Короткотривала високотемпературна обробка, що дозволяє одержати мікробні препарати із протизапальними профілями

Реферат: Винахід належить до підданих короткотривалій високотемпературній обробці мікроорганізмів для лікування або профілактики запальних захворювань, наприклад пробіотиків і/або культур молочних заквасок. UA 109112 C2 (12) UA 109112 C2 UA 109112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід в цілому стосується галузі мікроорганізмів. Зокрема, даний винахід стосується оброблених високою температурою мікроорганізмів, наприклад, пробіотиків і молочних заквасок, а також застосування таких бактерій. Один з варіантів втілення даного винаходу стосується підданих високотемпературній обробці мікроорганізмів, наприклад, пробіотиків і молочних заквасок, і їх застосування для приготування композиції для лікування або профілактики запальних захворювань. Пробіотики можна визначити як "живі мікроорганізми, які при введенні в адекватних кількостях приносять користь здоров'ю людини" (Настанови ФАО/ВООЗ Guidelines). Більшість опублікованих джерел пов'язана із живими пробіотиками. Однак, деякі дослідження розглядали користь для здоров'я, яку забезпечують нереплікативні бактерії, однак, в більшості дійшли до висновку, що теплова інактивація пробіотиків, як правило, веде до втрати очікуваних корисних ефектів (Rachmilewitz, D., K. et al, 2004, Gastroenterology 126:520-528; Castagliuolo, I., et al., 2005, FEMS Immunol.Med.Microbiol. 43:197-204; Gill, H. S. and K. J. Rutherfurd. 2001, Br.J.Nutr. 86:285289; Kaila, M., et al.,. 1995, Arch.Dis.Child 72:51-53;). Деякі, однак, показали, що вбиті пробіотики можуть зберігати деякі ефекти для здоров'я (Rachmilewitz, D., K. et al, 2004, Gastroenterology 126:520-528; Gill, H. S. and K. J. Rutherfurd. 2001, Br.J.Nutr. 86:285-289). Застосування живих пробіотиків як стратегія для лікування або запобігання запальним кишковим хворобам було відзначено у літературі, нещодавно був підготовлений огляд Dotan et al. (Dotan, I. and D. Rachmilewitz. 2005; Curr.Opin.Gastroenterol. 21:426-430). Наприклад, висококонцентрована суміш із восьми живих бактерій-пробіотиків (VSL#3) продемонструвала ефективність у профілактиці (Gionchetti, P., et al., 2003, Gastroenterology 124:1202-1209) та лікуванні рецидивних або таких, що не піддаються лікуванню паучитів у людей (Gionchetti, P., et al., 2000, Gastroenterology 119:305-309; Mimura, T., et al., 2004, Gut 53:108-114). Дуже цікавим є результати проведеного із застосуванням моделі DSS-мишей дослідження колітів Rachmilewitz et al. (Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 126:520-528), яке свідчить про те, що лікування живими і γ-опроміненими, однак, не знищеними тепловою обробкою VSL#3, захищає від колітів. Аналогічним чином, вбиті тепловою обробкою L. crispatus не показані ефективності у захисті від DSS-викликаних колітів, хоча живі бактерії очевидно знижували втрату ваги тіла і активність МПО в кишечнику (Castagliuolo, et al., 2005, FEMS Immunol.Med.Microbiol. 43:197-204). Такі дослідження дозволяють припустити, що живі пробіотики в контексті запалень кишечника є більш ефективними, аніж ті, що не реплікуються. Було встановлено, що інактивовані L. reuteri (вбиті тепловою обробклю і γ-опромінені) не можуть зменшувати стимульоване TNFα виробництво IL-8 клітинами T84, хоча їх живі аналоги показують значний корисний ефект (Ma, D., et al., 2004, Infect.Immun. 72:5308-5314). Очевидно, що інактивовані пробіотики значно легше обробляти, наприклад, у харчовій промисловості, і/або зберігати. Відтак, обнадійливим вважається той факт, що інактивовані пробіотики також можуть мати корисні ефекти для споживача, однак, одночасно розчаровує той факт, що такі ефекти, як правило, знижені або навіть відсутні у порівнянні із життєздатними пробіотиками. Наявними наразі технологіями для перетворення штамів пробіотиків на нереплікативні є, зазвичай, теплова обробка, γ-опромінення, ультрафіолетове опромінювання або застосування хімічних речовин (формалін, параформальдегід). Навряд чи якісь дослідження порівнювали ефекти різних методів інактивації на біологічну функцію одержаних нереплікативних бактерій. Крім вищевказаного дослідження Rachmilewitz, одне дослідження відзначало, що піддані тепловій обробці і γ-опромінені бактерії викликають різні рівні секреції цитокінів епітеліальними клітинами in vitro (Wong, C. and Z. Ustunol. 