Синтетична послідовність днк для експресії білка в клітинах кукурудзи та спосіб її застосування

Реферат: Винахід стосується синтетичної послідовності ДНК для експресії білка, який представляє інтерес, в клітинах кукурудзи, яка містить: a) оптимізовану по кодонах послідовність ДНК, яка кодує білок, який представляє інтерес, b) щонайменше одну послідовність сигналу поліаденілювання, вибрану із групи, яка складається із класу I і класу II. Винахід належить також до ДНК-конструкції для експресії білка, який представляє інтерес, трансгенної рослини, яка містить зазначену синтетичну послідовність ДНК та способу боротьби із комахами UA 115526 C2 (12) UA 115526 C2 шкідниками для зерен або насіння та способу боротьби із комахами-шкідниками для борошна грубого і дрібного помелу. UA 115526 C2 5 10 15 РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Було виявлено, що для досягнення необхідних рівнів експресії гетерологічних білків в трансгенних рослинах доцільно змінювати нативну кодуючу послідовність ДНК, яка іноді називається послідовністю дикого типу або вихідною послідовністю, різними способами, наприклад, таким чином, щоб використання кодонів точніше відповідало використанню кодонів для виду рослини-хазяїна, і/або щоб вміст G+С в кодуючій послідовності точніше відповідав рівню G+С, що звичайно є в кодуючих послідовностях для виду рослини-хазяїна, і/або щоб певні послідовності, які дестабілізують мРНК, були видалені. Наприклад, експресія в рослинах кристалічних білкових токсинів Bacillus thuringiensis (B. t.) проти комах було поліпшено із застосуванням одного або більше вказаних способів. Див., наприклад, патент США No. 5380301, патент США No. 5625136, патент США No. 6218188, патент США No. 6340593, патент США No. 6673990, патент США No. 7741118. Виродженість кодонів дозволяє створювати синтетичні послідовності ДНК, які кодують білок, який представляє інтерес, із використанням кодонів, які відрізняються від використовуваних у вихідній кодуючій послідовності ДНК. Що стосується видалення послідовностей, які можуть дестабілізувати мРНК, в патенті США No. 7741118 викладений список із 16 послідовностей сигналів поліаденілювання (стовпчик 15, таблиця II) і вимоги по зниженню кількості таких послідовностей у синтетичних кодуючих послідовностях, які призначені для експресії в рослинах. Послідовності сигналів поліаденілювання, наведені в таблиці II US 7741118, наведені нижче в таблиці 1: 20 Таблиця 1 Послідовності сигналів поліаденілювання, наведені в таблиці II US 7741118 1 2 3 4 5 25 30 AATAAA AATAAT AACCAA ATATAA AATCAA 6 7 8 9 10 ATACTA ATAAAA ATGAAA AAGCAT ATTAAT 11 12 13 14 15 ATACAT AAAATA ATTAAA AATTAA AATACA 16 CATAAA У US 7741118 також, переважно, потрібне видалення послідовності ATTTA (відомої як послідовність Шоу-Камена), оскільки вона була ідентифікована як потенційно дестабілізуюча мРНК. На відміну від викладеного в US 7741118, ми виявили, що зниження кількості послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих вище в таблиці 1, не є ні необхідним, ні достатнім для забезпечення підвищеної експресії синтетичних генів в рослинах. СУТЬ ВИНАХОДУ Нижче в таблиці 2 ідентифіковано 20 потенційних послідовностей сигналів поліаденілювання, які часто з'являються в генах кукурудзи. Таблиця 2 Потенційні послідовності сигналів поліаденілювання, знайдені в генах кукурудзи 1 2 3 4 5 ATATAT TTGTTT TTTTGT TGTTTT TATATA 6 7 8 9 10 TATTTT TTTTTT ATTTTT TTATTT TTTATT 11 12 13 14 15 Нижче в таблиці 3 ідентифіковано 20 поліаденілювання, які часто з'являються в генах сої. 35 1 TAATAA ATTTAT TATATT TTTTAT ATATTT потенційних 16 17 18 19 20 TATTAT TGTTTG TTATAT TGTAAT AAATAA послідовностей сигналів UA 115526 C2 Таблиця 3 Потенційні послідовності сигналів поліаденілювання, знайдені в генах сої 1 2 3 4 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ATTTTT TATTTT TTATTT TTTATT TTTTTT 6 7 8 9 10 TTTTAT AATTTT TTTTTA TAATTT TTAATT 11 12 13 14 15 AAATTT AAATAA ATATTT TTTGTT TTGTTT 16 17 18 19 20 ATATAT ATTATT ATTTTA TTTAAT TTTTAA Даний винахід надає синтетичну послідовність ДНК для експресії білка, який представляє інтерес, в клітинах кукурудзи, яка містить: a) оптимізовану по кодонах послідовність ДНК, яка кодує білок, який представляє інтерес, b) щонайменше одну послідовність сигналу поліаденілювання, вибрану із групи, яка складається із класу I і класу II, де клас I вибирають із групи, яка складається із AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA і CATAAA; і клас II вибирають із групи, яка складається із ATATAT, TTGTTT, TTTTGT, TGTTTT, TATATA, TATTTT, TTTTTT, ATTTTT, TTATTT, TTTATT, TAATAA, ATTTAT, TATATT, TTTTAT, ATATTT, TATTAT, TGTTTG, TTATAT, TGTAAT і AAATAA; і де вказана оптимізована по кодонах послідовність ДНК містить, щонайменше одну послідовність сигналу поліаденілювання із класу II, і де вказана синтетична послідовність ДНК містить менше послідовностей сигналів поліаденілювання класу II, ніж нативна послідовність ДНК білка, і містить таку ж кількість послідовностей сигналів поліаденілювання класу I в порівняннііз нативною послідовністю ДНК. Даний винахід також надає синтетичну послідовність ДНК для експресії білка, який представляє інтерес, в клітинах сої, яка містить: a) оптимізовану по кодонах послідовність ДНК, яка кодує білок, який представляє інтерес, b) щонайменше одну послідовність сигналу поліаденілювання, вибрану із групи, яка складається із класу I і класу III, де; клас I вибирають із групи, яка складається із AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA і CATAAA; і клас III вибирають із групи, яка складається із ATTTTT, TATTTT, TTATTT, TTTATT, TTTTTT, TTTTAT, AATTTT, TTTTTA, ATATAT, TAATTT, TTAATT, AAATTT, AAATAA, ATATTT, TTTGTT TTGTTT, ATTATT, ATTTTA, TTTAAT і TTTTAA, і де вказана оптимізована по кодонах послідовність ДНК містить, щонайменше одну послідовність сигналу поліаденілювання із класу III, і де вказана синтетична послідовність ДНК містить менше послідовностей сигналів поліаденілювання із класу III, ніж нативна послідовність ДНК білка, і містить таку ж кількість послідовностей сигналів поліаденілювання класу I в порівнянні із нативною послідовністю ДНК. Винахід також надає спосіб створення синтетичної послідовності ДНК, яка кодує білок, який представляє інтерес, який включає (a) спочатку, використання амінокислотної послідовності білка, який представляє інтерес, отриманої із поліпептиду(ів), що зустрічається(ються) в природі, який кодується(ються) нативною(ими) послідовністю(ями), які містять щонайменше одну послідовність сигналу поліаденілювання, наведену в таблиці 2, і (b) створення синтетичної послідовності ДНК, яка кодує вказану амінокислотну послідовність і містить менше послідовностей сигналів поліаденілювання, наведених в таблиці 2, в порівнянні із відповідною кодуючою послідовністю нативної(их) послідовності(ей), і містить таку ж кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, наведених в таблиці 1. У іншому варіанті здійснення винахід надає спосіб створення синтетичної послідовності ДНК, яка кодує білок, який представляє інтерес, який включає (a) спочатку, використання амінокислотної послідовності білка, який представляє інтерес, отриманої із поліпептиду(ів), що зустрічається(ються) в природі, який кодується(ються) нативною(ими) послідовністю(ями), які містять щонайменше одну послідовність сигналу поліаденілювання, наведену в таблиці 3, і (b) створення синтетичної послідовності ДНК, яка кодує вказану амінокислотну послідовність і містить менше послідовностей сигналів поліаденілювання, наведених в таблиці 3, в порівнянні 2 UA 115526 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 із відповідною кодуючою послідовністю нативної(их) послідовності(ей), і містить таку ж кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, наведених в таблиці. У деяких варіантах здійснення синтетичні послідовності ДНК, які надаються у винаході, не містять послідовностей сигналів поліаденілювання, наведених в таблиці 2 і/або таблиці 3, або кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 2 і/або таблиці 3, знижена наскільки це можливо за умови підтримки тієї ж кількості послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 1, і підтримки послідовностей із таблиці 1 в їх вихідних положеннях в послідовності. У деяких варіантах здійснення синтетичні послідовності ДНК, які надаються винаходом, кодують інсектицидний білок, необов'язково, отриманий із Bacillus thuringiensis, а також послідовності ДНК, корисні для стійкості до гербіцидів, нестачі води і/або стійкості до теплового стресу, модифікації олій для здорового харчування і для маркерних генів і селектованих маркерних генів трансформації. Синтетичні послідовності ДНК за винаходом можуть бути застосовані в ДНК-конструкції для експресії білка, який представляє інтерес, при цьому конструкція містить 5'-нетрансльовану послідовність, синтетичну послідовність ДНК за винаходом і 3'-нетрансльовану область, і вказана 5'-нетрансльована послідовність містить промотор, функціональний в рослинах, і вказана 3'-нетрансльована послідовність містить сигнал термінації транскрипції і поліаденілювання. Винахід також надає трансгенну рослину, яка містить синтетичні послідовності ДНК за винаходом. Також представлений спосіб боротьби із комахами-шкідниками в рослині, який включає експресію синтетичної послідовності ДНК за винаходом в рослині, де синтетична послідовність ДНК кодує токсини проти комах, наприклад, білок Cry Bacillus thuringiensis. Також представлений спосіб для стійкості до гербіцидів у рослини, який включає експресію синтетичної послідовності ДНК за винаходом в рослині, де синтетична послідовність ДНК кодує відомий фермент стійкості до гербіцидів, наприклад, такий фермент, як арилоксіалканоатдіоксигеназа (AAD1), див. WO/2005/107437, або фосфінотрицинацетилтрансфераза, або 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтаза. Також представлений спосіб для зміни олійних профілів в рослині, який включає експресію однієї або більше синтетичних послідовностей ДНК за винаходом в рослині, де синтетична послідовність ДНК кодує один або більше відомих ферментів для зміни олійних профілів в рослинах, наприклад, десатуразу жирних кислот. Також представлений спосіб для стійкості до стресу в рослині, який включає експресію синтетичної послідовності ДНК за винаходом, де синтетична послідовність ДНК кодує відомі гени стійкості до стресу нестачі води і/або теплового стресу, наприклад, для асоційованого зі стресом білка (SAP1); патентна публікація США NO:2010/0275327, і для білків 1-Cys пероксиредоксину (Per1) (Mowla et al., 2002, Planta 215:716-726). Також представлений спосіб додавання генів-репортерів до рослини, який включає експресію синтетичної послідовності ДНК за винаходом в рослині, де синтетична послідовність ДНК кодує відомий маркерний білок трансформації, який є функціональним в рослинах, наприклад, зелений флуоресцентний білок (GFP) або фермент бета-глюкуронідазу. Також представлений спосіб захисту від шкідників для зерен або насіння, який включає отримання вказаних зерен або насіння у рослин, які містять синтетичний ген за винаходом, який експресує токсин проти комах, і спосіб захисту від шкідників для борошна грубого і дрібного помелу, який включає отримання вказаного борошна грубого і дрібного помелу із зерна, яке містить синтетичний ген за винаходом, який експресує токсин проти комах. Також представлена композиція, отримана із трансгенних рослин, яка містить синтетичну ДНК за винаходом, де вказана композиція являє собою товарний продукт, вибраний із групи, яка складається із борошна грубого помелу, борошна дрібного помелу, білкового концентрату і олії. У деяких випадках кількість сигналів поліаденілювання, наведених в таблиці 1, може підтримуватися в синтетичних послідовностях ДНК за винаходом шляхом видалення примірників AATAAA і їх заміни на інші послідовності сигналів поліаденілювання, наведені в таблиці 1. Приклад вказаного показаний в прикладі 1, SEQ ID NO:5. ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ SEQ ID NO:1 являє собою нативну послідовність ДНК, яка кодує ядерний токсин Cry1Fa Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:2 являє собою послідовність ядерного токсину Cry1Fa Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:3 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ядерний токсин Cry1Fa 3 UA 115526 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Bacillus thuringiensis із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:4 являє собою послідовність ядерного токсину Cry1Fa Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:5 являє собою синтетичну послідовність ДНК за винаходом, яка кодує ядерний токсин Cry1Fa Bacillus thuringiensis із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій видалені послідовності, ідентифіковані в таблиці 2, і підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:6 являє собою послідовність ядерного токсину Cry1Fa Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:7 являє собою нативну послідовність ДНК, яка кодує токсин Cry34Ab1 Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:8 являє собою послідовність токсину Cry34Ab1 Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:9 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує токсин Cry34Ab1 Bacillus thuringiensis із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:10 являє собою послідовність токсину Cry34Ab1 Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:11 являє собою синтетичну послідовність ДНК за винаходом, яка кодує токсин Cry34Ab1 Bacillus thuringiensis із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій видалені послідовності, ідентифіковані в таблиці 2, і підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:12 являє собою послідовність токсину Cry34Ab1 Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:13 являє собою нативну послідовність ДНК, яка кодує токсин Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:14 являє собою послідовність токсину Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:15 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує токсин Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:16 являє собою послідовність токсину Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:17 являє собою синтетичну послідовність ДНК за винаходом, яка кодує токсин Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій видалені послідовності, ідентифіковані в таблиці 2, і підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:18 являє собою послідовність токсину Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:19 являє собою нативну послідовність ДНК, яка кодує ядерний токсин Cry1Ab1 Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:20 являє собою послідовність ядерного токсину Cry1Ab1 Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:21 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ядерний токсин Cry1Ab1 Bacillus thuringiensis із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:22 являє собою послідовність ядерного токсину Cry1Ab1 Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:23 являє собою синтетичну послідовність ДНК за винаходом, яка кодує ядерний токсин Cry1Ab1 Bacillus thuringiensis із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій видалені послідовності, ідентифіковані в таблиці 2, і підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:24 являє собою послідовність ядерного токсину Cry1Ab1 Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:25 являє собою нативну послідовність ДНК, яка кодує ядерний токсин Cry1Ca Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:26 кодує послідовність ядерного токсину Cry1Ca Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:27 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує ядерний токсин Cry1Ca Bacillus thuringiensis із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:28 кодує послідовність ядерного токсину Cry1Ca Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:29 являє собою синтетичну послідовність ДНК за винаходом, яка кодує ядерний токсин Cry1Ca Bacillus thuringiensis із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій видалені послідовності, ідентифіковані в таблиці 2, і підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:30 кодує послідовність ядерного токсину Cry1Ca Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:31 являє собою нативну послідовність ДНК, яка кодує токсин Cry6Aa Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:32 являє собою послідовність токсину Cry6Aa Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:33 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує токсин Cry6Aa Bacillus thuringiensis із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій підтримуються послідовності із таблиці 1. 4 UA 115526 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO:34 являє собою послідовність токсину Cry6Aa Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:35 являє собою синтетичну послідовність ДНК за винаходом, яка кодує токсин Cry6Aa Bacillus thuringiensis із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій видалені послідовності, ідентифіковані в таблиці 2, і підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:36 являє собою послідовність токсину Cry6Aa Bacillus thuringiensis. SEQ ID NO:37 являє собою нативну послідовність ДНК, яка кодує білок AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans. SEQ ID NO:38 являє собою послідовність білка AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans. SEQ ID NO:39 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує білок AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій підтримуються послідовності із таблиці 1 і таблиці 2. SEQ ID NO:40 являє собою послідовність білка AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans. SEQ ID NO:41 являє собою синтетичну послідовність ДНК за винаходом, яка кодує білок AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій видалені послідовності, ідентифіковані в таблиці 2, і підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:42 являє собою послідовність білка AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans. SEQ ID NO:43 являє собою нативну послідовність ДНК, яка кодує білок дельта-9-десатурази жирних кислот Aspergillus nidulans. SEQ ID NO:44 являє собою послідовність білка дельта-9-десатурази жирних кислот Aspergillus nidulans. SEQ ID NO:45 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує білок дельта-9десатурази жирних кислот Aspergillus nidulans із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій підтримуються послідовності із таблиці 1 і таблиці 2. SEQ ID NO:46 являє собою послідовність білка дельта-9-десатурази жирних кислот Aspergillus nidulans. SEQ ID NO:47 являє собою синтетичну послідовність ДНК за винаходом, яка кодує білок дельта-9-десатурази жирних кислот Aspergillus nidulans із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій видалені послідовності, ідентифіковані в таблиці 2, і підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:48 являє собою білок дельта-9-десатурази жирних кислот Aspergillus nidulans. SEQ ID NO:49 являє собою нативну послідовність ДНК, яка кодує білок SAP1 Xerophyta viscosa. SEQ ID NO:50 являє собою послідовність білка SAP1 Xerophyta viscosa. SEQ ID NO:51 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує білок SAP1 Xerophyta viscosa із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій підтримуються послідовності із таблиці 1 і таблиці 2. SEQ ID NO:52 являє собою послідовність білка SAP1 Xerophyta viscosa. SEQ ID NO:53 являє собою синтетичну послідовність ДНК за винаходом, яка кодує білок SAP1 Xerophyta viscosa із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій видалені послідовності, ідентифіковані в таблиці 2, і підтримуються послідовності із таблиці 1 SEQ ID NO:54 являє собою послідовність білка SAP1 Xerophyta viscosa. SEQ ID NO:55 являє собою нативну послідовність ДНК, яка кодує білок GFP1 Aequorea victoria. SEQ ID NO:56 являє собою послідовність білка GFP1 Aequorea victoria. SEQ ID NO:57 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує білок GFP1 Aequorea victoria із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій підтримуються послідовності із таблиці 1 і таблиці 2. SEQ ID NO:58 являє собою послідовність білка GFP1 Aequorea victoria. SEQ ID NO:59 являє собою синтетичну послідовність ДНК за винаходом, яка кодує білок GFP1 Aequorea victoria із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій видалені послідовності, ідентифіковані в таблиці 2, і підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:60 являє собою послідовність білка GFP1 Aequorea victoria. SEQ ID NO:61 являє собою нативну послідовність ДНК, яка кодує білок дельта-9-десатурази жирних кислот Leptosphaeria nodorum. SEQ ID NO:62 являє собою послідовність білка дельта-9-десатурази жирних кислот Leptosphaeria nodorum. SEQ ID NO:63 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує білок дельта-9десатурази жирних кислот Leptosphaeria nodorum із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій підтримуються послідовності із таблиці 1 і таблиці 2. 