Анти-roвo4-антитіло та його застосування

1. Анти-Robo4-антитіло, яке містить: (і) HVR-L1, що містить послідовність A1-A11 (RASQDVSTAVA) (SEQ ID NO:1) або послідовність SEQ ID NO:1, що містить 1-6 замін, вибраних з: A5 (S), A6 (I або G), A7 (A), A8 (S, R або I), A9 (Y або S) та A10 (L); (ii) HVR-L2, що містить послідовність B1-B7 (SASFLYS) (SEQ ID NO:2) або послідовність SEQ 2 (19) 1 3 тить послідовність GFTINGYYIH (SEQ ID NO:17), HVR-H2, що містить послідовність GFIYPAGGDTDYADSVKG (SEQ ID NO:18), і HVRH3, що містить послідовність ARLIGNKFGWSSYGMDY (SEQ ID NO:19). 5. Антитіло за п. 2 або 4, яке містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить HVR-L1, що містить SEQ ID NO:1, HVR-L2, що містить SEQ ID NO:2, HVR-L3, що містить SEQ ID NO:3, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить HVRH1, що містить SEQ ID NO:17, HVR-H2, що містить SEQ ID NO:18, і HVR-H3, що містить SEQ ID NO:19. 6. Антитіло за п. 3 або 4, яке містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить HVR-L1, що містить SEQ ID NO:1, HVR-L2, що містить SEQ ID NO:2, і HVR-L3, що містить SEQ ID NO:20; і варіабельний домен важкого ланцюга, що містить HVRH1, що містить SEQ ID NO:17, HVR-H2, що містить SEQ ID NO:18, і HVR-H3, що містить SEQ ID NO:19. 7. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, де антитіло містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: SEQ ID NO:72-97, показаних на фіг. 1А і 2А. 8. Антитіло за п. 1 або 4, де антитіло містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з: SEQ ID NO:140-154 та 156-165, показаних на фіг. 1B і 2B. 9. Антитіло за будь-яким з пп. 1-8, де антитіло є гуманізованим. 10. Антитіло за будь-яким з пп. 1-9, де антитіло вибране з групи, що складається з Fab, Fab’ і (Fab’)2. 11. Антитіло за будь-яким з пп. 1-10, яке додатково містить цитотоксичний засіб. 12. Антитіло за п. 11, де цитотоксичний засіб виб2’ 2’ раний із групи, що складається з: N -деацетил-N (3-меркапто-1-оксопропіл)майтансину (DM1), монометилауристатину E (MMAE), монометилауристатину F (MMAF) і їх комбінацій. 13. Антитіло за будь-яким з пп. 1-12, яке додатково містить детектовану мітку. 14. Антитіло за п. 13, де детектована мітка вибрана з групи, що складається з: біотину, флуоресцентного барвника, радіонукліда, хелатоутворювального засобу 1,4,7,10-тетраазациклододеканN,N',N",N'"-тетраоцтової кислоти (DOTA), мікропузирчика, емульсії перфторвуглецевих наночастинок, металевої частинки і їх комбінацій. 15. Антитіло за п. 13 або 14, де детектована мітка ковалентно приєднана до антитіла по залишку цистеїну. 16. Антитіло за п. 15, де залишок цистеїну знаходиться в положенні 118 Fc-області важкого ланцюга відповідно до EU-нумерації. 17. Антитіло за будь-яким з пп. 1-16, де антитіло є виділеним. 18. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-17 для одержання лікарського засобу для модуляції 96788 4 ангіогенезу, де вказана модуляція передбачає контактування клітини або тканини з ефективною кількістю антитіла. 19. Застосування за п. 18, в якому інгібується ангіогенез. 20. Застосування за п. 18 або 19, де ангіогенез асоційований з порушенням, вибраним із групи, що складається з: раку, атеросклерозу, ретролентальної фіброплазії, гемангіом, хронічного запалення, внутрішньоочних неоваскулярних захворювань, проліферативних ретинопатій, діабетичної ретинопатії, пов'язаної зі старінням дегенерації жовтої плями (AMD), неоваскулярної глаукоми, імунного відторгнення трансплантованої корнеальної тканини й інших тканин, ревматоїдного артриту, псоріазу і їх комбінацій. 21. Застосування за п. 20, де ангіогенез асоційований з раком. 22. Застосування за п. 21, де рак вибраний із групи, що складається з: плоскоклітинного раку, раку легені, раку очеревини, печінковоклітинного раку, раку ШКТ або раку шлунка, у тому числі шлунковокишкового раку, раку підшлункової залози, гліобластоми, раку шийки матки, раку яєчників, раку печінки, раку сечового міхура, раку сечових шляхів, гепатоми, раку молочної залози, раку ободової кишки, раку прямої кишки, раку ободової і прямої кишки, ендометріального раку або карциноми матки, карциноми слинних залоз, раку нирки або ниркового раку, раку передміхурової залози, раку вульви, раку щитовидної залози, раку печінки, анального раку, раку, що стосується статевого члена, меланоми, множинної мієломи і В-клітинної лімфоми, раку головного мозку, раку голови і шиї, остеогенної саркоми й ангіосаркоми і їх асоційованих метастазів і комбінацій. 23. Застосування за будь-яким з пп. 18-22, де клітина або тканина знаходиться в ссавці. 24. Застосування за п. 23, де ссавцем є людина. 25. Застосування за будь-яким з пп. 18-24, яке додатково передбачає контактування клітини з засобом, вибраним із групи, що складається з: протипухлинного засобу, хіміотерапевтичного засобу, інгібуючого ріст засобу, цитотоксичного засобу і їх комбінацій. 26. Застосування за п. 25, де засобом є антиVEGF-антитіло. 27. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-17 для одержання засобу для візуалізації in vivo у ссавця. 28. Застосування за п. 27, де ссавцем є людина. 29. Застосування за п. 27 або 28, де ссавець можливо має захворювання або порушення, вибране з групи, що складається з: раку, атеросклерозу, ретролентальної фіброплазії, гемангіом, хронічного запалення, внутрішньоочних неоваскулярних захворювань, проліферативних ретинопатій, діабетичної ретинопатії, пов'язаної зі старінням дегенерації жовтої плями (AMD), неоваскулярної глаукоми, імунного відторгнення трансплантованої корнеальної тканини, ревматоїдного артриту, псоріазу і їх комбінацій. 5 За даною заявкою запитується пріоритет відповідно до попередніх заявок на патент № 60/889214, поданої 9 лютого 2007 року, і 60/891475, поданої 23 лютого 2007 року, описи яких включені в даний опис як посилання в їх повному обсязі. Галузь, до якої належить винахід Даний винахід відноситься головним чином до галузей ангіогенезу і проліферації і міграції ендотеліальних клітин. Більш конкретно винахід стосується модуляторів Robo4 і застосування таких модуляторів. Рівень техніки Сімейством Roundabout рецепторів є молекули молекулярного орієнтування, що регулюють орієнтування аксонів, міграцію нейронів і хемотаксис лейкоцитів у відповідь на взаємодію з Slitбілками (Suchting et al., FASEB J. 19:121-123 (2005)). Молекули Roundabout-рецепторів містять п'ять доменів імуноглобуліну і три домени фібронектину в їх позаклітинній області. Magic Roundabout (тобто Robo4 або специфічна для ендотеліальних клітин молекула 4 (ESCSM4)) структурно відрізняється від інших членів сімейства Roundabout. Magic Roundabout (Robo4) людини містить два домени імуноглобуліну і домен головного комплексу гістосумісності (амінокислоти 46116 і 151-209), два домени типи III фібронектину (амінокислоти 252-335 і 347-432), трансмембранну область (468-490) і багату на пролін область (амінокислоти 715-772) (див. Huminiecki et al., Genomics 79(4):547-552 (2002) і Фіг. 1 у цій роботі). Robo4 миші і людини виявляють 75% ідентичність нуклеотидної послідовності (Huminiecki et al., вище (2002)). Аналіз експресії Robo4 показав, що експресія Robo4 є високо обмеженою, із сильною експресією в плаценті і пухлинах, що включає метастази пухлин головного мозку, сечового міхура й ободової кишки в печінку, де пухлинна експресія обмежена судинною мережею пухлини (Huminiecki et al., вище (2002)). Крім того, експресія Robo4 асоційована з ділянками активного ангіогенезу, але не детектується у нейронній тканині (Huminiecki, L. et al., вище (2002)). Як асоційований з мембраною рецептор з позаклітинними доменами, Robo4 є корисною мішенню для доставки цитотоксичних терапевтичних засобів для інгібування проліферації васкулярних ендотеліальних клітин під час ангіогенезу. Robo4 є також корисною мішенню для доставки детектованих маркерів до проліферуючих васкулярних ендотеліальних клітин. Кон'югати антитіл, націлені на Robo4 (також називаний ECSM4), також були описані як потенційні терапевтичні сполуки, коли цей кон'югат містить цитотоксин і потенційні діагностічні маркери, коли цей кон'югат містить детектовану мітку (див., наприклад, WO 2002036771). Застосування кон'югатів антитіло-лікарський засіб для локальної доставки цитотоксичних і цитостатичних засобів, тобто лікарських засобів для знищення або інгібування пухлинних клітин при лікуванні раку (Syrigos and Epenetos, Anticancer Res. 19:605-614 (1999); Niculescu-Duvaz and Springer, Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172 (1997); па 96788 6 тент США № 4975278), робить можливим націлену доставку лікарського засобу до пухлин і внутрішньоклітинне накопичення цих лікарських засобів. Були розроблені або знаходяться в процесі розробки кон'югати антитіло-лікарський засіб, що націлені на інші молекули. Наприклад, ZEVALIN (ібритумомаб тіуксетан, Biogen/Idec) є кон'югатом антитіло-радіоізотоп, що складається з мишачого моноклонального антитіла lgG1-каппа, спрямованого проти антигену CD20, що виявляється на поверхні нормальних і злоякісних В-лімфоцитів, і 111 90 радіоізотопу Іn або Y, зв'язаного лінкеромхелатором тіосечовиною (Wiseman et al., Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77 (2000); Wiseman et al., Blood 99(12):4336-42 (2002); Witzig et al., J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63 (2002); Witzig et al., J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69 (2002). Хоча ZEVALIN має активність проти В-клітинної неходжкінської лімфоми (NHL), його введення призводить до важких і пролонгованих цитопеній у більшості пацієнтів. MYLOTARG (гемтузумаб озогаміцин, Wyeth Pharmaceuticals), що складається з huCD33антитіла, зв'язаного з каліхеаміцином, був схвалений у 2000 році для лікування гострого мієлоїдного лейкозу за допомогою ін'єкції (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; патенти США №№ 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Кантузумаб мертансин (Immunogen, Inc.), що складається з антитіла hu242, зв'язаного через дисульфідний лінкер SPP з частиною майтансиноїдного лікарського засобу, DM1, розробляється для лікування типів раку, що експресують антиген CanAg, таких як рак ободової кишки, рак підшлункової залози, рак ШКТ і інші. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.), що складається з моноклонального антитіла проти специфічного для передміхурової залози мембранного антигену (PSMA), зв'язаного з частиною майтансиноїдного лікарського засобу, DM1, розробляється для потенційного лікування пухлин передміхурової залози. Ту ж саму частину майтансиноїдного лікарського засобу, DM1, зв'язували через недисульфідний нерозщеплюваний лінкер, SMCC, з мишачим моноклональним антитілом, ТА.1 (Chari et al., (1992) Cancer Research 52: 127-131). Повідомлялося, що цей кон'югат був у 200 разів менш сильним, ніж відповідний кон'югат з дисульфідним лінкером. Пептиди ауристатину, ауристатин Ε (АЕ) і монометилауристатин (ММАЕ), синтетичні аналоги доластатину, кон'югували з: (і) cBR96, химерним моноклональним антитілом, специфічним у відношенні Lewis Y на карциномах; (іі) сАС10, що є специфічним у відношенні CD30 на гематологічних злоякісних новоутвореннях (Klussman, et al., Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773 (2004); Doronina et al., Nature Biotechnology 21 (7):778-784 (2003); Francisco et al., Blood 102(4): 1458-1465 (2003); публікація патенту США № 2004/0018194; (Hi) анти-СD20-антитілами, такими як Rituxan( (ритуксимаб) (WO 04/032828), для лікування CD20-що експресують ракових захворювань і імунних порушень; (iv) анти-Ерh2-антитілами 2Н9 і анти-ІL-8антитілами для лікування раку ободової і прямої кишки (Mao, et al., Cancer Research 64(3):781-788 7 (2004)); (v) Е-селектин-антитілом (Bhaskar et al., Cancer Res. 63:6387-6394 (2003)); і (vi) іншими анти-СD30-антитілами (WO 03/043583). Монометилауристатин (ММАЕ) був також кон'югований з 2Н9, антитілом проти Eph2R, що є рецептором тирозинкінази типу 1 ТМ із близькою гомологією між мишою і людиною і надекспресується в клітинах раку ободової і прямої кишки (Mao et al., Cancer Res. 64:781-788 (2004)). Повідомлялося, що монометилауристатин MMAF, варіант ауристатину Ε (ММАЕ) з фенілаланіном на С-кінці (патенти США №>№ 5767237 і 6124431), є менш ефективним, ніж ММАЕ, але більш ефективним при кон'югації з моноклональними антитілами (Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, реферат № 623, представлений 28 березня 2004 року). Ауристатин F фенілендіамін (AFP); варіант із фенілаланіном ММАЕ зв'язували з антиCD70-mAb, 1F6, через С-кінець за допомогою фенілендіамінового спейсера (Law et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, реферат № 625, представлений 28 березня 2004 року). У даній галузі існує потреба в додаткових лікарських засобах для лікування захворювань і порушень, асоційованих з ангіогенезом, включаючи, наприклад, ангіогенез, що відхиляється від норми (аберантний), асоційований з типами раків, залежними від росту і проліферації судинної мережі ендотеліального походження. У даній галузі існує також потреба в додаткових націлених на ендотеліальні клітини кон'югатах анти-Robo4-антитілолікарський засіб для детектування і візуалізації росту і проліферації кровоносних судин, наприклад, у злоякісних пухлинах або очних порушеннях, підтримуваних або викликуваних надлишковою проліферацією кровоносних судин, а також у порушеннях або інших фізіологічних станах, при яких моніторинг росту кровоносних судин є корисним для розуміння або лікування цього фізіологічного стану. Даний винахід задовольняє вказані й інші потреби. Суть винаходу Даний винахід забезпечує антитіла, що специфічно зв'язуються з Robo4 (у тому числі, наприклад, з Robo4 примата і/або гризуна, наприклад, з Robo4 людини і/або миші), і діагностічні і терапевтичні способи з використанням таких антитіл. У деяких варіантах здійснення антитіла є гуманізованими або людськими. У деяких варіантах здійснення антитіло вибране з групи, що складається з: інтактного антитіла, варіанта антитіла і похідного антитіла, Fab, Fab', (Fab')2 і Fv. В одному варіанті здійснення винахід забезпечує анти-Robo4антитіло, що має афінність і специфічність у відношенні Robo4 людини і, необов'язково, мишачого Robo4, причому антитіло містить гіперваріабельні області (HVR), складається або власне кажучи складається з гіперваріабельних областей (HVR) послідовності варіабельного домену легкого ланцюга і важкого ланцюга, зображених на Фіг. 1А, 1B, 2А і 2В (SEQ ID NO:1-8, 17-71). В іншому варіанті здійснення винахід забезпечує анти-Robo4антитіло, що має афінність і специфічність у від 96788 8 ношенні Robo4 людини і, необов'язково, Robo4 миші, причому антитіло містить каркасні області (FR), складається або власне кажучи складається з каркасних областей (FR) послідовності варіабельного домену легкого ланцюга і важкого ланцюга, зображених на Фіг. 1А, 1B, 2А, 2В, 3A, 3B, 4А і 4В (SEQ ID NO:9-16, SEQ ID NO:12, де V замінений на М, і SEQ ID NO:99-139). В іншому варіанті здійснення винахід забезпечує анти-Robo4-антитіло, що має афінність і специфічність у відношенні Robo4 людини і, необов'язково, Robo4 миші, причому антитіло містить послідовності варіабельних доменів легкого ланцюга і важкого ланцюга або складається або власне кажучи складається з послідовностей варіабельних доменів легкому ланцюгу і важкому ланцюгу, зображених на Фіг. 1А і 1B (SEQ ID NO:72-97) і Фіг. 2А і 2В (SEQ ID NO:140-165). В одному варіанті здійснення винахід забезпечує анти-Robo4-антитіло, що містить: щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість послідовностей гіперваріабельних областей (HVR), вибраних із групи, що складається з: (і) HVR-L1, що містить послідовність А1-A11, де A1-A11 є RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:1) (іі) HVR-L2, що містить послідовність В1-В7, де В1-В7 є SASFLYS (SEQ ID NO:2) (ііі) HVR-L3, що містить послідовність С1-С9, де С1-С9 є QQSYTTPPT (SEQ ID NO:3) (iv) HVR-H1, що містить послідовність D1-D10, де D1-D10 є GFTINGYYIH (SEQ ID NO:17) (ν) HVR-H2, що містить послідовність Е1-Е18, де Е1-Е18 є GFIYPAGGDTDYADSVKG (SEQ ID NO:18) (vi) HVR-H3, що містить послідовність F1-F17, де F1-F17 є ARLIGNKFGWSSYGMDY(SEQ ID NO:19) і (vii) щонайменше одного варіантного HVR, де варіантний HVR містить інсерцію, делецію або заміну щонайменше одного амінокислотного залишку послідовності, зображеної в SEQ ID NO:1, 2, 3, 17, 18 чи 19. В іншому варіанті здійснення винахід забезпечує анти-Robo4-антитіло, що містить: щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять або шість послідовностей гіперваріабельних областей (HVR), вибраних із групи, що складається з: (і) HVR-L1, що містить послідовність А1-A11, де A1-A11 є RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:1) (іі) HVR-L2, що містить послідовність В1-В7, де В1-В7 є SASFLYS (SEQ ID NO:2) (iii) HVR-L3, що містить послідовність С1-С9, де С1-С9 є QQSYTTPPT (SEQ ID NO:3) (iv) HVR-H1, що містить послідовність D1-D10, де D1-D10 є GFTISGSWIH (SEQ ID NO:4) (ν) HVR-H2, що містить послідовність Е1-Е18, де Е1-Е18 є AVITPAGGYTYYADSVKG (SEQ ID NO:5) і (vi) HVR-H3, що містить послідовність F1-F16, де F1-F16 є SNRYSGQFVPAYAMDY (SEQ ID NO:6). В одному варіанті здійснення, HVR-L1 антитіла за винаходом містять послідовність SEQ ID NO:1. В одному варіанті здійснення, HVR-L2 антитіла за винаходом містять послідовність SEQ ID NO:2. В 9 одному варіанті здійснення, HVR-L3 антитіла за винаходом містять послідовність SEQ ID NO:3. В одному варіанті здійснення, HVR-H1 антитіла за винаходом містять послідовність SEQ ID NO:4. В одному варіанті здійснення, HVR-H2 антитіла за винаходом містять послідовність SEQ ID NO:5. В одному варіанті здійснення, HVR-H3 антитіла за винаходом містять послідовність SEQ ID NO:6. В одному варіанті здійснення, HVR-L1 містить RASQSISSYLA (SEQ ID NO:7) або RASQDGARSLA (SEQ ID NO:39) або RASQDGAIYLA (SEQ ID NO:40). В одному варіанті здійснення, HVR-L2 містить GASSRAS (SEQ ID NO:8) або SASFLAS (SEQ ID NO:41), чи SASLES (SEQ ID NO:42), або SATLAS (SEQ ID NO:43), або SASFLAS (SEQ ID NO:44), або SASNLAS (SEQ ID NO:45), або SASTLAS (SEQ ID NO:46). В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом, що містить вказані послідовності (у комбінації, як описано в даному документі), є гуманізованим антитілом або антитілом людини. В одному аспекті винахід забезпечує антитіло, що містить одну, дві, три, чотири, п'ять або шість HVR, де будь-яка HVR містить послідовність або складається або власне кажучи складається з послідовності, вибраної з групи, що складається з SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 і 8, і де SEQ ID NO:1 або 7 відповідає HVR-L1, SEQ ID NO:2 або 8 відповідає HVR-L2, SEQ ID NO:3 відповідає HVR-L3, SEQ ID NO:4 відповідає HVR-H1, SEQ ID NO:5 відповідає HVR-H2 і SEQ ID NO:6 відповідає HVRH3. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить HVR-L1, що містить SEQ ID NO:7, HVR-L2, що містить SEQ ID NO:2, HVR-L3, що містить SEQ ID NO:3, HVR-H1, що містить SEQ ID NO:4, HVR-H2, що містить SEQ ID NO:5, і HVR-H3, що містить SEQ ID NO:6. В іншому варіанті здійснення антитіло за винаходом містить HVR-L1, що містить SEQ ID NO:1, HVR-L2, що містить SEQ ID NO:8, HVR-L3, що містить SEQ ID NO:3, HVR-H1, що містить SEQ ID NO:4, HVR-H2, що містить SEQ ID NO:5, і HVR-H3, що містить SEQ ID NO.6. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить HVR-L1, що містить SEQ ID NO:1, HVR-L2, що містить SEQ ID NO:2, HVR-L3, що містить SEQ ID NO:3, HVR-H1, що містить SEQ ID NO:4, HVRH2, що містить SEQ ID NO:5, і HVR-H3, що містить SEQ ID NO:6. В іншому варіанті здійснення антитіло за винаходом містить HVR-L1, що містить SEQ ID NO:1, HVR-L2, що містить SEQ ID NO:2, HVRL3, що містить SEQ ID NO:20, HVR-H1, що містить SEQ ID NO:17, HVR-H2, що містить SEQ ID NO:18, і HVR-H3, що містить SEQ ID NO:19. Варіантні HVR в антитілі за винаходом можуть мати модифікації одного або декількох залишків у HVR. В одному варіанті здійснення варіант HVR-L1 містить SEQ ID NO:1, в якій А1-11 містить 1-6 (1, 2, 3, 4, 5 або 6) замін у будь-якій комбінації з наступних положень: А5 (S), А6 (І або G), А7 (А), А8 (S, R або І), А9 (Y або S) і А10 (L). В одному варіанті здійснення варіант HVR-L2 містить SEQ ID NO:2, в якій В1-7 містить 1-4 (1, 2, 3, 4, 5 або 6) замін у будь-якій комбінації з наступних положень: В1 (G), B3 (Т), В4 (S, L, N або Т), В5 (R, Ε або А), В6 (А або S) і В7 (Υ). В одному варіанті здійснення варі 96788 10 ант HVR-L3 містить SEQ ID NO:3, в якій С1-9 містить 1-6 (1, 2, 3, 4, 5 або 6) замін у будь-якій комбінації з наступних положень: C3 (Y, Р, Т, F або G), C4 (W, F, R або N), C5 (S, N, A, D, F, Н, V або G), C6 (Y, S, A, D, N, L, І, Μ, Υ або G), С7 (L, Η або Т) і С8 (L, F, А, М або S). В одному варіанті здійснення варіант HVR-H1 містить SEQ ID NO:4, в якій D1-10 містить 1-9 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або 9) замін у будьякій комбінації з наступних положень: D2 (Y), D3 (S), D4 (F або L), D5 (N, Т, Y, D або K), D6 (N або S), D7 (Υ, Ν або R), D8 (Y або A), D9 (М, F, L або N) і D10 (S, Ε або Q). В одному варіанті здійснення варіант HVR-H2 містить SEQ ID NO:5, в якій Е1-18 містить 1-10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10) замін у будь-якій комбінації з наступних положень: E1 (G або S), Е2 (F, G, І, Τ або R), Е4 (Υ або S), Е5 (G або S), Е6 (Τ, Υ або М), Е7 (D або L), Е8 (S), Е9 (D, S, Т, Н, K, А або V), E10 (І) і E11 (D, Ν, Α, Ε або І). В одному варіанті здійснення варіант HVR-H3 містить SEQ ID NO:6, в якій F1-18 містить 1-17 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17) замін у будь-якій комбінації з наступних положень: F2 (S), F3 (L, G, D, Μ або W), F4 (I, G, V або S), F5 (G, Υ або Ν), F6 (Ν, S або V), F7 (K, Υ, W або Μ), F8 (F, S, Ρ або делецію), F9 (G, A, S, Υ або делецію), F10 (W, R, Ρ, Ε, G або делецію), F11 (S, W, G, Η або делецію), F12 (S, W, Η або делецію), F13 (Υ, D, G, V або делецію), F14 (G або делецію), F15 (V або делецію), F16 (L або F), F17 (А) і F18 (V). Буква (букви) у дужках після будь-якого положення вказує ілюстративну заміну (тобто заміщення) амінокислоти або, де вказано, делецію амінокислоти. В одному варіанті здійснення, HVR-L1 містить послідовність SEQ ID NO:1; HVR-L2 містить SEQ ID NO:2; варіант HVR-L3 містить SEQ ID NO:3, в якій С4, С5, С6 і С6 є R, S, D і Н, відповідно; HVR-H1 містить SEQ ID NO:17; HVR-H2 містить SEQ ID NO:18; і HVR-H3 містить SEQ ID NO:19 або варіант HVR-H3, що містить SEQ ID NO:19. В одному варіанті здійснення цих антитіл антитіла додатково містять консенсусну послідовність каркасної області легкого ланцюга I людини. В одному варіанті здійснення положення 104 у каркасній області 4 легкого ланцюга (LC-FR4) (за нумерацією Кабата) є V. В одному варіанті здійснення положення 104 LC-FR4 є М. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіант HVR-H1 SEQ ID NO:4, пронумеровану D1-D10, в якій 1-6 замін вибрані з наступних замін: D2 (Y), D3 (S), D4 (F або L), D5 (S, Т, Y, D або K), D6 (N або S), D7 (S, N або R), D8 (W або A), D9 (М, F, L або N) і D10 (S, Ε або Q). В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіант HVR-H1, що містить SEQ ID NO:24, 25, 26, 27 або 28. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіант HVR-H2 SEQ ID NO:5, пронумеровану Е1-Е18, в якій 1-7 замін вибрані з наступних замін: Е1 (А або S), Е2 (V, G, І, Τ або R), Е4 (Т або S), Е5 (G або S), Е6 (Τ, Υ або М), Е7 (D або L), Е8 (S), Е9 (Y, S, Т, Н, K, А або V), E10 (І) і Е11 (Υ, Ν, Α, Ε або І). В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіант HVR-H2, що містить SEQ ID NO:29, 30, 31, 32 або 33. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіант HVR-H3, що містить 11 SEQ ID NO:6, пронумеровану F1-F16, в якій 1-15 замін вибрані з наступних замін: Fl (S, G, D, Μ або W), F2 (N, G, V або S), F3 (R, Υ або N), F4 (Y, S або V), F5 (S, Y, W або М), F6 (G, S, Ρ або делеція), F7 (Q, A, S, Υ або делеція), F8 (F, R, Р, Е, G або делеція), F9 (V, W, G, Η або делеція), F10 (Р, W, Η або делеція), F11 (A, D, G, V або делеція), F12 (Υ або делеція), F13 (А або V), F14 (L або F) і F15 (V). Відповідно до винаходу, амінокислотна заміна може включати амінокислотну делецію в даній послідовності. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіантний HVR-H3, що містить SEQ ID NO:34, 35, 36, 37 або 38. В одному варіанті вказаних антитіл каркасна консенсусна послідовність містить заміну в положенні 71, 73 і/або 78. У деяких варіантах антитіл положення 71 є А, 73 є Τ і/або 78 є А. В одному варіанті здійснення вказаних антитіл, антитіла додатково містять консенсусну послідовність каркаса важкого ланцюга підгрупи III людини. В одному аспекті винахід забезпечує антиRobo4-антитіло, що містить одну, дві, три, чотири, п'ять, шість або більше послідовностей HVR, зображених на Фіг. 1, 2, 3 і SEQ ID NO:1-8, 17-71. В одному варіанті здійснення винахід забезпечує гуманізоване анти-Robo4-антитіло. Гуманізоване анти-Robo4-антитіло за винаходом може містити одну або декілька послідовностей негіперваріабельної області (тобто каркаса) людини і/або консенсусу цієї області в його варіабельному домені важкого і/або легкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення одна або більше додаткових модифікацій присутні в цих послідовностях негіперваріабельної області людини і/або консенсусу цієї області. В одному варіанті здійснення варіабельний домен важкого ланцюга антитіла за винаходом містять консенсусну каркасну послідовність людини, що в одному варіанті є консенсусною каркасною послідовністю підгрупи III. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить консенсусну каркасну послідовність підгрупи III, модифіковану щонайменше в одному амінокислотному положенні. Наприклад, в одному варіанті здійснення варіантна консенсусна каркасна послідовність підгрупи III може містити заміну в одному або декількох положеннях 71, 73 і/або 78. В одному варіанті здійснення вказаною заміною є R71A, N73T і/або N78A і/або L78A, у будь-якій комбінації. В одному варіанті здійснення варіабельний домен легкого ланцюга антитіла за винаходом містять консенсусну каркасну послідовність людини, що в одному варіанті є консенсусною каркасною послідовністю підгрупи I. В одному варіанті здійснення консенсусна каркасна послідовність легкого ланцюга модифікована в одному або декількох положеннях. В одному варіанті здійснення консенсусна послідовність легкого ланцюга має в положенні 104 амінокислоту V. В одному варіанті здійснення консенсусна послідовність легкого ланцюга модифікована в положенні 104 відповідно до нумерації Кабата, де положення 104 є М. В одному аспекті винахід забезпечує антитіло, що містить 1-4 або усі з FR-послідовностей легкого ланцюга LC-FR1 (SEQ ID NO:9), LC-FR2 (SEQ ID NO:10), LC-FR3 (SEQ ID NO:11) і LC-FR4 (SEQ ID 96788 12 NO:12). В одному варіанті здійснення, LC-FR4 (SEQ ID NO:12) є варіантом, в якому положення 104 є М. В одному аспекті винахід забезпечує антитіло, що містить 1-4 чи усі з FR-послідовностей важкого ланцюга HC-FR1 (SEQ ID NO:13), HC-FR2 (SEQ ID NO:14), HC-FR3 (SEQ ID NO:15) і HC-FR4 (SEQ ID NO:16). В іншому варіанті здійснення винахід забезпечує терапевтичний засіб для застосування у суб'єкта-хазяїна, що індукує малу імуногенну реакцію або не індукує імуногенної реакції проти цього засобу у вказаного суб'єкта. Наприклад, в одному варіанті здійснення винахід забезпечує гуманізоване антитіло, що індукує або приблизно індукує реакцію людини проти мишачих антитіл (НАМА) на значно зниженому рівні у суб'єкта-хазяїна в порівнянні з мишачим антитілом, що виробляється проти Robo4 людини. В іншому прикладі винахід забезпечує гуманізоване антитіло, що індукує або приблизно індукує мінімальну реакцію людини проти мишачих антитіл або не індукує реакції людини проти мишачих антитіл (НАМА). В одному прикладі антитіло за винаходом індукує реакцію проти мишачого антитіла, що знаходиться на клінічно доступному рівні або нижче клінічно доступного рівня. Даний винахід забезпечує також антитіла, що містять модифікації в гібридних гіперваріабельних положеннях, описаних у даному документі нижче. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіантну консенсусну каркасину послідовність підгрупи людини, модифіковану в одному або декількох гібридних гіперваріабельних положеннях. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить варіантну консенсусну каркасну послідовність підгрупи III людини, модифіковану в одному або декількох положеннях 2635, 49-65, 95-102 і 94. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить варіантну консенсусну каркасну послідовність підгрупи каппа І людини, модифіковану в одному або декількох положеннях 24-34, 50-56 і 39-97. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить щонайменше частину каркасної послідовності (або всю каркасну послідовність) легкого ланцюга каппа людини. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить щонайменше частину каркасної консенсусної послідовності (або всю каркасну послідовність) каппа підгрупи І людини. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить каркасні послідовності, показані на Фіг. 3A і 3B. Антитіло за винаходом може містити будь-які придатні каркасні послідовності важкого ланцюга людини або їх консенсусні послідовності, за умови, що антитіло виявляє бажані біологічні характеристики (наприклад, бажану афінність зв'язування). В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить щонайменше частину каркасної послідовності (або всю каркасну послідовність) важкого ланцюга підгрупи III людини. В одному варіанті 13 здійснення антитіло за винаходом містить каркасні послідовності, показані на Фіг. 4А і 4В. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіабельний домен важкого і/або легкого ланцюга, що містить каркасну послідовність, зображену в SEQ ID NO:72-137 (Фіг. 1А, 1B, 2А, 2В, 3A, 3B, 4А і 4В). В одному аспекті антитіло за винаходом є гуманізованим анти-Robo4-антитілом, що зв'язує маркер васкулярних ендотеліальних клітин Robo4 людини. Наприклад, в одному варіанті здійснення антитіло за винаходом зв'язує Robo4 людини з величиною ІС50, що менше 1000 нМ, менше 500 нМ, менше 200 нМ, менше 100 нМ, менше 50 нМ, менше 30 нМ, менше 20 нМ, менше 10 нМ, менше 5 нМ, менше 3 нМ, менше 1 нМ, менше 0,1 нМабо 0,01 нМ. Порівняння здатностей інгібувати зв'язування ліганду з його рецептором може виконуватися відповідно до різних способів, відомих в даній галузі, у тому числі способами, описаними в розділі "Приклади" нижче. В одному аспекті антитіло за винаходом є анти-Robo4-антитілом, кон'югованим з цитотоксичною частиною молекули (кон'югат анти-Robo4антитіло-лікарський засіб, також називаний антиRobo4-ADC), де анти-Robo4-ADC інгібує Robo4зaлeжнy проліферацію клітин у клітині, що експресує Robo4. Експресуючі Robo4 клітини включають, але не обмежуються ними, ендотеліальні клітини, такі як васкулярні ендотеліальні клітини. Ілюстративні анти-Robo4-ADC описуються в даному документі. В одному варіанті здійснення анти-Robo4антитіло є гуманізованим. В одному варіанті здійснення анти-Robo4-антитіло є антитілом людини. В одному варіанті здійснення анти-Robo4-антитіло отримане мутагенезом і відбором з використанням фагового дисплею. В одному аспекті антитіло за винаходом є анти-Robo4-антитілом ADC, що інгібує Robo4залежну проліферацію клітин краще, ніж антиRobo4-антитіло порівняння, що не кон'юговане з цитотоксичним засобом. Наприклад, в одному варіанті здійснення анти-Robo4 ADC-антитіло за винаходом інгібує проліферацію клітин з величиною ІС50, що менше приблизно половини цієї величини для анти-Robo4-антитіла порівняння, що не кон'юговане з цитотоксичним засобом. В одному варіанті здійснення величина ІС50 ADC-антитіла за винаходом дорівнює приблизно 0,001, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3 або 0,4 величини ІС50 не-ADC-антитіла порівняння. Порівняння здатностей інгібувати проліферацію клітин може виконуватися відповідно до різних способів, відомими в даній галузі, у тому числі способами, описаними в розділі "Приклади" нижче. В одному варіанті здійснення, величини ІС50 визначають протягом діапазону концентрацій антитіла від приблизно 0,01 нМ до приблизно 100 нМ. В одному варіанті здійснення як гуманізоване антитіло, так і химерне антитіло є моновалентними. В одному варіанті здійснення як гуманізоване антитіло, так і химерне антитіло містять єдину Fabобласть, зв'язану з Fc-областю. В одному варіанті здійснення химерне антитіло спавнения містить послідовності варіабельного домену, зображені на Фіг. 7 (SEQ ID NO:9 і 10), зв'язані з Fc-областю 96788 14 людини. В одному варіанті здійснення Fc-область людини є Fc-областю IgG (наприклад, lgG1, 2, 3 або 4). В одному аспекті антитіло за винаходом містить Fc-область. В одному варіанті здійснення цією Fc-областю є lgG1, 2, 3 або 4. В одному варіанті здійснення, IgG є нативним IgG. В одному варіанті здійснення Fc-область виявляє збільшену антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC) відносно активності ADCC дикого типу нативного lgG1, 2, 3 або 4. В одному варіанті здійснення, IgG є Fc-область, змінена з нативного IgG таким чином, що змінена Fc-область виявляє збільшену активність ADCC відносно нативної Fc-області. В одному аспекті антитіло за винаходом є анти-Robo4-антитілом, кон'югованим з детектованою частиною молекули, такий як засіб візуалізації. В одному аспекті, антитіла за винаходом можуть бути кон'юговані з будь-якою частиною-міткою, що може бути приєднана ковалентно до антитіла через активовану частину молекули або реакційноздатну тіолову групу цистеїну (Singh et al., Anal. Biochem. 304: 147-15 (2002); Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL). Ця приєднана мітка може функціонувати для: (і) забезпечення детектованого сигналу; (іі) взаємодії з другою міткою для модифікації детектованого сигналу, забезпечуваного першою або другою міткою, наприклад, для утворення FRET (резонансний перенос енергії флуоресценції); (ііі) стабілізації взаємодій або збільшення афінності зв'язування, з антигеном або лігандом; (iv) впливу на рухливість, наприклад, електрофоретичну рухливість, або проникність у клітину, за допомогою заряду, гідрофобності, або формі інших фізичних параметрів, або (ν) забезпечення частини, що захоплює, для модуляції афінності лігандів, зв'язування антитіло/антиген, або комплексоутворення іонів. Мічені антитіла за винаходом додатково описані в даному документі. В одному варіанті здійснення детектованою міткою є водна нерозчинна частинка, що може бути детектована in vitro або in vivo. В одному варіанті здійснення цією часткою є магнітна мітка або металева мітка. Металеві частинки можуть детектуватися способами візуалізації з використанням магнітного резонансу (MRI), простежування окремих частинок або окремих молекул, імуногістохімії, частоти плазмонів з освітленням за методом темного поля (темнопольним освітленням) (в ультрамікроскопі), контрасту диференціальної інтерференції і відеопосилення, загального внутрішнього відображення і способу фототермальної інтерференції (РІС) (див., наприклад, PNAS USA 100(20): 113 50-11355 (2003); Sheetz et al., Nature 340:284288 (1989); Baschong et al., Histochemistry 83:409411 (1985); Slot and Geuze, Eur. J. Cell Biol. 38:8793 (1935); Frey and Frey, J. Struct. Biol. 127:94-100 (1999); Hainfeld and Powell, J. Histochem. Cytochem. 48:471-480 (2000); Schultz et al., PNAS USA 97:996-1001 (2000); Gelles et al., Nature 331:450-453 (1988); Sonnichsen et al., Appl Phys. 15 Lett. 77:2949-2951 (2000); Boyer et al., Science 297:1160-1163 (2002)). Складені з наночастинок засоби за винаходом можуть також включати, але не обмежуються ними, мікропузирчики (див. Ellegala et al., Circulation 108:336-341 (2003)), також називані акустично активними ліпосферами (AAL) (див. Tartis et al., Ultrasound Med. Biol. 32(11):177180 (2006)), суперпарамагнітні засоби, ліпосоми, емульсії перфторвуглецевих наночастинок (WO 2005104051) і дендримери (див. Caruthers et al., Methods in Molecular Medicine, 124:387-400 (2006) і цитовані в даному документі посилання, причому всі посилання включені в даний опис як посилання в їх повному обсязі). В одному аспекті винахід забезпечує антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність HVR-H1, HVR-H2 і/або HVR-H3, зображені на Фіг. 1B і 2В. В одному варіанті здійснення варіабельний домен містить послідовність HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 і/або HC-FR4, зображені на Фіг. 1B, 2В, 4А і 4В. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить послідовність СH1 і/або Fc. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність HVR-H1, HVR-H2 і/або HVR-H3, і HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 і/або HC-FR4, зображені на Фіг. 1B, 2В, 4А і 4В. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить послідовність HVR1-HC, HVR2НС і/або HVR3-HC, зображені на Фіг. 1B, 2В, 4Аі 4В, і послідовність СH1 і/або Fc. В одному аспекті винахід забезпечує антитіло, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить послідовність HVR1-LC, HVR2-LC і/або HVR3-LC, зображені на Фіг. 1А або 2А. В одному варіанті здійснення варіабельний домен містить послідовність FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC і/або FR4LC, зображені на Фіг. 3A i 3B. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом містить варіабельні домени легкого і важкого ланцюгів, описані в двох попередніх абзацах. В одному варіанті здійснення антитіло є моновалентним і містить Fc-область. В одному варіанті здійснення Fc-область містить щонайменше один виступ і щонайменше одну западину, причому присутність виступу і западини підсилює утворення комплексу між Fc-поліпептидом, що містить виступ, і Fc-поліпептидом, що містить западину, наприклад, як описано в WO 2005/063816. В одному варіанті здійснення Fc-область антитіла за винаходом містять перший і другий Fc-поліпептиди, причому перший і другий поліпептиди, кожний містить одну або декілька мутацій відносно Fcлюдини дикого типу. В одному варіанті здійснення мутацією западини є T366S, L368A і/або Y407V. В одному варіанті здійснення мутацією виступу є T366W. В одному варіанті здійснення перший поліпептид містить Fc-послідовність, зображену на Фіг. 13, а другий поліпептид містить Fcпослідовність, зображену на Фіг. 14. В одному варіанті здійснення винахід забезпечує способи модуляції одного або декількох аспектів Robo4-асоційованих ефектів (наприклад, активації Robo4, наступної передачі молекулярного 96788 16 сигналу (наприклад, фосфорилування активованої мітогеном протеїнкінази (МАРK), проліферації клітин, міграції клітин, виживаності клітин, морфогенезу й ангіогенезу клітин) введенням анти-Robo4антитіла суб'єкту (наприклад, суб'єкту-ссавцю, такому як людина). У деяких варіантах здійснення анти-Robo4-антитіло руйнує зв'язування ліганду з Robo4 (наприклад, зв'язуванням з послідовністю всередині позаклітинного домену Robo4 і інгібуванням за допомогою взаємодії вказаного зв'язаного домену з його партнером зв'язування (таким як молекула ліганду). В інших варіантах здійснення антитіло Robo4 зв'язується з послідовністю, що не знаходиться всередині сайту зв'язування ліганду Robo4, причому вказане зв'язування призводить до руйнування здатності Robo4 взаємодіяти з його партнером зв'язування. В одному варіанті здійснення винаходу, зв'язування антитіла з Robo4 інгібує Robo4асоційовану проліферацію ендотеліальних клітин. В іншому варіанті антитіла Robo4 за винаходом, зв'язування антитіла з Robo4 у клітині інгібує проліферацію, виживаність, розсіювання, морфогенез і/або рухливість у клітині. В іншому варіанті здійснення цією клітиною є ендотеліальна клітина, така як, без обмеження, васкулярна ендотеліальна клітина. В одному варіанті здійснення Robo4-антитіло за винаходом специфічно зв'язує щонайменше частину Robo4, показаного на Фіг. 5 (SEQ ID NO:138) або його варіанта. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом специфічно зв'язується всередині повнорозмірної амінокислотної послідовності Robo4, позбавленої лідерної послідовності (тобто позбавленої області, вказаної пунктирним підкреслюванням на Фіг. 5). В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом специфічно зв'язується всередині послідовності позаклітинного домену, показаного на Фіг. 5 (вказаного суцільним підкреслюванням на Фіг. 5). В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом специфічно зв'язує конформаційний епітоп, утворений частиною позаклітинних доменів або всіма позаклітинними доменами Robo4. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом специфічно зв'язує амінокислотну послідовність, що має щонайменше 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ідентичність або подібність послідовності з послідовністю, показаною на Фіг. 5 (SEQ ID NO:138). В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом специфічно зв'язує амінокислотну послідовність, що має щонайменше 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ідентичність або подібність послідовності з послідовністю повнорозмірної амінокислотної послідовності Robo4, позбавленої лідерної послідовності (тобто позбавленої області, вказаної пунктирним підкреслюванням на Фіг. 5). В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом специфічно зв'язує амінокислотну послідовність, що має щонайменше 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ідентичність або подібність з послідовністю позаклітинного домену Robo4 (області, вказаної суцільним підкреслюванням на Фіг. 5). В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом специфічно зв'язується з Robo4 перші 17 види тварини і не зв'язується специфічно з Robo4 інші види тварини. В одному варіанті здійснення першим видом тварини є людина і/або примат (наприклад, собакоподібна мавпа) і іншим видом тварини є представник сімейства щурячих (наприклад, щур), представник сімейства мишачих (наприклад, миша) і/або сімейства собачих. В одному варіанті здійснення першим видом тварини є людина. В одному варіанті здійснення першим видом тварини є примат, наприклад, собакоподібна мавпа. В одному варіанті здійснення другим видом тварини є представник сімейства мишачих, наприклад, миша. В одному варіанті здійснення другим видом тварини є представник сімейства собачих. В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом специфічно зв'язується з Robo4 щонайменше двох видів. В одному варіанті здійснення першим видом тварини є людина і/або примат (наприклад, собакоподібна мавпа), а другим видом тварини є представник сімейства мишачих (наприклад, миша). Антитіла за винаходом, що зв'язують більше одного виду, знаходять застосування в дослідженнях на тваринних моделях для терапевтичних або діагностічних цілей. В одному аспекті винахід забезпечує спосіб детектування Robo4 у сироватці ссавця, де концентрація Robo4 у сироватці, що є більш високою, ніж нормальні рівні Robo4, вказує на присутність ангіогенезу у ссавця. Відповідно до способу даного винаходу, детектоване або детектовано мічене анти-Robo4-антитіло за винаходом контактують із пробою сироватки тестованого ссавця, у тому числі, але не тільки, людини. Анти-Robo4-антитіло детектують безпосередньо з використанням детектованої мітки або опосередковано, наприклад, за допомогою контакту з детектовано міченим або детектованим вторинним антитілом. Концентрація (рівень) у сироватці анти-Robo4-антитіла в тестованому ссавці, що є більш високою, ніж концентрація анти-Robo4-антитіла в сироватці нормального ссавця, вказує на ангіогенез у тестованого ссавця. Нормальним ссавцем називають ссавця, про якого відомо, що він не зазнає ангіогенезу, або популяцію ссавців, що не зазнають ангіогенезу. В одному варіанті здійснення тестований ссавець і нормальний ссавець або популяція ссавців є ссавцями того самого виду, у тому числі, без обмеження, людини. Сироваткові рівні білка Robo4 були детектовані у пацієнтів-людей із запущеним недрібноклітинним раком легені (Gorn et al., Lung Cancer 49:71-76 (2005)). Сироваткові рівні антиRobo4-антитіла застосовні для діагностіки і прогнозу асоційованого з раком ангіогенезу. В одному аспекті винахід забезпечує композиції, що містять одне або декілька антитіл за винаходом і носій. В одному варіанті здійснення носій є фармацевтично прийнятним. В одному аспекті винахід забезпечує нуклеїнові кислоти, що кодують Robo4-антитіло за винаходом, вектори, що містять ці нуклеїнові кислоти, і клітини-хазяїни (наприклад, Е. coli або клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО)), що містять ці нуклеїнові кислоти або вектори, клітини, що містять нуклеїнову кислоту або вектор за винаходом. Векторможе бути вектором будь-якого типу, на 96788 18 приклад, рекомбінантним вектором, таким як експресуючий вектор. Можуть бути використані будьякі клітини з різноманіття клітин-хазяїнів. В одному варіанті здійснення клітина-хазяїн є прокаріотичною клітиною, наприклад, Е. coli. В одному варіанті здійснення клітина-хазяїн є еукаріотичною клітиною, наприклад, клітиною ссавця, такою як клітина яєчника китайського хом'ячка (СНО). В одному аспекті винахід забезпечує способи одержання анти-Robo4-антитіла. Наприклад, винахід забезпечує спосіб одержання Robo4антитіла, що передбачає експресію в придатній клітині-хазяїні рекомбінантного вектора за винаходом, що кодує вказане антитіло (або його фрагмент), і витягання вказаного антитіла. В одному аспекті винахід забезпечує виріб, що містить контейнер; і композицію, що міститься в цьому контейнері, де композиція містить одне або декілька анти-Robo4-антитіл за винаходом. В одному варіанті здійснення композиція містить нуклеїнову кислоту за винаходом. В одному варіанті здійснення композиція, що містить антитіло, додатково містить носій, який у деяких варіантах є фармацевтично прийнятним. В одному варіанті здійснення виріб за винаходом додатково містить інструкції для введення цієї композиції (наприклад, антитіла) суб'єкту. В одному аспекті винахід забезпечує набір, що містить перший контейнер, який містить композицію, що містить одне або декілька анти-Robo4антитіл за винаходом; і другий контейнер, що містить буфер. В одному варіанті здійснення буфер є фармацевтично прийнятним. В одному варіанті здійснення композиція, що містить антитіло, додатково містить носій, який у деяких варіантах здійснення є фармацевтично прийнятним. В одному варіанті здійснення набір додатково містить інструкції для введення композиції (наприклад, антитіла) суб'єкту. В одному аспекті винахід забезпечує Robo4антитіло за винаходом в приготуванні лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування захворювання, такого як рак, пухлина, клітинно-проліферативне захворювання, імунне (наприклад, аутоімунне) порушення і/або пов'язане з ангіогенезом порушення. В одному аспекті винахід забезпечує застосування нуклеїнової кислоти за винаходом в приготуванні лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування захворювання, такого як рак, пухлина, клітинно-проліферативне захворювання, імунне (наприклад, аутоімунне) порушення і/або пов'язане з ангіогенезом порушення. В одному аспекті винахід забезпечує застосування експресуючого вектора за винаходом в приготуванні лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування захворювання, такого як рак, пухлина, клітинно-проліферативне захворювання, імунне (наприклад, аутоімунне) порушення і/або пов'язане з ангіогенезом порушення. В одному аспекті винахід забезпечує застосування клітини-хазяїна за винаходом в приготуванні лікарського засобу для терапевтичного і/або про 19 філактичного лікування захворювання, такого як рак, пухлина, клітинно-проліферативне захворювання, імунне (наприклад, аутоімунне) порушення і/або пов'язане з ангіогенезом порушення. В одному аспекті винахід забезпечує застосування виробу за винаходом в приготуванні лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування захворювання, такого як рак, пухлина, клітинно-проліферативне захворювання, імунне (наприклад, аутоімунне) порушення і/або пов'язане з ангіогенезом порушення. В одному аспекті винахід забезпечує застосування набору за винаходом в приготуванні лікарського засобу для терапевтичного і/або профілактичного лікування захворювання, такого як рак, пухлина, клітинно-проліферативне захворювання, імунне (наприклад, аутоімунне) порушення і/або пов'язане з ангіогенезом порушення. Даний винахід забезпечує способи і композиції, застосовні для модуляції патологічних станів, асоційованих з порушеною регуляцією системи передачі сигналу Robo4. Шлях передачі сигналу Robo4 задіяний у множину біологічних і фізіологічних функцій, що включають, наприклад, проліферацію клітин і ангіогенез. Таким чином, в одному аспекті винахід забезпечує спосіб, що передбачає введення суб'єкту антитіла за винаходом. В одному аспекті винахід забезпечує спосіб інгібування Robo4-активованої проліферації клітин, що передбачає контактування клітини або тканини з ефективною кількістю антитіла за винаходом, за допомогою чого проліферація клітин, асоційована з активацією Robo4, інгібується. В одному аспекті винахід забезпечує спосіб лікування патологічного стану, асоційованого з порушенням регуляції активації Robo4 у суб'єкта, що передбачає введення суб'єкту ефективної кількості антитіла за винаходом, за допомогою чого вказаний стан піддається лікуванню. В одному аспекті винахід забезпечує спосіб інгібування росту клітин, що експресують Robo4, що передбачає контактування вказаної клітини з антитілом за винаходом або кон'югатом антитілолікарський засіб за винаходом, за допомогою чого викликається інгібування росту вказаної клітини. В одному аспекті винахід забезпечує спосіб терапевтичного лікування ссавця, що має ракову пухлину, яка містить клітину, що експресує Robo4, що передбачає введення вказаному ссавцю ефективної кількості антитіла за винаходом або кон'югату антитіло-лікарський засіб за винаходом, за допомогою чого вказаний ссавець піддається ефективному лікуванню. В одному аспекті винахід забезпечує спосіб лікування або профілактики клітиннопроліферативного порушення, асоційованого зі збільшеною експресією або активністю Robo4, що передбачає введення суб'єкту, що потребує такого лікування, ефективної кількості антитіла за винаходом або кон'югату антитіло-лікарський засіб за винаходом, за допомогою чого вказане клітиннопроліферативне порушення піддається ефективному лікуванню або профілактиці. В одному варіанті здійснення вказаним проліферативним порушенням є патологічний стан, асоційований з 96788 20 небажаною проліферацією ендотеліальних клітин або такою, що відхиляється від норми, такою як небажана проліферація васкулярних клітин або така, що відхиляється від норми, у порушеннях, що включають, але не обмежуваних ними, рак, ангіогенез і порушення, асоційовані (наприклад, збільшені проліферацією ендотеліальних клітин у тканині, підданій порушенню) із солідними пухлинами і метастазуванням, атеросклероз, ретролентальну фіброплазію, гемангіоми, хронічне запалення, внутрішньоочні неоваскулярні захворювання, такі як проліферативні ретинопатії, наприклад, діабетична ретинопатія, пов'язана зі старінням дегенерація жовтої плями (AMD), неоваскулярну глаукому, імунне відторгнення трансплантованої корнеальної тканини й інших тканин, ревматоїдний артрит і псоріаз. В іншому аспекті винахід забезпечує спосіб терапевтичного лікування пухлини у ссавця, де ріст вказаної пухлини щонайменше частково залежить від потенціюючої ріст дії Robo4, експресованого в ендотеліальних клітинах, у тому числі, без обмеження, васкулярних ендотеліальних клітинах, де спосіб передбачає контактування вказаної клітини з ефективною кількістю антитіла за винаходом або кон'югату антитіло-лікарський засіб за винаходом, з інгібуванням за допомогою росту ендотеліальних клітин, наприклад, в ангіогенезі, асоційованому з пухлиною, і ефективним лікуванням за допомогою цього вказаної пухлини. Ще в одному варіанті здійснення винахід забезпечує способи модуляції ангіогенезу контактуванням клітини або тканини з ефективною кількістю описаного в даному документі анти-Robo4антитіла. У деяких варіантах здійснення антитіло додатково містить цитотоксичний засіб. У деяких варіантах здійснення ангіогенез інгібується. У деяких варіантах здійснення ангіогенез асоційований з порушенням, вибраним з: раку, атеросклерозу, ретролентальної фіброплазії, гемангіом, хронічного запалення, внутрішньоочних неоваскулярних захворювань, проліферативних ретинопатій, діабетичної ретинопатії, пов'язаної зі старінням дегенерації жовтої плями (AMD), неоваскулярної глаукоми, імунного відторгнення трансплантованої корнеальної тканини й інших тканин, ревматоїдного артриту, псоріазу і їх комбінацій. У деяких варіантах здійснення ангіогенез асоційований з раком. У деяких варіантах здійснення рак вибраний із групи, що складається з: сарком, у тому числі остеогенних сарком і ангіосарком, плоскоклітинного раку, шлункового раку або раку ШКТ, у тому числі шлунково-кишкового раку, раку підшлункової залози, гліобластоми, раку шийки матки, раку яєчників, раку печінки, рак сечового міхура, раку сечових шляхів, гепатоми, раку молочної залози, раку ободової кишки, раку прямої кишки, раку прямої й ободової кишки, ендометріального раку або карциноми матки, карциноми слинних залоз, раку нирки або ниркового раку, раку передміхурової залози, раку вульви, раку щитоподібної залози, раку печінки, анального раку, раку, що стосується статевого члена, меланоми, множинної мієломи і В-клітинної лімфоми, раку головного мозку, раку голови і шиї і їх асоційованих метастазів і комбіна 21 цій. У деяких варіантах здійснення клітина або тканина знаходиться у ссавця. У деяких варіантах здійснення ссавцем є людина. У деяких варіантах здійснення способи додатково включають контактування клітини з засобом, вибраним з: протипухлинного засобу, хіміотерапевтичного засобу, інгібуючого ріст засобу, цитотоксичного засобу, засобу проти ангіогенезу і їх комбінацій. У деяких варіантах здійснення засобом є анти-VeGFантитіло. У деяких варіантах здійснення способи додатково включають контактування цієї клітини з другим, третім або четвертим засобом, вибраним з: протипухлинного засобу, хіміотерапевтичного засобу, інгібуючого ріст засобу, цитотоксичного засобу, анти-ангіогенного засобу і їх комбінацій. У деяких варіантах здійснення другим, третім або четвертим засобом є анти-VeGF-антитілo. Способи за винаходом можуть бути використані для дії на будь-який патологічний стан, наприклад, на клітини і/або тканини, асоційовані з підвищувальною регуляцією експресії Robo4. В одному варіанті здійснення клітиною, що є мішенню винаходу, є ендотеліальна клітина або васкулярна ендотеліальна клітина, проліферуюча в пухлині (у тому числі, наприклад, у випадку раку молочної залози, раку прямої й ободової кишки, раку легені, папілярної карциноми (наприклад, щитоподібної залози), раку ободової кишки, раку підшлункової залози, раку яєчника, раку шийки матки, раку центральної нервової системи, остеогенної саркоми, раку нирки, гепатоцелюлярного (печінково-клітинного) раку, раку сечового міхура, раку ШКТ, плоскоклітинного раку голови і шиї, меланоми і лейкозу або сарком (наприклад, остеогенної саркоми або ангіосаркоми) або будь-якого раку, ріст якого підтримується проліферацією ендотеліальних клітин в ангіогенезі). В одному варіанті здійснення патологічні стани асоційовані з проліферацією ендотеліальних клітин, що відхиляється від норми або небажана. У деяких варіантах здійснення мішень анти-Robo4-антитіла або кон'югату антитіло-лікарський засіб, включає проліферацію васкулярних клітин, що відхиляється від норми або небажана, при порушеннях, що включають, але не обмежуваних ними, рак (у тому числі, наприклад, солідні пухлини і метастазування), атеросклероз, ретролентальну фіброплазію, гемангіоми, хронічне запалення, внутрішньоочні неоваскулярні захворювання, такі як проліферативні ретинопатії, наприклад, діабетичну ретинопатію, пов'язану зі старінням дегенерацію жовтої плями (AMD), неоваскулярну глаукому, імунне відторгнення трансплантованої корнеальної тканини й інших тканин, ревматоїдний артрит, псоріаз і порушення, асоційовані з ангіогенезом (що включають, наприклад, порушення, посилювані проліферацією ендотеліальних клітин у тканині, підданій порушенню). Способи за винаходом можуть, крім того, включати додаткові стадії лікування. Наприклад, в одному варіанті здійснення спосіб додатково передбачає стадію, в якій клітину-мішень і/або тканину-мішень (наприклад, ракову клітину) піддають променевій терапії або дії хіміотерапевтичного засобу. 96788 22 В одному варіанті способів за винаходом клітиною, що є мішенню винаходу (наприклад, ендотеліальною клітиною пухлинної тканини або ретини), є клітина, в якій експресія Robo4 підвищена в порівнянні з ендотеліальною клітиною в нормальній тканині того ж походження. В одному варіанті здійснення спосіб за винаходом викликає загибель клітини-мішені. Наприклад, контакт з анти-Robo4антитілом за винаходом, у тому числі контакт із кон'югатом антитіло-лікарський засіб, призводить до поглинання цитотоксичною частини молекули, що викликає загибель клітини. Альтернативно, контакт з анти-Robo4-антитілом за винаходом, кон'югованим з цитотоксичною сполукою, може призводити до інтерналізації цієї цитотоксичної сполуки, що призводить до загибелі клітини. В іншому альтернативному варіанті здійснення контакт з анти-Robo4-антитілом за винаходом, кон'югованим з детектованою частиною молекули, дозволяє детектувати ендотеліальні клітини, наприклад, судинну мережу тканини (наприклад, пухлинної тканини або ретини), наприклад, з використанням способів візуалізації, добре відомих у релевантній галузі. Інший варіант винаходу забезпечує способи візуалізації in vivo введенням анти-Robo4-антитіла, описаного в даному документі, ссавцю. У деяких варіантах здійснення ссавцем є людина. У деяких варіантах здійснення в ссавця підозрюють наявність захворювання або порушення, вибраного з: раку, атеросклерозу, ретролентальної фіброплазії, гемангіом, хронічного запалення, внутрішньоочних неоваскулярних захворювань, проліферативних ретинопатій, діабетичної ретинопатії, пов'язаної зі старінням дегенерації жовтої плями (AMD), неоваскулярної глаукоми, імунного відторгнення трансплантованої корнеальної тканини, ревматоїдного артриту, псоріазу і їх комбінацій. Інший варіант здійснення винаходу забезпечує способи детектування клітини, що експресує Robo4, контактуванням клітини з описаним у даному документі анти-Robo4-антитілом. У деяких варіантах здійснення клітиною є васкулярна ендотеліальна клітина. У деяких варіантах здійснення клітина знаходиться у ссавці. У деяких варіантах здійснення, у ссавця підозрюють наявність захворювання або порушення, вибраного з: раку, атеросклерозу, ретролентальної фіброплазії, гемангіом, хронічного запалення, внутрішньоочних неоваскулярних захворювань, проліферативних ретинопатій, діабетичної ретинопатії, пов'язаної зі старінням дегенерації жовтої плями (AMD), неоваскулярної глаукоми, імунного відторгнення трансплантованої корнеальної тканини, ревматоїдного артриту, псоріазу і їх комбінацій. У деяких варіантах здійснення, у ссавця підозрюють наявність раку, вибраного з плоскоклітинного раку, раку легені, раку очеревини, печінково-клітинного раку, шлункового раку або раку ШКТ, у тому числі шлунково-кишкового раку, раку підшлункової залози, гліобластоми, раку шийки матки, раку яєчників, раку печінки, раку сечового міхура, раку сечових шляхів, гепатоми, раку молочної залози, раку ободової кишки, раку прямої кишки, раку ободової і прямої кишки, ендометріального раку або карци 23 номи матки, карциноми слинних залоз, раку нирки або ниркового раку, раку передміхурової залози, раку вульви, раку щитоподібної залози, раку печінки, анального раку, раку, що стосується статевого члена, меланоми, множинної мієломи і В-клітинної лімфоми, раку головного мозку, раку голови і шиї і їх асоційованих метастазів і комбінацій. Короткий опис фігур Фіг. 1А і 1B зображують зіставлення амінокислотних послідовностей варіабельних областей легкого і важкого ланцюгів для різних клонів антиRobo4 за винаходом (Фіг. 1А і 1B, відповідно). Гіперваріабельні області (HVR) легкого і важкого ланцюгів вказані під поміщеними в бокси визначаючими комплементарність областями (CDR). На Фіг. 1А, HVR-L1, L2 і L3 легкого ланцюга є положеннями Кабата 24-34, 50-56 і 89-102, відповідно. На Фіг. 1B, HVR-H1, Н2 і H3 важкого ланцюга є положеннями Кабата 26-35, 49-65 і 93-102, відповідно. Клони одержували з використанням фагового дисплею, як описано в прикладах, і секвенували. Фіг. 2А і 2В зображують амінокислотні послідовності варіабельних областей легкого і важкого ланцюгів (Фіг. 2А і 2В, відповідно) вибраних антитіл з дозрілою афінністю з бібліотек індивідуально рандомізованих HVR. HVR на Фіг. 2А і 2В знаходяться в тих самих положеннях, що зображені на Фіг. 1А і 1B. Фіг. 3A, 3B, 4А і 4В зображують зразкові акцепторні консенсусні каркасні послідовності людини для застосування на практиці даного винаходу, з наступними ідентифікаторами послідовностей: Консенсусні каркасні області варіабельного домену легкого ланцюга (VL) мінус HVR Кабата (Фіг. 3A і 3B) консенсусні каркаси 1-4 VL каппа підгрупи І людини (SEQ ID NO:9, 10, 99, 100) консенсусні каркаси 1-4 VL каппа підгрупи I' людини (SEQ ID NO:9, 101, 99, 100) консенсусні каркаси 1-4 VL каппа підгрупи II людини (SEQ ID NO:102, 103, 104, 100) консенсусні каркаси 1-4 VL каппа підгрупи III людини (SEQ ID NO:105, 106, 107, 100) консенсусні каркаси 1-4 VL каппа підгрупи IV людини (SEQ ID NO:108, 109, 110, 100) Положення HVR L1, L2 і L3 Кабата в цих каркасних послідовностях зображені в затінених боксах. Консенсусні каркасні області варіабельного домену важкого ланцюга (VH) мінус HVR кабата (Фіг. 4А і В) консенсусні каркаси 1-4 VH підгрупи І людини мінус HVR Кабата (підгрупа ІА, SEQ ID NO:111, 112, 113, 16) і (підгрупа IB, SEQ ID NO:114, 115, 113, 16) консенсусні каркаси 1-4 VH підгрупи І людини мінус подовжені HVR (підгрупа IС, SEQ ID NO:114, 115, 116, 16) і (підгрупа ID, SEQ ID NO:114, 115, 117, 16) консенсусні каркаси 1-4 VH підгрупи II людини мінус HVR Кабата (підгрупа IIА, SEQ ID NO:118, 119, 120, 16), (підгрупа IIВ, SEQ ID NO:121, 122, 120, 16) 96788 24 консенсусні каркаси 1-4 VH підгрупи II людини мінус подовжені HVR (підгрупа IIС, SEQ ID NO:121, 122, 123, 16), (підгрупа IID, SEQ ID NO:121, 122, 124, 16) консенсусні каркаси 1-4 VH підгрупи III людини мінус HVR Кабата (підгрупа IIΘΑ, SEQ ID NO:125, 126, 127, 16), (підгрупа IIІВ, SEQ ID NO:128, 129, 127, 16) консенсусні каркаси 1-4 VH підгрупи III людини мінус подовжені HVR (підгрупа IIІС, SEQ ID NO:128, 129, 130, 16), (підгрупа IIID, SEQ ID NO:128, 129, 131,16) каркаси 1-4 VH акцептора 1 людини мінус HVR Кабата (підгрупа акцептора ІА, SEQ ID NO:132, 126, 133, 16) і (підгрупа акцептора 1B, SEQ ID NO:128, 129, 133, 16) каркаси 1-4 VH акцептора 1 людини мінус подовжені HVR (підгрупа акцептора 1С, SEQ ID NO:128, 129, 134, 16) каркаси 1-4 VH акцептора 2 людини мінус HVR Кабата (підгрупа акцептора 2А, SEQ ID NO:132, 126, 135, 16) і (підгрупа акцептора 2В, SEQ ID NO:128, 129, 135, 16) каркаси 1-4 VH акцептора 2 людини мінус подовжені HVR (підгрупа акцептора 2С, SEQ ID NO:128, 129, 136, 16) і (підгрупа акцептора 2D, SEQ ID NO:128, 129, 137, 16). Фіг. 5А зображує повнорозмірну амінокислотну послідовність поліпептиду Robo4. Потенційна сигнальна послідовність вказана пунктирним підкресленням. Частина позаклітинного домену вказана безупинним підкресленням. Фіг. 5В зображує послідовність фрагмента His-міченого розчинного позаклітинного