Нуклеотидна послідовність для генотерапії віл-інфікованих пацієнтів шляхом експресії мембрано-анкерованих gp41 пептидів

Винахід стосується генотерапії ВІЛ-інфікованих пацієнтів шляхом експресії мембрано-анкерованих др41 пептидів. Вперше стали доступні лікувальні вектори, які кодують злитий протеїн, що містить похідне др41 пептиду ВІЛ і карбокситермінальний трансмембранний анкер, що зв'язані за допомогою гнучкого лінкеру. Було запропоновано дуже велике різноманіття терапевтичних підходів до лікування ВІЛ інфекцій. Однак, одержані активні речовини мають досить низьку толерантність у багатьох пацієнтів. Постійно, для покращення лікування СНІДу, ведеться пошук нових місць впливу і активних речовин з різною токсичністю. В цьому контексті, були запропоновані різні підходи генотерапевтичного інгібування різних стадії реплікації ВІЛ [порівняй Sorg Т. & Methali, M. Transfus. Sci. 18, 277-289 (1977)]. Wild et al. [Wild, C.T. Shugars, D.C. Greenwell, Т.К. McDanal, C.B. & Matthews, T.J. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 91, 9770-9774 (1994)] запропонували терапевтичний підхід, що ґрунтується на спостереженні, що пептиди, які є похідними трансмембранного протеїну др41 [порівняй SEQ ID NO: 4 відповідний цифровий код , у відповідності з Стандартом WIPO ST. 25: 4] ВІЛ, такий як, наприклад, пептид Т-20, раніше відомий як DP178, може ефективно інгібувати злиття ВІЛ і проникнення в клітину. Т-20 є пептидом, який перекривається з Стермінальним повторюваним гептадом, одного з двох доменів [порівняй позиції 539-589 і 622-662 SEQ ID NO: 4] в ектодомені др41, і може ефективно інгібувати інфекцію ВІЛ in vitro [Weissenhborn, W., Dessen., A., Harrison, S.C. Skehel, J.J &Wiley, D.C. Nature 387, 426-430 (1997); Chan, D.C. Fass, D., Berger, J.M. & Kim, P.S. Ce//89. 263-273 (1997); Furuta, R.A., Wild, СТ., Weng Y & Weiss, CD. Nat. Struct. Biol. 5, 276-279 (1998)]. В контексті клінічних досліджень [Kilby, J.M., Hopkins S., Venetta, T.M. et al. Nat. Med. 4, 1302-1307 (1998)], у випадку короткострокового призначення Т-20 забезпечується безпечне і ефективне інгібування реплікації ВІЛ. Однак, для досягнення антивірусного ефекту необхідні досить великі кількості пептиду і, оскільки, пептид має досить погану біодоступність при оральному призначенні, досить малий час напіврозкладу, і його виробництво у великих об'ємах залишається досить дорогим, ціль винаходу полягає у вн утрішньоклітинній імунізації з використанням пептиду, який є похідним др41, шляхом генотерапії. Винахідники вперше клонували послідовності, що кодують Т-20 5' IRES-NEO-Cassette (IRES: Сайт внутрішньорібосомального проникнення; NEO: Ген стійкості до неоміцину) ретровірусного вектору MPIN [порівняй Фігура 1, Hildinger et al., Hum. Gene Ther. 9 (1998) 33-42]. Для стимулювання секреції Т-20, з одного боку, пептид експресується безпосередньо за сигнальним пептидом людського рецептору низькоспорідненого нереального фактору росту (LNGFR Fense et al., Human Gene Therapy 8 (1997) 1815) (Конструкти М85 і М86), і з іншого боку був вибраний конструкт, який містить кодуючи послідовності мембранотранслокаційного сигналу (mts) похідного фактору росту фібробласту Капосі (амінокислоти 43-58 в mts протеїні; Rojas, M., Donahue, J.P., Tan, Z., Lin, Y.Z. Nat Biotechnol. 16, 370-375 (1998)) у фреймі Т20 (порівняй конструкти М89 і М90 на Фігурі 1). Використовуючи ці конструкти, продукували ретровірусні вектори шляхом трансфекції клітин Phoenix [Grignani, F., Kinsella, Т., Mencarelli, A. et al., Cancer Res. 58, 14-19 (1998)], і надосадкову рідину використовували для інфікування клітин Т-хелперів лінії РМ-1 [Bou-Habib, D.C. et al., J. Virol. 