5 UA 115526 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO:64 являє собою послідовність білка дельта-9-десатурази жирних кислот Leptosphaeria nodorum. SEQ ID NO:65 являє собою синтетичну послідовність ДНК за винаходом, яка кодує білок дельта-9-десатурази жирних кислот Leptosphaeria nodorum із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій видалені послідовності, ідентифіковані в таблиці 2, і підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:66 являє собою послідовність білка дельта-9-десатурази жирних кислот Leptosphaeria nodorum. SEQ ID NO:67 являє собою нативну послідовність ДНК, яка кодує білок PER1 Xerophyta viscosa. SEQ ID NO:68 являє собою послідовність білка PER1 Xerophyta viscosa. SEQ ID NO:69 являє собою синтетичну послідовність ДНК, яка кодує білок PER1 Xerophyta viscosa із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій підтримуються послідовності із таблиці 1 і таблиці 2. SEQ ID NO:70 являє собою послідовність білка PER1 Xerophyta viscosa. SEQ ID NO:71 являє собою синтетичну послідовність ДНК за винаходом, яка кодує білок PER1 Xerophyta viscosa із використанням кодонів, оптимізованих для кукурудзи, і в якій видалені послідовності, ідентифіковані в таблиці 2, і підтримуються послідовності із таблиці 1. SEQ ID NO:72 являє собою послідовність білка PER1 Xerophyta viscosa. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Винахід надає синтетичні послідовності нуклеїнових кислот, які кодують білки, які представляють інтерес. Синтетичні кодуючі послідовності, зокрема пристосовані для застосування в експресії білків, які представляють інтерес, у трансгенних рослинах. Білок, який представляє інтерес, може бути будь-яким білком або поліпептидом, який зустрічається в природі, або будь-яким варіантом, який зустрічається в природі, включаючи процесовані форми таких білків, але не обмежуючись ними. Білок, який представляє інтерес, також може бути білком, утвореним шляхом об'єднання частин або фрагментів більше ніж одного білка, який зустрічається в природі, наприклад, шляхом змішування і зіставлення функціональних білкових доменів. Переважна група білків, які представляють інтерес, являє собою групу, в якій отримуваний в результаті фенотип є агрономічною ознакою або білком-репортером, який застосовується для створення агрономічних ознак. Це включає в себе резистентність до комах, стійкість до гербіцидів, стійкість до нестачі води і/або теплового стресу і зміни олійного профілю, але не обмежується перерахованим. Більш переважна група білків, які представляють інтерес, являє собою групу, в якій отримуваний в результаті фенотип є агрономічною ознакою. Іншою переважною групою є група, в якій отримуваний в результаті фенотип забезпечує стійкість до гербіцидів. Іншою переважною групою є група, в якій отримуваний в результаті фенотип забезпечує стійкість до стресу. Іншою переважною групою є група, в якій отримуваний в результаті фенотип забезпечує модифікований олійний профіль для більш здорової їжі. Більш переважною групою є група, в якій білком, який представляє інтерес, є білок Cry, який забезпечує резистентність до комах. Нативні послідовності ДНК/послідовність ДНК дикого типу, які кодують білок, який представляє інтерес, повинні бути ідентифіковані і проаналізовані для визначення присутності послідовностей сигналів поліаденілювання, наведених в таблицях 1 і 2 і/або 3. Згідно із винаходом, для кодуючих послідовностей, призначених для застосування в кукурудзі, кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, наведених в таблиці 2, знижується в порівнянні із кількістю, присутньою в нативній послідовності. Для кодуючих послідовностей, призначених для застосування в сої, знижується кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, наведених в таблиці 3. Дуже важливо видалити послідовності сигналів поліаденілювання, наведені в таблицях 2 і 3, зокрема, коли вони з'являються у вкладеній мультимерній формі. У доповнення до видалення послідовностей сигналів поліаденілювання, наведених в таблицях 2 і 3, може бути необхідним видалення появ послідовності Шоу-Камен, ATTTA. У доповнення до видалення послідовностей сигналів поліаденілювання і послідовностей Шоу-Камен, є переважною побудова синтетичних кодуючих послідовностей ДНК, в яких кодони використовуються приблизно із тією ж частотою, із якою вони використовуються, в середньому, у генах, які зустрічаються в природі, в рослинах тих видів, в яких буде застосовуватися синтетична послідовність ДНК. У таблиці 4 наведені придатні процентні значення для використання кодонів в синтетичних генах, призначених для застосування в різних сільськогосподарських рослинах, а також для застосування, в загальному випадку, у дводольних рослинах, або, в загальному випадку, в рослинах. 6 UA 115526 C2 Таблиця 4 Цільові ремасштабовані склади кодонів синтетичних генів рослин Амінокислота Кодон % в кукурудзі % в сої Амінокислота Кодон % в кукурудзі % в сої ALA (А) GCA GCC GCG GCT AGA AGG CGA CGC CGG CGT AAC AAT GAC GAT TGC TGT TAA TAG TGA CAA CAG GAA GAG GGA GGC GGG GGT CAC CAT ATA ATC ATT 18,0 34,0 24,0 24,0 18,8 32,5 0 30,0 18,8 0 68,0 32,0 63,0 37,0 68,0 32,0 0 0 100 38,0 62,0 29,0 71,0 19,0 42,0 19,0 20,0 62,0 38,0 14,0 58,0 28,0 33,1 24,5 0 42,3 36,0 32,2 0 15 0 16,9 50,0 50,0 38,1 61,9 50,0 50,0 0 0 100 55,5 44,5 50,5 49,5 31,9 19,3 18,4 30,4 44,8 55,2 23,4 29,9 46,7 LEU (L) CTA CTC CTG CTT TTA TTG AAA AAG ATG TTC TTT CCA CCC CCG CCT AGC AGT TCA TCC TCG TCT ACA ACC ACG ACT TGG TAC TAT GTA GTC GTG GTT 0 29,9 33,3 19,5 0 17,2 22,0 78,0 100 71,0 29,0 26,0 24,0 28,0 22,0 25,3 0,0 17,6 25,3 15,4 16,5 21,0 37,0 22,0 20,0 100 73,0 27,0 0 34,8 42,4 22,8 0 22,4 16,3 31,5 0 29,9 42,5 57,5 100 49,2 50,8 39,8 20,9 0,0 39,3 16,0 18,2 21,9 18,0 0 25,8 32,4 30,2 0,0 37,4 100 48,2 51,8 11,5 17,8 32,0 38,7 ARG (R) ASN (N) ASP (D) CYS (С) END GLN (Q) GLU (Е) GLY (G) HIS (Н) ILE (I) 5 10 15 LYS (K) MET (M) PHE (F) PRO (Р) SER (S) THR (Т) TRP (W) TYR (Y) VAL (V) ТРАНСГЕННІ РОСЛИНИ Переважним варіантом здійснення даного винаходу є трансформація рослин генами, які кодують токсини проти комах. Трансформовані рослини, які експресують гени токсинів проти комах, є стійкими до нападу цільової комахи-шкідника завдяки наявності контрольованих об'ємів відповідного інсектицидного білка або його варіантів в клітинах трансформованої рослини. Внаслідок включення генетичного матеріалу, який кодує інсектицидні властивості інсектицидних токсинів B. t., в геном рослини, з'їденої конкретною комахою-шкідником, доросла особина або личинка гине після вживання кормової рослини. Була трансформована множина представників односім'ядольних і двосім'ядольних. Трансгенні агрономічні сільськогосподарські культури, а також фрукти і овочі, представляють комерційний інтерес. Такі сільськогосподарські культури включають кукурудзу, рис, сою, канолу, соняшник, люцерну, сорго, пшеницю, бавовну, арахіс, томат, картоплю і т. п., але не обмежуються перерахованим. Існує декілька методик внесення стороннього генетичного матеріалу в клітини рослин і для отримання рослин, які стабільно підтримують і експресують внесений ген. Такі методики включають запуск генетичного матеріалу, нанесеного на мікрочастинки, безпосередньо в клітини (патент США No. 4945050 і патент США No. 5141131). Рослини можуть трансформуватися із застосуванням 7 UA 115526 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 агробактеріальної технології, див. патент США No. 5177010, Європейський патент No. EP 131624B1, Європейський патент No. EP 159418B1, Європейський патент No. EP176112B1, патент США No. 5149645, EP120516B1, патент США No. 5464763, патент США No. 4693976, Європейський патент No. EP 116718B1, Європейський патент No. EP290799B1, Європейський патент No. EP320500B1, Європейський патент No. EP604662B1, патент США No. 7060876, патент США No. 6037526, патент США No. 6376234, Європейський патент No. EP292435B1, патент США No. 5231019, патент США No. 5463174, патент США No. 4762785, патент США No. 5608142 і патент США No. 5159135. Іншою технологією трансформації є технологія WHISKERS™, див. патент США No. 5302523 і патент США No. 5464765. Для трансформації рослин також була застосована технологія електропорації, див. WO1987006614, патент США No. 5472869, патент США No. 5384253, WO199209696, патент США No. 6074877, WO1993021335 і патент США No. 5679558. У доповнення до множини технологій для трансформування рослин, також може змінюватися тип тканини, який контактує із сторонніми генами. Така тканина могла б включати зародкову тканину, тканину калусу типу I і типу II, гіпокотиль, меристему і т. п., але не обмежується перерахованим. Практично всі рослинні тканини можуть бути трансформовані під час дедиференціації із застосуванням відповідних методик, відомих фахівцеві в даній галузі техніки. Відомі методики вставки ДНК в рослини включають трансформацію за допомогою Т-ДНК, яка доставляється Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як посередником трансформації. Застосування Т-ДНК-вмісних векторів для трансформації рослинних клітин ретельно досліджувалося і в достатньому об'ємі описано в європейському патенті No. EP120516B1; Lee and Gelvin (2008) Plant Physiol. 