домену Robo4 (SEQ ID NO:171), використаного, наприклад, в описаних у даному документі експериментах з використанням фагового дисплею анти-Robo4 Fab. Позаклітинний домен Robo4 зв'язували з гістидиновою міткою для полегшення витягання або детектування. Фіг. 6А зображує повнорозмірну послідовність важкого ланцюга анти-Robo4-антитіла YW71.22 (SEQ ID NO:169). Аланін, показаний жирним шрифтом і підкреслений, є положенням, в якому цистеїн був замінений для генерування thioMAb. Фіг. 6В зображує повнорозмірну послідовність легкого ланцюга анти-Robo4-антитіла YW71.22 (SEQ ID NO:170). Фіг. 7 зображує амінокислотну послідовність позаклітинного домену мишачого Robo4, що містить потенційну сигнальну послідовність і має гістидїнову мітку RRA(H)5, приєднану в положенні Н232 (SEQ ID NO:172). Пунктирна лінія, що підкреслює, вказує потенційну сигнальну послідовність, що відщеплюється під час експресії в клітинах ссавців. Фіг. 8 є діаграмою у виді стовпців результатів аналізу міграції HUVEC з використанням конструкцій Robo4. Фіг. 9 показує результати аналізу ВіаCore, що показують, що Robo4 не зв'язує Slit2. Фіг. 10 показує результати аналізу ВіаCore, що показують, що Robo4 взаємодіє з UNC5B. Фіг. 11 є фотографією ISH-аналізу, що показує, що Robo4 експресується в ендотелії фетальної миші. 25 Фіг. 12А і 12В показують експресію Robo4 у моделі мишачої пухлини ксенотранспланту раку ободової кишки НМ-7 людини. Фіг. 12С і 12D показують експресію Robo4 у моделі мишачої пухлини трансплантата раку молочної залози MDA-MB-175 людини. Фіг. 13A-D показують експресію Robo4 у злоякісній меланомі людини. Фіг. 14A-D показують експресію Robo4 у дрібноклітинному раку легені. Фіг. 14Е-Н показують експресію Robo4 у раку ободової кишки. Фіг. 15А-15С зображують інтерналізацію антиRobo4-антитіла 71.22 клітинами MS1 миші (Фіг. 15А і 15В) і інтерналізацію афінно зрілого антиRobo4-антитіла 71.22.S1.16 клітинами MS1 миші (Фіг. 15С). Фіг. 16 є діаграмою у виді стовпців, що показує результати аналізу міграції ендотеліальних клітин. Анти-Robo4-антитіло не блокує індуковану VEGF міграцію EC. Фіг. 17 є графіком змін медіанного обсягу пухлини як функції часу в моделях мишачих ксенотрансплантатів, яким вводили контроль, антиVEGF, анти-Robo4 (YW71.22) і анти-Robo4антитіло плюс анти-VEGF-антитіло. Голе Robo4антитіло не інгібувало ріст пухлин у цих експериментах. Фіг. 18А і 18В показують результати ГрафікРАС8-графіків, що показують, що афінно зрілі клони анти-Robo4-антитіл 71.22.S1.16 і 71.22.S1.21 зв'язують Robo4, ендогенно експресований на клітинах HUVEC. Фіг. 18С і 18D показують результати FACS-графіків, що показують, що ті ж самі афінно зрілі клони анти-Robo4-антитіл зв'язують мишачий Robo4, ендогенно експресований на клітинах MS1 миші. Ці графіки показують також, що вихідне антитіло, 71.22, також перехресно взаємодіє з Robo4 людини і миші. Фіг. 19А і 19В показують, що анти-Robo4антитіло 71.22 асоціюється із судинною мережею після ін'єкції мишей, як описано в прикладі 12. Фіг. 20А і 20В зображують результати аналізу відростання на гранулах, що показують, що антиRobo4-антитіло 71.22 інгібує подовження (елонгацію) трубок HUVEC. Фіг. 20А показує, що як загальна кількість, так і довжина трубок зменшуються після обробки HUVEC 71.22 у порівнянні з обробкою стороннім контрольним антитілом (антиамброзія, Е25). Анти-VEGF використовували як позитивний контрольний антитіла. Фіг. 20В показує ілюстративні приклади з концентрованими колами, намальованими при 100, 200 і 300 мкм. Докладний опис винаходу І. Вступ Даний винахід забезпечує композиції, що зв'язують Robo4 або його частину, набори і вироби, що містять такі композиції, і способи застосування таких композицій, що включають, наприклад, способи модуляції зв'язування ліганду з рецептором Robo4 і модуляції біологічних/фізіологічних активностей, асоційованих зі зв'язуванням ліганду з рецептором Robo4. Винахід оснований частково на ідентифікації різних анти-Robo4-антитіл, що зв'язують рецептор Robo4, рецептор, застосовний як терапевтична і діагностічна (наприклад, in vivo, 96788 26 in vitro або ex vivo візуалізації) мішень. АнтиRobo4-антитіла за винаходом можуть бути зручним чином використані як терапевтичні і діагностичні засоби для застосування в дії на патологічні стани, асоційовані з проліферацією ендотеліальних клітин, що відхиляється від норми або небажана, такою як проліферація васкулярних ендотеліальних клітин, що відхиляється від норми або небажана, у порушеннях, що включають, але не обмежувані ними, рак, порушений ангіогенез і порушення, асоційовані з проліферацією ендотеліальних клітин (наприклад, збільшених проліферацією ендотеліальних клітин) у тканині, підданій порушенню, солідні пухлини і метастазування, атеросклероз, ретролентальну фіброплазію, гемангіоми, хронічне запалення, внутрішньоочні неоваскулярні захворювання, такі як проліферативні ретинопатії, наприклад, діабетична ретинопатія, пов'язану зі старінням дегенерацію жовтої плями (AMD), неоваскулярну глаукому, імунне відторгнення трансплантованої корнеальної тканини й інших тканин, ревматоїдний артрит і псоріаз. АнтиRobo4-антитіла за винаходом можуть бути використані окремо або в комбінації з додатковими засобами (що включають протипухлинні композиції, хіміотерапевтичні засоби, цитотоксичні засоби, інгібуючі ріст засоби. У деяких варіантах здійснення винахід забезпечує способи ідентифікації і/або застосування націлених на Robo4 антитіл для блокування функції Robo4, доставки цитотоксичних засобів до клітин, що експресують Robo4 (наприклад, на клітинній поверхні) і/або доставки засобів візуалізації до клітин, що експресують Robo4 на клітинній поверхні. Наприклад, у деяких варіантах здійснення детектовано мічені анти-Robo4антитіла можуть бути зручним чином використані як засіб візуалізації для патологічних станів, в яких збільшена васкуляризація є шкідливою (наприклад, у випадку раку і дегенерації жовтої плями) або для фізіологічних станів, в яких проліферація ендотеліальних клітин, проліферація васкулярних клітин і/або ангіогенез є бажаним станом (таким як, наприклад, загоєння ран). II. Визначення У даному контексті наступні терміни мають значення, приписувані їм нижче, якщо немає інших вказівок. Термін "Robo4" або "Magic Roundabout", "Специфічна для ендотеліальних клітин молекула 4" або "ECSM4" стосується в даному контексті будьякого природного або варіантного (або природного, або синтетичного) поліпептиду Robo4, що містить амінокислотну послідовність, показану на Фіг. 5, її варіант або субпослідовність, з яким специфічно зв'язується антитіло за винаходом, в тому числі, наприклад, позаклітинного домену Robo4 або його будь-якої субпослідовності. Термін "Robo4 дикі типи" зазвичай стосується поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність природного білка Robo4. Термін "послідовність Robo4 дикого типу" зазвичай стосується амінокислотної послідовності, виявленої в природному Robo4. Поліпептид Robo4 за винаходом є поліпептидом Robo4 ссавці, таким як, без обмеження, Robo4 людини, кінських, бичачих, свинячих, собачих, котячих, гризунів. 27 "Robo4", "Magic Roundabout", "Специфічна для ендотеліальних клітин молекула 4" або "ECSM4" стосуються також нуклеїнових кислот і поліпептидних поліморфних варіантів, алелів, мутантів і міжвидових гомологів, що: (1) мають амінокислотну послідовність, яка має більшу, ніж 60% ідентичність амінокислотної послідовності, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, переважно 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% чи 99% або більш високу ідентичність амінокислотної послідовності, переважно протягом області щонайменше приблизно 25, 50, 100, 200, 500, 1000 або більше амінокислот, відносно амінокислотної послідовності, кодованої нуклеїновою кислотою Robo4 (у відношенні послідовності поліпептиду Robo4 людини див., наприклад, Фіг. 5 і 7 і SEQ ID NO:138 і 171; у відношенні послідовності мишачого поліпептиду Robo4 див., наприклад, SEQ ID NO:172); (2) зв'язуються з антитілами, наприклад, поліклональними антитілами і/або моноклональними антитілами, індукованими проти імуногену, що містить амінокислотну послідовність білка Robo4 і її консервативно модифіковані варіанти; (3) специфічно гібридизуються при жорстких умовах гібридизації з антисмисловим ланцюгом, що відповідає послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує білок Robo4 і його консервативно модифіковані варіанти, (4) мають послідовність нуклеїнової кислоти, що має більшу, ніж 95%, переважно більшу, ніж 96%, 97%, 98%, 99% або більш високу ідентичність нуклеотидної послідовності, переважно протягом області щонайменше приблизно 25, 50, 100, 200, 500, 1000 або більше нуклеотидів, відносно нуклеїнової кислоти Robo4 (наприклад, нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, представлений на Фіг. 5 і 7 і SEQ ID NO:138, 171 або 172. Переважно нуклеїнова кислота Robo4 має більшу, ніж 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичність відносно послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує SEQ ID NO:138, 171 або 172, переважно протягом області щонайменше приблизно 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 або 500, 600, 700, 800, 900 або 1000 або більше нуклеотидів. Термін "анти-Robo4-антитіло" або "антитіло, що зв'язується з Robo4", стосується антитіла, яке здатне зв'язувати Robo4 з достатньою афінністю, так що це антитіло застосовне як діагностічний і/або терапевтичний засіб в дії на Robo4. Переважно, ступінь зв'язування анти-Robo4-антитіла з неспорідненим нe-Robo4-білком дорівнює менше приблизно 10% зв'язування цього антитіла з Robo4, як виміряно, наприклад, радіоімуноаналізом (RIA). У деяких варіантах здійснення антитіло, що зв'язується з Robo4, має константу дисоціації (Kd)1 мкм, 100 нм, 10 нм, 1 нм або 0,1 нм. У деяких варіантах здійснення анти-Robo4-антитіло зв'язується з епітопом Robo4, що є консервативним серед Robo4 різних видів. В інших варіантах здійснення анти-Robo4-антитіло зв'язується з епітопом Robo4, що не є консервативним серед Robo4 різних видів. Термін "антитіло" використовується в самому широкому сенсі і конкретно включає моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), 96788 28 утворені з щонайменше двох інтактних антитіл, і фрагменти антитіл, поки вони виявляють бажану біологічну активність. "Виділеним" антитілом є антитіло, що було ідентифіковано і відділене або витягнуте з компонента його природного оточення. Забруднюючі компоненти його природного оточення є речовинами, що можуть перешкоджати дослідженню, діагностічним або терапевтичним застосуванням цього антитіла і можуть включати ферменти, гормони й інші білкові або небілкові розчинені речовини. У деяких варіантах здійснення антитіло очищають (1) до більше ніж 95 мас. % антитіла, як визначено, наприклад, за допомогою методу Лоурі, і, у деяких варіантах здійснення до більше ніж 99 мас. %; (2) до ступеня, достатнього для одержання щонайменше 15 залишків N-кінця або внутрішньої амінокислотної послідовності, з використанням, наприклад, секвенатора з обертовою чашею, або (3) до гомогенності за допомогою електрофореза в ДСН-ПААГ при відновних або невідновних умовах з використанням, наприклад, барвника Кумассі синього або барвника, що містить срібло. Виділене антитіло включає антитіло in situ у рекомбінантних клітинах, тому що щонайменше один компонентів природного оточення антитіла не буде присутній. Однак, зазвичай виділене антитіло одержують з використанням щонайменше однієї стадії очищення. "Природні (нативні) антитіла" є зазвичай гетеротетрамерними глікопротеїнами приблизно 150000 дальтон, що складаються з двох ідентичних легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких (Н) ланцюгів. Кожен легкий ланцюг зв'язаний з важким ланцюгом одним ковалентним дисульфідним зв'язком, у той час як кількість дисульфідних зв'язків варіюється серед важких ланцюгів різних ізотипів імуноглобуліну. Кожен важкий і легкий ланцюг має також регулярно розставлені внутрішньоланцюжкові дисульфідні містки. Кожен важкий ланцюг має на одному кінці варіабельний домен (VH), за яким іде ряд константних доменів. Кожен легкий ланцюг має варіабельний домен на одному кінці (VL) і константний домен на його іншому кінці; константний домен легкого ланцюга зіставлений з першим константної доменом важкого ланцюга, а варіабельний домен легкого ланцюга зіставлений з варіабельним доменом важкого ланцюга. Вважається, що конкретні амінокислотні залишки утворюють межу між варіабельними доменами легкого ланцюга і важкого ланцюга. Термін "варіабельна область" або "варіабельний домен" антитіла стосується амінокінцевих доменів важкого або легкого ланцюга антитіла. Варіабельний домен важкого ланцюга може називатися "VH". Варіабельний домен легкого ланцюга може називатися "VL". Такі домени є зазвичай найбільш варіабельними частинами антитіла і містять антигензв'язувальні сайти. Термін "варіабельні" стосується того факту, що визначені частини варіабельних доменів сильно розрізняються за послідовністю серед антитіл і використовуються в зв'язуванні і специфічності будь-якого конкретного антитіла у відношенні його конкретного антигену. Однак варіабельність роз 29 поділена нерівномірно протягом варіабельних доменів антитіл. Вона сконцентрована в трьох сегментах, називаних гіперваріабельними областями (HVR), у варіабельних доменах як легкого ланцюга, так і важкого ланцюга. Більш висококонсервативні частини варіабельних доменів називають каркасними областями (FR). Варіабельні домени нативних важкого і легкого ланцюгів, кожний, містять чотири FR-області, що у значній мірі приймають конфігурацію бета-шару, з'єднані трьома HVR, що утворюють петлі, що з'єднують структуру або шару, у деяких випадках, що утворюють частину структури бета-шару. HVR у кожному ланцюзі містяться разом у тісній близькості FR-областями, причому HVR іншого ланцюга сприяє утворенню антигензв'язувального сайту антитіл (див. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Константні домени не беруть участь безпосередньо в зв'язуванні антитіла з антигеном, але виявляють різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в антитілозалежній клітинній токсичності. "Легкі ланцюги" антитіл (імуноглобулінів) будьякого виду хребетних можуть бути віднесені до одного з двох явно різних типів, називаних каппа () і лямбда (), на основі амінокислотних послідовностей їх константних доменів. Залежно від амінокислотних послідовностей константних доменів важких ланцюгів, антитіла (імуноглобуліни) можуть бути віднесені до різних класів. Є п'ять основних класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, і деякі з них можуть бути додатково підрозділені на підкласи (ізотипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Константні домени важких ланцюгів, що відповідають різним класам імуноглобулінів, названі , , ,  і , відповідно. Структури субодиниць і тривимірні конфігурації різних класів імуноглобулінів добре відомі й описані в загальному вигляді, наприклад, у Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000). Антитіло може бути частиною більшої злитої молекули, утвореною ковалентною або нековалентною асоціацією цього антитіла з одним або декількома іншими білками або пептидами. Терміни "повнорозмірне антитіло", "інтактне антитіло" і "повне антитіло" використовуються в даному документі взаємозамінно у відношенні антитіла в його власне кажучи інтактній формі, не у вигляді фрагментів антитіл, визначених нижче. Ці терміни стосуються, зокрема, антитіла з важкими ланцюгами, що містять Fc-область. "Голе антитіло" для цілей за винаходом є антитілом, що не кон'юговане з цитотоксичною частиною або радіоактивною міткою. "Фрагменти антитіл" містять частину інтактного антитіла, переважно що містить його антигензв'язувальну область. Приклади фрагментів антитіл включають фрагменти Fab, Fab', F(ab')2 і Fv; діатіла; лінійні антитіла; одноланцюжкові молекули антитіл, і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Розщеплення антитіл папаїном робить два ідентичні антигензв'язувальні фрагменти, називані фрагментами "Fab", кожний з який має єдиний 96788 30 антигензв'язувальний сайт, і залишковий фрагмент "Fc", назва якого відображає його здатність легко кристалізуватися. Обробка пепсином робить фрагмент F(ab')2, що має два антигензв'язувальні сайти і все ще здатний зшивати антиген. "Fv" є мінімальним фрагментом антитіла, що містить повний антигензв'язувальний сайт. В одному варіанті здійснення дволанцюжковий різновид Fv складається з димеру одного варіабельного домену важкого ланцюга й одного варіабельного домену легкого ланцюга в тісній, нековалентній асоціації. В одноланцюжковому різновиді Fv (scFv) один варіабельний домен важкого ланцюга й один варіабельний домен легкого ланцюга можуть бути ковалентно зв'язані гнучким пептидним лінкером, так що легкий і важкий ланцюги можуть асоціюватися в "димерній" структурі, аналогічній структурі в дволанцюжковому різновиді Fv. Саме в цій конфігурації три HVR будь-якого варіабельного домену взаємодіють, визначаючи антигензв'язувальний сайт на поверхні димеру VHVL. Разом шість HVR надають антитілу антигензв'язувальну специфічність. Однак навіть єдиний варіабельний домен (або половина Fv, що містить тільки три HVR, специфічних у відношенні антигену) має здатність впізнавати і зв'язувати антиген, хоча і з більш низькою афінністю, ніж повний сайт зв'язування. Фрагмент Fab містить варіабельні домени важкого і легкого ланцюгів, а також містить константний домен легкого ланцюга і перший константний домен (СH1) важкого ланцюга. Фрагменти Fab' відрізняються від фрагментів Fab додаванням декількох залишків на карбоксикінці СH1-домену важкого ланцюга, у тому числі одного або декількох цистеїнів із шарнірної області антитіла. Fab'SH позначає в даному документі Fab', в якому залишок (залишки) цистеїну константних доменів несуть вільну тіолову групу. Фрагменти F(ab')2 антитіла спочатку продукуються у вигляді пар фрагментів Fab', що мають цистеїни шарнірної області між ними. Відомі також інші хімічні зчеплення фрагментів антитіл. "Одноланцюжкові Fv" фрагменти або "scFv" антитіла містять домени VH і VL антитіла, причому домени присутні в одноланцюжковому поліпептидному ланцюгу. Зазвичай поліпептид scFv додатково містить поліпептидний лінкер між доменами VH і VL, що дозволяє scFv утворювати бажану структуру для зв'язування антигену. У відношенні огляду scFv див. Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Термін "діатіла" ("diabodies") стосується фрагментів антитіл із двома антигензв'язувальними сайтами, причому фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), з'єднаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) в одному і тому ж поліпептидному ланцюзі (VH-VL). З використанням лінкера, що є занадто коротким для дозволу спарювання між двома доменами на одному і тому ж ланцюгу, домени спонукаються до спарювання з комплементарними доменами іншого ланцюга і створюють два антигензв'язувальні 31 сайти. Діатіла можуть бути бівалентними або біспецифічними. Діатіла описані більш повно, наприклад, у ЕР 404097; WO93/01161; Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9: 129-134; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Триатіла і тетратіла описані також у Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9: 129-134. Термін "моноклональне антитіло" стосується в даному контексті антитіла, отриманого з популяції власне кажучи гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла, що складають популяцію, є ідентичними, за винятком можливих мутацій, наприклад, природних мутацій, що можуть бути присутніми у мінорних кількостях. Таким чином, визначення "моноклональні" вказує природу антитіла як такого, що не є сумішшю різних антитіл. У деяких варіантах здійснення таке моноклональне антитіло зазвичай включає антитіло, що містить поліпептидну послідовність, яка зв'язує мішень, причому мішень-зв'язувальна поліпептидна послідовність була отримана способом, що включає відбір зв'язуючої єдину мішень поліпептидної послідовності з множини поліпептидних послідовностей. Наприклад, способом відбору може бути відбір унікального клону з множини клонів, наприклад, пулу гібридомних клонів, фагових клонів або клонів рекомбінантних ДНК. Повинно бути також зрозуміло, що відібрана мішень-зв'язувальна послідовність може бути додатково змінена, наприклад, для поліпшення афінності у відношенні цієї мішені, для гуманізації мішень-зв'язувальної послідовності, для поліпшення її продукування в культурі клітин, для зменшення її імуногенності in vivo, для створення мультиспецифічного антитіла і т.