рідкі, тверді і аерозольні форми для орального, парентерального, інгаляційного, місцевого (зовнішнього) застосування, при цьому, обрана форма повинна бути стерильною при її введенні методом ін'єкції. Кращим шляхом введення фармацевтичної композиції за винаходом є парентеральний шлях, в тому числі із застосуванням маршрутів ін'єкції, таких як внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, підшкірний, внутрішньочеревний, внутрішньопухлинний, також шлях або одноразового, або безперервного внутрішньовенного вливання. В одному з прикладів здійснення фармацевтична композиція за винаходом може бути введена шляхом ін'єкції безпосередньо в пухлину. В іншому прикладі здійснення фармацевтична композиція за винаходом може бути введена внутрішньовенно. Ще в одному прикладі здійснення фармацевтична композиція за винаходом може бути введена підшкірно або інтраперитонеально (внутрішньочеревно). Фармацевтичною композицією для парентерального введення може бути розчин або дисперсія в фармацевтично прийнятному водному або неводному середовищі, що містить буферний розчин для забезпечення відповідного показника рН та є ізоосмотичним щодо рідин організму, в разі необхідності, а також може містити антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні агенти і розчинні речовини, які роблять композицію сумісною з тканинами чи кров'ю реципієнта. Іншими компонентами, які можуть бути включені в композицію, є, наприклад, вода, спирти, такі як етанол, поліоли, такі як гліцерин, пропіленгліколь, рідкий поліетиленгліколь, ліпіди, такі як тригліцериди, рослинні олії, ліпосоми. Відповідна плинність і розмір часток заданої речовини може бути забезпечена за рахунок покривних речовини, таких як лецитин і поверхнево-активні речовини, наприклад, гідроксипропілцелюлози, полісорбати, і інші подібні речовини. Підходящими ізотонічними (isotonizing) засобами для парентеральних рідких композицій, являються, наприклад, цукри, такі як глюкоза, і хлорид натрію, а також їх комбінації. Крім того, фармацевтична композиція для введення шляхом ін'єкції або інфузії, може бути приготована у вигляді порошку, наприклад, у вигляді ліофілізованого порошку, що розводиться безпосередньо перед використанням у відповідному носії, такому як, наприклад, стерильна апірогенна вода. Фармацевтична композиція за винаходом для парентерального введення в організм може також мати форму, придатну для інтраназального введення, в тому числі, вона може бути приготована у вигляді розчинів, спреїв або аерозолів. Переважно, форма для інтраназального введення представлена у вигляді водного розчину і є ізотонічною або містить буферний розчин для підтримання показника рН від приблизно 5,5 до приблизно 6,5, щоб забезпечувати характеристики композиції аналогічними за своїми ознаками виділенням з носа. Крім того, композиція містить консерванти і стабілізатори, наприклад, такі як у відомих інтраназальних препаратах. Композиція може містити різні антиоксиданти, які уповільнюють окислення одного або декількох компонентів. Крім того, з метою запобігання дії мікроорганізмів, композиція може містити різні антибактеріальні і протигрибкові засоби, в тому числі, наприклад, і не обмежуючись названим, парабени, хлорбутанол, тімеросал, сорбінова кислота, і подібні відомі речовини зазначеного типу. Загалом, фармацевтична композиція за винаходом може включати, наприклад, щонайменше, близько 0,01% за вагою активного інгредієнта. Зокрема, композиція може містити активний інгредієнт у кількості від 1% до 75% за вагою одиниці композиції або, наприклад, від 25% до 60% за вагою, але не обмежуючись зазначеними значеннями. Фактична кількість дози композиції за даним винаходом, введена пацієнтам, включаючи людину, має визначатися фізичними і фізіологічними факторами, наприклад, такими як вага тіла, тяжкість стану хворого, вид захворювання, яке лікують, попередні або супутні терапевтичні втручання і спосіб введення композиції. Підходяща одинична доза, загальна доза та концентрація активного інгредієнта в композиції повинна визначатися лікарем. Композиція може, наприклад, вводитися при дозуванні від близько 1 мкг / кг ваги тіла до, приблизно, 1000 мг / кг ваги тіла пацієнта, наприклад, в діапазоні від 5 