68 6006-6013 (1994)]. В якості контролю використовували MPIN вектор, який містив ген стійкості до неоміцину, в якості чужорідного гену. Після відбору G418, культуральну масу інфікували ВІЛ-1, який одержували з провірусних клонів NL4-3 [Adachi, A., Gendelman H.E., Koenig, S., Folks, Т., Willey, R., Rabson, A. & Martin, M.A., J. Virol. 59 284-291 (1986)] або NL43/GFP [Welker, R., Harris, M., Cardel, B. & Krausslich, H.G. J., Virol. 72, 8833-8840 (1998)]. Ці два клони відрізняються наступним, у випадку NL4-3/GFP, замість nef протеїну експресуеться протеїн з зеленою флуоресценцією (GFP), так що реплікацію ВІЛ-1 можна аналізувати ви ходячи з продукування р24 антигену і/або шляхом проточної цитометрії. Всупереч усьому, в експресії Т-20 пептиду використовується згадані вище ретровірусні векторні конструкти, що, однак, не призводить до антивірусної активності будь якого типу. З використанням цих конструктів була клонована послідовність, що кодує, інтнегрін-зв'язуючий RGD пептид у фреймі з областю, що кодує Т-20. Продукування з використанням цих конструктів ґрунтувалось на припущені, що RGD основа може підтримувати секрецію пептидів на мембрані клітини. Однак, навіть з RGD, що секретує Т-20 пептид (порівняй Фігуру 1, М86), все ж спостерігалось відновлення ВІЛ-реплікації. В межах контексту представленого винаходу, неочікувано було встановлено, що продукування р24 і поширення NL43/GFP може значно зменшува тись, якщо експресується злитий протеїн, який на додаток до амінотермінального др41 пептиду, містить трансмембранний анкер приєднаний карбокситермінально через гнучкий лінкер. В цьому контексті, термін идр41 пептид" означає фрагмент др41 протеїну ВІЛ або його фрагмент, варіант або мутант. Наприклад, було встановлено, що продукування р24 можна зменшити більше ніж в десять в другій ступені раз, якщо РМ-1 перетворюється ретровірусним вектором, який експресує злитий протеїн, в якому Т-20 Стермінально через гнучкий пептидний лінкер з'єднаний з трансмембранним пептидом (мембрано закріпляючий домен, MSD) (порівняй Фігуру 1, М87), де злитий протеїн має послідовність показану на SEQ ID NO: 2. Об'єктом представленого винаходу є н уклеотидна послідовність загальної формули Послідовність, що кодує сигнальний пептид, є похідною людських неімунногенних протеїнів, що переважно вибирають з групи, що містить послідовності, які кодують сигнальні пептиди клітинно-мембранних протеїнів, таких як, наприклад, (людський) рецептор низькоспорідненого нереального фактору росту (LNGFR), рецептор інтерлейкіну-2 (IL-2R) і рецептору гранулоцитмакрофаг колонійстимулюючого фактору (GM-CSFR). В якості тренсмембранних анкерів мембранного протеїну типу-1 (тобто, мембранного протеїну, чий Nкінець розташований зовні і С-кінець розташований всередині клітини), використовуються протеїни, чиї цитоплазматичні домени будуть видалені, з одержання будь яких небажаних передач сигналу через протеїн. Виходячи з попередніх досліджень, це можна пояснити тим, що з експресованих областей не проявляється трансдукція сигналу, і вони не олігомеризують з іншими подібними мембранними протеїнами і таким чином опосередковано впливають на функції клітини. Переважно, розглядаються пептиди з групи, що містить трансмембранну область LNGFR або CD34. Нуклеотидна послідовність, переважно, містить як MSD нуклеотидну послідовність, що кодує ці трансмембранні анкери і/або нуклеотидну послідовність, що кодує фрагменти з видаленим цитоплазматичним доменом. Згідно з винаходом, можливе використання в якості гнучких лінкерів всіх гнучких пептидів, які здатні гнучко з'єднувати др41 пептид і трансмембранний анкер, таких як, наприклад, петля імуноглобуліну G (IgG), лінкер людського Р-глікопротеїну [С.