2006, J.Food Prot. 69:2285-2288). Описані та випробувані в літературі технології обробки штамів пробіотиків, внаслідок якої вони стають нереплікативними, як правило, не застосовні або важко застосовні у промислових масштабах, зокрема, у харчовій промисловості. Більшість продуктів, наявних сьогодні на ринку, які містять пробіотики, піддають тепловій обробці під час їхнього виробництва. Таким чином, пробіотики зручно піддавати тепловій обробці разом із готовим продуктом або принаймні однаковим способом, при цьому пробіотики зберігають або покращують свої корисні властивості або навіть набувають нової корисної властивості для споживача. Однак,застосовувані в літературі для інактивації бактерії способи теплової обробки, як правило, є довготривалими (від 20 хв. до 1 години або довше) при температурах, що змінюються від 40 до 100 °C, що не легко втілювати у промислових масштабах. Крім того, такі відомі з рівня техніки теплові обробки, як правило, призводять до принаймні часткової втрати активності пробіотиків. 1 UA 109112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В промислових масштабах довготривалі обробки не застосовуються, як правило, застосовуються короткотривалі теплові обробки, наприклад, обробки, подібні до ультрависокотемпературних теплових обробок. Теплові обробки такого виду знижують бактеріальне навантаження і зменшують час обробки, таким чином, зменшуючи забруднення поживних елементів. Відтак, бажано одержати мікробний клітинний препарат, отримуваний із життєздатних мікроорганізмів, наприклад, пробіотичних бактерій або молочних заквасок, який може бути підданий тепловій обробці тим же способом, яким звичайно обробляються продукти в процесі виробництва, і що дозволяє одержати або покращити корисні ефекти для здоров'я, наприклад, профілактику і/або лікування запальних захворювань. Відтак, однією із задач даного винаходу є доповнення рівня техніки композицією, що містить мікроорганізми, наприклад, пробіотичні бактерій або молочні закваски, яка може піддаватися тепловій обробці в промислових умовах для зменшення життєздатних бактеріальних клітин, і яка в результаті такої теплової обробки дозволяє одержати або покращити корисний ефект для здоров'я. Автори винаходу несподівано побачили, що вони можуть вирішити дану задачу за допомогою рішення, розкритого в незалежних пунктах формули. Залежні пункти формули додатково розвивають даний винахід. Автори вперше продемонстрували, що мікроорганізми, наприклад, штами пробіотиків або молочних заквасок, піддані тепловій обробці високою температурою протягом короткого періоду часу., мають протизапальні імунні профілі незалежно від їх первісних властивостей. Зокрема, за допомогою теплової обробки або створюється новий протизапальний профіль, або покращується існуючий. Відтак, наразі можливо одержати нереплікативні мікроорганізми із протизапальними імунними профілями шляхом застосування специфічних параметрів теплової обробки, що відповідають типовій застосовній у промисловості тепловій обробці, навіть якщо їх живі аналоги не є протизапальними штамами. Даний ефект спостерігався, наприклад, для декількох мікроорганізмів, наприклад, для пробіотичних представників лактобацил та біфідобактерій, а також для культур молочних заквасок. Перевага нереплікативних пробіотичних мікроорганізмів полягає в тому, що їх значно легше обробляти, ніж їх живі аналоги. Крім того, вони є значно стабільнішими у зберіганні і вимагають менш суворих умов пакування. Нереплікативні пробіотичні мікроорганізми дозволяють одержувати широкий діапазон продуктів, які за своєю природою не передбачають додавання живих пробіотиків без додаткових засобів для їх захисту. Це має значення, наприклад, для одержання зернових батончиків, фруктових соків, оброблених ультрависокою температурою напоїв, напоїв тривалого зберігання тощо. Крім того, наприклад, для споживачів із тяжкими розладами імунної системи застосування