146:325-332; Fraley et al. (1986) Crit. Rev. Plant Sci. 4: 1-46; і An et al. (1985) EMBO J. 4:277-284; і є загальновизнаним в даній галузі. Крім того, може бути застосоване злиття рослинних протопластів із ліпосомами, які містять ДНК, яка повинна бути доставлена, пряме ін'єктування ДНК, біолістична трансформація (бомбардування мікрочастинками) або електропорація, а також інші можливі способи. Після того, як вставлена ДНК була інтегрована в рослинний геном, вона залишається порівняно стабільною в подальших поколіннях. Вектор, який використовується для трансформації рослинної клітини, звичайно містить ген селектованого маркера, який кодує білок, який надає трансформованим рослинним клітинам стійкість до гербіциду або антибіотика, такого як, в тому числі, біалафос, канаміцин, G418, блеоміцин, або гігроміцин. Окремо використовуваний ген селектованого маркера повинен дозволяти вибирати трансформовані клітини, при цьому ріст клітин, які не містять вставлену ДНК, пригнічується за допомогою селективного комонента. У переважному варіанті здійснення даного винаходу рослини трансформуються генами, в яких використання кодонів в кодуючій білок ділянці було оптимізовано для рослин. Див., наприклад, патент США No. 5380831. Також, переважно, можуть бути використані рослини, які кодують усічений токсин, наприклад, функціональний білковий домен. Усічений токсин звичайно кодує від близько 55 % до близько 80 % нативного повнорозмірного токсину. Способи створення синтетичних генів B. t. для застосування в рослинах відомі в техніці (Stewart 2007, Frontiers in Drug Design and Discovery 1:297-341). Незалежно від методики трансформації, ген переважно вбудовується у вектор передачі генів, пристосований для експресії білка, який представляє інтерес, шляхом включення у вектор рослинного промотору. У доповнення до рослинних промоторів, промотори із ряду джерел можуть бути ефективно використані в рослинних клітинах для експресії сторонніх генів. Наприклад, можуть бути використані промотори із бактеріального джерела, такі як промотор октопінсинтази, промотор нопалінсинтази, промотор манопінсинтази; промотори із вірусного джерела, такі як промотори 35S і 19S віруси мозаїки цвітної капусти (CaMV) і т. п. Отримані із рослин промотори включають, але не обмежуються перерахованим, рибулозу-1, малу субодиницю (ssu) 6-бісфосфат (RUBP) карбоксилази, промотор бета-конгліциніну, промотор фазеоліну, промотор ADH (алкогольдегідрогенази), промотори білків теплового шоку, промотор ADF (фактор деполімеризації актину) і тканиноспецифічні промотори. Промотори також можуть містити певні елементи послідовностей енхансерів, які можуть підвищувати ефективність транскрипції. Типові енхансери включають ADH1-інтрон 1 і ADH1-інтрон 6, але не обмежуються вказаним. Також можуть бути використані конститутивні промотори. Конститутивні промотори керують безперервною експресією генів практично у всіх типах клітин практично в будь-які моменти часу (наприклад, актин, убіквітин, CaMV 35S). Тканиноспецифічні промотори відповідають за експресію генів в конкретних типах клітин або тканини, таких як листя або насіння (наприклад, зеїн, олеозин, напін, ACP (ацилпереносний білок)), і такі промотори також можуть використовуватися. Також можуть бути використані промотори, які є активними під час 8 UA 115526 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 певної стадії розвитку рослин, а також, які є активними в конкретних тканинах і органах рослин. Приклади таких промоторів включають, але не обмежуються перерахованим, специфічні для коріння, специфічні для пилку, специфічні для зародків, специфічні для кукурудзяних приймочок, специфічні для бавовняного волокна, специфічні для ендосперму насіння, специфічні для флоеми і т. п. У певних обставинах може бути потрібне використання індукованого промотору. Індукований промотор відповідає за експресію генів у відповідь на конкретний сигнал, такий як: фізичне стимулювання (наприклад, гени теплового шоку); світло (наприклад, RUBPкарбоксилаза); гормон (наприклад, глюкокортикоїд); антибіотик (наприклад, тетрациклін); метаболіти; і стрес (наприклад, засуху). Також можуть бути використані інші необхідні елементи транскрипції і трансляції, які функціонують в рослинах, такі як 5'-нетрансльовані лідерні послідовності, послідовності термінації транскрипції РНК і сигнальні послідовності додавання поліаденілювання. Множина специфічних для рослин векторів перенесення генів відома в техніці. Трансгенні сільськогосподарські рослини, які містять властивості стійкості до комах (IR), переважають в рослинах кукурудзи і бавовни в Північній Америці, і використання даних властивостей розширюється по всьому світу. Комерційні трансгенні сільськогосподарські рослини, які об'єднують властивості IR і стійкість до гербіцидів (HT), були розроблені множиною компаній, які виробляють насіння. Це включає комбінації властивостей IR, які додаються інсектицидними білками B. t., і властивості HT, такі як стійкість до інгібіторів ацетолактатсинтази (ALS), таких як сульфонілсечовини, імідазолінони, триазолопіримідин, сульфонаніліди і т. п., інгібітори глутамінсинтетази (GS), такі як біалафос, глюфосинат і т. п., інгібітори 4гідроксифенілпіруватдіоксигенази (HPPD), такі як мезотріон, ізоксафлютол і т. п, інгібітори 5енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (EPSPS), такі як гліфосат і т. п., і інгібітори ацетилкофермент А карбоксилази (ACCase), такі як галоксифоп, квізалофоп, диклофоп і т. п. Відомі інші приклади, в яких трансгенно отримані білки забезпечували стійкість рослин до хімічних класів гербіцидів, таких як феноксикислотні гербіциди і гербіциди, основані на піридилоксіацетатах ауксину (див. WO2007053482), або феноксикислотні гербіциди і арилоксифеноксипропіонатні гербіциди (див. заявку на патент США No. 20090093366). Здатність розв'язання проблем із множиною шкідників через властивості IR є цінною концепцією у виробництві товарних продуктів, і зручність даної концепції товару підвищується, якщо властивості боротьби із комахами і засоби боротьби із бур'янами об'єднуються в одній і тій же рослині. Крім того, підвищена цінність може бути отримана через об'єднання в одній рослині властивостей IR, які надаються інсектицидним білком B. t., таким чином, як в даному винаході, із одною або більше додатковими властивостями HT, такими як були вказані вище, плюс одна або більше додаткових вхідних властивостей (наприклад, стійкість до іншої комахи, яка надається отриманими із B. t. або іншими інсектицидними білками, стійкість до комахи, яка додається такими механізмами, як РНКi і т. п., стійкість до нематод, стійкість до захворювань, стійкість до стресів, поліпшена утилізація азоту і т. п.) або вихідних властивостей (наприклад, високий вміст олій, здоровий склад олій, поліпшення поживних властивостей і т. п.). Такі комбінації можуть бути отримані через звичайне схрещування (селекційні гібриди) або спільно в формі нового факту трансформації, який включає одночасне введення множини генів (молекулярні гібриди або спільна трансформація). Переваги включають можливість боротьби із комахамишкідниками і поліпшення боротьби із бур'янами в сільськогосподарській рослині, які забезпечують вторинні переваги для виробника і/або споживача. Таким чином, даний винахід може бути застосований в зв'язку із множиною властивостей для надання повного агрономічного комплексу поліпшеної якості сільськогосподарської рослини із можливістю гнучко і із оптимальними витратами боротися із будь-якою кількістю агрономічних проблем. Всі патенти, заявки на патенти, попередні заявки і публікації, які цитуються в даній заявці або на які є посилання в даній заявці, включені за допомогою посилання у всій їх повноті до того ступеня, в якому вони не суперечать явно викладеному в даній специфікації. Якщо це конкретно не вказано або не мається на увазі, то термін "один" означає "щонайменше один" при використанні в даному описі. Під "ізольованими" заявники розуміють, що нуклеотидні або поліпептидні молекули були видалені із свого нативного оточення і були поміщені в інше оточення за допомогою людини. Варіанти здійснення даного винаходу детальніше визначені в наведених нижче прикладах. Потрібно розуміти, що дані приклади наведені тільки як ілюстрація. На основі наведеного вище обговорення і даних прикладів фахівець в даній галузі техніки може встановити важливі характеристики даного винаходу і, без відхилення від його форми і обсягу, може вносити різні зміни і модифікації у варіанти здійснення винаходу з метою їх настройки для різних застосувань 9 UA 115526 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 і умов. Таким чином, різні модифікації варіантів здійснення винаходу, в доповнення до показаних і описаних в даній заявці, будуть очевидні фахівцям в даній галузі техніки на основі наведеного вище опису. Передбачається, що такі модифікації також попадають в межі обсягу прикладеної формули винаходу. Всі проценти наведені по вазі, і всі пропорції змішаного розчинника наведені по обсягу, якщо не відмічено зворотне. Всі температури наведені в градусах Цельсію. ПРИКЛАД 1 Синтетична кодуюча область, яка кодує ядерний токсин Cry1Fa Bacillus thuringiensis Послідовність для порівняння. Нативна послідовність ДНК, яка кодує ядерний токсин Cry1Fa, наведена під SEQ ID NO:1. Дана послідовність аналізувалася із метою визначення того, які із послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1, присутні в SEQ ID NO:1, і їх положень. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:1, потім піддавалась зворотній трансляції із використанням цільових частот кодонів, наведених в стовпчику таблиці 4 для синтетичних генів, призначених для використання в кукурудзі. Отримана в результаті послідовність ДНК аналізувалася, і кодони замінювалися за необхідності для видалення небажаних відкритих рамок зчитування і видалення небажаних сайтів рестрикції, і відновлення послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:1, зберігалася. Отримана в результаті послідовність ДНК дана під SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:3 аналізувалася, і кодони були змінені для видалення потенційних послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 2, при цьому підтримувалася та ж сама кількість послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1. Отримана в результаті послідовність, яка є варіантом здійснення даного винаходу, дана під SEQ ID NO:5. У таблиці 5 показано, що кількість і положення послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 1, підтримується в SEQ ID NO:5, за винятком того, що два входження AATAAA, одне в 426 н. п. і одне в 582 н. п., в SEQ ID NO:1 були замінені на AATCAA, внаслідок чого підтримується кількість і положення послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 1, але проводиться заміна кожної із двох послідовностей AATAAA на менш проблемні послідовності. У таблиці 6 показано, що кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 2, знижується в SEQ ID NO:5. Оскільки є перекриття послідовностей, ідентифікованих в таблицях 2 і 3 (послідовності 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 13 і 20 в таблиці 2 відповідають послідовностям 16, 15, 2, 5, 1, 3, 4, 6, 13 і 12, відповідно, в таблиці 3), також виходить, що кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 3, знижується в SEQ ID NO:5. Синтетична кодуюча область SEQ ID NO:5 була оптимізована для експресії в кукурудзі. Конструкція для застосування в експресії синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:5 зроблена шляхом об'єднання синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:5 із 5'-нетрансльованою областю, яка містить промотор, функціональний в рослинних клітинах, і 3'-нетрансльованою областю, яка містить послідовність термінації транскрипції і поліаденілювання. У одному із варіантів здійснення такої конструкції продукування первинного транскрипту мРНК, який містить SEQ ID NO:5, керувалося копією промотору убіквітину 1 кукурудзи із своїм нативним інтроном 1 (патент США No. 5510474). Фрагмент, який містить 3'-нетрансльовану область із гена пероксидази 5 кукурудзи (ZmPer5 3'UTR v2; патент США No. 6699984), був використаний для термінації транскрипції. Бінарна плазміда для трансформації рослин, pDAB111440, яка містить вказану вище касету експресії генів, була сконструйована і застосована в продукуванні трансгенних рослин кукурудзи. Плазміда pDAB111440 також містить ген стійкості до гербіцидів, який містить кодуючу область для арилоксіалконатдіоксигенази (AAD-1 v3; патент США No. 7838733(B2), і Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5) під транскрипційним контролем промотору паличновидного баднавірусу цукрової тростини (ScBV) (Schenk et al. (1999) Plant Molec. Biol. 39: 1221-30). Фрагмент, який містить 3'нетрансльовану область із гена ліпази кукурудзи (ZmLip 3'UTR; патент США No. 7179902), був використаний для термінації транскрипції. 