А. Нгусупа et al., Biochemistry 37 13660-13673 (1998)], С-термінальний лінкер людського реплікаційного протеїну A [hsRPA; cf. D.M. Jacobs et al., J. Biomol. NMR14, 321-331 (1999)] і лінкер паратироїд гормон-залежного протеїну [М. Weidler et al. FEBS Lett. 444, 239-244 (1999)]. Лінкер, переважно, має довжину до 30 амінокислот. Таким чином, нуклеотидна послідовність приведеної вище формули згідно з винаходом містить область в нуклеотидній послідовності, що кодує такий лінкер, переважно, петлю IgG, що відповідає нуклеотидам 1636-1683 на SEQ ID NO: 1. Як вже згадувалось, FI кодує пептид (позначений як др41 пептид), який відповідає послідовності частини ВІЛ-др41 -протеїну (порівняй SEQ ID NO: 4, включаючи др41 протеїн ВІЛ квазівидів (плакований)), який вибирають з області, яка включає дві гептад повторювані області (порівняй позиції амінокислот 539-589 і 622662 в SEQ ID NO: 3 і 4). В цьому контексті "ВІЛ" включає всі типи ВІЛ, особливо ВІЛ-1. В цьому контексті, наприклад, очікується, що використання ВІЛ-2 др41 пептиду буде призводити до перехресної реактивності з ВІЛ-1 і навпаки. др41 Пептиди, що кодуються FI, переважно, мають мінімальну довжину в 28 амінокислот, так що FI включає принаймні 84 нуклеотида. В межах контексту представленого винаходу, зокрема, в якості FI використовується послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотну послідовність представлену в SEQ ID NO: 2 з позиції 31 до 66 (відповідає пептиду Т-20), переважно, послідовність представлена в SEQ ID NO: 1 для нуклеотидів з 1528 до 1635. Відповідно до особливого втілення, пептид, що кодується FI, має максимальну довжину 40 амінокислот, що відповідає максимальній довжині в 120 основ кодуючої області FI. Згідно з особливим втіленням, нуклеотидна послідовність загальної формули "SP-FI-Hinge-MSD" має послідовність приведену в SEQ ID NO: 1 з нуклеотидами з 1438 до 1773, які кодують злитий протеїн приведений в SEQ ID NO: 2. Наступним об'єктом винаходу є злитий протеїн, що кодується в кожному випадку за допомогою приведених вище векторів/нуклеотидних послідовностей, загальної формули NH2-sp-fi-hinge-msd-COOH, Що стосується визначень "sp", "fi", "hinge" і "msd", посилання стосуються приведених вище визначень елементів послідовності "SP", ТІ, "Hinge" і "MSD", де стр уктура і функціональні характеристики злитого протеїну і/або окремих часткових областей протеїну вже загадувались. Згідно з переважним втіленням, злитий протеїн має амінокислотну послідовність приведену в SEQ ID NO: 2. Злитий протеїн ("fi-hinge-msd") одержують шляхом відщіплення сигнального пептиду, що має послідовність приведену в SEQ ID NO: 2 з позиції 31 до позиції 111. Також в об'єм винаходу включені гомологи і/або варіанти і фрагменти згаданого вище злитого протеїну, які по суті мають ту ж саму фармакологічну і біологічну дію і/або імуногенність і нуклеотидні послідовності, що кодують ці гомологи і фрагменти. В цьому контексті, терміни "гомологи" і "варіанти" означають послідовності, які відрізняються від природних послідовностей або відомих на сьогоднішній день частин послідовностей, замінами, делеціями або вставками індивідуальних амінокислот. В цьому контексті, зокрема, включені гомологи, варіанти і фрагменти протеїну приведеного в SEQ ID NO: 2 і нуклеотидних послідовностей, що їх кодують. Винахід в подальшому стосується вектору, якій містить одну з приведених вище нуклеотидних послідовностей. Вектор, переважно, є ретровірусним вектором. Згідно з переважним втіленням винаходу, вектор має структур у приведену на Фігурі 1. Вектор-вставка загальної формули "SP-FI-Hinge-MSD", що кодує злитий