живих пробіотиків може бути обмежене до виняткових випадків у зв'язку із потенційним ризиком розвитку бактеріємії. Наразі автори представляють спосіб одержання нежиттєздатних бактерій із протизапальними профілями, незалежно від їх первісних імунних профілів. Додатково, одержання нереплікативних мікроорганізмів дозволяє відновлення гарячою водою, наприклад, порошкових харчових композицій, із збереженням користі для здоров'я пацієнта-споживача. Наскільки відомо авторам, застосування високотемпературної обробки протягом короткого часу для одержання нереплікативних бактерій із протизапальними профілями досі не описувалося. Відповідно, один з варіантів втілення даного винаходу – це композиція, яка включає мікроорганізми, яка відрізняється тим, що мікроорганізми піддані високотемпературній обробці при принаймні 71.5 °C протягом принаймні 1 секунди. Мікроорганізми переважно є харчовими мікроорганізмами. Мікроорганізм є харчовим, якщо його допущено до використання для споживання людиною або твариною. В одному з варіантів втілення мікроорганізми можуть бути пробіотиками Для цілей даного винаходу пробіотики визначені як "мікробіальні клітинні препарати або компоненти мікробіальних клітин, які виявляють корисний ефект або покращують стан здоров'я істоти-носія" (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al "Probiotics: how should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10). В ще одному варіанті втілення винаходу мікроорганізми можуть бути культурами молочних заквасок. 2 UA 109112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переважно мікроорганізми піддають високотемпературній обробці при приблизно 71.5150 °C протягом короткого періоду часу у приблизно 1-120 секунд. Переважніше, мікроорганізми піддають високотемпературній обробці при приблизно 90140 °C, наприклад, 90°-120 °C, протягом короткого періоду часу у приблизно 1-30 секунд. В одному з варіантів втілення винаходу така високотемпературна обробка принаймні частково робить мікроорганізми нереплікативними. "Нереплікативні" мікроорганізми включають мікроорганізми, наприклад, пробіотичні бактерії і культури молочних заквасок, які були піддані тепловій обробці. Це включає мікроорганізми, що є інактивованими, мертвими, нежиттєздатними і /або наявні в якості фрагментів, наприклад, ДНК, метаболітів, цитоплазмідних сполук, і /або матеріалів клітинних стінок. "Нереплікативні" означає, що класичними способами культивування не можливо визначити життєздатні клітини і/або колонієутворюючі одиниці. Такі класичні способи культивування описані у книзі із мікробіології: James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology. 7th edition, Springer Science, New York, N.Y. 790 p. Як правило, відсутність життєздатних клітин демонструють наступним способом: відсутні видимі колонії на чашках з агаровим середовищем або відсутнє збільшення мутності у рідкому середовищі зросту після інокуляції різними концентраціями бактеріальних препаратів (зразки, "що не реплікуються") та інкубації у відповідних умовах (аеробне і /або анаеробне середовище протягом принаймні 24год). Високотемпературну обробку можна здійснювати при нормальному атмосферному тиску, а також можна здійснювати при високому тиску. Зазвичай, рівень тиску становить в межах від 1 до 50 бар, переважно 1-10 бар, переважніше 2-5 бар. Очевидно, переважно, щоб при застосуванні температури теплову обробку пробіотиків здійснювали у рідкому або твердому середовищі. Значення ідеального застосовуваного тиску залежить від природи композиції, в якій знаходяться мікроорганізми, та від застосовуваної температури. Високотемпературну обробку можна здійснювати при температурі в межах близько 71,5150 °C, переважно близько 90-120 °C, переважніше близько 120-140 °C. Високотемпературну обробку можна здійснювати протягом короткого проміжку часу близько 1-120 секунд, переважно 1-30 секунд, переважніше 5-15 секунд. Згаданий проміжок часу відповідає часу, протягом якого пробіотичні мікроорганізми піддаються обробці при даній температурі. Слід зазначити, що час нагрівання може змінюватися залежно від природи та кількості композиції, в якій знаходяться