10 UA 115526 C2 Таблиця 5 Послідовності таблиці 1, виявлені в нативній кодуючій області ядерного токсину Cry1Fa (SEQ ID NO:1) і в її перебудованій версії (SEQ ID NO:5) Послідовність із таблиці 1 Число ділянок в нативній послідовності ядерного токсину Cry1Fa (SEQ ID NO:1) Положення в нативній послідовності ядерного токсину Cry1Fa, н. п. (SEQ ID NO:1) Число ділянок у перебудованій послідовності ядерного токсину Cry1Fa (SEQ ID NO:5) 1 2 AATAAA AATAAT 2 5 0 5 3 4 5 AACCAA ATATAA AATCAA 0 1 2 426; 582 7; 46; 358; 430; 562 NA 1520 19; 628 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ATACTA ATAAAA ATGAAA AAGCAT ATTAAT ATACAT AAAATA ATTAAA AATTAA AATACA 1 0 2 0 2 0 0 2 2 3 1508 NA 314; 1211 NA 579; 1690 NA NA 66; 1266 368; 779 400; 1369; 1693 1 0 2 0 2 0 0 2 2 3 16 CATAAA разом 0 22 NA 0 22 0 1 4 Положення в перебудованій послідовності ядерного токсину Cry1Fa, н. п. (SEQ ID NO:5) NA* 7; 46; 358; 430; 562 NA 1520 19; 426; 582; 628 1508 NA 314; 1211 NA 579; 1690 NA NA 66; 1266 368; 779 400; 1369; 1693 NA *NA = Не застосовно Таблиця 6 Послідовності таблиці 2, виявлені в нативній кодуючій області ядерного токсину Cry1Fa (SEQ ID NO:1) і в її перебудованій версії (SEQ ID NO:5) Послідовність із таблиці 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ATATAT TTGTTT TTTTGT TGTTTT TATATA TATTTT TTTTTT ATTTTT TTATTT Число ділянок в нативній послідовності ядерного токсину Cry1Fa (SEQ ID NO:1) 1 3 1 2 1 0 0 1 2 Положення в нативній послідовності ядерного токсину Cry1Fa, н. п. (SEQ ID NO:1) Число ділянок в перебудованій послідовності ядерного токсину Cry1Fa (SEQ ID NO:5) 104 39; 612; 907 1089 1086; 1334 1771 NA NA 1615 172; 217 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 Положення в перебудованій послідовності ядерного токсину Cry1Fa, н. п. (SEQ ID NO:5) NA* NA NA NA NA NA NA NA NA UA 115526 C2 Продовження таблиці 6 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 TTTATT TAATAA ATTTAT TATATT TTTTAT ATATTT TATTAT TGTTTG TTATAT TGTAAT AAATAA разом 0 4 3 1 3 0 0 2 2 0 2 28 NA 357; 416; 561; 581 319; 497; 793 322 192; 464; 1063 NA NA 613; 908 321; 1770 NA 45; 429 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA *NA = Не застосовно 5 10 15 20 25 30 ПРИКЛАД 2 Синтетична кодуюча область, яка кодує токсин Cry34A Bacillus thuringiensis Послідовності для порівняння. Нативна послідовність ДНК, яка кодує токсин Cry34A, дана під SEQ ID NO:7. Дана послідовність була проаналізована із метою визначення того, які послідовності із ідентифікованих в таблиці 1 присутні в SEQ ID NO:7, і їх положень. Нативна послідовність ДНК була протрансльована у відповідну амінокислотну послідовність із використанням стандартного генетичного коду. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:7, піддавалась зворотній трансляції із використанням цільових частот кодонів, наведених в стовпчику таблиці 7 для синтетичних генів, призначених для використання в кукурудзі. Отримана в результаті послідовність ДНК аналізувалася, і кодони замінювалися за необхідності для видалення небажаних відкритих рамок зчитування і видалення небажаних сайтів рестрикції, і відновлення всіх послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:7, зберігалася. Отримана в результаті послідовність ДНК дана під SEQ ID NO:9. Була синтезована ДНК, яка має послідовність SEQ ID NO:9. SEQ ID NO:9 була проаналізована, і кодони були змінені із метою видалення потенційних послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 2, при цьому підтримувалася та ж сама кількість послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1. Отримана в результаті послідовність, яка є варіантом здійснення даного винаходу, дана під SEQ ID NO:11. У таблиці 7 показано, що кількість і положення послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 1, підтримується в SEQ ID NO:11. У таблиці 8 показано, що кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблицях 2 і 3, знижується в SEQ ID NO:5. ДНК із SEQ ID NO:5 синтезується, і рівні експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії даної послідовності, порівнюються із рівнями експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:3. Синтетична кодуюча область SEQ ID NO:5 була оптимізована для експресії в кукурудзі. Конструкція для застосування в експресії синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:5 зроблена шляхом об'єднання синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:5 із 5'-нетрансльованою областю, яка містить промотор, функціональний в рослинних клітинах, і 3'-нетрансльованою областю, яка містить послідовність термінації транскрипції і поліаденілювання. 35 12 UA 115526 C2 Таблиця 7 Послідовності таблиці 1, виявлені в нативній кодуючій області Cry34Ab1 (SEQ ID NO:7), і її перебудованої версії (SEQ ID NO:11) Послідовність із таблиці 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 AATAAA AATAAT AACCAA ATATAA AATCAA ATACTA ATAAAA ATGAAA AAGCAT ATTAAT ATACAT AAAATA ATTAAA AATTAA AATACA CATAAA разом Число ділянок в нативній послідовності Cry34Ab1 (SEQ ID NO:7) 2 1 0 0 2 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 12 Положення в нативній послідовності Cry34Ab1, н. п. (SEQ ID NO:7)) 247; 268 31 NA* NA 146; 310 329 65 281 NA NA 47 NA 127 126 NA 361 Число ділянок в перебудованій послідовності Cry34Ab1 (SEQ ID NO:11) Положення в перебудованій послідовності Cry34Ab1, н. п. (SEQ ID NO:11) 2 1 0 0 2 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 12 247; 268 31 NA NA 146; 310 329 65 281 NA NA 47 NA 127 126 NA 361 *NA = Не застосовно Таблиця 8 Послідовності таблиці 2, виявлені в нативній кодуючій області Cry34Ab1 (SEQ ID NO:7) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:11) Послідовність із таблиці 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ATATAT TTGTTT TTTTGT TGTTTT TATATA TATTTT TTTTTT ATTTTT TTATTT TTTATT TAATAA ATTTAT TATATT Число ділянок в нативній послідовності Cry34Ab1 (SEQ ID NO:7) 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 2 0 2 Положення в нативній послідовності Cry34Ab1, н. п. (SEQ ID NO:7)) Число ділянок в перебудованій послідовності Cry34Ab1 (SEQ ID NO:11) Положення в перебудованій послідовності Cry34Ab1, н. п. (SEQ ID NO:11) 181 NA NA NA 180 220 NA NA NA NA 33; 246 NA 182; 218 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 NA* NA NA NA NA NA NA NA NA NA 33; 246 NA NA 13 UA 115526 C2 Продовження таблиці 8 14 15 16 17 18 19 20 TTTTAT ATATTT TATTAT TGTTTG TTATAT TGTAAT AAATAA разом 1 1 1 0 1 0 1 12 156 219 184 NA 217 NA 30 0 0 0 0 0 0 1 3 NA NA NA NA NA NA 30 *NA = Не застосовно 5 10 15 20 25 30 ПРИКЛАД 3 Синтетична кодуюча область, яка кодує токсин Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis Послідовності для порівняння. Нативна послідовність ДНК, яка кодує токсин Cry35Ab1, дана під SEQ ID NO:13. Дана послідовність була проаналізована із метою визначення того, які послідовності із ідентифікованих в таблиці 1 присутні в SEQ ID NO:13, і їх положень. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:13, піддавалась зворотній трансляції із використанням цільових частот кодонів, наведених в стовпчику таблиці 4 для синтетичних генів, призначених для використання в кукурудзі. Отримана в результаті послідовність ДНК аналізувалася, і кодони замінювалися за необхідності для видалення небажаних відкритих рамок зчитування і видалення небажаних сайтів рестрикції, при цьому підтримувалися всі послідовності, ідентифіковані в таблиці 1. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:13, зберігалася. Отримана в результаті послідовність ДНК дана під SEQ ID NO:15. Дана послідовність буде синтезована і використана для порівняння із синтетичною кодуючою областю, спроектованою за винаходом. SEQ ID NO:15 була проаналізована, і кодони були змінені із метою видалення потенційних послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 2, при цьому підтримувалася та ж сама кількість послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1, за винятком двох входжень AATAAA, одного в 228 н. п. і одного в 276 н. п. в SEQ ID NO:8, які були замінені на AATCAA. Отримана в результаті послідовність, яка є варіантом здійснення даного винаходу, дана під SEQ ID NO:17. У таблиці 9 показано, що кількість і положення послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 1, підтримується в SEQ ID NO:17. У таблиці 10 показано, що кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблицях 2 і 3, знижується в SEQ ID NO:17 в порівнянні із SEQ ID NO:13. ДНК із SEQ ID NO:17 синтезується, і рівні експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії даної послідовності, порівнюються із рівнями експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії SEQ ID NO:13 і SEQ ID NO:15. Синтетична кодуюча область SEQ ID NO:17 була оптимізована для експресії в кукурудзі. Конструкція для застосування в експресії синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:17 зроблена шляхом об'єднання синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:17 із 5'нетрансльованою областю, яка містить промотор, функціональний в рослинних клітинах, і 3'нетрансльованої області, яка містить послідовність термінації транскрипції і поліаденілювання. 