мг / кг ваги тіла до 100 мг / кг ваги тіла або в діапазоні від 5 мг / кг ваги тіла до 500 мг / кг ваги тіла. Злитий протеїн і композиції, що його включають, проявляють протиракову або протипухлинну активність і можуть бути застосовані для лікування ракових захворювань. Винахід також відноситься до застосування злитого протеїну за винаходом, як визначено вище, для лікування онкологічних захворювань у ссавців, включаючи людину. Винахід також відноситься до способу лікування онкологічних захворювань у ссавців, у тому числі людини, що включає введення пацієнту, потребуючому такого лікування, протиракової ефективної кількості 21 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 злитого протеїну за винаходом, як визначено вище, опційно, у вигляді відповідної фармацевтичної композиції. Злитий протеїн за винаходом може бути застосований для лікування гематологічних злоякісних новоутворень, таких як лейкемія, гранулематоз, мієлома та інших гематологічних злоякісних новоутворень. Злитий протеїн також може бути застосований для лікування щільних пухлин, таких як рак молочної залози, рак легені, в тому числі недрібноклітинний рак легені, рак товстої кишки, рак підшлункової залози, рак яєчників, рак сечового міхура, рак простати, рак нирки, рак мозку тощо. Відповідні шляхи введення злитого протеїну при лікуванні раку, зокрема, включають парентеральний шлях, який полягає у введенні злитого протеїну за винаходом у вигляді ін'єкцій або інфузій (вливань), застосовуючи композицію і форму, прийнятну для такого шляху введення. Винахід більш детально розкрито в описі наступних загальних процедур і прикладів специфічних злитих протеїнів. Загальна процедура гіперекспресії злитого протеїну Приготування плазміди Амінокислотна послідовність цільового злитого протеїну була використана в якості шаблону для генерування кодуючої його послідовності ДНК, що містить кодони, оптимізовані для експресії в Escherichia coli (кишковій паличці). Така процедура дозволяє збільшити ефективність наступної операції синтезу цільового протеїну в Escherichia coli (кишковій паличці). Далі була автоматично синтезована результуюча нуклеотидна послідовність. Крім того, сайти розщеплення ферментів рестрикції NdeI (на 5'-кінці ведучої нитки) і XhoI (на 3'-кінці ведучої нитки) були додані до результуючого гену, що кодує цільовий протеїн. Вони були використані для клонування гену у векторі pET28a (Novagen). Вони також можуть бути використані для клонування гену, що кодує протеїн для інших векторів. Цільовий протеїн, експресований з даної структури, може бути опційно забезпечений на N-кінці полігістидиновим тегом (шість гістидинів), якому передує ділянка, розпізнана (активізована) тромбіном, що згодом застосовується для його очищення за допомогою афінної хроматографії. Деякі мішені були експресовані без тегу, зокрема, без гістидинової мітки, при цьому згодом вони були очищені на хроматографічному обладнанні SP Sepharose. Коректність отриманої структури була підтверджена, по-перше, дослідженням рестрикції виділених плазмід із застосуванням ферментів NdeI і XhoI, а потім автоматичним секвенуванням усієї рамки зчитування цільового протеїну. Праймери, використані для секвенування, стали доповненням до послідовностей промотора T7 (5'TAATACGACTCACTATAGG-3') і термінатора T7 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'), присутніх у векторі. Результуюча плазміда була застосована для гіперекспресії цільового злитого протеїну в комерційному штамі E.coli, який був трансформований у відповідності до рекомендацій виробника. Колонії, отримані на селективному середовищі (LB агар, канаміцин (50 мкг / мл), 1% розчин глюкози), були застосовані для підготовки нічної культури в рідкому середовищі LB, доповнені канаміцином (50 мкг / мл) і 1% глюкозою. Через 15 годин росту, культури, отримані в перемішувальному інкубаторі, були застосовані для інокуляції відповідної заданої культури. Гіперекспресія і очищення злитих протеїнів – загальна процедура А LB середовище з канаміцином (30 мкг / мл) і 100 мкМ (UM) сульфату цинку інокулювали нічною культурою. Культуру інкубували при 37° С до тих пір, поки оптична щільність (OD) при 600 нм не досягала 0,60-0,80. Потім додавали IPTG