мікроорганізми, та залежно від моделі застосовуваного нагрівального пристрою. Однак, зазвичай, суміш для дитячого харчування згідно даного винаходу та/або мікроорганізми піддають високотемпературній короткотривалій обробці (HTST), миттєвій пастеризації або надвисокій температурній обробці (UHT). Надвисока температурна обробка – це обробка при надвисокій температурі або надвисока теплова обробка (обидва терміни мають абревіатури UHT), яка передбачає принаймні часткову стерилізацію композиції шляхом її нагрівання за короткий проміжок часу, близько 1-10 секунд, при температурі, яка перевищує 135 °C (275 °F), та яка необхідна для того, щоб убити спори бактерій у молоці. Наприклад, обробка молока таким способом із застосуванням температур, які перевищують 135 °C, дозволяє знизити бактеріальне навантаження за необхідний час витримування (2-5 с), що уможливлює безперервний спосіб виробництва. Існує два основних види систем надвисокої теплової обробки: прямі та непрямі системи. У прямих системах продукти обробляються шляхом інжектування пари або нагнітання пари, в той час як в непрямих системах продукти піддаються тепловій обробці шляхом застосування пластинчастого теплообмінника, трубчастого теплообмінника або теплообмінника скребкового типу. Поєднання систем надвисокої теплової обробки можна застосовувати на будь-якій стадії або багатьох стадіях у процесі приготування продукту. Високотемпературна короткотривала обробка має наступне визначення (високотемпературна/короткотривала): спосіб пастеризації, призначений для досягнення 5кратного зниження, знищує 99,9999 % життєздатних мікроорганізмів у молоці. Така обробка вважається нормальною для знищення майже усіх дріжджів, грибків та загальних забруднюючих бактерій, які викликають псування продукту, а також забезпечує відповідне знищення загальних патогенних термостійких організмів. Під час високотемпературної короткотривалої обробки молоко нагрівають до 71,7 °C (161 °F) протягом 15-20 секунд. Миттєва пастеризація – це спосіб теплової пастеризації напоїв, які швидко псуються, такі, як фруктові або овочеві соки, пиво та молочні продукти. Її здійснюють перед розливом у контейнери для того, щоб знищити мікроорганізми, які викликають псування продукту, та зробити продукти безпечнішими і продовжити термін їхнього зберігання. Рідина рухається 3 UA 109112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 безперервним контрольованим потоком та одночасно обробляється високими температурами від 71,5 °C (160 °F) до 74° (165 °F) протягом 15-30 секунд. В контексті даного винаходу термін "короткотривала високотемпературна обробка" включає, наприклад, високотемпературні короткотривалі обробки (HTST), надвисокотемпературні теплові обробки та миттєву пастеризацію. Після того, як внаслідок високотемпературної короткотривалої обробки пробіотики стають нереплікативними, вони демонструють покращені або нові корисні ефекти, описані вище. Ефективною буде будь-яка кількість вищеописаних нереплікативних мікроорганізмів. Однак, як правило, переважно, якщо принаймні 90 %, переважно принаймні 95 %, переважніше принаймні 98 %, найпереванжіше принаймні 99 %, в ідеалі принаймні 99.9 %, в найідеальнішому варіанті всі пробіотики є нереплікативними. В одному з варіантів втілення даного винаходу всі мікроорганізми є нерепліктивними. В контексті даного винаходу можна застосовувати всі мікроорганізми. Переважно, мікроорганізми є харчовими. Типовими харчовими мікроорганізмами є пробіотики. Переважно, застосовують пробіотики, які можуть бути обрані з групи, до якої входять Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Candida, або їх суміші. Наприклад, пробіотики можуть бути обрані з групи, до якої входять Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, і/або їх суміші. Культури молочних заквасок можуть бути обрані з групи, до якої входять Propionibacterium, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, і їх суміші. Важливо, що високотемпературну обробку, наприклад, проводять при приблизно 71.5150 °C протягом короткого періоду часу в приблизно 1-120 секунд. Така обробка може застосовуватися щодо життєздатних або нежиттєздатних