Спосіб рафінування олії

Реферат: Винахід належить до способу рафінування олії, який включає: i-a) змішування водного розчину кислоти з олією з отриманням кислотної суміші, що має pH приблизно 1-4, де кислота вибрана з фосфорної кислоти, оцтової кислоти, лимонної кислоти, виннокам′яної кислоти, бурштинової кислоти і їх сумішей; i-b) змішування основи з кислотною сумішшю з отриманням суміші, яка прореагувала, що має pH приблизно 6-8, де змішування на стадіях i-a) і/або i-b) забезпечує емульсію, яка містить щонайменше приблизно 60 % водної фази по об'єму з розміром крапель приблизно 15 мкм до приблизно 45 мкм, де основа вибрана з гідроксиду натрію, гідроксиду калію, силікату натрію, карбонату натрію, карбонату кальцію і їх комбінації; і UA 111708 C2 (12) UA 111708 C2 і-с) змішування ферменту фосфоліпази з емульсією стадії i-b), де фермент фосфоліпази має амінокислотну послідовність, вказану в SEQ ID NO: 8. Винахід, також, належить до способу одержання фосфатидилінозитолу за стадіями та, що включає i-a) змішування водного розчину кислоти з олією з одержанням кислотної суміші, що має pН приблизно 1-4, де кислота вибрана з фосфорної кислоти, оцтової кислоти, лимонної кислоти, виннокам′яної кислоти, бурштинової кислоти і їх сумішей; -b) змішування основи з кислотною сумішшю з одержанням суміші, яка прореагувала, що має pН приблизно 6-8, де основа вибрана з гідроксиду натрію, гідроксиду калію, силікату натрію, карбонату натрію, карбонату кальцію і їх комбінації; і змішування на стадіях i-a) і/або i-b) забезпечує емульсію, що містить щонайменше приблизно 60 % водної фази із середнім розміром крапель приблизно 15 мкм до приблизно 45 мкм; i-c) перемішування ферменту фосфоліпази, що має амінокислотну послідовність, вказану в SEQ ID NO: 8, і i-d) виділення фосфатидилінозитолу. UA 111708 C2 5 10 СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ По даній заявці заявляється пріоритет по умовній заявці США No. 61/252638, поданій 16 жовтня 2009 року. Зміст вказаної вище заявки включений в цей документ як посилання в повному об'ємі. ПОСИЛАННЯ НА СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ, НАДАНИЙ ЧЕРЕЗ EFS-WEB Ця заявка була подана в електронній формі через сервер USPTO EFS-WEB, що дозволено і указано в MPEP § 1730 II.B.2.(a)(А), і ці подані в електронній формі документи включають представлений в електронній формі список послідовностей (SEQ ID); повний зміст цього списку послідовностей включений в цей документ як посилання для будь-яких цілей. Список послідовностей позначений на поданому в електронному вигляді файлs.txt таким чином: Назва файлу 001631-0051-888_SeqListing. txt 15 20 25 30 35 40 45 Дата створення 15 жовтня 2009 року Розмір 17,4 кбайт ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується, головним чином, ферментів фосфоліпаз, полінуклеотидів, що кодують ці ферменти, способів отримання і застосування цих полінуклеотидів і поліпептидів. У альтернативних варіантах здійснення винахід стосується ферментів фосфатидилінозитолспецифічної фосфоліпази С (PI-PLC), нуклеїнових кислот, що кодують їх, антитіл, які специфічно зв'язуються з ними і способів їх отримання і застосування. Передбачаються промислові способи і продукти, що включають застосування цих фосфоліпаз. Також в цьому документі передбачаються способи гідратації негідратованих фосфоліпідів (NHP) в ліпідній матриці. Способи забезпечують міграцію NHP до поверхні контакту олія-вода, тим самим дозволяючи проведення реакції або видалення NHP з ліпідів. У певних варіантах здійснення передбачаються способи видалення NHP, гідратованих фосфоліпідів і лецитинів (в сукупності, відомих як "камеді") з рослинних олій з отриманням продукту у вигляді рафінованої олії або жиру, які можна використовувати для виробництва продуктів харчування і/або нехарчових застосувань. У певних варіантах здійснення в цьому документі передбачені способи гідратації NHP з подальшою ферментативною обробкою і видаленням різних фосфоліпідів і лецитинів. Способи, представлені в цьому документі, можна застосовувати на практиці або для неочищених, або для рафінованих гідратацією олій. У певному варіанті здійснення в цьому документі передбачені способи отримання фосфоліпідів з харчової олії. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Неочищені рослинні олії, які отримуються способами або пресування, або екстракції розчинником, являють собою комплексну суміш триацилгліцеринів, фосфоліпідів, стеринів, токоферолів, вільних жирних кислот, металевих мікроелементів і інших менш значних сполук. Є бажаним видалення фосфоліпідів, вільних жирних кислот і металевих мікроелементів для отримання якісної салатної олії з м'яким смаком, світлим кольором і тривалим терміном придатності, або масла, придатного для перетворення в сировину, готову для хімічної або ферментативної конверсії в біопаливо (метилові або етилові складні ефіри), біопластик (епоксидоване масло) і інші традиційні матеріали на основі нафти. Видалення фосфоліпідів зумовлює практично всі втрати, пов'язані з очищенням рослинних олій. Більшість молекул фосфоліпідів мають як гідрофільну функціональну групу, так і ліпофільні ланцюги жирних кислот, вони звичайно є чудовими природними емульгаторами. Функціональна група в фосфоліпідах може являти собою будь-яку або декілька з множини відомих типів, деякі з яких проілюстровані на схемі 1 нижче. 1 UA 111708 C2 5 10 Фосфоліпіди, які містять функціональні групи: -холін, -інозитол і -етаноламін, мають найкращу афінність до води, в той час як кислоти, солі кислот (з кальцієм (Ca), магнієм (Mg) і залізом (Fe)) і солі -етаноламіну (Ca, Mg і Fe) мають значно нижчу афінність до води. Фосфатидна кислота і солі фосфатидної кислоти широко відомі як "негідратовані фосфоліпіди" або NHP. Таблиця 1 містить відносні ступені гідратації різних фосфоліпідів, як описано в Sen Gupta, A. K., Fette Seifen Anstrichmittel 88, pages 79-86 (1986), і пізніше в Segers, J.C., et al., "Degumming-Theory and Practice", опублікованої American Oil Chemists's Society в "Edible fats and Oils processing: basic principals and modern practices: World conference proceedings" / edited by David Erickson, (1990) pages 88-93. Таблиця 1 Відносні ступені гідратації Фосфоліпіди Фосфатидилхолін (PC) Фосфатидилінозитол (PI) Кальцієва сіль фосфатидилінозитолу Фосфатидилетаноламін (PE) Фосфатидна кислота (PA) Кальцієва сіль фосфатидилетаноламіну Кальцієва сіль фосфатидної кислоти 15 20 25 Відносний ступінь гідратації 100 44 24 16 8,5 0,9 0,6 Солі фосфоліпідів з кальцієм, магнієм і залізом утворюються ферментом, присутнім в олійному насінні, фосфоліпазою D (PLD). Фермент залишається недіючим в зрілому насінні доти, поки не ушкоджується захисне покриття насіння в ході зберігання або "підготовки" насіння перед витяганням олії. Реакція PLD в насінні приводить до відщеплення -холіну, -інозитолу, серину або -етаноламіну від фосфатної групи з утворенням Фосфатидної кислоти (PA). Крім того, оскільки відщеплення відбувається в присутності надлишку двовалентних металів (Ca, Mg і Fe), утворюються NHP. Комплекс фосфатидної кислоти з іонами кальцію представлений нижче: Фосфоліпіди звичайно вимірюють в олії як "вміст фосфору" в мільйонних частках. У таблиці 2 представлені типові кількості фосфоліпідів, присутніх в основних олійних культурах, і розподіл 2 UA 111708 C2 різних функціональних груп як процент фосфоліпідів, присутніх в олії. Соєва олія Таблиця 2 Типові рівні і розподіл фосфоліпідів для основного олійного насіння Фосфор (м.ч.) РС (%) РЕ (%) РА (%) РS (%) PI (%) 5 10 Соєва олія 400-1500 12-46 8-34 2-21 < 0.5 2-15 Олія каноли 200-900 25-40 15-25 10-20 < 0.5 2-15 Соняшникова олія 300-700 29-52 17-26 15-30 < 0.5 11-22 У таблиці 3 нижче представлені типові кількості і розподіли фосфоліпідів для соєвих камедей. У таблиці 3, "як є" означає типову композицію фосфоліпідів, видалених з рослинної олії, з утримуваною олією (2 молекули фосфоліпідів і 1 молекула олії), що дає вміст нерозчинних в ацетоні речовин, який дорівнює 67%. "Нормалізована" означає композицію фосфоліпідів без якої-небудь присутньої олії, що дає вміст нерозчинних в ацетоні речовин, який дорівнює 100%. Таблиця 3 Типові кількості фосфоліпідів і розподіли для соєвих камедей Фосфатидилхолін (PC) Фосфатидилетаноламін (PE) Фосфатидилсерин (PS) Фосфатидна кислота (PA) Фосфатидилінозитол (PI) Усього 15 20 25 30 35 Процент "як є" 33,9 14,3 0,4 6,4 16,8 71,8 Процент для "нормалізованої" 47,2 19,9 0,6 8,9 23,4 100,0 Конверсія фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну, фосфатидилсерину, фосфатидилінозитолу і фосфатидної кислоти в їх лізо- або фосфоформи значно змінює економічні показники рафінування в сучасному промисловому процесі очищення. Конверсія всіх фосфоліпідів в їх лізоформи, яка усуває втрату нейтральних олій, відповідає збільшенню виходу аж до 1,4%, в той час як конверсія всіх фосфоліпідів в їх фосфоформи відповідає збільшенню виходу олії аж до 3,0% для неочищеної олії із вмістом фосфору 1000 м. ч. протягом рафінування гідратацією. Фосфоліпіди можна частково або повністю видаляти з рослинних олій декількома різними відомими способами. Найбільш широко використовуваними процесами в промисловості є рафінування гідратацією, рафінування кислотою, очищення лугом і ферментативне рафінування. Ілюстративні способи описані в патентах США No. 4049686; 4698185; 5239096; 5264367; 5286886; 5532163; 6001640; 6103505; U.S. 6127137; 6143545; 6172248; 6548633; 7494676 і 7226771, і публікаціях США no. 2007/0134777, 2005/0059130, 2008/0182322 і 2009/0069587. Існуючі способи не є достатніми для видалення або реакції негідратованих фосфоліпідів, присутніх в олії, оскільки NHP не доступні для гідратації або реакції для забезпечення їх видалення. Існує потреба в економічних і ефективних способах видалення NHP, гідратованих фосфоліпідів і лецитинів (в сукупності відомих як "камеді") з рослинних олій для отримання продукту у вигляді рафінованої олії або жиру, які можна використовувати для виробництва продуктів харчування і/або нехарчових застосувань. Фосфоліпази являють собою ферменти, які гідролізують складноефірні зв'язки фосфоліпідів. Відповідно до їх значення в метаболізмі фосфоліпідів, ці ферменти широко поширені серед прокаріот і еукаріот. Фосфоліпази впливають на метаболізм, конструювання і реорганізацію біологічних мембран і залучені до каскадів передачі сигналу. Відомо декілька типів фосфоліпаз, які відрізняються їх специфічністю в залежності від положення зв'язку, на 3 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 який здійснюється вплив в молекулі фосфоліпіду. Ферменти фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC) являють собою сімейство еукаріотичних внутрішньоклітинних ферментів, які відіграють важливу роль в процесах передачі сигналу. Каталізована PI-PLC реакція являє собою: 1-фосфатидил-1D-міоінозитол 4,5-біфосфат (який також називається PIP2, фосфатидилінозитолбіфосфатом) + H2O↔1D-міоінозитол 1,4,5-трифосфат (який також називається IP3, інозитолтрифосфатом) + діацилгліцерин. Сімейства ферментів фосфоліпази С (PLC) ідентифіковані в бактеріях і в еукаріотичних трипаносомах. Ферменти PLC стосуються сімейства гідролаз і фосфодіестераз. PLC беруть участь в метаболізмі фосфатидилінозитол-4,5-біфосфату (PIP2) і каскадах ліпідної передачі сигналу залежним від кальцію чином. Ізоформи PLC можуть відрізнятися їх способом активації, рівнями експресії, каталітичною регуляцією, локалізацією в клітині, авідністю зв’язування з мембранами і розподілом в тканинах. Всі вони здатні каталізувати гідроліз PIP 2 на дві важливих молекули вторинних посередників, які продовжують каскад для зміни клітинних відповідей, таких як проліферація, диференціювання, апоптоз, ремоделювання цитоскелету, везикулярний транспорт, провідність іонних каналів, ендокринна функція і нейротрансмісія. PLC описані, наприклад, в Carmen G., J. Biol. Chem. 270 (1995) 1871 1-18714, Jianag Y., J. Biol. Chem, 271 (1996) 29528-29532, Waggoner D., J. Biol. Chem. 270 (1995) 19422-19429, Molecular Probes Product Sheet 2001, і Sano et al, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281: 844-851, 2001. Ферменти фосфоліпази A1 (PLA1) видаляють жирну кислоту в 1 положенні з утворенням вільної жирної кислоти і 1-лізо-2-ацилфосфоліпіду. Ферменти фосфоліпази A2 (PLA2) видаляють жирну кислоту у 2 положенні з утворенням вільної жирної кислоти і 1-ацил-2лізофосфоліпіду. Ферменти PLA1 і PLA2 можуть бути внутрішньо- або позаклітинними, мембранозв’язаними або