до отримання кінцевої концентрації в діапазоні 0,25-1мМ. Після перемішувальної інкубації (3,5 – 20год.) при 25° C культуру центрифугували протягом 25 хв. при 6000g). Бактеріальні гранули повторно суспендували в буфері, що містить 50 мМ KH 2PO4, 0,5 М NaCl, 10 мМ імідазолу, рН 7,4. Суспензію обробляли ультразвуком на льоду протягом 8 хвилин (40% - амплітуда, 15-секундний імпульс, інтервал 10с). Отриманий екстракт освітлювали центрифугуванням протягом 40 хвилин при 20000 g, 4° С. Смолу Ni-Sepharose (Ni-. Сефарози) (GE Healthcare) попередньо обробляли методом урівноваження буфером, який використовували для приготування екстракту бактеріальних клітин. Далі смолу інкубували протягом ночі при 4° С з супернатантом, отриманим після центрифугування екстракту. Далі її завантажували в хроматографічну колонку і промивали від 15 до 50 об'ємами буферу 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 20 мМ імідазолу, рН 7,4. Отриманий протеїн елюювали з колонки з використанням градієнта імідазолу в 50 мМ буферу КН2РО4 з 0,5 М NaCl, рН 7,4. Одержані фракції досліджували (аналізували) за допомогою SDS-PAGE. Відповідні фракції об'єднували і діалізували протягом ночі при 4° С проти 50 мМ Тріс-буфера, рН 7,2, 150 мМ NaCl, 500 мМ L-аргініну, 0,1 мМ ZnSO4, 0,01% Tween (Твін) 20, і в той же час Histag, якщо він присутній, розщеплювали тромбіном (1:50). Після розщеплення тромбін був відділений від 22 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 цільового злитого протеїну, експресованого His-тегом, завдяки очищенню з використанням TM смоли Benzamidine Sepharose . Очищення цільових злитих протеїнів, експресованих без Histag, проводили на SP Sepharose. Чистоту продукту досліджували із застосуванням SDSPAGE - електрофорезу [Maniatis et al, Molecular Cloning. (Молекулярне клонування) Cold Spring Harbor, NY, 1982]. Гіперекспресія і очищення злитих протеїнів – загальна процедура В LB середовище з канаміцином (30 мкг / мл) і 100 мкМ сульфату цинку було інокульоване нічною культурою. Культури інкубували при 37° С до тих пір, поки оптична щільність (OD) при 600 нм не досягала 0,60-0,80. Далі додавали IPTG до отримання кінцевої концентрації в діапазоні 0,5-1мМ. Після 20 - годинної перемішувальної інкубації при 25° C культуру центрифугували протягом 25 хв при 6000 g. Після гіперекспресії бактеріальні клітини були зруйновані у френч-пресі у буфері, що містив 50 мМ KH2PO4, 0,5 M NaCl, 10 мM імідазолу, 5мM бета-меркаптоетанолу, 0,5 мМ PMSF (фенілметілсульфоніл фториду (фториду), рН 7,8. Отриманий екстракт освітлювали центрифугуванням протягом 50 хвилин при 80000 g. Смолу Ni-Sepharose (Ni-сефарозу) інкубували протягом ночі з отриманим супернатантом. Після цього смолу зі зв'язаним протеїном упаковували в хроматографічну колонку. Resulting extract was clarified by centrifugation for 50 minutes at 8000 g. Для вимивання фракцій, що містять незв'язувальні протеїни, колонку промивали від 15 до 50 об'ємами буферу 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 10 мМ імідазолу, 5 мМ бета-меркаптоетанолу, 0,5 мМ PMSF (фенілметілсульфонілфторид), рН 7,8. Далі, щоб вимити більшість протеїнів, специфічно зв'язуючих із шаром (постіллю), колонку промивали буфером, що містить 50 мМ KH2PO4, 0,5 М NaCl, 500 мМ імідазолу, 10% гліцерину, 0,5 мм PMSF, рН 7, 5. Отримані фракції були проаналізовані, застосовуючи SDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning (Молекулярне клонування) Cold Spring Harbor, NY, 1982). Фракції, що містять цільовий протеїн, об'єднували і, якщо протеїн було експресовано з гістидиновим тегом, розщеплювали тромбіном (1U на 4 мг протеїну, протягом 8 годин при 16 °C), щоб видалити полігістидиновий тег. Потім фракції піддавали діалізу проти буферного розчину (500 мМ L-аргініну, 50 мМ Тріс, 2,5 мМ ZnSO4, рН 7,4). У даному описі приклади протеїнів, первинно експресованих гістидиновим тегом, якого було згодом видалено, позначено індексом a) поряд з номером Прикладу. Протеїни, які були первинно експресовані без гістидинового тегу, позначені індексом b) поряд з номером Прикладу. Аналіз злитих протеїнів із застосуванням 2-D електрофорезу Для того щоб додатково охарактеризувати одержані протеїни і вибрати відповідні хроматографічні