д., і що антитіло, яке містить змінену мішень-зв'язувальну послідовність, є також моноклональним антитілом за винаходом. На противагу препаратам поліклональних антитіл, що зазвичай включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло препарату моноклональних антитіл напрвлене проти єдиної детермінанти на антигені. Крім специфічності, препарати моноклональних антитіл є переважними внаслідок того, що вони зазвичай не забруднені іншими імуноглобулінами. Визначення "моноклональне" вказує на природу антитіла як отриманого власне кажучи з гомогенної популяції антитіл, і не повинне розумітися як потребуюче одержання антитіла будь-яким конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, що повинні використовуватися відповідно до даного винаходу, можуть бути отримані різними способами, у тому числі, наприклад, гібридомним способом (наприклад, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory nd Press, 2 ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563681 (Elsevier, N. Y., 1981)), способами рекомбінантних ДНК (див., наприклад, патент США № 4816567), технологіями фагового дисплею (див., наприклад, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 96788 32 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); і Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), і технологіями одержання антитіл людини або антитіл, подібних до антитіл людини, у тварин, що мають частини або усі з локусів або генів імуноглобуліну людини, що кодують послідовності імуногаобуліну людини (див., наприклад, WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7: 33 (1993); патенти США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); і Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). Моноклональні антитіла, описані в даному документі, особливо включають "химерні" антитіла, в яких частина важкого і/або легкого ланцюга є ідентичною з відповідними послідовностями або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах, отриманих з конкретного виду або приналежних до конкретного класу або підкласу антитіл, у той час як інший ланцюг (ланцюги) є ідентичним з відповідними послідовностями або гомологічним відповідним послідовностям в антитілах, отриманих з іншого виду або приналежних до іншого класу або підкласу, а також фрагменти таких антитіл, поки вони виявляють бажану біологічну активність (патент США № 4816567; і Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Химерні антитіла включають антитіла PRIMATIZED, в яких антигензв'язувальна область антитіла зроблена з антитіла, отриманого, наприклад, імунізацією мавп-макак антигеном, що представляє інтерес. "Гуманізовані" формі антитіл нелюдини (наприклад, мишачих) є химерними антитілами, що містять мінімальну послідовність, зроблену з імуноглобуліну нелюдини. У більшості випадків гуманізовані антитіла є імуноглобулінами людини (реципієнтним антитілом), в яких залишки з гіперваріабельної області реципієнта замінені залишками з гіперваріабельної області виду нелюдини (донорського антитіла), такого як миша, щур, кролик або примат (нелюдина), що мають бажану специфічність, афінність і потенціал. У деяких випадках залишки каркасної області (FR) імуноглобуліну людини заміняють відповідними залишками імуноглобуліну нелюдини. Крім того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, що не виявлені в реципієнтному антитілі або в донорському антитілі. Такі модифікації можуть бути зроблені для додаткового поліпшення ефективності антитіла. Звичайно гуманізоване антитіло буде містити власне кажучи усі щонайменше з одного, і звичайно двох, варіабельних доменів, в яких усі чи власне кажучи всі гіперваріабельні петлі відповідають гіперваріабельним петлям імуноглобуліну нелюдини, а всі або власне кажучи всі FR є FR послідовності імуноглобуліну людини. Таке гуманізоване антитіло буде іноді містити також щонайменше частину константної області (Fc) імуноглобуліну, 33 зазвичай константної області імуноглобуліну людини. У відношенні додаткових деталей див. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Див. також наступні оглядові статті і цитовані в них посилання: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994). "Антитіло людини" є антитілом, яке має амінокислотну послідовність, що відповідає амінокислотній послідовності, що продукується людиною, і/або було отримано з використанням будь-якого зі способів одержання антитіл людини, описаних у даному документі. Це визначення антитіла людини особливо виключає гуманізоване антитіло, що містить антигензв'язувальні залишки антитіла нелюдини. Антитіла людини можуть бути отримані з використанням різних способів, відомих у даній галузі, що включає бібліотеки фагового дисплею. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Для одержання моноклональних антитіл людини доступні також способи, описані в Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991). Див. також Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5:368-74 (2001). Антитіла людини можуть бути отримані введенням антигену в трансгенну тварину, що була модифікована для одержання таких антитіл у відповідь на введення антигену, але ендогенні локуси якої були порушені, наприклад, в імуногенну ксеномишу (див., наприклад, патенти США №№ 6075181 і 6150584, у відношенні технології XENOMOUSE). Див. також, наприклад, Li et al., PNAS USA, 103:3557-3562 (2006) у відношенні антитіл людини, генерованих з використанням технології В-клітинних гібридом людини. "Антиген" є заданим антигеном (наприклад, послідовністю Robo4), з яким може селективно зв'язуватися антитіло. Антигеном-мішенню може бути поліпептид, вуглевод, нуклеїнова кислота, ліпід, гаптен або інша природна або синтетична сполука. Переважно, антигеном-мішенню є поліпептид. "Акцепторний каркас людини" для поставлених у даному документі цілей є каркасом, що містить амінокислотну послідовність каркаса VL чи VH, зроблену з каркаса імуноглобуліну людини або консенсусного каркаса людини. Акцепторний каркас людини, "зроблений з" каркаса імуноглобуліну людини або консенсусного каркаса людини, може містити таку ж амінокислотну послідовність, або він може містити передіснуючі зміни амінокислотної послідовності. У деяких варіантах здійснення кількість передіснуючих змін амінокислот дорівнює 10 або менше, 9 або менше, 8 або менше, 7 або менше, 6 або менше, 5 або менше, 4 або менше, 3 або менше або 2 або менше. Якщо передіснуючі зміни амінокислот присутні в VH, зміни переважно зустрічаються тільки в трьох, двох або одному з положень 71Н, 73Н і 78Н; наприклад, амінокислотні залишки в вказаних положеннях 96788 34 можуть бути 71А, 73Т і/або 78А. В одному варіанті здійснення акцепторний каркас VL людини є ідентичним за послідовністю каркасу VL імуноглобуліну людини або консенсусній послідовності каркаса людини. "Консенсусний каркас людини" є каркасом, що представляє амінокислотні залишки, які найбільш часто зустрічаються, в відборі (селекції) каркасних послідовностей VL або VH імуноглобуліну людини. Зазвичай відбір послідовностей VL або VH імуноглобуліну людини виконують з підгрупи послідовностей варіабельних доменів. Зазвичай підгрупою послідовностей є підгрупа, описана в Kabat et al. В одному варіанті здійснення, для VL, підгрупою є підгрупа каппа І, як у Kabat et al. В одному варіанті здійснення, для VH, підгрупою є підгрупа III, як у Kabat et al. "Консенсусний каркас підгрупи III VH" містить консенсусну послідовність, отриману з амінокислотних послідовностей у підгрупі III варіабельного важкого ланцюга Kabat et al. В одному варіанті здійснення амінокислотна послідовність консенсусного каркаса підгрупи III VH містить щонайменше частину кожної з наступних послідовностей або всю послідовність з кожної з наступних послідовностей: EVQLYESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:128)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:129)-H2RFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:131)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:16). В іншому варіанті здійснення амінокислотна послідовність консенсусного каркаса підгрупи III VH містить щонайменше частину кожної з наступних послідовностей або всю послідовність з кожної з наступних послідовностей: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:128)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:129)H2-RFTISADTSKNTAYLQMNSLRLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:137)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:16). "Консенсусний каркас підгрупи I VL" містить консенсусну послідовність, отриману з амінокислотних послідовностей у підгрупі І варіабельного легкого ланцюга каппа Kabat et al. В одному варіанті здійснення амінокислотна послідовність консенсусного каркаса підгрупи І VL містить щонайменше частину всю або послідовність з кожної з наступних послідовностей або всю послідовність з кожної з наступних послідовностей: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:9)-L1WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ГО NO:10)-L2GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:99)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID NO:100). "Немодифікований каркас людини" є каркасом людини, що має ту ж саму амінокислотну послідовність, що й акцепторний каркас людини, наприклад, позбавлений заміни (замін) амінокислот людини на амінокислоти нелюдини в акцепторному каркасі людини. Термін "гіперваріабельна область (ділянка)", "HVR" або "HV", стосується в даному контексті областей варіабельного домену антитіла, що є гіперваріабельними за послідовністю і/або утворюють визначені вище петлі. Зазвичай антитіла містять шість гіперваріабельних областей; три в 35 96788 VH (H1, Н2, H3) і три в VL (L1, L2, L3). Ряд обрисів гіперваріабельних областей використовуються в даному документі і включені у винахід. Області Кабата (CDR), що визначають компліментарність, є HVR, що основані на варіабельності послідовності і найбільш часто використовуються (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Хотіа посилається замість цього на місце розташування структурних Петля L1 L2 L3 H1 H1 Н2 H3 Кабат L24-L34 L50-L56 L89-L97 Н31-Н35В Н31-Н35 Н50-Н65 Н95-Н102 Ab L24-L34 L50-L56 L89-L97 Н26-Н35В Н26-Н35 Н50-Н58 Н95-Н102 Обрис положення амінокислоти/межа гіперваріабельної області антитіла може варіюватися залежно від контексту і різних визначень, відомих у даній галузі (описаних нижче). Деякі положення всередині варіабельного домену можуть розглядатися як гібридні гіперваріабельні положення, в яких положення можуть вважатися такими, що знаходяться в гіперваріабельній області при одному наборі критеріїв, тоді як можуть вважатися такими, що знаходяться поза гіперваріабельною областю при іншому наборі критеріїв. Одне або декілька з вказаних положень можуть бути також виявлені в подовжених гіперваріабельних областях. В одному варіанті здійснення гібридні гіперваріабельні положення включають одне або декілька з положень: 26-30, 26-35, 33-35В, 47-49, 49-65, 5765, 95-102, 93, 94 і 102 у варіабельному домені важкого ланцюга. В одному варіанті здійснення гібридні гіперваріабельні положення включають одне або декілька з положень: 24-29, 24-34, 35-36, 46-49, 50-56, 89-97, 56 і 97 у варіабельному домені легкого ланцюга. У даному контексті, HVR легкого ланцюга називають взаємозамінно HVR-L1, -L2 або -L3, або HVR1-LC, HVR2-LC або HVR3-LC або з використанням іншого подібного позначення, що вказує на те, що мова йде про HVR легкого ланцюга. У даному контексті, HVR важкого ланцюга називають взаємозамінно HVR-H1, -Н2 або -H3, або HVR1-H, HVR2-H або HVR3-H або з використанням іншого подібного позначення, що вказує на те, що мова йде про HVR важкого ланцюга. Гіперваріабельні області можуть містити наступні "подовжені гіперваріабельні області": 24-36 або 24-34 (L1), 46-56 або 50-56 (L2) і 89-97 (L3) у VL і 26-35 (H1), 50-65 або 49-65 (Н2) і 93-102, 94102 або 95-102 (H3) у VH. Залишки варіабельних доменів пронумеровані відповідно до Kabat et al., вище, для будь-якого з вказаних визначень. "Зміненою гіперваріабельною областю" для цілей даного винаходу є гіперваріабельна область, що містить одну або декілька (наприклад, одну приблизно 16) амінокислотних замін. "Немодифікованою гіперваріабельною областю" для цілей даного винаходу є гіперваріабельна 36 петель (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Гіперваріабельні області Ab представляють компроміс між CDR Кабата і структурними петлями Хотіа і використовуються програмним забезпеченням для моделювання AbМ-антитіл (Oxford Molecular's Ab). "Контактні" гіперваріабельні області основані на аналізі доступних комплексних кристалічних структур. Залишки з кожної з вказаних гіперваріабельних областей представлені нижче. Хотіа L26-L32 L50-L52 L91-L96 Н26-Н32 Н26-Н32 Н53-Н55 Н96-Н101 Контактні L30-L36 L46-L55 L89-L96 Н30-Н35В Н30-Н35 Н47-Н58 Н93-Н101 (нумерація Кабата) (нумерація Хотіа) область, що має та ж саму амінокислотну послідовність, що й антитіло нелюдини, з якого вона отримана, тобто гіперваріабельна область, що позбавлена однієї або декількох амінокислотних замін. "Залишками каркаса" або "FR" є залишки варіабельних доменів, інші, ніж залишки гіперваріабельних областей, визначені в даному документі. У даному контексті позначення LC-FR1-4 або FR1-4LC або подібне позначення використовується взаємозамінно і стосується каркасних областей легкого ланцюга. У даному контексті позначення HCFR1-4 або FR1-4-H або подібне позначення використовується взаємозамінно і стосується каркасних областей важкого ланцюга. "Афінно дозрілим" антитілом є антитіло з однією або декількома змінами в одному або декількох CDR, що призводять до поліпшення афінно сті антитіла відносно антигену, у порівнянні з вихідним антитілом, що не має зміни (змін). Переважні афінно дозрілі антитіла будуть мати наномолярні або навіть пікомолярні афінності у відношенні антигену-мішені. Афінно дозрілі антитіла одержують процедурами, відомими в даній галузі. Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) описує дозрівання афінності перетасуванням доменів VH і VL. Випадковий мутагенез залишків CDR і/або каркаса описаний Barbas et al., PNAS USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995) і Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992). "Блокуючим" антитілом або антитілом"антагоністом" є антитіло, яке інгібує або зменшує біологічну активність антигену, який воно зв'язує. Наприклад, блокуючі антитіла або анти-Robo4антитіла-антагоністи суттєво або повністю інгібують ангіогенез зв'язуванням Robo4. Термін "нумерація залишків варіабельних доменів за Кабатом" або "нумерація положень амінокислот за Кабатом" стосується системи нумерації, використовуваної для варіабельних доменів важкого ланцюга або варіабельних доменів легкого ланцюга компіляції антитіл у Kabat et al., th Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 37 Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). З використанням цієї системи нумерації фактична лінійна амінокислотна послідовність може містити менше амінокислот або додаткові амінокислоти відповідно до укорочення FR або CDR або інсертуванням у FR або CDR варіабельного домену. Наприклад, варіабельний домен важкого ланцюга може включати інсерцію однієї амінокислоти (залишок 52а відповідно до Кабату) після залишку 52 Н2, і інсертовані залишки (наприклад, залишки 82а, 82b і 82с, і т.д. відповідно до Кабату) після залишку 82 FR важкого ланцюга. Нумерація Кабата залишків може бути визначена для конкретного антитіла зіставленням в областях гомології послідовності антитіла зі "стандартною" пронумерованою за Кабатом послідовністю. Фраза "власне кажучи однакова", або "власне кажучи та ж сама", позначає в даному контексті досить високий ступінь подібності між двома чисельними величинами (зазвичай однією, асоційованою з антитілом за винаходом, і іншою, асоційованою з посилальним/порівняльним антитілом), так що кваліфікований у даній галузі фахівець може вважати розходження між двома величинами малим або таким, що не має біологічної і/або статистичної значущості в контексті біологічної властивості, вимірюваної вказаними величинами (наприклад, величинами Kd). Розходження між двома вказаними величинами є переважно меншим, ніж приблизно 50%, переважно меншим, ніж приблизно 40%, переважно меншим, ніж приблизно 30%, переважно меншим, ніж приблизно 20%, переважно меншим, ніж приблизно 10% як функція величини для посилального/порівняльного антитіла. "Афінністю зв'язування" зазвичай називають міцність сумарного підсумку нековалентних взаємодій між єдиним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитіла) і його партнером зв'язування (наприклад, антигеном). Якщо немає іншої вказівки, "афінністю зв'язування", у даному контексті, називають внутрішню афінність зв'язування, що відображує взаємодію 1:1 між членами пари зв'язування (наприклад, антитіла й антигену). Афінність молекули X у відношенні партнера Υ може бути зазвичай представлена константою дисоціації (Kd). Афінність може бути вимірювана звичайними способами, відомими в даній галузі, у тому числі описаними в даному документі. Антитіла низкої афінності зв'язують антиген повільно і схильні легко дисоціюватися, тоді як антитіла високої афінності зазвичай зв'язують антиген швидше і схильні залишатися зв'язаними більш тривало. У даній галузі відомі різноманітні способи вимірювання афінності зв'язування, кожний з яких може бути використаний для цілей даного винаходу. Конкретні ілюстративні варіанти представлені надалі описі. В одному варіанті здійснення, "Kd", "KD" або "величину Kd" вимірюють за допомогою аналізу зв'язування радіоактивно міченого антигену (RIA), виконуваного з Fab-версією антитіла, що представляє інтерес, і його антигеном, як описано на прикладі наступного аналізу, що вимірює афінність 96788 38 зв'язування Fab у розчині у відношенні антигену зрівноважуванням Fab з мінімальною концентраціІ25 єю І-міченого антигену в присутності ряду розведень неміченого антигену, з наступним захопленням зв'язаного антигену покритим анти-Fabантитілом планшетом (Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). Для встановлення умов для цього аналізу, мікротитраційні планшети (Dynex) покривають протягом ночі 5 мкг/мл анти-Fаbантитіла, що захоплює (Cappel Labs) у 50 мм карбонаті натрію (рН 9,6) і потім блокують 2% (маса/об'єм) бичачим сироватковим альбуміном у ЕФР протягом двох-п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23°С). У неадсорбентному 125 планшеті (Nunc #269620), 100 пМ або 26 пМ [ І]антиген змішують із серійними розведеннями Fab, що представляє інтерес (наприклад, Fab-12, як описано в Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:45934599)). Потім представляючий інтерес Fab інкубують протягом ночі; однак інкубування може продовжуватися протягом більш тривалого періоду часу (наприклад, приблизно 65 годин) для гарантії того, що рівновага досягнута. Після цього суміші переносять у захоплюючий планшет для інкубування при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Потім розчин видаляють, і планшет промивають вісім разів 0,1% Твіном-20 у ЕФР. Після висушування планшетів додають 150 мкл на ямку сцинтилятору (MicroScint-20; Packard), і планшети рахують на гамма-лічильнику Topcount (Packard) протягом десяти хвилин. Концентрації будь-якого Fab, що дають зв'язування, менше або рівне 20% максимального зв'язування, відбирають для застосування в аналізах конкурентного зв'язування. Відповідно до іншого варіанта здійснення, Kd або величину Kd вимірюють за допомогою аналізу резонансу поверхневих плазмонів з використанням ВІАCore-2000 або BIAcore-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С чипів (мікропроцесорів) СМ5 з іммобілізованим антигеном при ~10 реакційних одиницях (RU). Коротко, біосенсорні чипи (мікропроцесори) з карбоксиметильованого декстрану (СМ5, BIAcore Inc.) активують гідрохлоридом N-етил-N'-(3диметиламінопропіл)карбодіімідом (EDC) і Nгідроксисукцинімідом (NHS) відповідно до інструкцій постачальника. Антиген розбавляють 10 мМ ацетатом натрію, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед інжекцією при швидкості потоку 5 мкл/хв для одержання приблизно 10 реакційних одиниць (RU) зв'язаного білка. Після інжекції антигену, інжектують 1 Μ етаноламін для блокування непрореагувавших груп. Для вимірювання кінетики двократні серійні розведення Fab (0,78-500 нМ) інжектують у ЕФР із 0,05% Твіном-20 (PBST) при 25°С при швидкості потоку приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (kon) і швидкості дисоціації (koff) розраховують з використанням простої 1:1 моделі зв'язування Langmuir (BIAcore Evaluation Software version 3.2) за допомогою одночасної підгонки сенсограм асоціації і дисоціації. Константу дисоціації (Kd) розраховують у вигляді відношення koff/kon. Див., наприклад, Chen, Y, (1999) J. Mol. Biol. 6 293:865-881. Якщо швидкість асоціації вище 10 M 1 -1 c відповідно до аналізу резонансу поверхневих 39 плазмонів, то швидкість асоціації може бути визначена з використанням способу гасіння флуоресценції, що вимірює збільшення або зменшення інтенсивності емісії флуоресценції (порушення=295 нм; емісія=340 нм, 16 нм смуга пропускання) при 25°С 20 нМ анти-антиген-антитіла (Fabформі) у ЕФР, рН 7,2, у присутності концентрацій антигену, що збільшуються, при вимірюванні в спектрофотометрі, такому як спектрофотометр з обмежувачем потоку (Aviv Instruments) або спектрофотометр 8000-series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) із переміщуваною кюветою. Фраза "суттєво зменшена" або "суттєво відрізняється" означає в даному контексті досить високий ступінь розходження між двома чисельними величинами (зазвичай однією, асоційованою з антитілом за винаходом, і іншою, асоційованою з посилальним/порівняльним