розчинними. Внутрішньоклітинна PLA2 зустрічається практично в кожній клітині ссавців. Ферменти фосфоліпази С (PLC) видаляють фосфатну групу з утворенням 1,2-діацилгліцерину і фосфатного складного ефіру. Ферменти фосфоліпази D (PLD) утворюють 1,2-діацилгліцерофосфат і основну групу. СУТЬ ВИНАХОДУ У даному документі передбачаються поліпептиди і полінуклеотиди, які кодують поліпептиди, що мають активність фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC) або еквівалентного ферменту, і/або активність іншої фосфоліпази, включаючи активність фосфоліпази А, В, С, D, пататину, фосфатази фосфатидної кислоти (PAP) і/або ацилгідролази ліпідів (LAH) або еквівалентного ферменту, і способи отримання і застосування цих полінуклеотидів і поліпептидів. У одному аспекті в цьому документі передбачаються поліпептиди, наприклад, ферменти, які мають активність фосфоліпази, наприклад, активність фосфоліпази А, В, D або С, наприклад, активність фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC). Ферментативна активність поліпептидів і пептидів, представлених в цьому документі, включає (містить або складається з) активність фосфоліпази, активність фосфоліпази С або активність фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC), включаючи гідроліз ліпідів, реакції ацидолізу (наприклад, заміну етерифікованої жирної кислоти вільною кислотою), реакції трансетерифікації (наприклад, обмін жирними кислотами між триацилгліцеридами), синтез складних ефірів, реакції переетерифікації, і активність ацилгідролази ліпідів (LAH). У іншому аспекті поліпептиди, представлені в цьому документі, використовують для синтезу енантіомерно чистих хіральних продуктів. Поліпептиди, представлені в цьому документі, можна використовувати в різних фармацевтичних, сільськогосподарських і промислових контекстах, включаючи виробництво косметичних засобів і нутрицевтиків. Крім того, поліпептиди, представлені в цьому документі, можна використовувати в харчовій промисловості, пивоварінні, добавках для ванн, виробництві спирту, синтезі пептидів, енантіоселективності, отриманні шкур в шкіряній промисловості, обробці відходів і деградації тваринних відходів, регенерації срібла в фотопромисловості, медичному обслуговуванні, знеклеюванні шовку, деградації біоплівки, конверсії біомаси в етанол, біологічному захисті, протимікробних засобах і дезінфікуючих засобах, засобах для персонального догляду і косметичних засобах, біотехнологічних реагентах, в збільшенні виходу крохмалю в процесі вологого подрібнення кукурудзи, і як фармацевтичні засоби, такі як засоби, які сприяють травленню, і протизапальні (антифлогістонні) засоби. У певних варіантах здійснення в цьому документі передбачаються композиції (наприклад, фосфоліпаза, фосфоліпаза С, фосфатидилінозитол-специфічна фосфоліпаза С (PI-PLC)) і способи отримання олій з низьким вмістом фосфоліпідів, наприклад, олій з більш низьким вмістом фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну, фосфатидилсерину, фосфатидилінозитолу і/або фосфатидної кислоти. Композицією або способом, передбаченими 4 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в цьому документі, можна обробляти будь-яке масло, наприклад, рослинну олію, наприклад, олію каноли, соєву олію або тваринне масло або жир, наприклад, сало. Будь-які продукти харчування, готові в їжу продукти, або продукти випікання, смажіння або варіння (наприклад, соуси, маринади, приправи, розпилювані олії, маргарини, масла для випікання, майонез, кулінарні жири, салатні олії, приправи, що зачерпуються ложкою і наливаються, і т. п., і продукти, виготовлені з ними) можуть містити рослинну олію або тваринний жир, оброблені композицією або способом, передбаченими в цьому документі. Рослинні олії, модифіковані в олії з більш низьким вмістом фосфоліпідів, можна застосовувати в будь-яких продуктах харчування, придатних в їжу продуктах або продуктах випікання або варіння, наприклад, соусах, маринадах, приправах, розпилюваних оліях, маргаринах, маслах для випікання, майонезі, кулінарних жирах, салатних оліях, приправах, які зачерпуються ложкою і наливаються, і т. п. В одному варіанті здійснення в цьому документі передбачені масла, такі як рослинні олії, наприклад, олія каноли або соєва олія, і продукти харчування або продукти випікання або варіння, включаючи соуси, маринади, приправи, розпилювані олії, маргарини, масла для випікання, майонез, кулінарні жири, салатні олії, приправи, які зачерпуються ложкою і наливаються, і т. п., де масло або продукт харчування, продукт випікання або варіння модифіковані з використанням ферменту, представленого в цьому документі. У одному аспекті ці рослинні олії, наприклад, олія каноли, рицинова олія, кокосова олія, коріандрова олія, кукурудзяна олія, бавовняна олія, олія лісового горіха, конопляна олія, льняна олія, олія пінника лучного, оливкова олія, пальмова олія, пальмоядрова олія, арахісова олія, ріпакова олія, рисова олія, сафлорова олія, олія сасанкви, соєва олія, соняшникова олія, талове масло, олія камелії, різні види "природних" олій, що мають змінений склад жирних кислот, отриманих за допомогою генетично модифікованих організмів (GMO) або традиційної "селекції", такі як високоолеїнова, низьколіноленова або низьконасичена олія (високоолеїнова олія каноли, низьколіноленова соєва олія або високостеаринові соняшникові олії), тваринні жири (таловий жир, сало, жир масла і курячий жир), риб'ячий жир (жир тихоокеанської корюшки, жир печінки тріски, жир хоплостета, жир сардин, жир оселедця і жир менхадена), або суміші будь-якого з вказаних вище, і продукти харчування або продукти випікання, жаріння або варіння, містять олії з більш низьким вмістом жирних кислот, включаючи олії з низьким вмістом пальмітинової кислоти, міристинової кислоти, лауринової кислоти, стеаринової кислоти, каприлової кислоти (октанова кислота) і т. д., перероблені з використанням композиції або способу, представлених в цьому документі. У одному аспекті в цьому документі передбачені поліпептиди, наприклад, ферменти і каталітичні антитіла, які мають активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC), термостабільні і термостійкі види ферментативної активності, і специфічні до жирних кислот або селективні до жирних кислот види активності, і види ферментативної активності, стійкі до низьких або високих значень pH, і полінуклеотиди, що кодують ці поліпептиди, включаючи вектори, клітини-хазяї, трансгенні рослини і тварини, що не є людиною, і способи отримання і застосування цих полінуклеотидів і поліпептидів. У іншому аспекті в цьому документі передбачаються виділені, синтетичні або рекомбінантні нуклеїнові кислоти (a), які кодують поліпептид, що має ферментативну активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PIPLC), і (i) які мають щонайменше приблизно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або більше, або 100% ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 5 і кодують поліпептид, що має щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять, двадцять, двадцять одну, двадцять дві, двадцять три, двадцять чотири, двадцять п'ять, двадцять шість, двадцять сім, двадцять вісім, двадцять дев'ять або тридцять або більше, або всі з амінокислотних змін (мутацій), що складаються зі змін, описаних в таблиці 12, таблиці 13, таблиці 14 і/або таблиці 15, або еквівалентних амінокислотних замін або мутацій, або будь-яку їх комбінацію, і необов'язково ідентичність послідовностей визначають за допомогою аналізу з алгоритмом порівняння послідовностей або візуальним дослідженням, і необов'язково алгоритм порівняння послідовностей являє собою алгоритм BLAST версії 2.2.2, де встановлені параметри фільтрування: "blastall-p blastp-d nr pataa" -F F, і всі інші параметри встановлені як параметри за умовчанням; (ii) які кодують поліпептид, який має амінокислотну послідовність, як указано в SEQ ID NO: 6 і має щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, 5 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять, двадцять, двадцять одну, двадцять дві, двадцять три, двадцять чотири, двадцять п'ять, двадцять шість, двадцять сім, двадцять вісім, двадцять дев'ять або тридцять або більше, або всі з амінокислотних змін (мутацій), що складаються зі змін, описаних в таблиці 12, таблиці 13, таблиці 14 і/або таблиці 15, або еквівалентних амінокислотних змін або замін (мутацій), або будь-яку їх комбінацію, (iii) які гібридизуються в жорстких умовах з нуклеїновою кислотою, яка містить SEQ ID NO: 5 і кодує поліпептид, що має щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять, двадцять, двадцять одну, двадцять дві, двадцять три, двадцять чотири, двадцять п'ять, двадцять шість, двадцять сім, двадцять вісім, двадцять дев'ять або тридцять або більше, або усі з амінокислотних змін (мутацій), що складаються зі змін, описаних у таблиці 12, таблиці 13, таблиці 14 і/або таблиці 15, або еквівалентних амінокислотних або змін замін (мутацій), або будь-яку їхню комбінацію, де жорсткі умови включають стадію промивання, що включає промивання в 0,2× SSC при температурі приблизно 65 °C протягом приблизно 15 хвилин; (iv) які являють собою нуклеїнову кислоту, що містить послідовність SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 або SEQ ID NO: 10 або складається з них; або (v) які мають щонайменше приблизно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або більше, або 100% ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 або SEQ ID NO: 10; (b) послідовність нуклеїнової кислоти згідно з (a), що кодує поліпептид, який має ферментативну активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази C, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази C (PI-PLC), але позбавлена нативної сигнальної послідовності або амінокислотної послідовності пробілка; (c) послідовність нуклеїнової кислоти згідно з (a) або (b), що кодує поліпептид, який має ферментативну активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази C, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази C (PI-PLC), але позбавлена нативної промоторної послідовності; (d) нуклеїнова кислота згідно з (c), крім того, що містить гетерологічну промоторну послідовність або іншу послідовність регуляції транскрипції; (e) послідовність нуклеїнової кислоти за будь-яким з (a)-(d), крім того, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує гетерологічну амінокислотну послідовність, або, крім того, що містить гетерологічну нуклеотидну послідовність; (f) нуклеїнова кислота згідно з (e), де нуклеїнова кислота, яка кодує гетерологічну амінокислотну послідовність, містить або складається з послідовності, яка кодує гетерологічну (лідерну) сигнальну послідовність, абомітку або епітоп, або гетерологічна нуклеотидна послідовність містить гетерологічну промоторну послідовність; (g) нуклеїнова кислота згідно з (d), (e) або (f), де гетерологічна нуклеотидна послідовність кодує гетерологічну (лідерну) сигнальну послідовність, що містить або складається з Nкінцевого і/або C-кінцевого подовження для направлення в ендоплазматичну мережу (ER) або ендомембрану, або в рослинну ендоплазматичну мережу (ER) або ендомембранну систему, або гетерологічна послідовність кодує ділянку рестрикції; (h) нуклеїнова кислота згідно з (d), (e) або (f), де гетерологічна промоторна послідовність містить або складається з конститутивного або індуцибельного промотору, або специфічного для типу клітин промотору або специфічного для рослини промотору або специфічного для бактерій промотору; (і) нуклеїнова кислота згідно з будь-яким з (a)-(h), де активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази C, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази C (PI-PLC), є термостабільною; (j) нуклеїнова кислота згідно з будь-яким з (a)-(h), де активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази C, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази C (PI-PLC), є термостійкою; (k) послідовність нуклеїнової кислоти повністю комплементарна нуклеотидній послідовності згідно з будь-яким з (a)-(j). В одному аспекті виділена, синтетична або рекомбінантна нуклеїнова кислота кодує поліпептид або пептид, що має активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази C, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази C (PI-PLC), що є термостабільною. Поліпептиди і пептиди, які кодуються нуклеїновими кислотами, представленими в даному документі, або будь-який поліпептид або пептид, представлений у даному документі, можуть зберігати ферментативну або