режими, були визначені ізоелектричні точки протеїнів. Для вирішення поставленої задачі застосовували метод двовимірного електрофорезу (2-D), який було здійснено в два етапи у відповідності з наступним регламентом. Етап 1. Ізоелектрофокусування протеїнів в градієнті рН і умовах денатуралізації. Протеїнові композиції (препарати) при концентрації 1 - 2 мг / мл осаджували шляхом змішування у співвідношенні 1:1 з розчином осадження, що містив 10% трихлороцтової кислоти і 0,07% бета-меркаптоетанолу в ацетоні. Суміш інкубували протягом 30 хв. при -20° С і потім центрифугували протягом 25 хв. при 15000 g і 4° С. Супернатант видаляли і осад двічі промивали холодним ацетоном з 0,07% бета-меркаптоетанолом. Після того залишки ацетону випаровували до знищення відчутного запаху. Осад протеїну суспендували в 250 мл буферу для регідратації, що включав 8 М сечовини, 1% CHAPS, 15 мМ DTT, 0,5% амфоліту (GE Healthcare) з профілем рН 3-11 або 6-11, залежно від згодом використовуваної стрічки (для здійснення ізоелектрофокусування). Протеїновий розчин було поміщено в керамічну камеру для ізоелектрофокусування з подальшим застосуванням 13 см стрічки DryStrip (GE Healthcare) з відповідним профілем рН (3-11 або 6-11). Все покривали шаром мінерального масла. Камери поміщали в апараті Ettan IPGphor III, де ізоелектрофокусування проводили відповідно до програми, визначеної для наявних розмірів смуги і профілю рН: 16-годинне зневоднення при 20° С. Фокусування в електричному полі при фіксованому градієнті pH Час 1 година 1година 2години 30 хвилин 30 хвилин Вольтаж 500 V градієнтt 500 – 1000 V градієнт 1000 – 8000 V 8000 V 55 23 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Після цього стрічку, яка містила сфокусовані протеїни, промивали протягом 1 хвилини у деіонізованій воді, фарбували із застосуванням фарбувального засобу Coomassie Brilliant, а потім знебарвлювали і архівували у вигляді зображення з позначеннями розташування протеїнів. Знебарвлену стрічку врівноважували 2 х 15 хв. буфером наступного складу: 50 мМ Tris-HCl рН 8,8, 6 М сечовини, 1% DTT (дитиотреитол), 2% SDS(додецилсульфату натрію), 30% гліцерину. Етап 2. Сепарація у другому напрямку із застосуванням SDS-PAGE. Стрічку поміщали над 12,5% поліакриламідним гелем з однією лункою на стандартний розмір, після чого здійснювали сепарацію в апараті для SDS-PAGE при вольтажу 200 В протягом 3 годин. Гель фарбували фарбувальним засобом Coomassie Brilliant, потім архівували із застосуванням шкали. Протеїни були ідентифіковані шляхом визначення ваги на основі їх розмірного стандарту, а показника IPI було прочитано по шкалі 6-11 на основі кривих, забезпечених виробником (GE Healthcare) (відношення рН до % довжини стрічки від кінця, позначеного як анод), або по шкалі 3-11 на основі кривої, визначеної експериментально за допомогою калібрувального набору для ізоелектрофокусування (GE Healthcare). Приклади В наступних прикладах здійснення показані репрезентативні приклади злитих протеїнів за винаходом В прикладах послідовності амінокислот злитих протеїнів позначені від N-кінця до C-кінця протеїну. В прикладах під позначенням, TRAIL завжди слід розуміти hTRAIL. Використовуються позначення компонентів амінокислотної послідовності, де поряд з позначенням з трьох літер дається еквівалентне позначення з однієї літери. LINKER1: стеричний лінкер Gly Gly /gg LINKER2: стеричний лінкер Gly Gly Gly / ggg LINKER3: стеричний лінкер Gly Ser Gly /GSG LINKER4: стеричний лінкер linker Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS LINKER5: стеричний лінкер linker Gly Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGGS LINKER6: стеричний лінкер Gly Gly Ser Gly Gly/GGSGG LINKER7: стеричний лінкер Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly/ GGGSGGG LINKER8: стеричний лінкер Gly Gly Gly Gly Ser Gly /GGGGSG LINKER9: стеричний лінкер Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser/ GGGSGGGGGS LINKER10: стеричний лінкер Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly / GGGGSGGGG LINKER11: стеричний лінкер Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly/ GSGGGSGGG LINKER12: стеричний лінкер Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys/ CAACAAAC