антитілом), так що кваліфікований у даній галузі фахівець може вважати, що розходження між цими двома величинами є розходженням статистичної значущості в контексті біологічної властивості, вимірюваної вказаними величинами (наприклад, величинами Kd, реакцією HАМА). Це розходження між вказаними двома величинами є переважно більшим, ніж приблизно 10%, переважно більшим, ніж приблизно 20%, більшим, ніж приблизно 30%, більшим, ніж приблизно 40% і/або більшим, ніж приблизно 50% як функція посилальної/порівняльної величини. "Процентна (%) ідентичність амінокислотної послідовності" у відношенні пептидної або поліпептидної послідовності визначається як відсоток амінокислотних залишків у кандидатній послідовності, що ідентичні з амінокислотними залишками в конкретній пептидній або поліпептидній послідовності, після зіставлення послідовностей і введення "гепів", якщо необхідно, для досягнення максимальної процентної ідентичності послідовності, без урахування будь-яких консервативних замін як частини ідентичності послідовності. Зіставлення для цілей визначення процентної ідентичності амінокислотної послідовності може досягатися різними способами, що знаходяться в межах кваліфікації в даній галузі, наприклад, з використанням публічно доступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як програми BLAST, BLAST2, ALIGN або Megalign (DNASTAR). Кваліфіковані в даній галузі фахівці можуть визначити придатні параметри для вимірювання зіставлення, у тому числі будь-які алгоритми, необхідні для одержання максимального зіставлення протягом повної довжини порівнюваних послідовностей. Однак для цілей даного винаходу величини % ідентичності амінокислотної послідовності генерують з використанням комп'ютерної програми для порівняння послідовностей ALIGN-2. Автором комп'ютерної програми ALIGN-2 для порівняння послідовностей є Genentech, Inc., і вихідний код програми був введений з документацією користувача в U.S. Copyright Office, Washington D. С, 20559, де він був зареєстрований під U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Програма ALIGN-2 привселюдно доступна з Genentech, Inc., South San Francisco, California, або може бути компільована для застосування на операційній системі UNIX, переважно 96788 40 цифровій UNIX V4.0D. Всі параметри порівняння встановлюються програмою ALIGN-2 і не варіюються. У ситуаціях, коли ALIGN-2 використовується для порівняння амінокислотних послідовностей, %-ну ідентичність конкретної амінокислотної послідовності А відносно конкретної амінокислотної послідовності В, з конкретною амінокислотною послідовністю В або проти конкретної амінокислотної послідовності В (що може бути альтернативно перефразована як конкретна амінокислотна послідовність А, що має або містить деяку %-ну ідентичність амінокислотної послідовності відносно конкретної амінокислотної послідовності В, з конкретною амінокислотною послідовністю В або проти конкретної амінокислотної послідовності В) розраховують у такий спосіб: 100дріб Х/Y, де X позначає кількість амінокислотних залишків, оцінених як ідентичні збіги програмою зіставлення послідовностей ALIGN-2 у зіставленні програмою А і В, і де Υ позначає загальну кількість амінокислотних залишків у В. Повинно бути зрозуміло, що, коли довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності В, %-на ідентичність амінокислотної послідовності А відносно В не буде дорівнювати %-ній ідентичності амінокислотної послідовності В відносно А. Якщо немає інших вказівок, усі величини %-ної ідентичності амінокислотних послідовностей, використовувані в даному документі, отримані, як описано безпосередньо в попередньому абзаці, з використанням комп'ютерної програми ALIGN-2. Термін "вектор" стосується в даному контексті молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою він був зв'язаний. Одним типом вектора є "плазміда", що є кільцевою дволанцюжковою ДНК, в яку можуть бути ліговані додаткові ДНК-сегменти. Іншим типом вектора є фаговий вектор. Іншим типом вектора є вірусний вектор, в якому додаткові ДНКсегменти можуть бути ліговані у вірусний геном. Деякі вектори здатні до реплікації в клітині-хазяїні, в якій вони введені (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальний сайт ініціації реплікації, іепісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомні вектори ссавців) можуть бути інтегровані в геном клітини-хазяїна після введення в клітину-хазяїна, і за допомогою цього реплікуватися разом з геномом хазяїна. Крім того, деякі вектори здатні керувати експресією генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори називають у даному документі "рекомбінантними експресуючими векторами" або просто "експресуючими векторами". Зазвичай експресуючі вектори, використовувані в способах рекомбінантних ДНК, знаходяться часто у формі плазмід. У даному описі "плазміда" або "вектор" можуть використовуватися взаємозамінно, тому що плазміда є найбільш часто використовуваною формою вектора. "Полінуклеотид", або "нуклеїнова кислота", використовувані взаємозамінно в даному документі, 41 позначає полімери нуклеотидів будь-якої довжини і включають ДНК і РНК. Ці нуклеотиди можуть бути дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифікованими нуклеотидами або основами і/або їх аналогами або будь-яким субстратом, що може бути включений у полімер ДНК- або РНКполімеразою або синтетичною реакцією. Полінуклеотид може містити модифіковані нуклеотиди, такі як метильовані нуклеотиди і їх аналоги. Якщо є присутньою модифікація у відношенні нуклеотидної структури, вона може вироблятися до або після зборки полімеру. Послідовність нуклеотидів може перериватися ненуклеотидними компонентами. Полінуклеотид може містити модифікацію (модифікації), зроблену після синтезу, наприклад, кон'югацію з міткою. Інші типи модифікацій включають, наприклад, "кепі", заміну одного або декількох природних нуклеотидів аналогом, міжнуклеотидні модифікації, такі як модифікації з незарядженими зв'язками (наприклад, метилфосфонати, фосфотриефіри, фосфоамідати, карбамати і т.д.) і з зарядженими зв'язками (наприклад, фосфоротіоати, фосфородитіоати і т.д.), модифікації, що містять бічні ланцюги, такі як, наприклад, білки (наприклад, нуклеази, токсини, антитіла, сигнальні пептиди, полі-L-лізин і т.д.), модифікації з інтеркаляторами (наприклад, акридином, псораленом і т.д.), модифікації, що містять хелатори (наприклад, метали, радіоактивні метали, бор, окисні метали і т.д.), модифікації, що містять алкілувальні засоби, модифікації з модифікованими зв'язками (наприклад, альфа-аномерні нуклеїнові кислоти і т.д.), а також немодифіковані формі полінуклеотиду (полінуклеотидів). Крім того, будь-яка з гідроксильних груп, що зазвичай є присутньою у цукрах, може бути замінена, наприклад, фосфонатними групами, фосфатними групами, захищена стандартними захисними групами або активована для одержання додаткових зв'язків з додатковими нуклеотидами або може бути кон'югована з твердими або напівтвердими носіями. 5'- і 3'-кінцеві ОН можуть бути фосфориловані або замінені аміногрупами або органічними кепуючими групами з 1-20 атомів вуглецю. Інші гідроксили можуть бути також дериватізовані стандартними захисними групами. Полінуклеотиди можуть також містити аналогові формі цукрів рибози або дезоксирибози, що зазвичай відомі в даній галузі, у тому числі, наприклад, 2'-О-метил-, 2'-О-аліл-, 2'-фторабо 2'азидорибозу, карбоциклічні аналоги цукрів, аномерні цукри, епімерні цукри, такі як арабіноза, ксилози або ліксози, піранозні цукри, фуранозні цукри, седогептулози, ациклічні аналоги і основні нуклеозидні аналоги, такі як метилрибоза. Один або декілька фосфодіефірних зв'язків можуть бути замінені альтернативними єднальними групами. Ці альтернативні зв'язувальні групи включають, але не обмежуються ними, варіанти, в яких фосфат замінений P(O)S ("тіоатом"), P(S)S ("дитіоатом"), (O)NR2 ("амідатом"), P(O)R, P(O)OR', CO або СН2 ("формацеталем"), в яких кожний R або R' означає незалежно Η або заміщений або незаміщений алкіл (1-20 С), який необов'язково містить простий ефірний зв'язок (-О-), арил, алкеніл, циклоалкіл, циклоалкеніл або аралкіл. Не всі зв'язки в полінук 96788 42 леотиді повинні бути ідентичними. Попередній опис застосовний до всіх згадуваних в даному документі полінуклеотидів, що включають РНК і ДНК. "Олігонуклеотид" позначає зазвичай в даному контексті короткі, зазвичай одноланцюжкові, зазвичай синтетичні полінуклеотиди, які зазвичай, але не обов'язково, мають довжину приблизно 200 нуклеотидів. Терміни "олігонуклеотид" і "полінуклеотид" не є взаємовиключними. Попередній опис для полінуклеотидів так само і цілком застосовний до олігонуклеотидів. "Порушення" або "захворювання" є будь-яким станом, що буде одержувати користь від лікування речовиною/молекулою або способом за винаходом. Воно включає хронічні і гострі порушення або захворювання, у тому числі патологічні стани, що роблять схильним ссавця до розглянутого порушення. Необмежувальні приклади порушень, що підлягають лікуванню, описаному в даному документі, включають злоякісні і доброякісні пухлини; нелейкозні і лімфоїдні злоякісні порушення; нейронні, гліальні, астроцитальні, гіпоталамічні й інші гландулярні, макрофагальні, епітеліальні, стромальні і бластоцельні порушення; і запальні, імунологічні та інші пов'язані з ангіогенезом порушення. Терміни "клітинно-проліферативне порушення" і "проліферативне порушення" стосуються порушень, які асоційовані з деяким ступенем патологічної проліферації клітин. В одному варіанті здійснення клітинно-проліферативним порушенням є рак. В одному варіанті здійснення клітиннопроліферативним порушенням є ангіогенез. "Пухлиною" називають, у даному контексті, будь-який неопластичний ріст і проліферацію клітин, незалежно від того, чи є вони злоякісними або доброякісними, і всі передракові і ракові клітини і тканини. Терміни "рак", "раковий", "клітиннопроліферативне порушення", "проліферативне порушення" і "пухлина" не є взаємовиключними, як описано в даному документі. Терміни "рак" і "раковий" стосуються фізіологічного стану ссавців, що зазвичай характеризується нерегульованою проліферацією клітин. Приклади раку включають, але не обмежуються ними, карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкоз. Більш конкретні приклади таких ракових захворювань включають плоскоклітинний рак, рак легені (у тому числі дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарциному легені і плоскоклітинний рак легені), рак очеревини, печінковоклітинний рак, рак ШКТ або рак шлунку (у тому числі шлунково-кишковий рак), рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак ободової кишки, рак ободової і прямої кишки, карциному ендометрію або матки, карциному слинних залоз, рак нирки або ренальний рак, рак печінки, рак передміхурової залози, рак вульви, рак щитоподібної залози, карциному печінки і різні типи раку голови і шиї, а також В-клітинну лімфому (у тому числі фолікулярну низькодиференційовану не ходжкінську лімфому (NHL); дрібноклітинну лімфоцитарну (SL) NHL; фолікулярну NHL проміжного ступеня; дифузійну NHL проміжного ступеня; лімфобластну NHL висо 43 кого ступеня; слабко диференційовану дрібноклітинну NHL високого ступеня; генералізовану NHL; лімфому клітин кори головного мозку; пов'язану зі СНІДом лімфому; і макроглобулінемію Вальденстрема); хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL); гострий лімфобластний лейкоз (ALL); лейкемічний ретикулоендотеліоз; хронічний мієлобластний лейкоз; і лімфопроліферативне порушення після трансплантації (PTLD), а також васкулярну проліферацію, яка відхиляється від норми, асоційовану з факоматозом, водянку (наприклад, асоційовану з пухлинами головного мозку) і синдром Мейжа. Термін "протипухлинна композиція" або "протиракова композиція" чи "протираковий засіб" стосується композиції, застосовної в лікуванні раку, що містить щонайменше один активний терапевтичний засіб, наприклад, "протираковий засіб". Приклади терапевтичних засобів (протиракових засобів) включають, але не обмежуються ними, наприклад, хіміотерапевтичні засоби, засоби, що інгібують ріст, цитотоксичні засоби, засоби, використовувані в променевій терапії, анти-ангіогенні засоби, апоптотичні засоби, антитубулінові засоби й інші засоби для лікування раку, такі як анти-НеR2-антитіла, анти-СD20-антитіла, антагоніст рецептора епідермального фактора росту (EGFR) (наприклад, інгібітор тирозинкіназ), інгібітор HER1/EGFR (наприклад, ерлотиніб (Tarceva), інгібітори тромбоцитарного фактора росту (наприклад, Gleevec (Іматинібу мезилат)), інгібітор СОХ-2 (наприклад, целекоксиб), інтерферони, цитокіни, антагоністи (наприклад, нейтралізуючі антитіла), що зв'язуються з однією або декількома з наступних мішеней EbВ2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, ВСМА або VEGF-рецептори (рецепторів), TRAIL/Apo2, і інші біоактивні й органічні хімічні засоби, і т.д. їх комбінації також включені в даний винахід. "Ангіогенним фактором або засобом" є фактор росту, що стимулює розвиток кровоносних судин, наприклад, стимулює ангіогенез, ріст ендотеліальних клітин, стабільність кровоносних судин і/або утворення і розвиток судин (тубулогенез) і т.д. Наприклад, ангіогенні фактори включають, але не обмежуються ними, наприклад, VEGF і члени сімейства VEGF, PLGF, сімейство PDGF, сімейство фібробластного фактора росту (FGF), ТІЕ-ліганди (ангіопоетини), ефрини, Del-1, фібробластні фактори росту: кислий (aFGF) і основний (bFGF), фолістатин, гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (G-CSF), фактор росту гепатоцитів (HGF)/фактор розсіювання (SF), інтерлейкін-8 (IL8), лептин, мідкін, плацентарний фактор росту, отриманий із тромбоцитів фактор росту ендотеліальних клітин (PD-ECGF), тромбоцитарний фактор росту, зокрема, PDGF-BB або PDGFR-beta, плейотропін (PTN), програнулін, проліферин, трансформуючий фактор росту альфа (TGF-альфа), трансформуючий фактор росту бета (TGF-бета), фактор некрозу пухлин альфа (TNF-альфа), ендотеліальний фактор росту судин (VEGF)/фактор проникності судин (VPF), і т.д. Цей термін включає також фактори, що прискорюють загоєння ран, такі як гормон росту, інсуліноподібний фактор росту І (IGF-I), VIGF, епідермальний фактор росту (EGF), 96788 44 CTGF і члени його сімейства і TGF-альфа і TGFбета. Див., наприклад, Klagsbrun and D'amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (наприклад, таблицю 1, що перелічує відомі ангіогенні фактори; і Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003). Термін "VEGF" використовується в даному контексті для ендотеліального фактора росту судин людини, що містить 165 амінокислот, і споріднених ендотеліальних факторів росту судин людини, що містить 121 амінокислоту, 189 амінокислот і 206 амінокислот, описаних Leung et al., Science, 246:1306 (1989), і Houck et al., Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), разом з їх природними алельними і процесованими формами. Термін "VEGF" стосується також VEGF видів нелюдини, таких як миша, щур або примат. Іноді VEGF конкретного виду вказується такими термінами, як hVEGF для VEGF людини або mVEGF для мишачого VEGF і т.д. Термін "VEGF" використовується також для позначення укорочених форм поліпептиду, що містять амінокислоти 8-109 або 1-109 ендотеліального фактора росту судин людини, що містить 165 амінокислот. Посилання на будь-які такі формі VEGF можуть бути знайдені в даній заявці, наприклад, "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" або "VEGF165". Положення амінокислот для "укороченого" нативного VEGF нумеруються як вказано в послідовності нативного VEGF. Наприклад, положення амінокислоти 17 (метіоніну) в укороченому нативному VEGF є також положенням 17 (метіоніном) у нативному VEGF. Укорочений нативний VEGF має афінність зв'язування у відношенні рецепторів KDR і Flt-1, порівнянну з афінністю нативного VEGF. Відповідно до переважного варіанта здійснення, VEGF є VEGF людини. "Антагоністом VEGF" називають молекулу, здатну до нейтралізації, блокування, інгібування, елімінації, зменшення активностей VEGF або перешкоджання активностям VEGF, у тому числі зв'язуванню її з одним або декількома рецепторами VEGF, або нуклеїновою кислотою, що кодує їх. Переважно, антагоніст VEGF зв'язує VEGF або рецептор VEGF. Антагоністи VEGF включають анти-VEGF-антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти, поліпептиди, що зв'язують VEGF і рецептори VEGF і блокують взаємодію ліганд-рецептор (наприклад, імуноадгезини, пептитіла), антитіла до рецептора VEGF і антагоністи рецептора VEGF, такі як низькомолекулярні інгібітори тирозинкіназ VEGFR, аптамери, що зв'язують VEGF, і нуклеїнові кислоти, що гібридизуються при жорстких умовах з послідовностями нуклеїнових кислот, що кодують VEGF або рецептор VEGF (наприклад, RNAi). Відповідно до одного переважного варіанта здійснення антагоніст VEGF зв'язується з VEGF і інгібує індуковану VEGF проліферацію клітин in vitro. Відповідно до одного переважного варіанта здійснення антагоніст VEGF зв'язується з VEGF або рецептором VEGF з більшою афінністю, ніж не-VEGF або нерецептор VEGF. Відповідно до одного переважного варіанта здійснення антагоніст VEGF зв'язується з VEGF або рецептором VEGF з Kd між 1 45 мкМ і 1 пМ. Відповідно до іншого переважного варіанта здійснення антагоніст VEGF зв'язується з VEGF або рецептором VEGF між 500 нМ і 1 пМ. Відповідно до одного переважного варіанта здійснення антагоніст VEGF вибраний із групи, що складається з поліпептиду, такого як антитіло, пептитіла, імуноадгезину, низькомолекулярної молекули або аптамеру. В одному переважному варіанті здійснення антитілом є анти-VEGF-антитіло, таке як антитіло AVASTIN або анти-VEGFрецептор-антитіло, таке як анти-VEGFR-2-антитіло або анти-VEGFR3-антитіло. Інші приклади антагоністів VEGF включають: VEGF-Trap, Mucagen, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (сорафеніб), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW786034, RWJ-417975/CT6758 і KRN-633. "Анти-VeGF-антитіло" є антитілом, що зв'язується з VEGF з достатньою афінністю і специфічністю. Переважно, анти-VeGF-антитіло за винаходом може бути використане як терапевтичний засіб у націлюванні на захворювання або стани і перешкоджанні захворюванням або станам, в яких бере участь активність VEGF. Анти-VeGF-антитіло зазвичайне буде зв'язуватися ні з іншими гомологами VEGF, такими як VEGF-B або VEGF-C, ні з іншими факторами росту, такими як PLGF, PDGF або bFGF. Переважним анти-VeGF-антитілом є моноклональне антитіло, що зв'язується з тим самим епітопом, що і моноклональне анти-VeGFантитіло А4.6.1, що продукується гібридомою АТСС НВ 10709. Більш переважно, анти-VeGFантитілом є рекомбінантне гуманізоване моноклональне анти-VeGF-антитіло, генероване згідно з Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599, у тому числі, без обмеження, антитіло, відоме як бевацизумаб (BV; Avastin). Відповідно до іншого варіанта здійснення, анти-VEGF-антитіла, що можуть бути використані, включають, але не обмежуються ними, антитіла, описані в WO 2005/012359. Відповідно до одного варіанта здійснення анти-VEGF-антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга будь-якого з антитіл, описаних на Фіг. 24, 25, 26, 27 і 29 WO 2005/012359 (наприклад, G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, В20, В20-4 і В20.4.1). В іншому переважному варіанті здійснення анти-VEGF-антитіло, відоме як ранібізумаб, є антагоністом VEGF, що вводиться для очного захворювання, такого як діабетична невропатія і AMD. Анти-VEGF-антитіло "Бевацизумаб (BV)", також відоме як "rhuMAb VEGF" або "AVASTIN" є гуманізованим моноклональним анти-VEGFантитілом, генерованим згідно з Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599. Воно містить мутовані каркасні області lgG1 людини і антигензв'язувальні визначальні комплементарність області з мишачого моноклонального анти-hVeGFантитіла А.4.6.1, що блокує зв'язування VEGF людини з його рецепторами. Приблизно 93% амінокислотної послідовності бевацизумабу, що включає більшість каркасних областей, зроблені з lgG1 людини, і приблизно 7% послідовності зроблені з 96788 46 мишачого антитіла А4.6.1. Бевацизумаб має молекулярну масу приблизно 149000 дальтон і є глікозильованим. Інші анти-VeGF-антитіла включають антитіла, описані в патенті США № 6884879 і WO 2005/044853. Анти-VeGF-антитіло ранібізумаб або антитіло LUCENTIS або rhuFab V2 є Fab-фрагментом гуманізованого, афінно зрілого антитіла проти VEGF людини. Ранібізумаб одержують стандартними способами рекомбінантної технології в експресуючому векторі Escherichia coli і бактеріальною ферментацією. Ранібізумаб не є глікозильованим і має молекулярну масу ~48000 дальтон. Див. WO98/45331 і US20030190317. Порушення регуляції ангіогенезу може призводити до ангіогерезу, що відхиляється від норми, тобто коли є надлишковий або невідповідний ріст нових кровоносних судин (наприклад, місце розташування, або час виникнення ангіогенезу є небажаними з медичної точки зору) у патологічному стані або коли він призводить до патологічного стану. Надлишковий, невідповідний або нерегульований ангіогенез має місце, коли є ріст нових кровоносних судин, що сприяє погіршенню патологічного стану або викликає патологічний