зв’язувальну активність (наприклад, зв'язування субстрату) в умовах, які 6 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включають діапазон температур від приблизно -100°C до приблизно -80°C, від приблизно -80°C до приблизно -40°C, від приблизно -40°C до приблизно -20°C, від приблизно -20°C до приблизно 0°C, від приблизно 0°C до приблизно 5°C, від приблизно 5°C до приблизно 15°C, від приблизно 15°C до приблизно 25°C, від приблизно 25°C до приблизно 37°C, від приблизно 37°C до приблизно 45°C, від приблизно 45°C до приблизно 55°C, від приблизно 55°C до приблизно 70°C, від приблизно 70°C до приблизно 75°C, від приблизно 75°C до приблизно 85°C, від приблизно 85°C до приблизно 90°C, від приблизно 90°C до приблизно 95°C, від приблизно 95°C до приблизно 100°C, від приблизно 100°C до приблизно 105°C, від приблизно 105°C до приблизно 110°C, від приблизно 110°C до приблизно 120°C, або 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C або більше. У даному документі передбачені термостабільні поліпептиди, що зберігають активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази C, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази C (PI-PLC), при температурі в діапазонах, описаних вище, при приблизно pН 3,0, приблизно pН 3,5, приблизно pН 4,0, приблизно pН 4,5, приблизно pН 5,0, приблизно pН 5,5, приблизно pН 6,0, приблизно pН 6,5, приблизно pН 7,0, приблизно pН 7,5, приблизно pН 8,0, приблизно pН 8,5, приблизно pН 9,0, приблизно pН 9,5, приблизно pН 10,0, приблизно pН 10,5, приблизно pН 11,0, приблизно pН 11,5, приблизно pН 12,0 або більше. В одному аспекті поліпептиди, представлені в даному документі, можуть бути термостійкими і можуть зберігати активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази C, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази C (PI-PLC) після впливу температури в діапазоні від приблизно -100°C до приблизно -80°C, від приблизно -80°C до приблизно -40°C, від приблизно -40°C до приблизно -20°C, від приблизно -20°C до приблизно 0°C, від приблизно 0°C до приблизно 5°C, від приблизно 5°C до приблизно 15°C, від приблизно 15°C до приблизно 25°C, від приблизно 25°C до приблизно 37°C, від приблизно 37°C до приблизно 45°C, від приблизно 45°C до приблизно 55°C, від приблизно 55°C до приблизно 70°C, від приблизно 70°C до приблизно 75°C, від приблизно 75°C до приблизно 85°C, від приблизно 85°C до приблизно 90°C, від приблизно 90°C до приблизно 95°C, від приблизно 95°C до приблизно 100°C, від приблизно 100°C до приблизно 105°C, від приблизно 105°C до приблизно 110°C, від приблизно 110°C до приблизно 120°C, або 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C або більше. У деяких варіантах здійснення термостійкі поліпептиди зберігають активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази C, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази C (PIPLC) після впливу температури в діапазонах, описаних вище, при приблизно pН 3,0, приблизно pН 3,5, приблизно pН 4,0, приблизно pН 4,5, приблизно pН 5,0, приблизно pН 5,5, приблизно pН 6,0, приблизно pН 6,5, приблизно pН 7,0, приблизно pН 7,5, приблизно pН 8,0, приблизно pН 8,5, приблизно pН 9,0, приблизно pН 9,5, приблизно pН 10,0, приблизно pН 10,5, приблизно pН 11,0, приблизно pН 11,5, приблизно pН 12,0 або більше. У іншому аспекті в цьому документі передбачені зонди нуклеїнової кислоти або праймери для ампліфікації для виділення, отримання і/або ідентифікації нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC). У одному варіанті здійснення зонд нуклеїнової кислоти, наприклад, зонд для ідентифікації нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC), включає зонд, що містить або складається з щонайменше приблизно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 або більше послідовно розташованих основ послідовності, представленої в цьому документі, або її фрагментів або підпослідовностей, де зонд ідентифікує нуклеїнову кислоту шляхом зв’язування або гібридизації. Зонд може містити олігонуклеотид, що містить щонайменше приблизно від 10 до 50, приблизно від 20 до 60, приблизно від 30 до 70, приблизно від 40 до 80, або приблизно від 60 до 100 послідовно розташованих основ послідовності, що містить послідовність, представлену в цьому документі, або її фрагменти або підпослідовності. Зонд може містити олігонуклеотид, що містить щонайменше приблизно від 10 до 50, приблизно від 20 до 60, приблизно від 30 до 70, приблизно від 40 до 80, або приблизно від 60 до 100 послідовно розташованих основ послідовності нуклеїнової кислоти, представленої в цьому документі, або її підпослідовності. У одному варіанті здійснення послідовності пари праймерів для ампліфікації нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC), містять пару праймерів, 7 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що містить або складається з пари праймерів, здатної ампліфікувати нуклеїнову кислоту, що містить послідовність, представлену в цьому документі, або її фрагменти або підпослідовності. Один або кожний представник послідовностей пари праймерів для ампліфікації може містити олігонуклеотид, що містить щонайменше приблизно від 10 до 50 послідовно розташованих основ послідовності. У одному варіанті здійснення способи ампліфікації нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC), включають ампліфікацію матричної нуклеїнової кислоти за допомогою послідовностей пари праймерів для ампліфікації, здатної ампліфікувати послідовність нуклеїнової кислоти, представленої в цьому документі, або її фрагменти або підпослідовності. У одному варіанті здійснення вектори, експресуючі касети, експресуючі вектори, плазміди, або носії для клонування містять нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі, або її підпослідовність. У одному аспекті вектор, експресуюча касета, експресуючий вектор, плазміда або носій для клонування можуть містити або містяться у вірусному векторі, фагу, фагміді, косміді, фосміді, бактеріофагу, штучній хромосомі, аденовірусному векторі, ретровірусному векторі або аденоасоційованому вірусному векторі; або бактеріальній штучній хромосомі (BAC), векторі, що походить з бактеріофагу PI, (PAC), штучній хромосомі дріжджів (YAC), або штучній хромосомі ссавців (MAC). У одному аспекті експресуюча касета містить нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі, яка функціонально зв’язана з промотором. Промотор може являти собою вірусний, бактеріальний промотор, промотор ссавців або рослин. У одному аспекті промотор рослин може являти собою промотор картоплі, рису, кукурудзи, пшениці, тютюну або ячменю. Промотор може являти собою конститутивний промотор. Конститутивний промотор може включати CaMV35S. У іншому аспекті промотор може являти собою індуцибельний промотор. У одному аспекті промотор може являти собою тканиноспецифічний промотор або промотор, регульований навколишнім середовищем, або промотор, регульований в залежності від стадії розвитку. Таким чином, промотор може являти собою, наприклад, промотор, специфічний для насіння, специфічний для листя, специфічний для коріння, специфічний для стебла, або промотор, що індукується обпаданням листя. У одному аспекті експресуюча касета може додатково містити експресуючий вектор рослин або вірусів рослин. У одному варіанті здійснення клітина-хазяїн або трансформована клітина містить нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі. У одному аспекті клітина-хазяїн або трансформована клітина може являти собою бактеріальну клітину, клітину ссавця, клітину гриба, дріжджову клітину, клітину комах або клітину рослин. У одному аспекті клітина рослин може являти собою клітину картоплі, пшениці, рису, кукурудзи, тютюну або ячменю. Трансформована клітина може являти собою будь-яку з клітин-хазяїв, відомих фахівцям в даній галузі, включаючи прокаріотичні клітини, еукаріотичні клітини, такі як бактеріальні клітини, клітини грибів, клітини дріжджів, клітини ссавців, клітини комах або клітини рослин. Ілюстративні клітини бактерій включають клітини будь-якого виду з роду Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Salmonella, Pseudomonas і Staphylococcus, включаючи, наприклад, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens. Ілюстративні клітини грибів включають клітини будь-якого виду Aspergillus. ілюстративні клітини дріжджів включають клітини будь-якого виду з Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces або Schwanniomyces, включаючи Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae або Schizosaccharomyces pombe. Ілюстративні клітини комах включають будь-який вид Spodoptera або Drosophila, включаючи Drosophila S2 і Spodoptera Sf9. Ілюстративні клітини тварин включають клітини CHO, COS або меланоми Bowes або будь-яку клітинну лінію миші або людини. У іншому варіанті здійснення трансгенні тварини, що не є людиною, містять нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі, або вектор, експресуючу касету, експресуючий вектор, плазміду або носій для клонування, представлені в цьому документі. Трансгенною твариною, що не є людиною, може бути миша, щур, коза, кролик, вівця, свиня або корова. У одному варіанті здійснення трансгенна рослина або насіння містить нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі, або вектор, експресуючу касету, експресуючий вектор, плазміду або носій для клонування, представлені в цьому документі. У одному варіанті здійснення рослина являє собою рослину кукурудзи, рослину сорго, рослину картоплі, рослину томата, рослину пшениці, олійну рослину, рослину ріпаку, рослину сої, рослину рису, рослину ячменю, траву, насіння бавовнику, пальму, рослину кунжуту, рослину арахісу, рослину соняшника або рослину тютюну; трансгенне насіння. У одному варіанті здійснення насіння являє собою кукурудзяне насіння, пшеничне зерно, олійне насіння, насіння ріпаку, насіння сої, ядро кокосового горіха, насіння соняшника, насіння кунжуту, рис, ячмінь, арахіс, насіння 8 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бавовнику, насіння пальми, арахіс, насіння кунжуту, насіння соняшника або насіння рослини тютюну. У одному аспекті в цьому документі передбачені антисмисловий олігонуклеотид або інгібіторна РНК, що містять нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі або що складається з них. У іншому аспекті в цьому документі передбачений спосіб інгібування трансляції послідовності фосфоліпази, яка містить інформацію, (транскрипт, мРНК) в клітині, що включає введення в клітину або експресію в клітині антисмислового олігонуклеотиду або інгібіторної РНК, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, представлену в цьому документі, або що складаються з них. У одному варіанті здійснення виділені, синтетичні або рекомбінантні поліпептиди мають активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитолспецифічної фосфоліпази С (PI-PLC), або являють собою поліпептиди, здатні індукувати імунну відповідь, специфічну для фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC) (наприклад, епітоп); і в альтернативних аспектах пептиди і поліпептиди, представлені в цьому документі, містять послідовність: (a) яка містить амінокислотну послідовність: (i) що має щонайменше 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або більше, або 100% ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 6, і що має щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять, двадцять, двадцять одну, двадцять дві, двадцять три, двадцять чотири, двадцять п'ять, двадцять шість, двадцять сім, двадцять вісім, двадцять дев'ять або тридцять або більше, або всі з амінокислотних змін (мутацій), що складаються зі змін, описаних в таблиці 12, таблиці 13, таблиці 14 і/або таблиці 15, або еквівалентних амінокислотних змін або замін (мутацій), або будь-яку їх комбінацію, де необов'язково ідентичність послідовностей визначають за допомогою аналізу з алгоритмом порівняння послідовностей або візуальним дослідженням; (ii) що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі; (iii) що має щонайменше приблизно 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або більше, або 100% ідентичність послідовності з SEQ ID NO: 8; (b) поліпептид згідно з (a), але позбавлений нативної сигнальної послідовності і/або послідовності пробілка; (с) поліпептид згідно з (a) або (b), крім того, який містить гетерологічну амінокислотну послідовність або гетерологічну частину; (d) поліпептид згідно з (с), де гетерологічна амінокислотна послідовність або гетерологічна частина містить гетерологічну (лідерну) сигнальну