LINKER13: стеричний лінкер Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys/ CAAACAAC LINKER 14: стеричний лінкер Cys/C LINKER 15: стеричний лінкер Gly/G LINKER16: стеричний лінкер Ser Gly Gly/SGG FURIN: послідовність, розщеплена фурином Arg Lys Lys Arg / RKKR FURIN.NAT: нативна послідовність, розщеплена фурином His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln / HRQPRGWEQ UROKIN: послідовність, розщеплена урокіназою Arg Val Val Arg / RVVR MMP: послідовність, розщеплена металопротеазою Pro Leu Gly Leu Ala Gly/ PLGLAG PEG1: лінкер пегилювання Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE PEG2: лінкер пегилювання Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu Gly/ ASGCGPEG TRANS1: транспортуюча послідовність His His His His His His /HHHHHH TRANS2: транспортуюча послідовність Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg/RRRRRRR TRANS3: транспортуюча послідовність Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg/RRRRRRRR TRANS4: транспортуюча послідовність Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala /yaraaarqara TRANS5: транспортуюча послідовність Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro /thrppmwspvwp TRANS6: транспортуюча послідовність Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg /YGRKKRRQRRR Приклад 1. Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 1 Протеїн послідовності SEQ. No. 1 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 258 амінокислот, і масу 29, 5 кДа, в якому домен (a) сформовано послідовністю TRAIL121-281, а доменом (b) ефекторного пептиду є 83амінокислотна активна форма людського гранулізину (SEQ. No. 34), приєднана на С-кінці домену (a). 24 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Крім того, між доменом (a) і доменом (b) послідовно розміщені стеричний лінкер G, стеричний лінкер (gsG), сайт розщеплення металопротеазою MMP (PLGLAG) і сайт розщеплення урокіназою (RVVR). Таким чином, структура злитого протеїну за винаходом має вигляд: (TRAIL121-281)-LINKER15-LINKER3-MMP-UROKIN-(SEQ. No. 34) Амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що включає кодони, оптимізовані для експресії в E. Coli, є, відповідно, SEQ. No. 1 і SEQ. No. 57, як показано в доданому Переліку послідовностей (Sequence Listing). Амінокислотна послідовність SEQ. No 1 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності SEQ № 57. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E.coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу у відповідності з загальною методикою, описаною вище. Протеїн був експресований з гістидиновим тегом. Приклад 2. Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 2 Протеїн послідовності SEQ. No. 2 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 261 амінокислот, і масу 30, 09 кДа, в якому домен (a) є послідовністю TRAIL119-281, а доменом (b) ефекторного пептиду є 83-амінокислотна активна форма людського гранулізину (SEQ. No. 34), приєднана на N-кінці домену (a). Крім того, між доменом (b) і доменом (а) послідовно розміщені сайт розщеплення урокіназою (RVVR), сайт розщеплення металопротеазою (PLGLAG) і стеричний лінкер (ggggs). Таким чином, структура злитого протеїну за винаходом має вигляд: (SEQ. No. 34)-UROKIN-MMP-LINKER4-(TRAIL119-281) Амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що включає кодони, оптимізовані для експресії в E. Coli, є, відповідно, SEQ. No. 2 і SEQ. No. 58, як показано в доданому Переліку послідовностей (Sequence Listing). Амінокислотна послідовність SEQ. No 2 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності SEQ № 58. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E.coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу у відповідності з загальною методикою, описаною вище. a Протеїн був експресований як з гістидиновим тегом (Приклад 2 ), так і без гістидинового тегу b (Приклад 2 ). Приклад 3. Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 3 Протеїн послідовності SEQ. No. 3 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 186 амінокислот, і масу 21, 5 кДа, в якому домен (a) є послідовністю TRAIL121-281, а доменом (b) ефекторного пептиду є синтетичний 15-амінокислотний літичний пептид (SEQ. No. 35), приєднаний на С-кінці домену (a). Крім того, між доменом (а) і доменом (b) послідовно розміщені: сайт розщеплення металопротеазою (PLGLAG) і сайт розщеплення урокіназою (RVVR). Таким чином, структура злитого протеїну за винаходом має вигляд: (TRAIL121-281)-MMP-UROKIN-(SEQ. No. 35) Амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що включає кодони, оптимізовані для експресії в E. Coli, є, відповідно, SEQ. No. 3 і SEQ. No. 59, як показано в доданому Переліку послідовностей (Sequence Listing). Амінокислотна послідовність SEQ. No 3 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності SEQ № 59. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E.coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу у відповідності з загальною методикою, описаною вище. Протеїн був експресований з гістидиновим тегом. Приклад 4. Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 4 Протеїн послідовності SEQ. No. 4 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 227 амінокислот, і масу 25, 7 кДа, в якому домен (a) є послідовністю TRAIL121-281, а доменом (b) ефекторного пептиду є 56-амінокислотний пілосулін-1 (SEQ. No. 36), приєднаний на N -кінці домену (a). 25 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, між доменом (b) і доменом (а) послідовно розміщені: сайт розщеплення урокіназою (RVVR) і сайт розщеплення металопротеазою (PLGLAG). Таким чином, структура злитого протеїну за винаходом має вигляд: (SEQ. No. 36)-UROKIN-MMP-(TRAIL 121-281) Амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що включає кодони, оптимізовані для експресії в E. Coli, є, відповідно, SEQ. No. 4 і SEQ. No. 60, як показано в доданому Переліку послідовностей (Sequence Listing). Амінокислотна послідовність SEQ. No 4 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності SEQ No 60. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E.coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу у відповідності з загальною методикою, описаною вище. Протеїн був експресований з гістидиновим тегом. Приклад 5. Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 5 Протеїн послідовності SEQ. No. 5 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 264 амінокислот, і масу 29,5 кДа, в якому домен (a) є послідовністю TRAIL95-281, а доменом (b) ефекторного пептиду є 56-амінокислотний пілосулін-1 (SEQ. No. 36), приєднаний на С-кінці домену (a). Крім того, між доменом (а) і доменом (b) послідовно розміщені: інкорпорований стеричний лінкер (CAACAAC), стеричний лінкер (GGG), сайт розщеплення металопротеазою (PLGLAG) і сайт розщеплення урокіназою (RVVR). Таким чином, структура злитого протеїну за винаходом має вигляд: (TRAIL95-281)-LINKER12-LINKER2-MMP-UROKIN-(SEQ. No. 36) Амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що включає кодони, оптимізовані для експресії в E. Coli, є, відповідно, SEQ. No. 5 і SEQ. No. 61, як показано в доданому Переліку послідовностей (Sequence Listing). Амінокислотна послідовність SEQ. No 5 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності SEQ No 65. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E.coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу у відповідності з загальною методикою, описаною вище. Протеїн був експресований з гістидиновим тегом. Приклад 6. Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 6 Протеїн послідовності SEQ. No. 6 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 299 амінокислот, і масу 33,2 кДа, в якому домен (a) є послідовністю TRAIL95-281, а доменом (b) ефекторного пептиду є 90-амінокислотний пептидний пілосулін-5 (SEQ. No. 37), приєднаний на С-кінці домену (a). Крім того, між доменом (а) і доменом (b) послідовно розміщені: інкорпорований стеричний лінкер (GSG), стеричний лінкер (CAACAAAC), сайт розщеплення металопротеазою (PLGLAG) і сайт розщеплення урокіназою (RVVR) і стеричний лінкер (G). Таким чином, структура злитого протеїну за винаходом має вигляд: (TRAIL95-281)-LINKER3-LINKER12-MMP-UROKIN-LINKER15-(SEQ. No. 37) Амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що включає кодони, оптимізовані для експресії в E. Coli, є, відповідно, SEQ. No. 6 і SEQ. No. 62, як показано в доданому Переліку послідовностей (Sequence Listing). Амінокислотна послідовність SEQ. No 6 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності SEQ No 62. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E.coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу у відповідності з загальною методикою, описаною вище. a Протеїн був експресований як з гістидиновим тегом (Приклад 6 ), так і без гістидинового b тегу (Приклад 6 ). Приклад 7. Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 7 Протеїн послідовності SEQ. No. 7 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 224 амінокислот, і масу 25,6 кДа, в якому домен (a) є послідовністю TRAIL95-281, а доменом (b) ефекторного пептиду є 17-амінокислотний активний пептид з тахіплезину (tachyplesin) (SEQ. No. 38), приєднаний на С-кінці домену (a). 26 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Крім того, між доменом (а) і доменом (b) послідовно розміщені: інкорпорований стеричний лінкер (CAACAAAC), стеричний лінкер (GG), сайт розщеплення металопротеазою (PLGLAG) і сайт розщеплення урокіназою (RVVR) Таким чином, структура злитого протеїну за винаходом має вигляд: (TRAIL95-281)-LINKER12-LINKER1-MMP-UROKIN-(SEQ. No. 38) Амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що включає кодони, оптимізовані для експресії в E. Coli, є, відповідно, SEQ. No. 7 і SEQ. No. 63, як показано в доданому Переліку послідовностей (Sequence Listing). Амінокислотна послідовність SEQ. No 7 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності SEQ No 63. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E.coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу у відповідності з загальною методикою, описаною вище. a Протеїн був експресований як з гістидиновим тегом (Приклад 7 ), так і без гістидинового b тегу (Приклад 7 ). Приклад 8. Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 8 Протеїн послідовності SEQ. No. 8 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 202 амінокислот, і масу 23,8 кДа, в якому домен (a) є послідовністю TRAIL114-281, а доменом (b) ефекторного пептиду є 17-амінокислотний активний пептид з тахіплезину (tachyplesin) (SEQ. No. 38), приєднаний на С-кінці домену (a). Крім того, між доменом (а) і доменом (b) послідовно розміщені: інкорпорований сайт розщеплення металопротеазою (PLGLAG) і сайт розщеплення урокіназою (RVVR) і 7- аргінінтранспортуюча послідовність (RRRRRRR). Таким чином, структура злитого протеїну за винаходом має вигляд: (TRAIL114-281)-MMP-UROKIN-TRANS2-(SEQ. No. 38) Амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що включає кодони, оптимізовані для експресії в E. Coli, є, відповідно, SEQ. No. 8 і SEQ. No. 64, як показано в доданому Переліку послідовностей (Sequence Listing). Амінокислотна послідовність SEQ. No 8 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності SEQ No 64. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E.coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу у відповідності з загальною методикою, описаною вище. a Протеїн був експресований як з гістидиновим тегом (Приклад 8 ), так і без гістидинового b тегу (Приклад 8 ). Приклад 9. Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 9 Протеїн послідовності SEQ. No. 9 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 243 амінокислот, і масу 27,6 кДа, в якому домен (a) є послідовністю TRAIL95-281, а доменом (b) ефекторного пептиду є 38-амінокислотний злитий пептид бомбезин-магаїнін (SEQ. No. 39), приєднаний на N -кінці домену (a). Крім того, між доменом (b) і доменом (а) послідовно розміщено: сайт розщеплення урокіназою (RVVR), сайт розщеплення металопротеазою (PLGLAG) і стеричний лінкер (CAAACAAC). Таким чином, структура злитого протеїну за винаходом має вигляд: (SEQ. No. 39)-UROKIN-MMP-LINKER13-(TRAIL95-281) Амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що включає кодони, оптимізовані для експресії в E. Coli, є, відповідно, SEQ. No. 9 і SEQ. No. 65, як показано в доданому Переліку послідовностей (Sequence Listing). Амінокислотна послідовність SEQ. No 9 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності SEQ No 65. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E.coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу у відповідності з загальною методикою, описаною вище. Протеїн був експресований з гістидиновим тегом. Приклад 10. Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 10 Протеїн послідовності SEQ. No. 10 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 196 амінокислот, і масу 22,4 кДа, в якому домен (a) є послідовністю TRAIL119-281, а доменом 27 UA 115436 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (b) ефекторного пептиду є 23-амінокислотний магаїнін-2 (SEQ. No. 40), приєднаний на N -кінці домену (a). Крім того, між доменом (b) і доменом (а) послідовно розміщено: сайт розщеплення урокіназою (RVVR) і сайт розщеплення металопротеазою (PLGLAG). Таким чином, структура злитого протеїну за винаходом має вигляд: (SEQ. No. 40)-UROKIN-MMP-(TRAIL119-281) Амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що включає кодони, оптимізовані для експресії в E. Coli, є, відповідно, SEQ. No. 10 і SEQ. No. 66, як показано в доданому Переліку послідовностей (Sequence Listing). Амінокислотна послідовність SEQ. No 10 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності SEQ No 66. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E.coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу у відповідності з загальною методикою, описаною вище. Протеїн був експресований з гістидиновим тегом. Приклад 11. Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 11 Протеїн послідовності SEQ. No. 11 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 202 амінокислот, і масу 23 кДа, в якому домен (a) є послідовністю TRAIL121-281, а доменом (b) ефекторного пептиду є синтетичний 14-амінокислотний літичний пептид (SEQ. No. 41), приєднаний на С-кінці домену (a). Крім того, між доменом (а) і доменом (b) послідовно розміщено: інкорпорований стеричний лінкер (GGGGSGGGG), сайт розщеплення урокіназою (RVVR), сайт розщеплення металопротеазою (PLGLAG) і 8-аргінін транспортуюча послідовність (RRRRRRRR). Таким чином, структура злитого протеїну за винаходом має вигляд: (TRAIL121-281)-LINKER10-UROKIN-MMP-TRANS3-(SEQ. No. 41) Амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що включає кодони, оптимізовані для експресії в E. Coli, є, відповідно, SEQ. No. 11 і SEQ. No. 67, як показано в доданому Переліку послідовностей (Sequence Listing). Амінокислотна послідовність SEQ. No 11 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності SEQ No 67. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E.coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу у відповідності з загальною методикою, описаною вище. a Протеїн був експресований як з гістидиновим тегом (Приклад 11 ), так і без гістидинового b тегу (Приклад 11 ). Приклад 12. Злитий протеїн послідовності SEQ. No. 12 Протеїн послідовності SEQ. No. 12 являє собою злитий протеїн, що має довжину, складену з 205 амінокислот, і масу 23,2 кДа, в якому домен (a) є послідовністю TRAIL121-281, а доменом (b) ефекторного пептиду є синтетичний 14-амінокислотний літичний пептид (SEQ. No. 41), приєднаний на С-кінці домену (a). Крім того, між доменом (а) і доменом (b) послідовно розміщено: інкорпорований стеричний лінкер (gg), послідовність лінкера пегілювання (ASGCGPEG), послідовність стеричного лінкера (ggG), сайт розщеплення металопротеазою (PLGLAG), сайт розщеплення урокіназою (RVVR), сайт розщеплення урокіназою (RVVR) і поліаргінін-транспортуюча послідовність (RRRRRRR). Таким чином, структура злитого протеїну за винаходом має вигляд: (TRAIL 121-281)-LINKER1-PEG2-LINKER2-MMP-UROKIN-TRANS2-(SEQ. No. 41) Амінокислотна послідовність і ДНК кодуюча послідовність, що включає кодони, оптимізовані для експресії в E. Coli, є, відповідно, SEQ. No. 12 і SEQ. No. 68, як показано в доданому Переліку послідовностей (Sequence Listing). Амінокислотна послідовність SEQ. No 12 структури, описаної вище, була використана в якості шаблону для генерування кодуючої ДНК послідовності SEQ No 68. Була генерована плазміда, яка містить кодуючу послідовність ДНК, при цьому гіперекспресію злитого протеїну здійснювали відповідно до описаних вище загальних методик. Гіперекспресію проводили відповідно до загальної методики А з використанням штаму E.coli Tuner (DE3) від Novagen. Протеїн розділяли із застосуванням електрофорезу у відповідності з загальною методикою, описаною вище. 28