35 14 UA 115526 C2 Таблиця 9 Послідовності таблиці 1, виявлені в нативній кодуючій області Cry35Ab1 (SEQ ID NO:13) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:17) Послідовність із таблиці 1 1 AATAAA Число ділянок в нативній послідовності Cry35Ab1 (SEQ ID NO:13) 5 2 AATAAT 4 3 4 5 AACCAA ATATAA AATCAA 0 1 3 6 7 ATACTA ATAAAA 1 5 8 ATGAAA 5 9 10 11 12 AAGCAT ATTAAT ATACAT AAAATA 0 1 1 7 13 ATTAAA 4 14 AATTAA 5 15 16 AATACA CATAAA разом 3 0 45 Положення в нативній послідовності Cry35Ab1, н. п. (SEQ ID NO:13) 13; 100; 228; 276; 810 193; 217; 385; 864 NA* 966 394; 750; 914 Число ділянок в перебудованій послідовності Cry35Ab1 (SEQ ID NO:17) Положення в перебудованій послідовності Cry35Ab1, н. п. (SEQ ID NO:17) 3 13; 100; 810 4 193; 217; 385; 864 0 1 5 8 101; 224; 277; 575; 811 23; 671; 769; 806; 854 NA 522 734 226; 578; 618; 838; 862; 873; 1137 462; 589; 834; 1131 461; 521; 588; 833; 1130 261; 303; 733 NA 1 5 NA 966 228; 276; 394; 750; 914 8 101; 224; 277; 575; 811 23; 671; 769; 806; 854 NA 522 734 226; 578; 618; 838; 862; 873; 1137 5 0 1 1 7 4 5 3 0 45 462; 589; 834; 1131 461; 521; 588; 833; 1130 261; 303; 733 NA *NA = Не застосовно Таблиця 10 Послідовності таблиці 2, виявлені в нативній кодуючій області Cry35Ab1 (SEQ ID NO:13) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:17) Послідовність із таблиці 2 1 2 3 4 ATATAT TTGTTT TTTTGT TGTTTT Число ділянок в нативній послідовності Cry35Ab1 (SEQ ID NO:13) 1 0 0 0 Положення в нативній послідовності Cry35Ab1, н. п. (SEQ ID NO:13) 168 NA NA NA 15 Число ділянок в перебудованій послідовності Cry35Ab1 (SEQ ID NO:17) Положення в перебудованій послідовності Cry35Ab1, н. п. (SEQ ID NO:17) 0 0 0 0 NA* NA NA NA UA 115526 C2 Продовження таблиці 10 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 TATATA TATTTT TTTTTT ATTTTT TTATTT TTTATT TAATAA ATTTAT TATATT TTTTAT ATATTT TATTAT 1 2 0 1 3 2 2 0 2 1 1 4 17 18 19 20 TGTTTG TTATAT TGTAAT AAATAA 0 2 1 8 разом 959 609; 1144 NA 1145 63; 145; 1143 144; 1056 12; 216 NA 169; 607 143 608 171; 549; 604; 1141 NA 606; 958 300 26; 192; 227; 275; 384; 809; 863; 1097 31 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 NA NA NA NA 1143 NA 12 NA NA NA NA 1141 0 0 0 2 NA NA NA 809; 863 5 *NA = Не застосовно 5 10 15 20 25 30 35 ПРИКЛАД 4 Синтетична кодуюча область, яка кодує ядерний токсин Cry1Ab Bacillus thuringiensis Послідовності для порівняння. Нативна послідовність ДНК, яка кодує ядерний токсин Cry1Ab, дана під SEQ ID NO:19. Дана послідовність була проаналізована із метою визначення того, які послідовності із ідентифікованих в таблиці 1 присутні в SEQ ID NO:19, і їх положень. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:19, піддавалась зворотній трансляції із використанням цільових частот кодонів, наведених в стовпчику таблиці 4 для синтетичних генів, призначених для використання в кукурудзі. Отримана в результаті послідовність ДНК аналізувалася, і кодони замінювалися за необхідності для видалення небажаних відкритих рамок зчитування і видалення небажаних сайтів рестрикції, при цьому підтримувалися всі послідовності, ідентифіковані в таблиці 1. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:19, зберігалася. Отримана в результаті послідовність ДНК дана під SEQ ID NO:21. SEQ ID NO:21 була проаналізована, і кодони були змінені із метою видалення потенційних послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 2, при цьому підтримувалася та ж сама кількість послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1. Отримана в результаті послідовність, яка є варіантом здійснення даного винаходу, дана під SEQ ID NO:23. У таблиці 11 показано, що кількість і положення послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 1, підтримується в SEQ ID NO:23. У таблиці 12 показано, що кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблицях 2 і 3, знижується в SEQ ID NO:23 в порівнянні із SEQ ID NO:19. Синтетична кодуюча область SEQ ID NO:23 була оптимізована для експресії в кукурудзі. Конструкція для застосування в експресії синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:23 була зроблена шляхом об'єднання синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:23 із 5'нетрансльованою областю, яка містить промотор, функціональний в рослинних клітинах, і 3'нетрансльованої області, яка містить послідовність термінації транскрипції і поліаденілювання. У одному із варіантів здійснення такої конструкції, продукування первинного транскрипту мРНК, який містить SEQ ID NO:23, керувалося копією промотору убіквітину 1 кукурудзи із своїм нативним інтроном 1 (патент США No. 5510474). Фрагмент, який містить 3'-нетрансльовану область із гена пероксидази 5 кукурудзи (ZmPer5 3'UTR v2; патент США No. 6699984), був використаний для термінації транскрипції. Бінарна плазміда для трансформації рослин, pDAB111449, яка містить вказану вище касету експресії генів, була сконструйована і застосована в продукуванні трансгенних рослин кукурудзи. Плазміда pDAB111449 також містить ген стійкості до гербіцидів, який містить кодуючу область для арилоксіалконатдіоксигенази (AAD-1 v3; патент США No. 7838733(B2), and Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 16 UA 115526 C2 107:20240-5) під транскрипційним контролем промотору паличновидного баднавірусу цукрової тростини (ScBV) (Schenk et al. (1999) Plant Molec. Biol. 39: 1221-30). Фрагмент, який містить 3'нетрансльовану область із гена ліпази кукурудзи (ZmLip 3'UTR; патент США No. 7179902), був використаний для термінації транскрипції. 5 Таблиця 11 Послідовності таблиці 1, виявлені в нативній кодуючій ядерний токсин Cry1Ab області (SEQ ID NO:19) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:23) Послідовність із таблиці 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 13 15 16 AATAAA AATAAT AACCAA ATATAA AATCAA ATACTA ATAAAA ATGAAA AAGCAT ATTAAT ATACAT AAAATA ATTAAA AATTAA AATACA CATAAA разом Число ділянок в нативній послідовності ядерного токсину Cry1Ab (SEQ ID NO:19) 0 3 2 2 2 0 0 1 0 1 2 0 3 0 0 0 16 Положення в нативній послідовності ядерного токсину Cry1Ab, н. п. (SEQ ID NO:19) Число ділянок в перебудованій послідовності ядерного токсину Cry1Ab (SEQ ID NO:23) Положення в перебудованій послідовності ядерного токсину Cry1Ab, н. п. (SEQ ID NO:23) NA* 960, 1126, 1387 253, 280 185, 1391 688, 1129 NA NA 1232 NA 1636 1366, 1613 NA 249, 704, 785 NA NA NA NA 0 3 2 2 3 0 0 1 0 1 2 0 3 0 0 0 17 NA 960, 1126, 1387 253, 280 185, 1391 688, 1129, 1639 NA NA 1232 NA 1636 1366, 1613 NA 249, 704, 785 NA NA NA NA *NA = Не застосовно Таблиця 12 Послідовності таблиці 2, виявлені в нативній кодуючій області Cry1Ab (SEQ ID NO:19) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:23) Послідовність із таблиці 2 1 2 3 4 5 6 7 ATATAT TTGTTT TTTTGT TGTTTT TATATA TATTTT TTTTTT Число ділянок в нативній послідовності ядерного токсину Cry1Ab (SEQ ID NO:19) 0 1 0 0 2 0 0 Положення в нативній послідовності ядерного токсину Cry1Ab, н. п. (SEQ ID NO:19) NA* 42 NA NA 1097, 1792 NA NA 17 Число ділянок в перебудованій послідовності ядерного токсину Cry1Ab (SEQ ID NO:23)) Положення в перебудованій послідовності ядерного токсину Cry1Ab, н. п. (SEQ ID NO:23) 0 0 0 0 0 0 0 NA NA NA NA NA NA NA UA 115526 C2 Продовження таблиці 12 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 ATTTTT TTATTT TTTATT TAATAA ATTTAT TATATT TTTTAT ATATTT TATTAT TGTTTG TTATAT TGTAAT AAATAA разом 2 0 1 2 2 0 0 1 2 1 2 0 2 18 199, 1649 NA 470 1340, 1386 503, 799 NA NA 110 937, 940 530 1096, 1791 NA 959, 1125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA 959 *NA = Не застосовно 5 10 15 20 25 30 ПРИКЛАД 5 Синтетична кодуюча область, яка кодує ядерний токсин Cry1Ca Bacillus thuringiensis Послідовності для порівняння. Нативна послідовність ДНК, яка кодує ядерний токсин Cry35A, дана під SEQ ID NO:25. Дана послідовність була проаналізована із метою визначення того, які послідовності із ідентифікованих в таблиці 1 присутні в SEQ ID NO:25, і їх положень. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:25 піддавалась зворотній трансляції із використанням цільових частот кодонів, наведених в стовпчику таблиці 4 для синтетичних генів, призначених для використання в кукурудзі. Отримана в результаті послідовність ДНК аналізувалася, і кодони замінювалися за необхідності для видалення небажаних відкритих рамок зчитування і видалення небажаних сайтів розпізнавання рестрикційних ферментів, при цьому підтримувалися всі послідовності, ідентифіковані в таблиці 1. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:25, зберігалася. Отримана в результаті послідовність ДНК дана під SEQ ID NO:27. Дана послідовність буде синтезована і використана для порівняння із синтетичним геном, спроектованим за винаходом. SEQ ID NO:27 була проаналізована, і кодони були змінені із метою видалення потенційних послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 2, при цьому підтримувалася та ж сама кількість послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1. Отримана в результаті послідовність, яка є варіантом здійснення даного винаходу, дана під SEQ ID NO:29. У таблиці 13 показано, що кількість і положення послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 1, підтримується в SEQ ID NO:29. У таблиці 14 показано, що кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблицях 2 і 3, знижується в SEQ ID NO:29 в порівнянні із SEQ ID NO:25. Синтезується ДНК із SEQ ID NO:29, і рівні експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії даної послідовності, порівнюються із рівнями експресії, які спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії SEQ ID NO:25 і SEQ ID NO:27. Синтетичний ген SEQ ID NO:29 був оптимізований для експресії в кукурудзі. Конструкція для застосування в експресії синтетичного гена SEQ ID NO:29 була зроблена шляхом об'єднання синтетичного гена SEQ ID NO:29 із 5'-нетрансльованою областю, яка містить промотор, функціональний в рослинних клітинах, і 3'-нетрансльованої області, яка містить термінатор транскрипції і послідовність поліаденілювання. 