стан. Нові кровоносні судини можуть живити патологічні тканини, руйнувати нормальні тканини і, у випадку раку, нові кровоносні судини можуть дозволити пухлинним клітинам уникнути переходу в кровотік і локалізуватися в інших органах (пухлинні метастази). Патологічні стани, що включають ненормальний ангіогенез, включають як не неопластичні, так і неопластичні стани, що включають, наприклад, рак, особливо васкулярізовані солідні пухлини і метастатичні пухлини (в тому числі рак ободової кишки, рак молочної залози, рак легені (особливо дрібноклітинний рак легені) або рак передміхурової залози), небажану аберантну гіпертрофію, артрит, ревматоїдний артрит (RA), запальне захворювання кишечнику або IBD (хвороба Крона і виразковий коліт), псоріаз, псоріатичні бляшки, саркоїдоз, атеросклероз, атеросклеротичні бляшки, діабетичну або інші проліферативні ретинопатії, у тому числі ретролетальну фіброплазію, неоваскулярну глаукому, пов'язану зі старінням дегенерацію жовтої плями, діабетичний макулярний набряк, корнеальну васкуляризацію, відторгнення корнеального трансплантата, ретинальну/хороїдальну неоваскуляризацію, неоваскуляризацію передньої поверхні райдужної оболонки (почервоніння), очне неоваскулярне захворювання, рестеноз судин, артеріовенозні мальформації (AVM), менінгіому, гемангіому, ангіофіброму, гіперплазії щитоподібної залози (у тому числі хвороба Грейвса), хронічне запалення, запалення легень, гостре легеневе ушкодження/ARDS, сепсис, первинну легеневу гіпертензію, злоякісні легеневі випоти, набряк головного мозку (наприклад, асоційований з гострим інсультом/закритим ушкодженням голови/травмою), синовіальне запалення, осифікувальний міозит, гіпертрофічне кісткоутворення, остеоартрит (ОА), рефрактерні (резистентні) асцити, полікістозне захворювання яєчника, ендометріоз, 3rd spacing of fluid захворювань (панкреатит, тунельний синдром, опіки, хво 47 роба кишечнику), маткові фіброїди, передчасні пологи, хронічне запалення, таке як IBD, відторгнення ниркового алотрансплантату, запальну хворобу травного тракту, нефротичний синдром, небажаний або аберантний ріст маси тканини (не раковий), гемофілічну артроподію, гіпертрофічні шрами, інгібування росту волосся, синдром Ослера-Вебера, піогенні гранулемні ретролентальні гіперплазії, склеродермію, трахому, спайки судин, синовіт, дерматит, передеклампсію, асцити, перикардіальний випіт (такий як випіт, асоційований з перикардитом) і плевральний випіт. У даному контексті термін "лікування" стосується клінічного втручання в спробі зміни природного ходу захворювання отримуючих лікування індивідуума або клітини, і воно може виконуватися або для профілактики, або під час розвитку клінічної патології. Бажані ефекти лікування включають запобігання появі або рецидиву захворювання, послаблення симптомів, зменшення будь-яких прямих або опосередкованих патологічних наслідків захворювання, запобігання метастазуванню, зменшення швидкості прогресування захворювання, послаблення або полегшення стану захворювання і ремісію або поліпшений прогноз. У деяких варіантах здійснення, антитіла за винаходом використовують для затримки розвитку захворювання або порушення. "Ефективною кількістю" є кількість, ефективна, у дозах і протягом необхідних періодів часу, для одержання бажаного терапевтичного або профілактичного результату. "Терапевтично ефективна кількість" речовини/молекули за винаходом може варіюватися відповідно до таких факторів, як стан захворювання, вік, стать і маса індивідуума і здатність речовини/молекули індукувати бажану відповідну реакцію в індивідуумі. Терапевтично ефективна кількість включає кількість, в якій будь-які токсичні або шкідливі для здоров'я ефекти речовини/молекули переважуються терапевтично корисними ефектами. Термін "терапевтично ефективна кількість" стосується кількості антитіла, поліпептиду або антагоніста за винаходом, ефективного для "лікування" захворювання або порушення у ссавця (також називаного пацієнтом). У випадку раку, терапевтично ефективна кількість лікарського засобу може зменшувати кількість ракових клітин; зменшувати розмір пухлини; інгібувати (тобто сповільнювати до деякої міри або переважно зупиняти) інфільтрацію ракових клітин у периферичні органи; інгібувати (тобто уповільнювати до деякої міри і переважно зупиняти) метастазування пухлини; інгібувати до деякої міри ріст пухлини і/або полегшувати до деякої міри один або декілька симптомів, асоційованих з раком. Що стосується міри, в якій лікарський засіб може попереджати ріст і/або вбивати існуючі ракові клітини, ця міра може бути цитостатичною і/або цитотоксичною. В одному варіанті здійснення терапевтично ефективна кількість є кількістю, що продовжує виживання пацієнта. В іншому варіанті здійснення терапевтично ефективна кількість є кількістю, що поліпшує виживання пацієнта без прогресування. 96788 48 "Профілактично ефективна кількість" є кількістю, ефективною у дозах і протягом необхідних періодів часу, для досягнення бажаного профілактичного результату. Зазвичай, але необов'язково, оскільки профілактичну дозу використовують у суб'єктів до захворювання або на ранніх стадіях захворювання, профілактично ефективна кількість повинна бути меншою, ніж терапевтично ефективна кількість. Термін "цитотоксичний засіб" стосується даному контексті речовини, що інгібує або запобігає клітинній функції і/або викликає деструкцію клітин. Передбачається, що вказаний термін включає ра211 131 125 90 діоактивні ізотопи (наприклад, At , І , І , Y , 186 188 153 212 32 Re , Re , Sm , Ві , Ρ і радіоактивні ізотопи Lu), хіміотерапевтичні засоби (наприклад, метотрексат, адріаміцин, вінкаалкалоїди (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалувальні засоби, ферменти і їх фрагменти, такі як нуклеолітичні ферменти, антибіотики і токсини, такі як токсини з малими молекулами або ферментативно активні токсини бактеріального, грибного, рослинного або тваринного походження, у тому числі їх фрагменти і/або варіанти, і різні протипухлинні або протиракові засоби, описані нижче. Інші цитотоксичні засоби описані нижче. Засіб, що знищує пухлинні клітини, викликає деструкцію пухлинних клітин. "Хіміотерапевтичний засіб" є хімічною сполукою, застосовною у лікуванні раку. Приклади хіміотерапевтичних засобів включають алкілувальні засоби, такі як тіотепа і CYTOXAN, циклофосфамід; алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа й уредопа; етиленіміни і метиламеламіни, що включають алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметилоломеламін; ацетогеніни (зокрема, булатацин і булатаціонон); дельта-9тетрагідроканабінол (дронабінол, MARINOL); бета-лапахон; лапахол; колхіцини; бетулінову кислоту; камптотецин (у тому числі синтетичний аналог топотекан (HYCAMTIN), СРТ-11 (іринотекан, CAMPTOSAR), ацетилкамптотецин, скополектин і 9-амінокамптотецин); бріостатин; калістатин; СС1065 (у тому числі його синтетичні аналоги адозелезин, карцелезин і бізелезин); подофілотоксин; подофілінову кислоту; теніпозид; криптофіцини (зокрема, криптофіцин 1 і криптофіцин 8); доластатин; дуокарміцин (у тому числі синтетичні аналоги, KW-2189 і СВ1-ТМ1); елеутеробін; панкратистатин; саркодиктилін; спонгістатин; азотні аналоги іприту, такі як хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамід, естрамустин, іфосфамід, меклоретамін, гідрохлорид меклоретаміноксиду, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, урацилпохідне іприту; нітрозо сечовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин і ранімнустин; антибіотики, такі як ендиїнові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, зокрема, каліхеаміцин гама II і каліхеаміцин омега II (див., наприклад, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)); динеміцин, у тому числі динеміцин А; еспераміцин; а також хромофор неокар 49 циностатин і споріднені хромопротеїни ендиїнові антибіотичні хромофори), аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, карабіцин, карміноміцин, скарцинофілін, хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6-діазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубіцин ADRIAMYCIN (у тому числі морфолінодоксорубіцин, ціаноморфоліно-доксорубіцин, 2піролідино-доксорубіцин і дезоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, такі як мітоміцин С, мікофенолову кислоту, ногаламіцин, оливоміцини, пепломіцин, порфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидін, убенімекс, зиностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринів, такі як флударабін, 6-меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; аналоги піримідинів, такі як анцитабін, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксіуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин; андрогени, такі як калустерон, дромо етанол она пропіонат, епітіостанол, мепітіостан, тестолактон; антиадренали, такі як аміноглутетимід, мітотан, трилостан; замінник фолієвої кислоти, такий як фролинова кислота; ацеглатон; альдофосфаміду глікозид; амінолевулінову кислоту; енілурацил; амсакрин; бестрабуцил; бісантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазихон; елфорнітин; еліптинію ацетат; епотилон; етоглуцид; галію нітрат; гідроксисечовину; лентинан; лонидаїнін; майтансиноїди, такі як майтансин і ансамітоцини; мітогуазон; мітоксинтрон; мопіданмол; нітраерин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лосоксантрон; 2-етилгідразид; прокарбазин; полісахаридний комплекс PSK (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; різоксин; сізоферан; спірогерманій; тенуазонову кислоту; триазихон; 2,2',2''трихлортриетиламін; трихотецени (зокрема, токсин Т-2, веракурін А, роридин А і ангуїдин); уретан; віндезин (ELDISINE, FILDESIN); дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("Ara-С"); тіотепа; таксоли, наприклад, паклітаксел TAXOL (BristolMyers Squibb Oncology, Princeton, N. J.), ABRAXANE, що не містить Кремофору, альбумін-вбудований препарат паклітакселу, що складається з наночастинок (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) і доцетаксел TAXOTERE (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабін (GEMZAR); 6тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платини, такі як цисплатин і карбоплатин; вінбластин (VELBAN); платину; етопозид (VP-16); іфосфамід; мітоксантрон; вінкристин (ONCOVIN); оксаліплатин; лейкововін; вінорелбін (NAVELBINE); новантрон; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; ібандронат; інгібітор топоізомерази RFS 2000; дифторметилорнітин (DMFO); ретиноїди, такі як ретинова кислота; капецитабін (XELOD А); фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якої з вищеописаних речовин; а також комбінації з двох або більше з вищео 96788 50 писаних сполук, такі як CHOP, абревіатура для комбінованого терапевтичного засобу з використанням циклофосфаміду, доксорубіцину, вінкристину і преднізолону, і FOLFOX, абревіатура для схеми лікування з використанням оксаліплатину (ELOXATIN), об'єднаного з 5-ФО і лейкововіном. Додаткові хіміотерапевтичні засоби включають цитотоксичні засоби, застосовні як кон'югати антитіло-лікарський засіб, такі як майтансиноїди (наприклад, DM1) і ауристатини ММАЕ і ММА. У це визначення включені також протигормональні засоби, що діють регулюючи, зменшуючи, блокуючи або інгібуючи дії гормонів, що можуть стимулювати ріст раку, і часто використовуються у формі, що підходить для системного лікування, або лікування всього організму. Вони самі можуть бути гормонами. Приклади включають антиестрогени і селективні модулятори рецептора естрогену (SERM), у тому числі, наприклад, тамоксифен (у тому числі тамоксифен NOLVADEX), ралоксифен EVISTA, дролоксифен, 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY1 17018, онапристон і тореміфен FARESTON; антипрогестерони; понижуючі регулятори рецептора естрогену (ERD); засобу, що функціонують, придушуючи або виключаючи яєчники, наприклад, агоністи рилізингфактора лютеїнізувального гормону (LHRH), такі як LUPRON і лейпроліду ацетат ELIGARD, госереліну ацетат, бусереліну ацетат і триптерелін; інші антиандрогени, такі як флутамід, нілутамід і бікалутамід; і інгібітори ароматази, які інгібують фермент ароматазу, що регулює продукування естрогену в надниркових залозах, такі як, наприклад, 4(5)-імідазоли, аміноглютетимід, мегестролу ацетат MEGASE, ексеместан AROMASIN, форместан, фадрозол, форозол RIVISOR, летрозол FEMARA і анастрозол ARIMIDEX. Крім того, таке визначення хіміотерапевтичних засобів включає бісфосфонати, такі як клодронат (наприклад, BONEFOS або OSTAC), етидронат DIDROCAL, NE-58095, золедронову кислоту/золедронат ZOMETA, алендронат FOSAMAX, памідронат AREDIA, тилудронат SKELID або ризедронат ACTONEL; а також троксацитабін (аналог цитозину 1,3-діоксаланнуклеозид); антисмислові олігонуклеотиди, зокрема, олігонуклеотиди, що інгібують експресію генів у шляхах передачі сигналу, які приблизно задіяні в аберантну проліферацію клітин, такі як, наприклад, РKС-альфа, Raf, H-Ras і рецептор епідермального фактора росту (EGF-R); вакцини, такі як вакцина THERATOPE, і вакцини генної терапії, наприклад, вакцина ALLOVTBCTIN, вакцина LEUVECTIN і вакцина VAXID; інгібітор топоізомерази 1 LURTOTECAN; ABARELIX rmRH; лапатинібу дитозилат (інгібітор з малою молекулою подвійної ErbВ-2 і EGFR тирозинкінази, також відомий як GW572016); і фармацевтично прийнятні солі, кислоти і похідні будь-якої з вищевказаних сполук. "Інгібуючим ріст засобом" називають, у даному контексті, сполуку або композицію, що інгібують росту і/або проліферацію клітини (наприклад, клітини, що експресує Robo4) in vitro або in vivo. Та 51 ким чином, інгібуючим ріст засобом може бути засіб, що значно зменшує відсоток клітин (наприклад, клітин, що експресують Robo4) у S-фазі. Приклади інгібуючих ріст засобів включають засоби, що блокують прогресування клітинного циклу (у місці, іншому, ніж S-фаза), такі як засоби, що індукують зупинку фази G1 і М-фази. Класичні блокатори М-фази включають алкалоїди Vinca (вінкристин і вінбластин), таксани й інгібітори топоізомерази II, такі як доксорубіцин, епірубіцин, даунорубіцин, етопозид і блеоміцин. Засоби, що зупиняють G1, беруть участь також у зупинці S-фази, наприклад, ДНК-алкілувальні засоби, такі як тамоксифен, преднізон, дакарбазин, меклоретамін, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил і аrа-С. Додаткова інформація може бути знайдена в Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), зокрема, стор. 13. Таксани (паклітаксел і доцетаксел) є протираковими засобами, отриманими з тиса. Доцетаксел (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer), отриманий з тиса європейського, є напівсинтетичним аналогом паклітакселу (TAXOL, Bristol-Myers Squibb). Паклітаксел і доцетаксел стимулюють зборку мікротрубочок з димерів тубуліну і стабілізують мікротрубочки запобіганням деполімеризації, що призводить до інгібування мітозу в клітинах. "Доксорубіцин" є антрацикліновим антибіотиком. Повна хімічна назва доксорубіцину (8S-цис)10-[(3-аміно-2,3,6-тридезокси--L-ліксогексапиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагідро-6,8,11тригідрокси-8-(гідроксіацетил)-1-метокси-5,12нафтацендіон. III. Анти-Robo4-антитіла В одному аспекті даний винахід забезпечує антитіла, що зв'язуються з Robo4. В одному варіанті здійснення анти-Robo4-антитіло є моноклональним антитілом. В одному варіанті здійснення анти-Robo4-антитіло є фрагментом антитіла, наприклад, фрагментом Fab, Fab'-SH, Fv, scFv або (Fab')2. В одному варіанті здійснення анти-Robo4антитіло є химерним, гуманізованим антитілом або антитілом людини. В одному варіанті здійснення анти-Robo4-антитіло є очищеним. В іншому аспекті винаходу забезпечені полінуклеотиди, що кодують анти-Robo4-антитіла. У деяких варіантах здійснення забезпечені вектори, які містять полінуклеотиди, що кодують анти-Robo4антитіла. У деяких варіантах здійснення забезпечені клітини-хазяїни, що містять такі вектори. В іншому аспекті винаходу забезпечені композиції, що містять анти-Robo4-антитіла, або полінуклеотиди, що кодують анти-Robo4-антитіла. У деяких варіантах здійснення композиція є фармацевтичною композицією для лікування захворювань і порушень, що включають, наприклад, рак, атеросклероз, ретролентальну фіброплазію, гемангіоми, хронічне запалення, внутрішньоочні неоваскулярні захворювання, проліферативні ретинопатії, діабетичну ретинопатію, пов'язану зі старінням дегенерацію жовтої плями (AMD), неоваскулярну глаукому, імунне відторгнення трансплантованої 96788 52 корнеальної тканини й інших тканин, ревматоїдний артрит, псоріаз і їх комбінації. Зразкові моноклональні антитіла, отримані з фагової бібліотеки, забезпечені в даному документі й описані в прикладах нижче. Ці антитіла названі YW71.6, YW71.1, YW71.22, YW71.89, YW79.1, YW79.8 і YW79.11. Вказані антитіла були афінно дозрілими для генерування YW71.22.S1.2, YW71.22S1.8, YW71.22S1.16, YW71.22S1.23, YW71.22S1.24, YW71.22S1.27, YW71.22S1.31, YW71.22S1.38, YW71.22S1.77 YW71.22.S2.21, YW71.22.S2.79, YW71.22.H1.2, YW71.22.H1.9, YW71.22.H1.46, YW71.22.H1.77, YW71.22.H1.91 і YW71.22.H2.31. Послідовності варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів антитіл представлені на Фіг. 1 і 2. Антитіло за винаходом може містити будь-які придатні каркасні послідовності легкого ланцюга людини або консенсусні каркасні послідовності легкого ланцюга людини, за умови, що антитіло виявляє біологічні характеристики (наприклад, бажану афінність зв'язування). В одному варіанті здійснення використовувані в даному документі консенсусні каркаси людини є консенсусними каркасними послідовностями підгрупи III VH (див. Фіг. 4А і 4В) і/або підгрупи І VL каппа (див. Фіг. 3A і 3B). Таким чином, акцепторний каркас VH людини може містити одну, дві, три або всі чотири з наступних каркасних послідовностей: FR1, що містить EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:13), FR2, що містить WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:14), FR3, що містить RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:15), FR4, що містить WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:16). В інших варіантах здійснення консенсусні каркаси VH включають: консенсусні каркаси 1-4 підгрупи І VH людини мінус CDR Кабата (SEQ ID NO:111, 112, 113, 16); консенсусні каркаси 1-4 підгрупи І VH мінус подовжені гіперваріабельні області (SEQ ID NO:114, 115, 113, 16 чи SEQ ID NO:114, 115, 116, 16 чи SEQ ID NO:114, 115, 117, 16); консенсусні каркаси 1-4 підгрупи II VH людини мінус CDR Кабата (SEQ ID NO:118, 119, 120, 16); консенсусні каркаси 1-4 підгрупи II VH людини мінус подовжені гіперваріабельні області (SEQ ID NO:121, 122, 120, 16 чи SEQ ID NO:121, 122, 123, 16 чи SEQ ID NO:121, 122, 124, 16); консенсусні каркаси 1-4 підгрупи III VH людини мінус CDR Кабата (SEQ ID NO:125, 126, 127, 16); консенсусні каркаси 1-4 підгрупи III VH людини мінус подовжені гіперваріабельні області (SEQ ID NO:128, 129, 127, 16 чи SEQ ID NO:128, 129, 130, 16 чи SEQ ID NO:128, 129, 131, 16); каркаси 1-4 акцептора 1 VH людини мінус CDR Кабата (SEQ ID NO:132, 126, 133, 16); каркаси 1-4 акцептора 1 VH людини мінус подовжені гіперваріабельні області (SEQ ID NO:128, 129, 133, 16 чи SEQ ID NO:128, 129, 134, 16); 53 каркаси 1-4 акцептора 2 VH людини мінус CDR Кабата (SEQ ID NO:132, 126, 135, 16); або каркаси 1-4 акцептора 2 VH людини мінус подовжені гіперваріабельні області (SEQ ID NO:128, 126, 135, 16 чи SEQ ID NO:128, 126, 136, 16 чи SEQ ID NO:128, 126, 137, 16). В одному варіанті здійснення каркасна область 4 акцептори VH людини (Н-FR4) містить WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:45). Каркас акцептора VL людини може містити одну, дві, три або чотири з наступних каркасних послідовностей: FR1, що містить DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:9), FR2, що містить WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:10), FR3, що містить GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:11), FR4, що містить FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:173) чи FGQGTKMEIKR (SEQ ID NO:139). В іншому варіанті здійснення консенсусні каркаси VL включають: консенсусні каркаси 1-4 підгрупи І VL каппа людини (SEQ ID NO:9, 10, 99, 100); консенсусні каркаси 1-4 підгрупи І VL каппа людини (SEQ ID NO:9, 101, 99, 100); консенсусні каркаси 1-4 підгрупи II VL каппа людини (SEQ ID NO:102, 103, 104, 100); консенсусні каркаси 1-4 підгрупи III VL каппа людини (SEQ ID NO:105, 106, 107, 100); або консенсусні каркаси 1-4 підгрупи IV VL каппа людини (SEQ ID NO:108, 109, 110, 100). Хоча акцептор може бути ідентичним за послідовністю вибраної каркасної послідовності людини, незалежно від того, чи походить він з імуноглобуліну людини або консенсусного каркаса людини, даний винахід припускає, що акцепторна послідовність може містити передіснуючі амінокислотні заміни відносно послідовності імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної послідовності людини. Передіснуючі заміни є переважно мінімальними; зазвичай тільки чотирма, трьома, двома розходженнями або одним розходженням відносно послідовності імуноглобуліну людини або консенсусної каркасної послідовності. Залишки гіперваріабельних областей антитіла нелюдини включають у каркаси акцепторів VL і/або VH людини. Наприклад, можна включити залишки, що відповідають залишкам CDR Кабата, залишки гіперваріабельних петель Хотіа, залишки Abm і/або контактні залишки. Необов'язково, включені залишки гіперваріабельних подовжених областей у такий спосіб: 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 8997 (L3), 26-35 (H1), 50-65 чи 49-65 (Н2) і 93-102, 94102 або 95-102 (H3). Хоча "включення" залишків гіперваріабельних областей обговорюється в даному документі, повинно бути зрозуміло, що воно може досягатися різними шляхами, наприклад, нуклеїнова кислота, що кодує бажану амінокислотну послідовність, може бути генерована мутуванням нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність варіабельного домену миші, так що її каркасні залишки змінюються на залишки акцепторного каркаса людини, 96788 54 або мутуванням нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність варіабельного домену людини, так що залишки гіперваріабельного домену змінюються на залишки нелюдини, або синтезом нуклеїнової кислоти, що кодує бажану послідовність, і т.