протеїн згідно з винаходом, переважно, має нуклеотидну послідовність приведену в SEQ ID NO: 1. приклад згаданого вище вектору депонований в Німецьку колекцію мікроорганізмів і культур клітин [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Brunswick, Germany, 11.11.1999, під номером DSM 13139] згідно з Будапештською угодою. Згаданий вище вектор можна використати для in vitro трансфекування Т-лімфоцитів і кровотворних стволових клітин, після чого ці трансфековані клітини можна призначати ВІЛ-інфікованим пацієнтам для терапевтичного лікування. Вектори згідно з винаходом є особливо придатними для використання (тобто, для безпосереднього (in vivo) використання) при генотерапевтичному лікуванні ВІЛ-інфікованих пацієнтів, в цьому випадку переважними є вектори націлені на тропізм, тобто, особливо по відношенню до ВІЛ націлених клітин (CD4+ клітин). Винахід в подальшому стосується генотерапевтичного медикаменту, який містить згаданий вище вектор. Винахід пояснюється далі більш детально, з посиланням на приклади. Приклади Клітини і віруси HeLa-, 293- і Phoenix-Ampho клітини культивували в середовищі Дульбекко (Dulbecco's Medium) (Gibco, Paisley, Great Britain), яке доповнювали 10% ембріональної бичачої сироватки (FCS; Sigma, Deisenhofen, Germany). PM-1 культивували в RPMI з 10% FCS. Вірусні клони NL4-3/GFP, NL4-3env-GFP і pNL4-3 вже були описані вище. (NL4-3: Welker R., Harris, M., Cardel, В. & Krausslich, H.G. J. Virol. 72, 8833-8840 (1998); NL4-2envGFP: He, J. Chen, Y., Farzan, M., et al. Nature 385, 645-649) (1997)). Використовували псевдотипований envвільний клон NL4-3env-GFP, плазміди pSNJG, pSVIIIenvJRFL, pSVIIIen vYU2 і pSVIIIen vH XB2 (Welker, R., Harris, M., Cardel, B. & Krausslich, H.G. J. Virol. 72, 8833-8840 (1998); He, J. Chen, Y., Farzan, M., et al. Nature 385, 645649) (1997); von Laer, D., Thomson, S., Vogt, В., et al., J. Virol 72, 1424-1430(1998)). Ці плазміди містять VSV (вірус вазикулярного стоматиту) Г-кДНК або кДНК ВІЛ оболонки JR-FL, YU2 і НХВ2. Інфікуючи реплікаційно-відповідні віруси одержували шляхом трансфекування NL4-3 або NL4-3/GFP-DNA клітин HeLa. Псевдотиповані реплікаційно-невідповідні ВІЛ одержували шляхом спів-трансфекування pNL43env-GFP і одного з оболонко-экспресуемих плазмідів 293-клітин. Ретровірусні вектори вводили в Phoenix вмісні клітини, як описано вище [Grignani, F., Kinsella, Т., Mencarelli, A., et al., Cancer Res. 58, 14-19 (1998)]. Клонування ретровірусних векторів M85 і М86: Послідовність, що кодує сигнальний пептид людського рецептору низькоспорідненого нереального фактору росту (LNGFR) ампліфікували за допомогою іолімеразної ланцюгової реакції (PCR) починаючи з вектору dLN використовуючи іраймери SPNot+ (Послідовність ID NO: 5) і SPBgl2 (SEQ ID NO: 6), вставляючи Notl сайт эозщеплення в 5* кінець і Bglll сайт розщеплення в 3' кінець (dLN: Fehse et al., Human Gene Therapy 8 (1997) 1815). Послідовність, що кодує злиття-інгібуючий пептид ампліфікували NL4-3 використовуючи праймер T20Bgl+ (M85; SEQ ID NO: 7) або Т20ВдІ-RGD+ (М86; SEQ ID NO: 8) і T20Hind- (SEQ NO ID: 9), вставляючи Bglll сайт розщеплення в 5' кінець і Hindlll сайт розщеплення в 3' кінець. Фрагменти зшивали у вектор pBluescriptKS дигеруючи Notl і Hindlll. М87 і М88: Трансмембранний домен dLNGFR ампліфікували dLN використовуючи 5' праймер, який також містив hinge-область мишачого IgG важкого ланцюгу і Bglll сайт розщеплення (hingeTMBgl+; SEQ ID NO: 10), і З' праймер ретровірусного вектору dLN (U3-; послідовність ID NO: 11). Цей PCR продукт вставляли разом з сигнальним пептидом PCR продукту (SPNot+/SPBgl-) у вектор pBluescriptKS (після дигерування Notl і Hindlll), і