послідовність, маркер, мітку, яка піддається детекції, або епітоп, або складається з них; (е) поліпептид згідно з (d), де гетерологічна (лідерна) сигнальна послідовність містить Nкінцеве і/або С-кінцеве подовження для націлювання на ендоплазматичну мережу (ER) або ендомембрану, або на рослинну ендоплазматичну мережу (ER) або систему ендомембран, або складається з них; (f) поліпептид за будь-яким з (a)-(е), де фосфоліпаза, наприклад, фосфоліпаза С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічна фосфоліпаза С (PI-PLC) каталізує реакцію, що включає: 1-фосфатидил-1D-міоінозитол 4,5-біфосфат (який також називається PIP2, фосфатидилінозитолбіфосфатом)+H2O↔1D-міоінозитол 1,4,5-трифосфат (який також називається IP3, інозитолтрифосфатом) + діацилгліцерин. (g) поліпептид згідно з (a)-(f), де активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC) є термостабільною; (h) поліпептид згідно з (a)-(f), де активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC), є термостійкою; (i) поліпептид згідно з будь-яким з (a)-(h), де: (i) поліпептид є глікозилованим або поліпептид містить щонайменше одну ділянку глікозилування, (ii) поліпептид згідно з (i), де глікозилування являє собою N-зв’язане глікозилування або О-зв’язане глікозилування; (iii) поліпептид згідно з (i) або (ii), де поліпептид є глікозилованим після експресії в клітинах дріжджів; або (iv) поліпептид згідно з (iii), де клітина дріжджів являє собою Р. pastoris або S. pombe; (j) поліпептид згідно з будь-яким з (a)-(i), крім того, що містить композицію, яка містить щонайменше один другий фермент, або щонайменше один другий фермент фосфоліпази, або 9 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що міститься в ній; або (k) поліпептид згідно з (j), де щонайменше один другий фермент фосфоліпаза містить поліпептид, що має послідовність, як указано в SEQ ID NO: 2 і/або SEQ ID NO: 4, або щонайменше один з їх варіантних ферментів, як описано в таблицях 8 і 9. У одному аспекті виділений, синтетичний або рекомбінантний поліпептид може містити поліпептид, представлений в цьому документі, який позбавлений сигнальної (пептидної) послідовності, наприклад, позбавлений його гомологічної сигнальної послідовності, і в одному аспекті містить гетерологічну сигнальну (пептидну) послідовність. У одному аспекті виділений, синтетичний або рекомбінантний поліпептид може містити поліпептид, представлений в цьому документі, який містить гетерологічну сигнальну послідовність, таку як гетерологічна сигнальна послідовність фосфоліпази або не фосфоліпази (наприклад, не фосфоліпази, не фосфоліпази С або не фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC)). У одному аспекті химерні білки містять перший домен, що містить сигнальну послідовність, представлену в цьому документі, і щонайменше другий домен. Білок може являти собою злитий білок. Другий домен може містити фермент. Фермент може являти собою фосфоліпазу, наприклад, фосфоліпазу С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічну фосфоліпазу С (PI-PLC), представлену в цьому документі, або інший фермент. У одному аспекті активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC) включає питому активність при приблизно 37 °C в діапазоні від приблизно 100 до приблизно 1000 одиниць на міліграм білка. У іншому аспекті активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC) включає питому активність від приблизно 500 до приблизно 750 одиниць на міліграм білка. Альтернативно активність фосфоліпази включає питому активність при 37°C в діапазоні від приблизно 500 до приблизно 1200 одиниць наміліграм білка. У одному аспекті активність фосфоліпази включає питому активність при 37°C в діапазоні від приблизно 750 до приблизно 1000 одиниць на міліграм білка. У іншому аспекті термостійкість включає збереження щонайменше половини питомої активності фосфоліпази 37°C після нагрівання до підвищеної температури. Альтернативно, термостійкість може включати збереження питомої активності при 37°C в діапазоні від приблизно 500 до приблизно 1200 одиниць на міліграм білка після нагрівання до підвищеної температури. У одному варіанті здійснення виділені, синтетичні або рекомбінантні поліпептиди, представлені в цьому документі, містять щонайменше одну ділянку глікозилування. У одному аспекті глікозилування може являти собою N-зв’язане глікозилування. У одному аспекті поліпептид може бути глікозилованим після експресії в Р. pastoris або S. pombe або в рослинах, таких як продукуючі олію рослини, наприклад, соя, канола, рис, соняшник або генетичномодифіковані (GMO) варіанти цих рослин. У одному аспекті поліпептид може зберігати активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC) в умовах, що включають приблизно pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5 або pH 4,0 або нижче. У іншому аспекті поліпептид може зберігати активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC) в умовах, що включають приблизно pH 7, pH 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5, pH 11, pH 11,5, pH 12,0 або більше. У одному варіанті здійснення препарати білка містять поліпептид, представлений в цьому документі, де препарат білка містить рідину, тверду речовину або гель. У одному аспекті гетеродимери, представлені в цьому документі, містять поліпептид і другий домен. У одному аспекті другий домен може являти собою поліпептид, і гетеродимер може являти собою злитий білок. У одному аспекті другий домен може являти собою епітоп або мітку. У одному аспекті гомодимери, представлені в цьому документі, містять поліпептид, представлений в цьому документі. У одному варіанті здійснення іммобілізовані поліпептиди, представлені в цьому документі, мають активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитолспецифічної фосфоліпази С (PI-PLC), де поліпептид містить поліпептид, представлений в цьому документі, поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі, або поліпептид, що містить поліпептид, представлений в цьому документі, і другий домен. У одному аспекті поліпептид, представлений в цьому документі, може бути іммобілізований на клітині, везикулі, ліпосомі, плівці, мембрані, металі, смолі, полімері, кераміці, склі, мікроелектроді, графітовій частинці, гранулі, гелі, пластині, кристалі, таблетці, пілюлі, капсулі, порошку, агломераті, поверхні, пористій структурі, чипі або капілярній трубці, або матеріалах, таких як зерна, лушпиння, кора, шкіра, волосся, емаль, кістка, шкаралупа і матеріали, які походять з них. Полінуклеотиди, поліпептиди і ферменти, представлені в цьому документі, 10 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можна виготовляти в твердій формі, такій як порошок, ліофілізований препарат, гранули, таблетка, плитка, кристал, капсула, пілюля, драже, або в рідкій формі, такій як водний розчин, аерозоль, гель, паста, завис, водна/масляна емульсія, крем, капсула або суспензія везикул або міцел. У одному аспекті в цьому документі передбачені виділені, синтетичні або рекомбінантні антитіла, які специфічно зв'язуються з поліпептидом, представленим в цьому документі. У іншому аспекті виділені, синтетичні або рекомбінантні антитіла являють собою моноклональні або поліклональні антитіла, або їх антигензв’язувальні фрагменти. У одному аспекті в цьому документі передбачена гібридома. що містить антитіло, представлене в цьому документі. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений чип, що містить іммобілізований поліпептид, іммобілізовану нуклеїнову кислоту або антитіло, представлені в цьому документі, або їх комбінацію. У одному варіанті здійснення добавки в корм для тварини містять поліпептид, представлений в цьому документі, наприклад, поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі. У одному аспекті поліпептид в харчовій добавці може бути глікозилованим. У одному варіанті здійснення їстівні матриці для доставки ферменту містять поліпептид, представлений в цьому документі, наприклад, поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі. У одному аспекті матриця для доставки включає драже. У одному аспекті поліпептид може бути глікозилованим. У одному аспекті активність фосфоліпази є термостійкою. У іншому аспекті активність фосфоліпази є термостабільною. У одному варіанті здійснення способи виділення або ідентифікації поліпептиду, що має активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитолспецифічної фосфоліпази С (PI-PLC), включають стадії: (a) надавання антитіла, представленого в цьому документі; (b) надавання зразка, що містить поліпептиди; і (с) контактування зразка стадії (b) з антитілом стадії (a) в умовах, де антитіло може специфічно зв'язуватися з поліпептидом, тим самим виділяючи або ідентифікуючи поліпептид, який має активність фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC). У одному варіанті здійснення способи отримання антитіл проти фосфоліпази включають введення тварині, яка не є людиною, нуклеїнової кислоти, представленої в цьому документі, або поліпептиду, представленому в цьому документі, або їх підпослідовності в кількості, достатній для індукування гуморальної імунної відповіді, тим самим отримуючи антитіло проти фосфоліпази. У цьому документі передбачені способи отримання антитіла проти фосфоліпази, що включають введення тварині, яка не є людиною, нуклеїнової кислоти, представленої в цьому документі, або поліпептиду, представленому в цьому документі, або їх підпослідовностей в кількості, достатній для індукування імунної відповіді. У одному варіанті здійснення способи отримання рекомбінантного поліпептиду включають стадію: (А) (a) надавання нуклеїнової кислоти, представленої в цьому документі, де нуклеїнова кислота необов'язково зв'язана з промотором, де нуклеїнова кислота містить нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі; і (b) експресії нуклеїнової кислоти стадії (a) в умовах, які дозволяють експресію поліпептиду, тим самим отримуючи рекомбінантний поліпептид; або (В) спосіб згідно з (А), крім того, що включає трансформацію клітини-хазяя нуклеїновою кислотою стадії (a) з подальшою експресією нуклеїнової кислоти стадії (a), тим самим отримуючи рекомбінантний поліпептид в трансформованій клітині. У одному варіанті здійснення способи ідентифікації поліпептиду, що має активність фосфоліпази, включають стадії: (a) надавання поліпептиду, представленого в цьому документі; (b) надавання субстрату фосфоліпази; і (с) контактування поліпептиду з субстратом стадії (b) і детекція зменшення кількості субстрату або збільшення кількості продукту реакції, де зниження кількості субстрату або збільшення кількості продукту реакції виявляє поліпептид, який має активність фосфоліпази. У іншому варіанті здійснення способи ідентифікації субстрату фосфоліпази включають стадії: (a) надавання поліпептиду, представленого в цьому документі; (b) надавання тестованого субстрату; і (с) контактування поліпептиду стадії (a) з тестованим субстратом стадії (b) і детекція зменшення кількості субстрату або збільшення кількості продукту реакції, де зменшення кількості субстрату або збільшення кількості продукту реакції ідентифікує тестований субстрат як субстрат фосфоліпази. У іншому аспекті способи визначення того, чи зв'язується специфічно тестована сполука з поліпептидом, включають стадії: (a) експресії нуклеїнової кислоти або вектора, що містить нуклеїнову кислоту, в умовах, що дозволяють трансляцію нуклеїнової кислоти в поліпептид, де нуклеїнова кислота містить нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі; (b) надавання 11 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тестованої сполуки; (с) контактування поліпептиду із тестованою сполукою; і (d) визначення того, чи зв'язується специфічно тестована сполука стадії (b) з поліпептидом. У іншому аспекті способи визначення того, чи зв'язується специфічно тестована сполука з поліпептидом, включають стадії: (a) надавання поліпептиду, представленого в цьому документі; (b) надавання тестованої сполуки; (с) контактування поліпептиду із тестованою сполукою; і (d) визначення того, чи зв'язується специфічно тестована сполука стадії (b) з поліпептидом. У одному варіанті здійснення способи ідентифікації модулятора активності фосфоліпази включають стадії: (А) (a) надавання поліпептиду, представленого в цьому документі; (b) надавання тестованої сполуки; (с) контактування поліпептиду стадії (a) із тестованою сполукою стадії (b) і вимірювання активності фосфоліпази, де зміна активності фосфоліпази, виміряної в присутності тестованої сполуки, в