18 UA 115526 C2 Таблиця 13 Послідовності таблиці 1, виявлені в нативній кодуючій Cry1Ca області (SEQ ID NO:25) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:29) Послідовність із таблиці 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AATAAA AATAAT AACCAA ATATAA AATCAA ATACTA ATAAAA ATGAAA AAGCAT ATTAAT Число ділянок в нативній послідовності ядерного токсину Cry1Ca (SEQ ID NO:25) 0 2 0 2 1 0 1 2 1 7 11 12 13 ATACAT AAAATA ATTAAA 0 0 4 14 15 16 AATTAA AATACA CATAAA разом 1 1 0 22 Положення в нативній послідовності ядерного токсину Cry1Ca, н. п. (SEQ ID NO:25) Число ділянок в перебудованій послідовності ядерного токсину Cry1Ca (SEQ ID NO:29) Положення в перебудованій послідовності ядерного токсину Cry1Ca, н. п. (SEQ ID NO:29) NA* 646, 916 NA 684, 1757 1405 NA 1826 254, 569 335 177, 246, 250, 813, 817, 1402, 1534 NA NA 245, 249, 816, 1401 642 1381 NA 0 2 1 2 1 0 1 2 1 7 NA 646, 916 1042 684, 1757 1405 NA 1826 254, 569 335 177, 246, 250, 813, 817, 1402, 1534 NA NA 245, 249, 816, 1401 642 1381 NA 0 0 4 1 1 0 23 *NA = Не застосовно Таблиця 14 Послідовності таблиці 2, виявлені в нативній кодуючій ядерний токсин Cry1Ca області (SEQ ID NO:25) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:29) Послідовність із таблиці 2 1 ATATAT Число ділянок в нативній послідовності ядерного токсину Cry1Ca (SEQ ID NO:25) 4 2 3 4 TTGTTT TTTTGT TGTTTT 3 0 Положення в нативній послідовності ядерного токсину Cry1Ca, н. п. (SEQ ID NO:25) Число ділянок в перебудованій послідовності ядерного токсину Cry1Ca (SEQ ID NO:29) Положення в перебудованій послідовності ядерного токсину Cry1Ca, н. п. (SEQ ID NO:29) 323, 325, 908, 1024 NA 186, 1302, 1512 NA 0 NA* 0 0 0 NA NA NA 19 UA 115526 C2 Продовження таблиці 14 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 TATATA TATTTT TTTTTT ATTTTT TTATTT TTTATT TAATAA ATTTAT TATATT TTTTAT ATATTT TATTAT TGTTTG TTATAT TGTAAT AAATAA разом 3 1 1 2 1 2 0 1 2 2 1 0 0 1 1 1 26 324, 1023, 1819 1346 1326 529, 959 901 900, 962 NA 899 510, 909 470, 961 110 NA NA 1818 525 645 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA 645 *NA = Не застосовно 5 10 15 20 25 30 ПРИКЛАД 6 Синтетична кодуюча область, яка кодує токсин Cry6Aa Bacillus thuringiensis Послідовності для порівняння. Нативна послідовність ДНК, яка кодує токсин Cry6Aa, дана під SEQ ID NO:31. Дана послідовність була проаналізована із метою визначення того, які послідовності із ідентифікованих в таблиці 1 присутні в SEQ ID NO:31, і їх положень. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:31 піддавалась зворотній трансляції із використанням цільових частот кодонів, наведених в стовпчику таблиці 4 для синтетичних генів, призначених для використання в кукурудзі. Отримана в результаті послідовність ДНК аналізувалася, і кодони замінювалися за необхідності для видалення небажаних відкритих рамок зчитування і видалення небажаних сайтів розпізнавання рестрикційних ферментів, при цьому підтримувалися всі послідовності, ідентифіковані в таблиці 1. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:31, зберігалася. Отримана в результаті послідовність ДНК дана під SEQ ID NO:33. Дана послідовність була синтезована і використана для порівняння із синтетичним геном, спроектованим за винаходом. SEQ ID NO:33 була проаналізована, і кодони були змінені із метою видалення потенційних послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 2, при цьому підтримувалася кількість послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1. Отримана в результаті послідовність, яка є варіантом здійснення даного винаходу, дана під SEQ ID NO:35. У таблиці 15 показано, що кількість і положення послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 1, підтримується в SEQ ID NO:35. У таблиці 16 показано, що кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблицях 2 і 3, знижується в SEQ ID NO:35 в порівнянні із SEQ ID NO:31. Синтезується ДНК із SEQ ID NO:35, і рівні експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії даної послідовності, порівнюються із рівнями експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії SEQ ID NO:31 і SEQ ID NO:33. Синтетична кодуюча область SEQ ID NO:35 була оптимізована для експресії в кукурудзі. Конструкція для застосування в експресії синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:35 зроблена шляхом об'єднання синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:35 із 5'нетрансльованою областю, яка містить промотор, функціональний в рослинних клітинах, і 3'нетрансльованої області, яка містить термінатор транскрипції і послідовність поліаденілювання. 20 UA 115526 C2 Таблиця 15 Послідовності таблиці 1, виявлені в нативній кодуючій області Cry6Aa (SEQ ID NO:31) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:35) Послідовність із таблиці 1 1 2 AATAAA AATAAT Число ділянок в нативній послідовності Cry6Aa (SEQ ID NO:31) 1 6 3 4 5 AACCAA ATATAA AATCAA 0 2 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ATACTA ATAAAA ATGAAA AAGCAT ATTAAT ATACAT AAAATA ATTAAA 0 3 1 0 2 0 3 5 14 AATTAA 7 15 16 AATACA CATAAA разом 2 1 38 Положення в нативній послідовності Cry6Aa, н. п. (SEQ ID NO:31) Число ділянок в перебудованій послідовності Cry6Aa (SEQ ID NO:35) Положення в перебудованій послідовності Cry6Aa, н. п. (SEQ ID NO:35) 292 430, 1309, 1360, 1384, 1402, 1420 NA* 824, 1344 103, 634, 832, 1234, 1270 NA 269, 293, 826 794 NA 919, 1183 NA 530, 806, 1358 51, 56, 188, 495, 963 52, 57, 316, 463, 496, 718, 964 922, 1238 664 1 6 292 430, 1309, 1360, 1384, 1402, 1420 NA 824, 1344 103, 634, 832, 1234, 1270 NA 269, 293, 826 794 NA 919, 1183 1275 530, 806, 1358 51, 56, 188, 495, 963 52, 57, 316, 463, 496, 718, 964 922, 1238, 1274 664 0 2 5 0 3 1 0 2 1 3 5 7 3 1 40 *NA = Не застосовно Таблиця 16 Послідовності таблиці 2, виявлені в нативній кодуючій області Cry6Aa (SEQ ID NO:31) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:35) Послідовність із таблиці 2 1 ATATAT 2 3 4 5 6 7 8 TTGTTT TTTTGT TGTTTT TATATA TATTTT TTTTTT ATTTTT Число ділянок в нативній послідовності Cry6Aa (SEQ ID NO:31) 4 1 0 1 2 2 Положення в нативній послідовності Cry6Aa, н. п. (SEQ ID NO:31) 147, 218, 1275, 1372 788 NA NA 941 388, 489 NA 236, 555 21 Число ділянок в перебудованій послідовності Cry6Aa (SEQ ID NO:35) 0 Положення в перебудованій послідовності Cry6Aa, н. п. (SEQ ID NO:35) NA* 0 0 0 0 0 0 0 NA NA NA NA NA NA NA UA 115526 C2 Продовження таблиці 16 9 10 11 TTATTT TTTATT TAATAA 1 1 5 12 13 14 15 16 17 18 ATTTAT TATATT TTTTAT ATATTT TATTAT TGTTTG TTATAT 3 2 2 1 1 0 4 19 20 TGTAAT AAATAA разом 1 2 33 113 109, 257 66, 429, 1383, 1401, 1419 108, 299, 938 148, 1373 1314, 1365 387 111 NA 247, 301, 940, 1190 1204 1308, 1359 0 0 0 NA NA NA 0 0 0 0 0 0 0 NA NA NA NA NA NA NA 0 1 1 NA 1359 *NA = Не застосовно 5 10 15 20 25 30 ПРИКЛАД 7 Синтетична кодуюча область, яка кодує AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans Послідовності для порівняння. Нативна послідовність ДНК, яка кодує білок AAD1, дана під SEQ ID NO:37. Дана послідовність була проаналізована із метою визначення того, які послідовності із ідентифікованих в таблиці 1 присутні в SEQ ID NO:37, і їх положень. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:37, піддавалась зворотній трансляції із використанням цільових частот кодонів, наведених в стовпчику таблиці 4 для синтетичних генів, призначених для використання в кукурудзі. Отримана в результаті послідовність ДНК аналізувалася, і кодони замінювалися за необхідності для видалення небажаних відкритих рамок зчитування і видалення небажаних сайтів розпізнавання рестрикційних ферментів, при цьому підтримувалися всі послідовності, ідентифіковані в таблиці 1. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:37, зберігалася. Отримана в результаті послідовність ДНК дана під SEQ ID NO:39. Дана послідовність була синтезована і використана для порівняння із синтетичним геном, спроектованим за винаходом. SEQ ID NO:39 була проаналізована, і кодони були змінені із метою видалення потенційних послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 2, при цьому підтримувалася кількість послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1. Отримана в результаті послідовність, яка є варіантом здійснення даного винаходу, дана під SEQ ID NO:41. У таблиці 17 показано, що кількість і положення послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 1, підтримується в SEQ ID NO:41. У таблиці 18 показано, що кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблицях 2 і 3, знижується в SEQ ID NO:41 в порівнянні із SEQ ID NO:37. Синтезується ДНК із SEQ ID NO:41, і рівні експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії даної послідовності, порівнюються із рівнями експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії SEQ ID NO:37 і SEQ ID NO:39. Синтетична кодуюча область SEQ ID NO:41 була оптимізована для експресії в кукурудзі. Конструкція для застосування в експресії синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:41 зроблена шляхом об'єднання синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:41 із 5'нетрансльованою областю, яка містить промотор, функціональний в рослинних клітинах, і 3'нетрансльованої області, яка містить термінатор транскрипції і послідовність поліаденілювання. 22 UA 115526 C2 Таблиця 17 Послідовності таблиці 1, виявлені в нативній кодуючій області AAD1 (SEQ ID NO:37) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:41) Послідовність із таблиці 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 AATAAA AATAAT AACCAA ATATAA AATCAA ATACTA ATAAAA ATGAAA AAGCAT ATTAAT ATACAT AAAATA ATTAAA AATTAA AATACA CATAAA разом Число ділянок в нативній послідовності AAD1 (SEQ ID NO:37) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Положення в нативній послідовності AAD1, н. п. (SEQ ID NO:37) NA* NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Число ділянок в перебудованій послідовності AAD1 (SEQ ID NO:41) Положення в перебудованій послідовності AAD1, н. п. (SEQ ID NO:41) 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 NA NA 652 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA *NA = Не застосовно Таблиця 18 Послідовності таблиці 2, виявлені в нативній кодуючій області AAD1 (SEQ ID NO:37) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:41) Послідовність із таблиці 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Число ділянок в нативній послідовності AAD1 (SEQ ID NO:37) ATATAT TTGTTT TTTTGT TGTTTT TATATA TATTTT TTTTTT ATTTTT TTATTT TTTATT TAATAA ATTTAT TATATT TTTTAT ATATTT 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Положення в нативній послідовності AAD1, н. п. (SEQ ID NO:37) NA* NA NA NA NA 166 NA NA NA NA NA NA NA NA NA 23 Число ділянок в перебудованій послідовності AAD1 (SEQ ID NO:41) Положення в перебудованій послідовності AAD1, н. п. (SEQ ID NO:41) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA UA 115526 C2 Продовження таблиці 18 16 17 18 19 20 TATTAT TGTTTG TTATAT TGTAAT AAATAA разом 0 0 0 0 0 1 NA NA NA NA NA 0 0 0 0 0 0 NA NA NA NA NA *NA = Не застосовно 5 10 15 20 25 30 ПРИКЛАД 8 Синтетична кодуюча область, яка кодує дельта-9-десатуразу Aspergillus nidulans Послідовності для порівняння. Нативна послідовність ДНК, яка кодує білок дельта-9десатурази Aspergillus nidulans, дана під SEQ ID NO:43. Дана послідовність була проаналізована із метою визначення того, які послідовності із ідентифікованих в таблиці 1 присутні в SEQ ID NO:43, і їх положень. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:43, піддавалась зворотній трансляції із використанням цільових частот кодонів, наведених в стовпчику таблиці 4 для синтетичних генів, призначених для використання в кукурудзі. Отримана в результаті послідовність ДНК аналізувалася, і кодони замінювалися за необхідності для видалення небажаних відкритих рамок зчитування і видалення небажаних сайтів рестрикції, при цьому підтримувалися всі послідовності, ідентифіковані в таблиці 1. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:43, зберігалася. Отримана в результаті послідовність ДНК дана під SEQ ID NO:45. Дана послідовність була синтезована і використана для порівняння із синтетичним геном, спроектованим за винаходом. SEQ ID NO:45 була проаналізована, і кодони були змінені із метою видалення потенційних послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 2, при цьому підтримувалася кількість послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1. Отримана в результаті послідовність, яка є варіантом здійснення даного винаходу, дана під SEQ ID NO:47. У таблиці 1 показано, що кількість і положення послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 1, підтримується в SEQ ID NO:47. У таблиці 20 показано, що кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблицях 2 і 3, знижується в SEQ ID NO:47 в порівнянні із SEQ ID NO:43. Синтезується ДНК із SEQ ID NO:47, і рівні експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії даної послідовності, порівнюються із рівнями експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії SEQ ID NO:43 і SEQ ID NO:45. Синтетична кодуюча область SEQ ID NO:47 була оптимізована для експресії в кукурудзі. Конструкція для застосування в експресії синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:47 зроблена шляхом об'єднання синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:47 із 5'нетрансльованою областю, яка містить промотор, функціональний в рослинних клітинах, і 3'нетрансльованої області, яка містить послідовність термінації транскрипції і поліаденілювання.24 UA 115526 C2 Таблиця 19 Послідовності таблиці 1, виявлені в нативній кодуючій області дельта-9-десатурази Aspergillus nidulans (SEQ ID NO:43) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:47) Послідовність із таблиці 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Число ділянок в нативній послідовності Asp-∆9 (SEQ ID NO:43) AATAAA AATAAT AACCAA ATATAA AATCAA ATACTA ATAAAA ATGAAA AAGCAT ATTAAT ATACAT AAAATA ATTAAA AATTAA AATACA CATAAA разом 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 Положення в нативній послідовності Asp-∆9, н. п. (SEQ ID NO:43) NA* NA 1326 NA NA NA NA NA 94 NA NA NA NA NA NA NA Число ділянок в перебудованій послідовності Asp∆9 (SEQ ID NO:47) Положення в перебудованій послідовності Asp∆9, н. п. (SEQ ID NO:47) 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 NA NA 1326 NA NA NA NA NA 94 NA NA NA NA NA NA NA *NA = Не застосовно Таблиця 20 Послідовності таблиці 2, виявлені в нативній кодуючій області дельта-9-десатурази Aspergillus nidulans (SEQ ID NO:43) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:47) Послідовність із таблиці 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ATATAT TTGTTT TTTTGT TGTTTT TATATA TATTTT TTTTTT ATTTTT TTATTT TTTATT TAATAA ATTTAT TATATT TTTTAT Число ділянок в нативній послідовності Asp-∆9 (SEQ ID NO:43) 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Положення в нативній послідовності Asp-∆9, н. п. (SEQ ID NO:43) NA* NA NA NA NA 166 NA NA NA NA NA NA NA NA 25 Число ділянок в перебудованій послідовності Asp-∆9 (SEQ ID NO:47) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Положення в перебудованій послідовності Asp-∆9, н. п. (SEQ ID NO:47) NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA UA 115526 C2 Продовження таблиці 20 15 16 17 18 19 20 ATATTT TATTAT TGTTTG TTATAT TGTAAT AAATAA разом 1 0 0 0 0 0 1 479 NA NA NA NA NA 0 0 0 0 0 0 0 NA NA NA NA NA NA *NA = Не застосовно 5 10 15 20 25 30 ПРИКЛАД 9 Синтетична кодуюча область, яка кодує SAP1 Xerophyta viscosa Послідовності для порівняння. Нативна послідовність ДНК, яка кодує білок SAP1 Xerophyta viscosa, дана під SEQ ID NO:49. Дана послідовність була проаналізована із метою визначення того, які послідовності із ідентифікованих в таблиці 1 присутні в SEQ ID NO:49, і їх положень. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:49 піддавалась зворотній трансляції із використанням цільових частот кодонів, наведених в стовпчику таблиці 4 для синтетичних генів, призначених для використання в кукурудзі. Отримана в результаті послідовність ДНК аналізувалася, і кодони замінювалися за необхідності для видалення небажаних відкритих рамок зчитування і видалення небажаних сайтів рестрикції, при цьому підтримувалися всі послідовності, ідентифіковані в таблиці 1. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:49, зберігалася. Отримана в результаті послідовність ДНК дана під SEQ ID NO:51. Дана послідовність була синтезована і використана для порівняння із синтетичним геном, спроектованим за винаходом. SEQ ID NO:52 була проаналізована, і кодони були змінені із метою видалення потенційних послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 2, при цьому підтримувалася кількість послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1. Отримана в результаті послідовність, яка є варіантом здійснення даного винаходу, дана під SEQ ID NO:53. У таблиці 1 показано, що кількість і положення послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 1, підтримується в SEQ ID NO:53. У таблиці 21 показано, що кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблицях 2 і 3, знижується в SEQ ID NO:53 в порівнянні із SEQ ID NO:49. Синтезується ДНК із SEQ ID NO:53, і рівні експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії даної послідовності, порівнюються із рівнями експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії SEQ ID NO:49 і SEQ ID NO:51. Синтетична кодуюча область SEQ ID NO:53 була оптимізована для експресії в кукурудзі. Конструкція для застосування в експресії синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:53 зроблена шляхом об'єднання синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:53 із 5'нетрансльованою областю, яка містить промотор, функціональний в рослинних клітинах, і 3'нетрансльованої області, яка містить термінатор транскрипції і послідовність поліаденілювання. 26 UA 115526 C2 Таблиця 21 Послідовності таблиці 1, виявлені в нативній кодуючій області SAP1 Xerophyta viscosa (SEQ ID NO:49) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:53) Послідовність із таблиці 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 AATAAA AATAAT AACCAA ATATAA AATCAA ATACTA ATAAAA ATGAAA AAGCAT ATTAAT ATACAT AAAATA ATTAAA AATTAA AATACA CATAAA разом Число ділянок в нативній послідовності XvSAP1 (SEQ ID NO:49) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Положення в нативній послідовності XvSAP1, н. п. (SEQ ID NO:49) NA* NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Число ділянок в перебудованій послідовності XvSAP1 (SEQ ID NO:53) 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 Положення в перебудованій послідовності XvSAP1, н. п. (SEQ ID NO:53) NA NA NA NA NA NA NA 25 NA NA NA NA NA NA NA NA *NA = Не застосовно Таблиця 22 Послідовності таблиці 2, виявлені в нативній кодуючій області SAP1 Xerophyta viscosa (SEQ ID NO:49) і її перебудованої версії (SEQ ID NO:53) Послідовність із таблиці 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Число ділянок в нативній послідовності XvSAP1 (SEQ ID NO:49) ATATAT TTGTTT TTTTGT TGTTTT TATATA TATTTT TTTTTT ATTTTT TTATTT TTTATT TAATAA ATTTAT TATATT TTTTAT 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 Положення в нативній послідовності XvSAP1, н. п. (SEQ ID NO:49) NA* NA NA NA NA 755 NA 756 NA NA NA NA NA NA 27 Число ділянок в перебудованій послідовності XvSAP1 (SEQ ID NO:53) Положення в перебудованій послідовності XvSAP1, н. п. (SEQ ID NO:53) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA UA 115526 C2 Продовження таблиці 22 15 16 17 18 19 20 ATATTT TATTAT TGTTTG TTATAT TGTAAT AAATAA разом 1 1 1 0 0 0 5 754 665 696 NA NA NA 0 0 0 0 0 0 0 NA NA NA NA NA NA *NA = Не застосовно 5 10 15 20 25 30 ПРИКЛАД 10 Синтетична кодуюча область, яка кодує GFP1 Aequorea victoria Послідовності для порівняння. Нативна послідовність ДНК, яка кодує GFP1 Aequorea victoria, дана під SEQ ID NO:55. Дана послідовність була проаналізована із метою визначення того, які послідовності із ідентифікованих в таблиці 1 присутні в SEQ ID NO:55, і їх положень. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:55, піддавалась зворотній трансляції із використанням цільових частот кодонів, наведених в стовпчику таблиці 4 для синтетичних генів, призначених для використання в кукурудзі. Отримана в результаті послідовність ДНК аналізувалася, і кодони замінювалися за необхідності для видалення небажаних відкритих рамок зчитування і видалення небажаних сайтів рестрикції, при цьому підтримувалися всі послідовності, ідентифіковані в таблиці 1. Амінокислотна послідовність, яка кодується SEQ ID NO:55, зберігалася. Отримана в результаті послідовність ДНК дана під SEQ ID NO:57. Дана послідовність була синтезована і використана для порівняння із синтетичним геном, спроектованим за винаходом. SEQ ID NO:57 була проаналізована, і кодони були змінені із метою видалення потенційних послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 2, при цьому підтримувалася кількість послідовностей, ідентифікованих в таблиці 1. Отримана в результаті послідовність, яка є варіантом здійснення даного винаходу, дана під SEQ ID NO:59. У таблиці 1 показано, що кількість і положення послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблиці 1, підтримується в SEQ ID NO:59. У таблиці 23 показано, що кількість послідовностей сигналів поліаденілювання, ідентифікованих в таблицях 2 і 3, знижується в SEQ ID NO:59 в порівнянні із SEQ ID NO:55. Синтезується ДНК із ID NO:59, і рівні експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії даної послідовності, порівнюються із рівнями експресії, що спостерігаються в рослинних клітинах, трансформованих для експресії SEQ ID NO:55 і SEQ ID NO:57. Синтетична кодуюча область SEQ ID NO:59 була оптимізована для експресії в кукурудзі. Конструкція для застосування в експресії синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:59 зроблена шляхом об'єднання синтетичної кодуючої області SEQ ID NO:59 із 5'нетрансльованою областю, яка містить промотор, функціональний в рослинних клітинах, і 3'нетрансльованої області, яка містить термінатор транскрипції і послідовність поліаденілювання. 28