послідовність Т20 (виходячи з NL4-3) надалі вставляли як PCR продукт, який містить фланкуючий Bglll сайт розщеплення (використовуючи PCR праймер T20Bgl+, що відповідає SEQ ID NO: 7 (дивіться вище) і T20Bgl-, що відповідає SEQ ID NO: 12). М89 і М90: Послідовність, що кодує Т20, з мембранотранслокаційний сигнал (mts) ампліфікували NL4-3 використовуючи праймер RGD-T20Not+ (M89; SEQ ID NO: 13) або T20Not+ (M90; SEQ ID NO: 14) і T20mtsHind(SEQ ID NO: 15). В 5' праймері присутній Notl сайт розщеплення і в 3' праймер містить Hindlll сайт розщеплення. Мембранотранслокаційний сигнал (mts) вводили в 3' праймер. Продукт вводили в вектор pBluescriptKS дигеруючи Notl і Hindlll. Гени, що кодують різні Т20-злиті протеїни переносили як Notl х Hindlll фрагменти разом з polio-IRES з SF1 MIN у вектор MP1N [Hildinger et al., Hum. Gene Ther. 9 (1998) 33-42]. Інфікування ВІЛ РМ-1-клітини (5x10 4в 0,5мл) інфікували від 3000 до 6000 TCID50 (50% доза інфікування культури тканини) реплікаційно-відповідного ВІЛ. Для аналізу р24, продукуючи середовище замінювали на 5 день, клітини інкубували протягом ночі, і досліджували вільні від клітин залишки використовуючи р24 ELISA, як описано вище [Konvalinka, J., Litterst, М.А., Welker, R., et al. J. Virol. 69, 7180-7186 (1995)]. Результати досліджень приведені на Фіг.2. Зараження NL4-3/GFP контролювали в моменти, що визначали виходячи з значень аналізу проточної цитомерії FACScalibur (Beckton Dickinson, Heidelberg, Germany). Для цієї цілі, РМ-1 (з і без векторів MP1N м М85-М87) інфікували 0,01 mоі (mоі: багаторазове інфікування; характеризується інфікуванням клітини рядом вірусних часточок) NL-4/GFP і аналізували за допомогою проточної цитометрії на 4, 7 і 10 день. Відсоток EGFP-позитивних і, таким чином, ВІЛ-інфікованих клітини показаний на Фіг. З по порядку різних культур. Визначений поріг становить приблизно 0,1% позитивних клітин. Визначення механізму дії Визначення стадії, на якій відбувається інгібування реплікації ВІЛ, "один цикл" інфікування проводили клоном NL4-3env-GFP. Клон NL4-3env-GFP, завдяки мутації в env-гені, є реплікаційно-дефектним і експресує GFP замість nef. Для одержання інфекційних віріонів, вектор псевдотипували з оболонками трьох різних ВІЛ клонів (НХВ, YU2 і JR-FL) і з G протеїном вірусу васкулярного стоматиту (VSV G). Н ХВ класифікували як Ттропічний, з використанням співрецептору CXCR4, в той час як YU2 і JR-FL є М-тропічними і використовують CCR-5. env-Гени згаданих останніх дво х клонів клонували безпосередньо з первинного ВІЛ ізоляту [Не, J., Chen, Y., Farzan, M. et al. Nature 385, 645-649 (1997)]. Ці ВІЛ псевдотипи здатні до "одного циклу" інфікування, що не поширюється на всю культур у. В РМ1/М87 клітинах (тобто, в клітинах, які трансфекуються вектором згідно з винаходом, що кодує мембрано-анкерований Т-20 злитий протеїн) інфікування інгібується більш сильно завдяки трьом різним ВІЛ оболонкам, з коефіцієнтом 15-30, ніж у випадку VSV-G псевдотипованих, в яких не спостерігається суттєве інгібування (порівняй Фігура 4). Тільки подібний вільному Т-20 пептиду [порівняй Wild СТ. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9770-9774], генетично експресований мембрано-анкерований Т-20 злитий протеїн також інгібує проникнення, що медіюється оболонками різних ВІЛ варіантів. Ці результати ясно показують, що вірусінгібуюча стадія проникнення вірусу медіюється ВІЛ-env, що дуже ймовірно є приводом для мембранного злиття. Всі стадії ВІЛреплікації не впливають на подальше проникнення вірусу. Ці дослідження показали, що мембрано-анкерований др41 пептид ефективно інгібує реплікацію ВІЛ, в той час як чистий др41 пептид є не ефективним.