д. У наведених у даному документі прикладах варіанти з трансплантованою гіперваріабельною областю генерували мутагенезом Кункеля нуклеїнової кислоти, що кодує акцепторні послідовності людини, з використанням окремого олігонуклеотиду для кожної гіперваріабельної області. Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987). Придатні зміни можуть бути введені в каркас і/або гіперваріабельну область, за допомогою рутинних способів, для корекції або відновлення правильних взаємодій гіперваріабельна область-антиген. А. Фрагменти антитіл Даний винахід включає фрагменти антитіл. Фрагменти антитіл можуть бути генеровані традиційними способами, такими як ферментативне розщеплення, або рекомбінантними способами. У деяких випадках маються переваги використання фрагментів антитіл, а не повних антитіл. Менший розмір фрагментів робить можливим швидкий кліренс і може призводити до поліпшеного доступу до солідних пухлин. У відношенні огляду деяких фрагментів антитіл див. Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134. Були розроблені різні способи для одержання фрагментів антитіл. Традиційно фрагменти одержували протеолітичним розщепленням інтактних антитіл (див., наприклад, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) і Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однак фрагменти можуть бути тепер продуковані безпосередньо рекомбінантними клітинамихазяїнами. Фрагменти антитіл Fab, Fv і scFv (усіх) можуть бути експресовані в Е. coli і секретовані з Е. coli, що робить можливим легке одержання великих кількостей фрагментів. Фрагменти антитіл можуть бути виділені з фагових бібліотек антитіл, обговорюваних вище. Альтернативно, фрагменти Fab'-SH можуть бути витягнуті безпосередньо з Е. coli і хімічно зв'язані з одержанням фрагментів F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Відповідно до іншого підходу, фрагменти F(ab')2 можуть бути виділені безпосередньо з культури рекомбінантних клітин-хазяїнів. Фрагменти Fab і F(ab')2 зі збільшеним часом напівжиття in vivo, що містять залишки єднального рецептор порятунку епітопа, описані в патенті США № 5869046. Інші способи одержання фрагментів антитіл будуть очевидними для кваліфікованого в даній галузі фахівця. У деяких варіантах здійснення антитіло є о дно ланцюжковим Fv-фрагментом (scFv). Див. WO 93/16185; патенти США №№ 5571894 і 5587458. Fv і scFv є єдиними різновидами з інтактними антигензв'язувальними сайтами, що позбавлені константних областей; таким чином, вони можуть бути придатні для зменшеного неспецифічного зв'язування під час використання in vivo. Можуть бути сконструйовані scFv-злиті білки для одержання злиття ефекторного білка на аміно- або карбоксикінці scFv. Див. Antibody EnGlneering, ed. Borrebaeck, вище. Фрагмент анти 55 тіла може бути також "лінійним антитілом", наприклад, як описано в патенті США № 5641870. Такі лінійні антитіла можуть бути моноспецифічними або біспецифічними. В. Гуманізовані антитіла Винахід включає гуманізовані антитіла. У даній галузі відомі різні способи гуманізації антитіл нелюдини. Наприклад, гуманізоване антитіло може мати один або декілька амінокислотних залишків, введених в нього, із джерела, що не є людиною. Амінокислотні залишки нелюдини часто називають "імпортними" залишками, що зазвичай беруться з "імпортного" варіабельного домену. Гуманізація може виконуватися власне кажучи згідно зі способом Winter et al. (Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-1536), заміною послідовностями гіперваріабельних областей відповідних послідовностей антитіла людини. Таким чином, такі "гуманізовані" антитіла є химерними антитілами (патент США № 4816567), в яких власне кажучи менше ніж один інтактний варіабельний домен людини був замінений відповідною послідовністю з виду, що не є людиною. На практиці гуманізовані антитіла є зазвичай антитілами людини, в яких деякі залишки гіперваріабельної області і, можливо, деякі залишки FR замінені залишками з аналогічних сайтів в антитілах гризуна. Вибір варіабельних доменів людини, як легкого ланцюга, так і важкого ланцюга, для використання в одержанні гуманізованих антитіл, може бути важливим для зменшення антигенності. Відповідно до так званого "best-fit" (найбільш пристосованого) способу, послідовність варіабельного домену антитіла гризуна піддають скринінгу проти всієї бібліотеки відомих послідовностей варіабельних доменів людини. Потім послідовність людини, що є найбільш близькою до послідовності гризуна, приймають як каркас людини для гуманізованого антитіла. Див., наприклад, Sims et al., (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Інший спосіб використовує конкретний каркас, зроблений з консенсусної послідовності всіх антитіл людини конкретної підгрупи легкого або важкого ланцюгів. Такий самий каркас може бути використаний для декількох інших гуманізованих антитіл. Див., наприклад, Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA, 89:4285; Presta et al., (1993) J. Immunol., 151:2623. Крім того, зазвичай бажано, щоб гуманізовані антитіла зберігали високу афінність у відношенні антигену й інші сприятливі біологічні властивості. Для досягнення цієї задачі, відповідно до одного способу, гуманізовані антитіла одержують способом аналізу вихідних послідовностей і різних умоглядних гуманізованих продуктів з використанням тривимірних моделей вихідних і гуманізованих послідовностей. Тривимірні моделі імуноглобуліну зазвичай є доступними і відомі кваліфікованим у даній галузі фахівцям. Доступні і комп'ютерні програми, що ілюструють і зображують можливі тривимірні конформаційні структури вибраних кандидатних послідовностей імуноглобулінів. Дослідження зображень дозволяє аналізувати 96788 56 можливу роль залишків у функціонуванні кандидатної послідовності імуноглобуліну, тобто аналізувати залишки, що впливають на здатність кандидатного імуноглобуліну зв'язуватися з його антигеном. Таким шляхом, залишки FR можуть бути відібрані і комбіновані з реципієнтних і імпортних послідовностей, так що досягається бажана властивість антитіла, така як збільшена афінність у відношенні антигену-мішені (антигенів-мішеней). Зазвичай залишки гіперваріабельної області беруть участь безпосередньо і найбільш суттєво в дії на зв'язування антигену. У деяких варіантах здійснення винахід забезпечує антитіла, що гуманізовані таким чином, що зменшується або елімінується реакція НАМА. Зменшення або елімінація реакції НАМА є важливим аспектом клінічного розвитку придатних терапевтичних засобів. Див., наприклад, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147: 1352; Reichmarm et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50: 1495. Варіанти антитіл можуть бути додатково отримані з використанням рутинних способів, відомих у даній галузі, деякі з яких додатково описані нижче. Наприклад, амінокислотна послідовність антитіла, описаного в даному документі, може служити як початкова (вихідна) послідовність для створення різноманіття каркасних і/або гіперваріабельних послідовностей. Вибрану каркасну послідовність, з якою зв'язують вихідну гіперваріабельну послідовність, називають у даному документі акцепторним каркасом людини. Хоча акцепторні каркаси людини можуть походити або бути отримані з імуноглобуліну людини (його VL і/або VH-областей), переважно акцепторні каркаси людини походять або отримані з послідовності консенсусного каркаса, тому що було показано, що такі каркаси мають мінімальну імуногенність, або не мають імуногенності, у пацієнтів-людей. Коли акцептор вибраний з імуноглобуліну людини, можна, необов'язково, вибрати каркасну послідовність людини, що вибирають на основі її гомології з донорською каркасною послідовністю зіставленням донорської каркасної послідовності з різними каркасними послідовностями людини в колекції каркасних послідовностей людини, і вибрати як акцептор найбільш гомологічну каркасну послідовність. С. Антитіла людини Антитіла людини за винаходом можуть бути сконструйовані об'єднанням послідовності (послідовностей) варіабельного домену Fv-клону, вибраної (вибраних) з бібліотек фагового дисплею на основі послідовностей людини, з відомою послідовністю (послідовностями) константного домену людини, описаними вище. Альтернативно, моноклональні антитіла людини за винаходом можуть бути отримані гібридомним способом. Лінії клітин мієломи людини і гетеромієломи миша-людина для одержання моноклональних антитіл людини були описані, наприклад, Kozbor J Immunol, 133 57 3001 (1984), Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc, New York, 1987) і Boerner et al., J. Immunol, 147 86 (1991). Тепер можна одержувати трансгенних тварин (наприклад, мишей), що здатні, після імунізації, продукувати повний репертуар (спектр) антитіл людини під час відсутності одержання ендогенного імуноглобуліну. Наприклад, було описано, що гомозиготна делеція гена з'єднуючої області важкого ланцюга (JH) антитіла у химерних або мутантних у відношенні зародкової лінії мишей призводить до повного інгібування ендогенного продукування антитіла. Перенос ряду генів імуноглобуліну зародкової лінії людини в таких мутантним у відношенні зародкової лінії мишей буде призводити до продукування антитіл людини після стимуляції антигеном. Див., наприклад, Jakobovits et al., ProcNatl Acad Sci USA, 90:2551 (1993), Jakobovits et al., Nature, 362 255 (1993), Bruggermann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993). Перетасування генів може бути також використане для одержання антитіл людини з антитіл нелюдини, наприклад, гризуна, де антитіло людини має подібні афінності і специфічності з вихідним антитілом нелюдини. Відповідно до цього способу, що також називають "імпринтингом епітопа", варіабельну область або важкого ланцюга, або легкого ланцюга фрагмента антитіла нелюдини, отриману способами фагового дисплею, описаними в даному документі, заміняють репертуаром (спектром) генів V-домену людини з одержанням популяції scFv- або Fab-химер ланцюг нелюдини/ланцюг людини. Відбір з антигеном призводить до виділення химерних scFv або Fab з ланцюгом нелюдини/ланцюгом людини, в яких ланцюг людини відновлює антигензв'язувальний сайт, зруйнований після видалення відповідної ланцюга нелюдини в первинному клоні фагового дисплею, тобто епітоп регулює (робить імпринтинг) вибір ланцюгапартнера людини. При повторенні цього процесу для заміни іншого ланцюга нелюдини, одержують антитіло людини (див. РСТ WO 93/06213, опублікований 1 квітня 1993 року). На відміну від традиційної гуманізації антитіл нелюдини трансплантацією CDR, вказаний спосіб забезпечує цілком людські антитіла, що не мають залишків FR або CDR, що походять з антитіл нелюдини. D. Варіанти антитіл У деяких варіантах здійснення обговорюється модифікація (модифікації) описаних у даному документі антитіл. Наприклад, може бути бажаним поліпшення афінності зв'язування і/або інших біологічних властивостей антитіла. Варіанти амінокислотної послідовності антитіла можуть бути отримані введенням придатних змін у нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло, або пептидним синтезом. Такі модифікації включають, наприклад, делеції залишків з антитіла і/або інсерції залишків в антитіло і/або заміни залишків в амінокислотних послідовностях антитіла. Будь-яка комбінація делеції, інсерції і заміни може бути зроблена для одержання кінцевої конструкції, за умови, що кінцева конструкція має бажані характеристики. Амінокислотні зміни можуть бути введені в амінокис 96788 58 лотній послідовності розглянутого антитіла в момент утворення послідовності. Застосовний спосіб ідентифікації деяких залишків або областей антитіла, що є переважними місцями розташування для мутагенезу, названий "аланін-скануючим мутагенезом", описаним Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 10811085. У ньому ідентифікують мішень або групу залишків-мішеней (наприклад, заряджені залишки, такі як arg, asp, his, lys i glu) і заміняють нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, аланіном або поліаланіном) для впливу на взаємодію амінокислот з антигеном. Потім місця розташування амінокислот, що демонструють функціональну чутливість до замін, поліпшують введенням додаткових або інших варіантів у сайтах замін або замість сайтів замін. Таким чином, хоча сайт для введення варіації амінокислотної послідовності є заздалегідь визначеним, характер мутації в сайті не може бути попередньо визначеним. Наприклад, для аналізу виконання мутації в конкретному сайті, проводять аланінсканування або випадковий мутагенез у мішені або ділянці-мішені, і експресовані імуноглобуліни піддають скринінгу на бажану активність. Інсерції амінокислотних послідовностей включають аміно- і/або карбоксикінцеві злиття, з довжиною від одного залишку до поліпептидів, що містять сто або більше залишків, а також інсерції єдиних або множинних амінокислотних залишків всередині послідовності. Приклади термінальних інсерцій включають антитіло з N-кінцевим метіонільним залишком. Інші інсерційні варіанти молекули антитіла включають злиття з N- або С-кінцем антитіла з ферментом (наприклад, для ADEPT) або поліпептидом, що збільшує час напівжиття в сироватці антитіла. У деяких варіантах здійснення антитіло за винаходом змінюють для збільшення або зменшення ступеня глікозилування антитіла. Глікозилування поліпептидів є зазвичай або N-зв'язаним, або Озв'язаним. N-зв'язаним називають приєднання вуглеводної частини до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-хсерин і аспарагін-х-треонін, де X є будь-якою амінокислотою, за винятком проліну, є послідовностями впізнавання для ферментативного приєднання вуглеводної частини до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, присутність кожної з трипептидних послідовностей у поліпептиді, створює потенційний сайт глікозилування. О-зв'язаним називають приєднання одного з цукрів Nацетилгалактозаміну, галактози або ксилози до гідроксіамінокислоти, найбільш звичайно серину або треоніну, хоча може бути також використаний 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Додавання або делецію сайтів глікозилування в антитілі зазвичай виконують зміною амінокислотної послідовності таким чином, що створюється або видаляється одна або декілька вищеописаних трипептидних послідовностей (для N-зв'язаних сайтів глікозилування). Ця зміна може бути також зроблена додаванням, делецією або заміною одного або декількох залишків серину чи треоніну в 59 послідовності вихідного антитіла (для О-зв'язаних сайтів глікозилування). Якщо антитіло містить Fc-область, може бути змінений приєднаний до нього вуглевод. Нативні антитіла, що продукуються клітинами ссавців, зазвичай містять розгалужений біантенний олігосахарид, що зазвичай приєднаний N-зв'язком до Asn297 СН2-домену Fc-області. Див., наприклад, Wright et al., (1997) TIBTECH 15:26-32. Вказаний олігосахарид може включати різні вуглеводи, наприклад, манозу, N-ацетилглюкозамін (GlcNAc), галактозу і сіалову кислоту, а також фукозу, приєднану до GlcNAc у "стеблі" біантенної олігосахаридної структури. У деяких варіантах здійснення можуть бути зроблені модифікації олігосахариду в антитілі за винаходом для створення варіантів антитіл з певними поліпшеними властивостями. Наприклад, забезпечені варіанти антитіл, що мають вуглеводну структуру, що позбавлена фукози, приєднаної (прямо або опосередковано) до Fc-області антитіла. Такі варіанти можуть мати поліпшену функцію ADCC. Див., наприклад, патенти США № US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Приклади публікацій, що стосуються "дефукозильованих" або "фукозонедостатніх" антитіл, включають: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Приклади клітинних ліній, здатних продукувати дефукозильованих антитіла, включають клітини СНО Lee13, недостатні у відношенні фукозилування білків (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Заявку на патент США № US 2003/0157108 A1, Presta, L; і WO 2004/056312 A1, Adams et al., зокрема, у прикладі 11), і лінії клітин з нокаутом гена, такого як ген альфа-1,6фукозилтрансферази, FUT8, клітини СНО з нокаутом (Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006) і WO2003/085107). Додатково забезпечені варіанти антитіл з розсіченими олігосахаридами, наприклад, в яких біантенний олігосахарид, приєднаний до Fc-області, розсічений GlcNAc. Такі варіанти антитіл можуть мати зменшене фукозилювання і/або поліпшену функцію ADCC. Приклади таких варіантів антитіл описані, наприклад, у WO 2003/011878 (JeanMairet et al.); патент США № 6602684 (Umana et al.); і US 2005/0123546 (Umana et al.). Забезпечені також варіанти антитіл щонайменше з одним залишком галактози в олігосахариді, приєднаному до Fc-області. Такі варіанти антитіл можуть мати збільшену функцію CDC. Такі варіанти антитіл описані, наприклад, у WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.) і WO 1999/22764 (Raju, S.). У деяких варіантах здійснення варіант антитіла містить Fc-область з однією або декількома амінокислотними замінами, що додатково поліп 96788 60 шують ADCC, наприклад, замінами в положеннях 298333 і/або 334 Fc-область (EU нумерація залишків). Такі заміни можуть зустрічатися в комбінації з будь-якими з вищеописаних варіацій. У деяких варіантах здійснення винахід розглядає варіант антитіла, що має деякі, але не всі ефекторні функції, які роблять його бажаним кандидатом для багатьох застосувань, в яких час напівжиття антитіла in vivo є важливим, але визначені ефекторні функції (такі як комплемент і ADCC) є необов'язковими або шкідливими. У деяких варіантах здійснення вимірюють Fc-активності антитіла для гарантії, що збережено тільки бажані властивості. Аналізи цитотоксичності in vitro і/або in vivo можуть бути проведені для підтвердження зменшення/виснаження активностей CDC і/або ADCC. Наприклад, можуть проводитися аналізи зв'язування Fc-рецептора (Fc) для гарантії того, що антитіло не має зв'язування FcR (отже, ймовірної відсутності активності ADCC), але зберігає здатність зв'язування FcRn. Первинні клітини для медиювання ADCC, NK-клітини, експресують тільки FcRIII, тоді як моноцити експресують FcRI, FcRII і FcRIII. Експресія Fc на гемопоетичних клітинах підсумована в таблиці 3 на сторінці 464 Raverh and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Необмежувальні приклади аналізів in vitro для оцінювання активності ADCC представляючої інтерес молекули описані в патенті США № 5500362 (див., наприклад, Hellstrom, I., et al., PNAS USA 83:70597063 (1986)) і Hellstrom, I. et al., PNAS USA 82:1499-1502 (1985; 5821337 (див. Bruggemann, Μ. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Альтернативно, можуть бути використані нерадіоактивні способи аналізу (див, наприклад, нерадіоактивний аналіз цитотоксичності АСТІ для проточної цитометрії (CellTechnology, Inc. Mountain Fiew, CA і нерадіоактивний аналіз цитотоксичності CytoTox 96 (Promega, Madison, WI). Застосовні ефекторні клітини для таких аналізів включають мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) і природні клітини-кілери (NK). Альтернативно або додатково, активність ADCC молекули, що представляє інтерес, може бути оцінена in vivo, наприклад, у моделі тварини, такої як описана в dynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998). Аналізи зв'язування C1q можуть також проводитися для підтвердження, що антитіло нездатне зв'язувати C1q і, отже, позбавлене активності CDC. Для оцінки активації комплементу може виконуватися аналіз CDC (див, наприклад, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:165 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003) і Gragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Визначення зв'язування FcRn і кліренсу in vivo/часу напівжиття можуть також проводитися з використанням спсобів, відомих у даній галузі (див, наприклад, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)). Забезпечено інші варіанти антитіл, які мають одну або декілька амінокислотних замін. Представляючі інтерес сайти для замінювального мутагенезу включають гіперваріабельні області, але обговорюються також зміни FR. Консервативні заміни показані в таблиці 1 під заголовком "пере