порівнянні з активністю за відсутності тестованої сполуки, забезпечує визначення того, що тестована сполука модулює активність фосфоліпази; (В) спосіб згідно з (А), де активність фосфоліпази вимірюють шляхом надавання субстрату фосфоліпази і детекції зменшення кількості субстрату або збільшення кількості продукту реакції, або, збільшення кількості субстрату або зменшення кількості продукту реакції; (с) спосіб згідно з (В), де зниження кількості субстрату або збільшення кількості продукту реакції із тестованою сполукою в порівнянні з кількістю субстрату або продукту реакції без тестованої сполуки ідентифікує тестовану сполуку як активатор активності фосфоліпази; або, (d) спосіб згідно з (В), де збільшення кількості субстрату або зменшення кількості продукту реакції із тестованою сполукою в порівнянні з кількістю субстрат або продукту реакції без тестованої сполуки ідентифікує тестовану сполуку як інгібітор активності фосфоліпази. У одному аспекті способи виділення або витягання нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з активністю фосфоліпази, із зразка, включають стадії: (А) (a) надавання полінуклеотидного зонда, що містить нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі; (b) виділення нуклеїнової кислоти із зразка або обробку зразка так, щоб нуклеїнова кислота в зразку була доступна для гібридизації з полінуклеотидним зондом стадії (a); (с) комбінування виділеної нуклеїнової кислоти або обробленого зразка стадії (b) з полінуклеотидним зондом стадії (a); і (d) виділення нуклеїнової кислоти, яка специфічно гібридизується з полінуклеотидним зондом стадії (a), тим самим виділяючи або витягуючи із зразка нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид з активністю фосфоліпази; (В) спосіб згідно з (А), де зразок являє собою або містить зразок з навколишнього середовища; (C) спосіб згідно з (В), де зразок з навколишнього середовища являє собою або містить зразок води, зразок рідини, зразок ґрунту, зразок повітря або біологічний зразок; або (D) спосіб згідно з (C), де біологічний зразок отриманий з бактеріальної клітини, клітини найпростіших, клітини комах, клітини дріжджів, клітини рослин, клітини грибів або клітин ссавців. У одному варіанті здійснення способи виділення або витягання нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має активність фосфоліпази із зразка, включають стадії: (a) надавання послідовностей пари праймерів для ампліфікації нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має активність фосфоліпази, де пара праймерів здатна ампліфікувати нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі; (b) виділення нуклеїнової кислоти із зразка або обробку зразка, так щоб нуклеїнова кислота в зразку була доступна для гібридизації з парою праймерів для ампліфікації; і, (с) об'єднання нуклеїнової кислоти стадії (b) з парою праймерів для ампліфікації стадії (a) і ампліфікації нуклеїнової кислоти із зразка, тим самим, виділяючи або витягуючи нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид, який має активність фосфоліпази, із зразка. У одному варіанті здійснення зразок являє собою зразок з навколишнього середовища, наприклад, зразок води, зразок рідини, зразок ґрунту, зразок повітря або біологічний зразок, наприклад, бактеріальну клітину, клітину найпростіших, клітину комах, клітину дріжджів, клітину рослин, клітину грибів або клітину ссавців. Один або кожний член пари праймерів для ампліфікації може включати олігонуклеотид, що містить щонайменше приблизно від 10 до 50 або більше послідовно розташованих основ послідовності, представленої в цьому документі. У одному варіанті здійснення способи збільшення термостійкості або термостабильності поліпептиду фосфоліпази включають глікозилування поліпептиду фосфоліпази, де поліпептид містить щонайменше тридцять послідовно розташованих амінокислот поліпептиду, представленого в цьому документі; або поліпептиду, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, представленою в цьому документі, тим самим збільшуючи термостійкість або термостабільність поліпептиду фосфоліпази. У одному аспекті специфічна активність фосфоліпази може бути термостабільною або термостійкою при температурі в діапазоні від більше ніж приблизно 37 °C до приблизно 95 °C. У одному варіанті здійснення способи надекспресії рекомбінантного поліпептиду фосфоліпази, наприклад, фосфоліпази С, наприклад, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC) в клітині включають експресію вектора, що містить нуклеїнову кислоту, 12 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 представлену в цьому документі, або послідовність нуклеїнової кислоти, представлену в цьому документі, де ідентичність послідовностей визначають за допомогою аналізу з алгоритмом порівняння послідовностей або візуальним дослідженням, де надекспресію забезпечують з використанням високоактивного промотору, біцистронного вектора або ампліфікації гена у векторі. У одному варіанті здійснення способи отримання варіанту нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з активністю фосфоліпази, включають стадії: (А) (a) надавання матричної нуклеїнової кислоти, що містить нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі; і (b) модифікація, делеція або вставка одного або декількох нуклеотидів в матричній послідовності, або їх комбінації, з отриманням варіанту матричної нуклеїнової кислоти; (В) спосіб згідно з (А), крім того, що включає експресію варіанту нуклеїнової кислоти з отриманням варіанту поліпептиду фосфоліпази; (C) спосіб згідно з (А) або (В), де модифікації, вставки або делеції вносять способом, що включає ПЛР із зниженою точністю, шафлінг, олігонуклеотиднаправлений мутагенез, об'єднуючу ПЛР, мутагенез за допомогою статевої ПЛР, мутагенез in vivo, касетний мутагенез, зворотно-множинний мутагенез, експонентно-множинний мутагенез, сайтспецифічний мутагенез, повторне збирання гена, мутагенез з насиченням сайтів гена (GSSM), синтетичне повторне збирання лігуванням (SLR) або їх комбінацію; (D) спосіб згідно з будь-яким з (А)-(C), де модифікації, вставки або делеції вносять способом, що включає рекомбінацію, рекомбінацію зворотної послідовності, мутагенез з модифікацією ДНК фосфотіоатом, мутагенез з матрицею, яка містить урацил, мутагенез з дуплексами, які містять розриви, мутагенез з репарацією точок невідповідності, мутагенез з дефектом репарації штаму-хазяя, хімічний мутагенез, мутагенез радіогенного походження, мутагенез з делецією, мутагенез з рестрикцією і селекцією, мутагенез з рестрикцією і виправленням помилок, синтез штучного гена, множинний мутагенез, отримання химерного мультимера нуклеїнової кислоти і їх комбінацію; (Е) спосіб згідно з будь-яким з (А)-(D), де спосіб багато разів повторюють доти, поки не отримують (варіантну) фосфоліпазу, яка має змінену або відмінну (варіантну) активність, або змінену або відмінну (варіантну) стабільність в порівнянні з поліпептидом, що кодується матричною нуклеїновою кислотою, або змінену або відмінну (варіантну) вторинну структурою в порівнянні з поліпептидом, що кодується матричною нуклеїновою кислотою, або зі зміненою або відмінною (варіантною) посттрансляційною модифікацією в порівнянні з поліпептидом, що кодується матричною нуклеїновою кислотою; (F) спосіб згідно з (Е), де варіант поліпептиду фосфоліпази є термостійким і зберігає деяку активність після впливу збільшеної температури; (G) спосіб згідно з (Е), де поліпептид варіанту фосфоліпази має збільшене глікозилування відносно глікозилування фосфоліпази, що кодується матричною нуклеїновою кислотою; (Н) спосіб згідно з (Е), де поліпептид варіанту фосфоліпази має активність фосфоліпази при високій температурі, де фосфоліпаза, що кодується матричною нуклеїновою кислотою, не є активною при високій температурі; (I) спосіб згідно з будь-яким з (А)-(Н), де спосіб багато разів повторюють доти, поки не отримають фосфоліпазу, що кодує послідовність, в якій використовуються кодони, змінені в порівнянні з кодонами матричної нуклеїнової кислоти; або (J) спосіб згідно з будь-ким (А)-(Н), де спосіб багато разів повторюють доти, поки не отримують ген фосфоліпази, що має підвищений або знижений рівень експресії транскрипту або підвищену або знижену стабільність відносно рівня експресії і стабільності матричної нуклеїнової кислоти. У одному аспекті передбачені способи модифікації кодонів в нуклеїновій кислоті, що кодує поліпептид фосфоліпази, причому способи включають стадії: (a) надавання нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з активністю фосфоліпази, що містить нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі; і, (b) ідентифікації кодона в нуклеїновій кислоті стадії (a) і заміни його відмінним кодоном, що кодує ту ж амінокислоту, що і замінений кодон, тим самим модифікуючи нуклеїнову кислоту, яка кодує фосфоліпазу. У одному варіанті здійснення передбачені способи отримання бібліотеки нуклеїнових кислот, що кодують множину модифікованих активних центрів фосфоліпази або ділянок зв’язування субстрату, де модифіковані активні центри або ділянки зв’язування субстрату походять з першої нуклеїнової кислоти, що містить послідовність, що кодує перший активний центр або першу ділянку зв’язування субстрату, причому спосіб включає стадії: (А) (a) надавання першої нуклеїнової кислоти, що кодує перший активний центр або першу ділянку зв’язування субстрату, де перша послідовність нуклеїнової кислоти містить нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі, і нуклеїнова кислота кодує активний центр фосфоліпази або ділянку зв’язування субстрату фосфоліпази; (b) надавання набору мутагенних олігонуклеотидів, які кодують варіанти амінокислот, що зустрічаються в природі, у множині з вибраних для націлювання кодонів в першій нуклеїновій кислоті; і, (с) використання набору мутагенних олігонуклеотидів для отримання набору кодуючих активний центр або зв'язуючу субстрат ділянку варіантів нуклеїнових кислот, що кодують ряд варіантів амінокислот в кожному кодоні 13 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислоти, який був підданий мутагенезу, тим самим отримуючи бібліотеку нуклеїнових кислот, що кодують множину модифікованих активних центрів фосфоліпази або ділянок зв’язування субстрату; (В) спосіб згідно з (А), що включає мутагенез першої нуклеїнової кислоти стадії (a) способом, що включає оптимізовану систему направлених змін, мутагенез з насиченням сайтів гена (GSSM), синтетичне повторне збирання лігуванням (SLR); (C) спосіб згідно з (А) або (В), який включає мутагенез першої нуклеїнової кислоти стадії (a) або її варіантів способом, що включає ПЛР зі зниженою точністю, шафлінг, олігонуклеотиднаправлений мутагенез, об'єднуючу ПЛР, мутагенез за допомогою статевої ПЛР, мутагенез in vivo, касетний мутагенез, зворотно-множинний мутагенез, експонентно-множинний мутагенез, сайт-специфічний мутагенез, повторне збирання гена, мутагенез з насиченням сайтів гена (GSSM), синтетичне повторне збирання лігуванням (SLR) і їх комбінацію; або (D) спосіб згідно з (А) або (В), який включає мутагенез першої нуклеїнової кислоти стадії (a) або її варіантів способом, що включає рекомбінацію, рекомбінацію зворотної послідовності, мутагенез з модифікацією ДНК фосфотіоатом, мутагенез з матрицею, який містить урацил, мутагенез з дуплексами, який містить розриви, мутагенез з репарацією точок невідповідності, мутагенез з дефектом репарації штаму-хазяя, хімічний мутагенез, мутагенез радіогенного походження, мутагенез з делецією, мутагенез з рестрикцією і селекцією, мутагенез з рестрикцією і виправленням помилок, синтез штучного гена, множинний мутагенез, отримання химерного мультимера нуклеїнової кислоти і їх комбінації. У одному аспекті способи отримання низькомолекулярної сполуки включають стадії: (a) надавання множини біосинтетичних ферментів, здатних синтезувати або модифікувати низькомолекулярну сполуку, де один з ферментів містить фермент фосфоліпазу, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі; (b) надавання субстрату щонайменше для одного з ферментів стадії (a); і (с) реакція субстрату стадії (b) з ферментами в умовах, які полегшують множину біокаталітичних реакцій, з отриманням низькомолекулярної сполуки за допомогою серії біокаталітичних реакцій. У іншому аспекті способи модифікації низькомолекулярної сполуки включають стадії: (А) (a) надавання ферменту фосфоліпази, де фермент містить поліпептид, представлений в цьому документі, або поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі; (b) надавання низькомолекулярної сполуки; і (с) реакція ферменту стадії (a) з низькомолекулярною сполукою стадії (b) в умовах, які полегшують ферментативну реакцію, яка каталізується ферментом фосфоліпазою, тим самим, модифікуючи низькомолекулярну сполуку ферментативною реакцією фосфоліпази; (В) спосіб згідно з (А), що включає множину низькомолекулярних субстратів для ферменту стадії (a), тим самим отримуючи бібліотеку модифікованих низькомолекулярних сполук, що отримуються за допомогою щонайменше однієї ферментативної реакції, яка каталізується ферментом фосфоліпазою; (C) спосіб згідно з (А) або (В), крім того, що включає множину додаткових ферментів в умовах, які полегшують множину біокаталітичних реакцій ферментами, з отриманням бібліотеки модифікованих низькомолекулярних сполук, що отримуються множиною ферментативних реакцій; (D) спосіб згідно з (C), крім того, що включає стадію тестування бібліотеки для визначення того, чи присутня в бібліотеці конкретна модифікована низькомолекулярна сполука, яка виявляє бажану активність; або (Е) спосіб згідно з (D), де стадія тестування бібліотеки, крім того, включає стадії систематичного видалення всіх, крім однієї, біокаталітичних реакцій, що використовуються для отримання частини з множини модифікованих низькомолекулярних сполук з бібліотеки, з тестуванням частини модифікованих низькомолекулярних сполук на наявність або відсутність конкретної модифікованої низькомолекулярної сполуки з бажаною активністю, і ідентифікації щонайменше однієї конкретної біокаталітичної реакції, в результаті якої утворюється модифікована низькомолекулярна сполука з бажаною активністю. У іншому аспекті способи визначення функціонального фрагмента ферменту фосфоліпази включають стадії: (А) (a) надавання ферменту фосфоліпази, де фермент містить поліпептид, представлений в цьому документі, або поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі; і (b) видалення множини амінокислотних залишків з послідовності стадії (a) і тестування підпослідовності, що залишилася, відносно активності фосфоліпази, тим самим визначаючи функціональний фрагмент ферменту фосфоліпази; або, (В) спосіб згідно з (А), де активність фосфоліпази вимірюють шляхом надавання субстрату фосфоліпази і тестування зменшення кількості субстрату або збільшення продукту реакції. У одному аспекті способу передбачений спосіб інженерії цільних клітин з новими або модифікованими фенотипами з використанням аналізу метаболічних змін в режимі реального часу, причому спосіб включає стадії: (a) отримання модифікованої клітини за допомогою модифікації генетичного набору клітини, де генетичний набір модифікований додаванням в клітину нуклеїнової кислоти, представленої в цьому документі; (b) культивування модифікованої 14 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітини з отриманням множини модифікованих клітин; (с) вимірювання щонайменше одного параметра метаболізму клітини за допомогою контролю клітинної культури стадії (b) в режимі реального часу; і (d) аналіз даних стадії (с) для визначення наявності відмінностей виміряного параметра від порівняльного вимірювання в немодифікованій клітині в аналогічних умовах, тим самим ідентифікуючи отриманий за допомогою способів інженерії фенотип клітини з використанням аналізу метаболічних змін в режимі реального часу; (В) згідно з (А), де генетичний набір клітини модифікують способом, що включає делецію послідовності або модифікацію послідовності в клітині, або, нокаут експресії гена; (C) спосіб згідно з (А) або (В), крім того, що включає селекцію клітини, що містить новий отриманий способами інженерії фенотип; або (D) спосіб згідно з (C), крім того, що включає культивування відібраної клітини, тим самим, отримуючи новий штам, що містить новий отриманий способами інженерії фенотип. У одному варіанті здійснення способи отримання трансгенної рослини включають наступні стадії: (a) введення гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в рослинну клітину, де гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, представлену в цьому документі, тим самим отримуючи трансформовану клітину рослин; і (b) отримання трансгенної рослини з трансформованої клітини. У одному аспекті стадія (a) може додатково включати введення гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти електропорацією або мікроін’єкцією в протопласти клітин рослин. У іншому аспекті стадія (a) може додатково включати введення гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти безпосередньо в тканину рослин бомбардуванням частинками з ДНК. Альтернативно стадія (a) може додатково включати введення гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в ДНК клітини рослини з використанням хазяя Agrobacterium tumefaciens. У одному аспекті клітина рослини може являти собою клітину картоплі, кукурудзи, рису, пшениці, тютюну або ячменю. У одному варіанті здійснення способи експресії гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в рослинній клітині включають наступні стадії: (а) трансформація клітини рослин гетерологічною послідовністю нуклеїнової кислоти, функціонально пов'язаною з промотором, де гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти містить нуклеїнову кислоту, представлену в цьому документі; (b) вирощування рослини в умовах, при яких гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти експресується в клітині рослин. У одному аспекті в цьому документі передбачені детергентні композиції, що містять поліпептид фосфоліпази, представлений в цьому документі, або поліпептид фосфоліпази, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі. У одному аспекті фосфоліпаза являє собою не поверхнево-активну фосфоліпазу або поверхнево-активну фосфоліпазу. У іншому аспекті фосфоліпаза включена до складу неводної рідкої композиції, відлитого твердого тіла, ліофілізованого порошку, гранульованої форми, форми у вигляді частинок, пресованої таблетки, драже, форми гелю, пасти, аерозолю або форми зависі. У одному аспекті способи миття предмета включають стадії: (a) надавання композиції, що містить поліпептид фосфоліпази, представлений в цьому документі, або поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі; (b) надавання предмета; і (с) контактування поліпептиду стадії (a) і предмета стадії (b) в умовах, де композиція може відмити предмет. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачені композиції, що містять поліпептид фосфоліпази, представлений в цьому документі, або поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі. У одному аспекті способи пом'якшення, лікування або попередження опосередковуваної ліпополісахаридом (LPS) токсичності включать введення пацієнту фармацевтичної композиції, що містить поліпептид, представлений в цьому документі, або поліпептид, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, представленою в цьому документі. У іншому аспекті в цьому документі передбачені фармацевтичні препарати, попередники фармацевтичних препаратів і фармацевтичні композиції, що містять поліпептид, представлений в цьому документі, або поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі. У іншому аспекті в цьому документі передбачені способи виготовлення фармацевтичного препарату, попередника фармацевтичного препарату або фармацевтичної композиції, що включають додавання поліпептиду, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі, в фармацевтичний препарат, попередник фармацевтичного препарату або фармацевтичну композицію. У одному аспекті фармацевтичну композицію застосовують для попередження, лікування або пом'якшення опосередковуваної ліпополісахаридом (LPS) токсичності, або для детоксикації ендотоксину або деацилування 2'або 3'-ланцюга жирної кислоти від ліпіду А. У одному варіанті здійснення способи детоксикації ендотоксину включають контактування ендотоксину з поліпептидом, представленим в цьому документі, або поліпептидом, що 15 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі. У іншому варіанті здійснення способи отримання варіанту кодуючої фосфоліпазу послідовності, що має збільшену експресію в клітині-хазяїні включають модифікацію нуклеїнової кислоти, представленої в цьому документі, так щоб один, декілька або всі мотиви, що кодують ділянки N-зв’язаного глікозилування, були модифіковані в мотив, що не кодує ділянки глікозилування. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачені композиції, що містять суміш ферментів фосфоліпаз, що містять: (a) (i) поліпептид фосфоліпази, представлений в цьому документі, або поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі, і (ii) щонайменше один другий фермент; (b) композицію згідно з (a), де щонайменше один фермент являє собою фермент фосфоліпазу; або (с) композицію згідно з (b), де щонайменше один другий фермент фосфоліпази містить поліпептид, як вказаний в SEQ ID NO: 2 і/або SEQ ID NO: 4, або щонайменше один варіант ферментів PLC, як описано в таблицях 8 і 9. У одному аспекті способи отримання біопалива, наприклад, біодизеля, включають стадії: (А) (a) надавання поліпептиду фосфоліпази, представленого в цьому документі, або ферменту фосфоліпази, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі, або композиції, що містить поліпептид, представлений в цьому документі; (b) надавання композиції, що містить ліпід або алкіловий складний ефір; (с) контактування поліпептиду фосфоліпази згідно з (a) з композицією згідно з (b); (В) спосіб згідно з (А), де композиція, що містить ліпід або алкіловий складний ефір являє собою, або містить, масло і/або жир; або (C) спосіб згідно з (А) або (В), де композиція, що містить ліпід або алкіловий складний ефір, являє собою або містить водорості, рослинну олію, рослинну олію прямої перегонки, рослинну олію холодного пресування, відпрацьовану рослинну олію, тваринний жир, топлене сало, жир, сало або жовтий жир. У іншому аспекті в цьому документі передбачені палива, наприклад, біопалива, наприклад, біодизель, виготовлені способами, які включають стадії: (А) (a) надавання поліпептиду фосфоліпази, представленого в цьому документі, або ферменту фосфоліпази, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі, або композиції, що містить поліпептид, представлений в цьому документі; b) надавання композиції, що містить ліпід або алкіловий складний ефір; (с) контактування поліпептиду фосфоліпази згідно з (a) з композицією згідно з (b); (В) спосіб згідно з (А), де композиція, що містить ліпід або алкіловий складний ефір, являє собою або містить масло і/або жир; або (C) спосіб згідно з (А) або (В), де композиція, що містить ліпід або алкіловий ефір, являє собою або містить водорості, рослинну олію, рослинну олію прямої перегонки, рослинну олію холодного пресування, відпрацьовану рослинну олію, тваринний жир, топлене сало, жир, сало або жовтий жир. У іншому аспекті сухий екстракт барди (DDS), суха барда (DDS), конденсований екстракт барди (CDS), вологий екстракт барди (DWG) або суха гранульована барда (DDGS) містять поліпептид, представлений в цьому документі, або поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі або композицією, представленою в цьому документі. У іншому варіанті здійснення в цьому документі передбачається біомаса, що містить (a) поліпептид, представлений в цьому документі, або поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі, або композицію, надану в цьому документі; (b) біомасу згідно з (a), де біомаса являє собою або містить біомасу тварин, водоростей і/або рослин, або біомасу, яка містить ліпіди або лігноцелюлозну, або матеріал відходів. У іншому варіанті здійснення в цьому документі передбачений продукт на основі нафти, що містить: (a) поліпептид, представлений в цьому документі, або поліпептид, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі, або композицію, представлену в цьому документі; (b) отриманий способом, що включає застосування поліпептиду, представленого в цьому документі, або поліпептиду, що кодується нуклеїновою кислотою, представленою в цьому документі, або композиції, представленої в цьому документі; або (с) продукт на основі нафти згідно з (a) або (b), що містить масло, біодизель або бензин, або біоетанол, біобутанол, біопропанол або біометанол; або суміш біоетанолу, біобутанолу, біопропанолу, біометанолу і/або біодизеля і газоліну. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб гідратації негідратованих фосфоліпідів (NHP) в ліпідній матриці шляхом забезпечення міграції їх до поверхні контакту олія-вода. Потім NHP піддають реакції і/або видаляють з ліпідів. У одному варіанті здійснення спосіб включає a) змішування водної кислоти з придатним в їжу маслом з отриманням кислотної суміші, що має pH менше ніж приблизно 4; і b) змішування основи з кислотною сумішшю з отриманням суміші, яка прореагувала, що має pH приблизно 6-9. У певних варіантах здійснення змішування на стадіях a) і/або b) приводить до емульсії, яка 16 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містить водну фазу із середнім розміром крапель від приблизно 15 мкм до приблизно 45 мкм. У певних варіантах здійснення змішування на стадіях a) і/або b) приводить до емульсії, яка містить щонайменше приблизно 60% водної фази по об'єму з розміром крапель від приблизно 15 мкм до приблизно 45 мкм, де процент водної фази оснований на загальному об'ємі водної фази. У певних варіантах здійснення змішування на стадіях a) і/або b) приводить до емульсії, яка містить щонайменше приблизно 60, 70, 80, 90, 93, 95, 96, 97, 98 або 99% водної фази по об'єму з розміром крапель від приблизно 20 мкм до приблизно 45 мкм. У певних варіантах здійснення спосіб додатково включає рафінування реакційної суміші водою або ферментом з отриманням рафінованої олії. У певних варіантах здійснення змішування на стадіях a) і/або b) проводять за допомогою змішувача з високими зсувними зусиллями з швидкістю лопаті щонайменше приблизно 1400 см/с, 1600 см/с, 1800 см/с, 2000 см/с, 2100 см/с, 2300 см/с, 2500 см/с, 3000 см/с або 3500 см/с. У способах, наданих в цьому документі, можна використовувати будь-яку кислоту, яку визнає придатною фахівець в даній галузі. У певних варіантах здійснення кислота вибрана з групи, яка складається з фосфорної кислоти, оцтової кислоти, лимонної кислоти, виннокам’яної кислоти, янтарної кислоти і їх суміші. У способах, наданих в цьому документі можна використовувати будь-яку кислоту, яку визнає придатною фахівець в даній галузі. У певних варіантах здійснення основа вибрана з групи, яка складається з гідроксиду натрію, гідроксиду калію, силікату натрію, карбонату натрію, карбонату кальцію і їх комбінації. У певних варіантах здійснення спосіб гідратації негідратованих фосфоліпідів в придатному в їжу маслі, крім того, включає стадію рафінування гідратацією або ферментативного рафінування для отримання рафінованої олії. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб, де після гідратації NHP йде ферментативна обробка і видалення різних фосфоліпідів і лецитинів. Такі способи можна здійснювати на практиці або на неочищених, або на рафінованих гідратацією, оліях. У певних варіантах здійснення спосіб рафінування олії, представлений в цьому документі, включає a) змішування водного розчину кислоти з харчовою олією з отриманням кислотної суміші, що має pH приблизно від 1 до 4, b) змішування основи з кислотною сумішшю з отриманням суміші, яка прореагувала, що має pH приблизно 6-9, і с) рафінування суміші, яка прореагувала, водою або ферментом з отриманням рафінованої олії. У певних варіантах здійснення змішування на стадії a) і/або b) приводить до емульсії, яка містить водну фазу із середнім розміром крапель від приблизно 15 мкм до приблизно 45 мкм. У певних варіантах здійснення змішування на стадіях a) і/або b) приводить до емульсії, яка містить щонайменше приблизно 60% водної фази по об'єму з розміром крапель від приблизно 15 до приблизно 45 мкм, де процент водної фази оснований на об'ємі водної фази. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб видалення NHP, гідратованих фосфоліпідів і лецитинів (в сукупності відомих як "камеді") з рослинних олій з отриманням продукту у вигляді рафінованої олії або жиру, який можна використовувати для виробництва харчових продуктів і/або нехарчових застосувань. У певних варіантах здійснення в способах рафінування, наданих в цьому документі, використовується вода, різні кислоти і/або різні основи або їх комбінація. У іншому аспекті в цьому документі передбачений спосіб збільшення швидкості реакції фосфоліпази, що використовується в способі ферментативного рафінування, так щоб ферментативна реакція мала тривалість менше приблизно однієї години. У іншому аспекті в цьому документі передбачений спосіб рафінування композиції на основі олії, в якому як гідратовані, так і негідратовані, фосфоліпіди можна обробляти в єдиному процесі, де ферментативна реакція завершується протягом менше приблизно однієї години. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб гідролізу, розщеплення або руйнування композиції, яка містить фосфоліпід, що включає: (А) (a) надавання поліпептиду фосфоліпази; (b) надавання композиції, що містить фосфоліпід; і (с) контактування поліпептиду стадії (a) з композицією стадії (b) в умовах, де фосфоліпаза гідролізує, розщеплює або руйнує композицію, яка містить фосфоліпід; (В) спосіб згідно з (А), де композиція містить ліпідний бішар, який містить фосфоліпід, або мембрану; або (C) спосіб згідно з будь-яким з (А) або (В), де композиція містить клітину рослини, бактеріальну клітину, клітину дріжджів, клітину комах або клітину тварин. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб розрідження або видалення композиції, яка містить фосфоліпід, що включає: (a) надавання поліпептиду фосфоліпази; (b) надавання композиції, що містить фосфоліпід; і (с) контактування поліпептиду стадії (a) з композицією стадії (b) в умовах, де фосфоліпаза 17 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 видаляє або розріджує композицію, яка містить фосфоліпід. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб очищення фітостерину або тритерпену, що включає: (A1) (AIa) надавання композиції, що містить поліпептид фосфоліпази; (AIb) надавання композиції, що містить фітостерин або тритерпен; і (AIc) контактування поліпептиду стадії (a) з композицією стадії (b) в умовах, де поліпептид може каталізувати гідроліз фосфоліпіду в композиції; (BI) спосіб згідно з (AI), де фітостерин або тритерпен містить рослинний стерин; (CI) спосіб згідно з (BI), де рослинний стерин походить з рослинної олії; (DI) спосіб згідно з (CI), де рослинна олія включає кокосову олію, олію каноли, олію какао, кукурудзяну олію, бавовняну олію, льняну олію, оливкову олію, пальмову олію, арахісову олію, олію, отриману з рисового лушпиння, сафлорову олію, кунжутну олію, соєву олію або соняшникову олію; (EI) спосіб згідно з будь-яким з (AI)-(DI), крім того, що включає застосування неполярних розчинників для кількісної екстракції вільних фітостеринів і фітостерилових ефірів жирних кислот; або (FI) спосіб згідно з (EI), де фітостерин або тритерпен включає β-ситостерин, кампестерин, стигмастерин, стигмастанол, β-ситостанол, ситостанол, десмостерин, халінастерин, пориферастерин, кліонастерин або брасикастерин. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб рафінування олії або жиру, що включає: (A1) (A1a) надавання композиції, що містить поліпептид фосфоліпази; (A1b) надавання композиції, що містить олію або жир, які містять фосфоліпід; і (A1c) контактування поліпептиду стадії (A1a) з композицією стадії (A1b) в умовах, де поліпептид може каталізувати гідроліз фосфоліпіду в композиції; (B1) спосіб згідно з (A1), де поліпептид знаходиться у водному розчині, який додають в композицію; (C1) спосіб згідно з (B1), де рівень води складає приблизно від 0,5 до 5%; (D1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(C1), де тривалість процесу складає менше ніж приблизно 2 години; (E1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(C1), де тривалість процесу складає менше ніж приблизно 60 хвилин; (F1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(C1), де тривалість процесу складає менше ніж приблизно 30 хвилин, менше ніж приблизно 15 хвилин або менше ніж приблизно 5 хвилин; (G1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(F1), де умови гідролізу включають температуру приблизно від 25°С до 70°C; (H1) спосіб згідно з будь-яким з (AI)-(GI), де умови гідролізу включають застосування лугів; (I1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(H1), де умови гідролізу включають pH приблизно від pH 3 до pH 10; (J1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(I1), де умови гідролізу включають додавання емульгаторів і/або змішування після контактування стадії (A1)(A1c); (K1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(J1), що включає додавання реагенту для розшарування емульсії і/або нагрівання або охолоджування для забезпечення відділення водної фази; (L1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(K1), що включає рафінування перед стадією контактування для збирання лецитину центрифугуванням, а потім додавання PLC, PLC і/або PLA для видалення негідратованих фосфоліпідів; (M1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(L1), що включає рафінування гідратацією неочищеної олії до менше ніж 10 м. ч. фосфору для харчових олій і додаткове фізичне очищення до менше ніж приблизно 50 м. ч. фосфору для біодизельних масел; або (N1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(M1), що включає додавання кислоти для забезпечення гідратації негідратованих фосфоліпідів. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб рафінування олії або жиру, що включає: (a1) надавання композиції, що містить поліпептид фосфоліпази; (b1) надавання композиції, що містить жир або олію, які містять фосфоліпід; і (c1) контактування поліпептиду стадії (a1) і композиції стадії (b1) в умовах, де поліпептид може каталізувати гідроліз фосфоліпіду в композиції. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб фізичного очищення композиції, яка містить фосфоліпід, що включає: (А-1) (А-1a) надавання композиції, що містить поліпептид фосфоліпази; 18 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (А-1b) надавання композиції, що містить фосфоліпід; і (А-1c) контактування поліпептиду стадії (А-1a) з композицією стадії (А-1b) до, в процесі або після фізичного очищення; (В-1) спосіб згідно з (А-1), де поліпептид додають до фізичного очищення, і композиція, що містить фосфоліпід, містить рослину, і поліпептид експресується трансгенно в рослині, причому поліпептид додають в процесі дроблення насіння або іншої частини рослини або поліпептид додають після дроблення або перед очищенням; (С-1) спосіб згідно з (А-1), де поліпептид додають в процесі фізичного очищення; (D-1) спосіб згідно з (А-1), де поліпептид додають після фізичного очищення: в інтенсивному змішувачі або ретенційному змішувачі; після стадії нагрівання; в центрифузі; в соапсток; в змивну воду; або на стадії відбілювання або дезодорування; або (Е-1) спосіб згідно з будь-яким з (А-1)-(D-1), крім того, що включає додавання ферменту фосфоліпази А (PLA), фосфоліпази В (PLB), фосфоліпази С (PLC), фосфоліпази D (PLD) або фосфатази, або їх комбінації. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб лужного очищення композиції, яка містить фосфоліпід, що включає: (A1) (A1a) надавання композиції, що містить поліпептид, який має активність фосфоліпази; (A1b) надавання композиції, що містить фосфоліпід; і (A1e) контактування поліпептиду стадії (A1a) з композицією стадії (A1b) до, в процесі або після лужного очищення; (B1) спосіб згідно з (A1), де поліпептид додають до додавання кислоти або лугу; (C1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(B1), де поліпептид додають в процесі лужного очищення і різні рівні кислоти і луги додають, в залежності від рівнів фосфору і рівнів вільних жирних кислот; або (D1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(B1), де поліпептид додають після лужного очищення: в інтенсивному змішувачі або ретенційному змішувачі; після стадії нагрівання; в центрифузі; в соапсток; в змивну воду; або на стадії відбілювання або дезодорування; або (E1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(D1), де умови лужного очищення забезпечують додаванням концентрованого розчину лугу, або де умови лужного очищення включають застосування концентрованого розчину лугу - більш концентрованого, ніж промисловий стандарт 11%, або де умови лужного очищення включають застосування концентрованого розчину лугу, який є концентрованим на 12-50%; (F1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(E1), де композиція, що містить фосфоліпід, містить рослину; (G1) спосіб згідно з будь-яким з (F1), де поліпептид експресується в рослині трансгенно; (H1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(G1), де поліпептид додають в процесі дроблення насіння або іншої частини рослини або поліпептид додають після дроблення або перед очищенням; або (I1) спосіб згідно з будь-яким з (A1)-(H1), який включає процес, вказаний на фігурі 10; або процес, вказаний на фігурі 10, в якому додають достатню кількість кислоти для забезпечення зниження вмісту металевого кальцію і магнію. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб деацилування 2'- або 3'-ланцюга жирної кислоти з ліпіду А, що включає контактування ліпіду А з поліпептидом фосфоліпази. У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб зменшення маси камеді і збільшення вмісту нейтральної олії (тригліцериди) шляхом зниження утримання олії, що включає: (A1) (A1a) надавання композиції, що містить поліпептид фосфоліпази; (A1b) надавання композиції, що містить олію або жир, які містять фосфоліпід; і (A1e) контактування поліпептиду стадії (A1a) і композиції стадії (Alb) в умовах, де поліпептид може каталізувати гідроліз фосфоліпіду в композиції протягом часу, достатнього для зниження маси камеді і збільшення кількості нейтральних масел; (B1) препарат білка згідно з (A1), де препарат білка містить склад, що містить неводну рідку композицію, відлите тверде тіло, порошок, ліофілізований порошок, гранулярну форму, форму у вигляді частинок, пресовану таблетку, драже, пілюлю, форму гелю, гідрогель, пасту, аерозоль, спрей, лосьйон, склад зависі, водну/масляну емульсію, крем, капсулу, везикулу, або міцелярну суспензію; або (C1) спосіб згідно з (A1) або (B1), що включає застосування змішування композиції з високим зсувним зусиллям з подальшим змішуванням без зсувного зусилля або з низьким зсувним зусиллям щонайменше з одним поліпептидом за винаходом, що має активність фосфоліпази, для забезпечення належного контактування фосфоліпідного субстрату з фосфоліпазою. 19 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У одному варіанті здійснення в цьому документі передбачена олія або жир, які продукуються способами, наданими в цьому документі. Ферменти для застосування в способах, наданих в цьому документі, включають ферменти, які мають активність фосфоліпази. Активність фосфоліпази включає, наприклад, активність фосфоліпази С (PLC), активність фосфоліпази А (PLA), активність фосфоліпази A1 або активність фосфоліпази A2, активність фосфоліпази В (PLB), включаючи активність фосфоліпази В 1 або фосфоліпази B2, активність фосфоліпази D (PLD), включаючи активність фосфоліпази D1 або активність фосфоліпази D2. У одному варіанті здійснення ферменти для застосування в цьому документі включають поліпептиди, які мають активність фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC) або еквівалентного ферменту, і/або активність іншої фосфоліпази, включаючи активність фосфоліпази А, В, С, D, пататину, фосфатаз фосфатидної кислоти (PAP) і/або ацилгідролази ліпідів (LAH) або еквівалентного ферменту. У певних варіантах здійснення фермент для застосування в способах, представлених в цьому документі, вибраний з фосфоліпази А, фосфоліпази С, фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С або їх комбінації. У певних варіантах здійснення фермент для застосування в способах, наданих в цьому документі, вибраний з фосфоліпази С, фосфатидилінозитолспецифічної фосфоліпази С або їх комбінації. У певних варіантах здійснення фермент для застосування в способах, наданих в цьому документі, являє собою фермент фосфатидилінозитол-специфічну фосфоліпазу С, як описано в цьому документі. У певних варіантах здійснення фермент для застосування в способах, наданих в цьому документі, вибраний з фосфоліпази С, і ферменту, що містить SEQ ID NO: 8. У певних варіантах здійснення фермент для застосування в способах, наданих в цьому документі, являє собою фермент, що містить SEQ ID NO: 8. У іншому варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб отримання фосфоліпіду з харчової олії. У певному варіанті здійснення фосфоліпіди, що отримуються способами, наданими в цьому документі, включають множину фосфоліпідів, включаючи, але не обмежуючись ними, фосфатидилхолін (PC), фосфатидилетаноламін (PE), фосфатидилсерин (PS), фосфатидилінозитол (PI), фосфатидну кислоту (PA), лізофосфатидилхолін (LPC), лізофосфатидилетаноламін (LPE), лізофосфатидилсерин (LPS), лізофосфатидилінозитол (LPI), лізофосфатидну кислоту (LPA), холін (C), етаноламін (Е), серин (S) і інозитол (I). У іншому варіанті здійснення в цьому документі передбачений спосіб отримання холіну (C), етаноламіну (Е), серину (S) або інозитолу (I) з харчової олії. Докладний опис одного або декількох варіантів здійснення даного винаходу представлений далі на прикладених нижче кресленнях і описі. Інші властивості, цілі і переваги винаходу будуть очевидні з опису і креслень, і з формули винаходу. Всі публікації, патенти, патентні заявки, послідовності з GenBank і матеріали АТСС, цитовані в даному описі для будь-яких цілей, таким чином, повністю включені в даний опис як посилання. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Описані нижче креслення ілюструють варіанти здійснення винаходу, і не мається на увазі, що вони обмежують об'єм винаходу, який охоплюється формулою винаходу. На Фіг. 1 схематично проілюстрований ілюстративний спосіб очищення рослинної олії з використанням фосфоліпаз за винаходом. На Фіг. 2 схематично проілюстрований ілюстративний процес рафінування за винаходом для фізично очищених олій, як детально розглянуто нижче. На Фіг. 3 схематично проілюстрований гідроліз фосфатидів фосфоліпазою С за винаходом, як детально розглянуто нижче. На Фіг. 4 схематично проілюстрований ілюстративний процес лужного очищення за винаходом, і проілюстрований альтернативний варіант здійснення, що включає застосування фосфоліпази С за винаходом як "добавки для лужного очищення" (лужне очищення з тривалим перемішуванням), як детально розглянуто нижче. На Фіг. 5 схематично проілюстроване застосування фосфоліпази С за винаходом як добавки для рафінування, як детально розглянуто нижче. На Фіг. 6 схематично проілюстрований ілюстративний процес лужного очищення за винаходом, і проілюстрований альтернативний варіант здійснення, що включає застосування фосфоліпази С за винаходом як "добавки для лужного очищення" (лужне очищення з тривалим перемішуванням), як детально розглянуто нижче. На Фіг. 7 проілюстрований інший варіант способів за винаходом, де в способі використовують дві стадії центрифугування, як детально розглянуто нижче. На Фіг. 8 проілюстрований інший варіант способів за винаходом, де в способі використовують три стадії центрифугування, як детально розглянуто нижче. 20 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фіг. 9 проілюстрований інший ілюстративний варіант цього процесу, в якому використовується обробка кислотою і є стадія центрифугування перед стадією рафінування, як детально розглянуто нижче. На Фіг. 10 проілюстрована масова частка окремих типів фосфоліпідів (PL): фосфатидної кислоти (PA), фосфатидилетаноламіну (PE), фосфатидилінозитолу (PI), фосфатидилхоліну (PC) відносного загального вмісту PL, що залишається після обробки мутантними фосфоліпазами за винаходом. На Фіг. 11 проілюстровані поліпшені мутанти, отримані способом "мутагенезу з насиченням сайтів гена" або "GSSM", відібраних для включення в бібліотеку повторного збирання генів, яка включає ілюстративні фосфоліпази за винаходом. На Фіг. 12 проілюстрований спиртовий процес, який може включати ферменти за винаходом. На Фіг. 13 представлена композиція фосфоліпідів у витягнутих вологих камедях в контрольних прикладах. На Фіг. 14 представлене порівняння фосфоліпідів згідно з контрольними прикладами проти прикладів з використанням способів, представлених в цьому документі, де pH на стадії b) доводять до pH 7,0. На Фіг. 15 порівнюється втрата нейтральної олії в фазу камеді в контрольних реакціях з нейтральним pH проти реакцій з доведеним pH при pH 7,0, паралельно. На Фіг. 16 порівнюється втрата нейтральної олії в фазу камеді в умовах різних pH, де використовується фосфоліпаза A1. На Фіг. 17 представлений розподіл крапель у водній фазі, отриманій способом згідно з прикладом 17A. На Фіг. 18 представлений розподіл крапель у водній фазі, отриманій способом згідно з прикладом 17B. На Фіг. 19 представлений розподіл крапель у водній фазі, отриманій способом згідно з прикладом 17C. На Фіг. 20 представлений розподіл крапель у водній фазі, отриманій способом згідно з прикладом 17D. На Фіг. 21 представлений порівняльний розподіл крапель у водній фазі, отриманій способами згідно з прикладами 17A, 17B, 17C і 17D. Подібні символи на різних кресленнях вказують на подібні елементи. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід стосується поліпептидів, які мають активність фосфатидилінозитолспецифічної фосфоліпази С (PI-PLC) або еквівалентного ферменту, і/або активність іншої фосфоліпази, включаючи активність фосфоліпази А, В, С, D, пататину, фосфатаз фосфатидної кислоти (PAP) і/або ацилгідролаз ліпідів (LAH) або активність еквівалентного ферменту, полінуклеотидів, які кодують їх, антитіл, які специфічно зв'язуються з ними, і способів їх отримання і застосування. У одному варіанті здійснення активність ферменту фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC) у поліпептидів за винаходом включає: 1-фосфатидил-1D-міоінозитол 4,5-біфосфат (який також називається PIP2, фосфатидилінозитолбіфосфатом)+H2O↔1D-міоінозитол 1,4,5-трифосфат (який також називається IP3, інозитолтрифосфатом) + діацилгліцерин У альтернативних варіантах здійснення ферменти за винаходом можуть ефективно розщеплювати гліцеринфосфатний складноефірний зв'язок в оліях, таких як рослинні олії, наприклад, фосфоліпіди олійного насіння, з утворенням екстрагованої водою фосфорилованої основи і дигліцериду. У альтернативних варіантах здійснення фосфоліпази за винаходом мають активність ацилгідролази ліпідів (LAH); або можуть розщеплювати гліцеринфосфатні складноефірні зв'язки в фосфатидилхоліні (PC), фосфатидилетаноламіні (PE), фосфатидилсерині (PS), фосфатидилінозитолі (PI), фосфатидній кислоті і/або сфінгомієліні, або вони мають комбінацію цих видів активності. Наприклад, в одному аспекті фосфоліпаза за винаходом є специфічною до одного або декількох специфічних субстратів, наприклад, фермент за винаходом може мати специфічність дії відносно PE і PC; PE і PI; PE і PS; PS і PC; PS і PI; PI і PC; PS, PI і PC; PE, PI і PC; PC, PE і PS; PE, PS і PI; або PE, PS, PI і PC. У альтернативних варіантах здійснення фосфоліпазу за винаходом (наприклад, фермент фосфатидилінозитол-специфічну фосфоліпазу С (PI-PLC) або фермент з еквівалентною активністю) можна використовувати для ферментативного рафінування олій, наприклад, неочищених олій, оскільки фосфатна група розчинна у воді і її легко видаляти. Дигліцеридний продукт залишається в олії і, таким чином, втрати знижуються. PLC за винаходом можна 21 UA 111708 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосовувати в доповнення до або замість PLA1 і PLA2 в комерційному рафінуванні олії, такому як спосіб ENZYMAX®, де фосфоліпіди гідролізують за допомогою PLA1 і PLA2. У альтернативних варіантах здійснення фосфоліпази за винаходом є активними при високій і/або при низькій температурі, або протягом широкого діапазону температур, наприклад, вони можуть бути активними при температурах в діапазоні від 20°C до 90°C, від 30°C до 80°C, або від 40°C до 70°C. Також винахід стосується фосфоліпаз, які мають активність при лужних pH або кислих pH, наприклад, при низькій кислотності води. У альтернативних аспектах фосфоліпази за винаходом можуть мати активність в кислих pH, таких як pH 6,5, pH 6,0, pH 5,5, pH 5,0, pH 4,5, pH 4,0, pH 3,5, pH 3,0, pH 2,5, pH 2,0 або при більш кислих pH (тобто pH 10,0). У одному аспекті фосфоліпази за винаходом є активними в діапазоні температур від приблизно 40°C до приблизно 70°C, 75°C або 80°C, або більше, в умовах низької водної активності (низького вмісту води). Також винахід стосується способів отримання PLC і/або модифікації активності ілюстративних фосфоліпаз за винаходом для отримання ферментів з альтернативними бажаними властивостями, наприклад, з активністю ферменту фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази С (PI-PLC), що має альтернативні субстрати, або з видами активності в різних умовах навколишнього середовища, наприклад, при різних температурах, pH і т. п. Наприклад, фосфоліпази, отримані способами за винаходом, можуть мати змінену субстратну специфічність, специфічність зв’язування субстрату, характер розщеплення субстрату, термічну стабільність, pH/профіль активності, pH/профіль стабільності (такий як збільшена стабільність при низьких, наприклад, pH