пробіотиків. Можна здійснювати більше однієї високотемпературної обробки, наприклад, при приблизно 71.5-150 °C протягом короткого періоду часу у приблизно 1-120 секунд. В одному з варіантів даного винаходу пробіотики можуть бути обрані з групи, до якої входять роди Bifidobacterium, Lactobacillus і Escherichia або їх суміші. Типовими прикладами біфідобактерій є Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve або Bifidobacterium lactis. Типовими прикладами лактобацил є Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus абоLactobacillus rhamnosus. Типовим прикладом Escherichia є штами Escherichia coli із очікуваними корисними ефектами для здоров'я. В одному з варіантів даного винаходу культурами молочних заквасок є Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii і Lactococcus lactis. Додатково, наприклад, пробіотики можна обрати з групи, до якої входять Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Escherichia coli Nissle 1917, або їх суміші. Додатково, наприклад, молочні закваски можна обрати з групи, до якої входять Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus delbrueckii підвид. bulgaricus NCC 15 і Lactococcus lactis NCC 2287. Всі штами були депозитовані згідно Будапештської угоди і є наступними: Bifidobacterium longum NCC 3001: ATCC BAA-999 Bifidobacterium longum NCC 2705: CNCM I-2618 Bifidobacterium breve NCC 2950 CNCM I-3865 Bifidobacterium lactis NCC 2818: CNCM I-3446 Lactobacillus paracasei NCC 2461: CNCM I-2116 Lactobacillus rhamnosus NCC 4007: CGMCC 1.3724 Streptococcus themophilus NCC 2019: CNCM I-1422 Streptococcus themophilus NCC 2059: CNCM I-4153 Lactococcus lactis NCC 2287: CNCM I-4154 Lactobacillus casei NCC 4006: CNCM I-1518 Lactobacillus casei NCC 1825: ACA-DC 6002 Lactobacillus acidophilus NCC 3009: ATCC 700396 Lactobacillus bulgaricus NCC 15: CNCM I-1198 Escherichia coli Nissle 1917: DSM 6601 4 UA 109112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Композиції згідно даного винаходу включають піддані короткотривалій високотемпературній обробці мікроорганізми в кількості, достатній для принаймні часткового лікування запальних захворювань і/або їх ускладнень. Адекватна для досягнення даної мети кількість зветься "терапевтично ефективна доза". Ефективні для даної мети кількості залежатимуть від певноїкількості відомим фахівцям з рівня техніки факторів, наприклад, від тяжкості хвороби, ваги та загального стану здоров'я споживача, а також від ефективності харчової матриці. Для профілактичних потреб композиції згідно винаходу вводяться споживачу, схильному до або який має інший ризик запальних захворювань, в кількості, достатній для принаймні часткового зниження ризику розвитку запальних захворювань. Така кількість визначається як "профілактично ефективна доза ". Знов, точні кількості залежатимуть від певної кількості відомим фахівцям з рівня техніки факторів, наприклад, від ваги та загального стану здоровя споживача, а також від ефективності харчової матриці. Фахівці з рівня техніки зможуть регулювати терапевтично ефективну дозу і/або профілактично ефективну дозу відповідним чином. Як правило, композиція згідно даного винаходу містить піддані "короткотривалій високотемпературній обробці " мікроорганізми в терапевтично ефективній дозі і/або у профілактично ефективній дозі. Відповідно, терапевтично ефективна і/або профілактично ефективна доза може становити в діапазоні приблизно 0,005 мг – 1000 мг нереплікативних підданих "короткотривалій високотемпературній обробці " мікроорганізмів на добову дозу. В кількісних значеннях нереплікативні піддані "короткотривалій високотемпературній обробці " мікроорганізми можуть бути наявні в композиції в кількості, що відповідає між 104 і 1012 еквіваленту КУО/г композиції в сухій вазі. Очевидно, мікроорганізми, що не реплікуються, не утворюють колоній, відповідно, цей термін слід розуміти як кількість мікроорганізмів, що не реплікуються, одержану з 104-1012 КУО/г бактерій, що реплікуються. Це включає мікроорганізми, які не активовані, не життєздатні або мертві або наявні в якості фрагментів ДНК або клітинних стінок або цитоплазмідних сполук. Інакше кажучи, кількість мікроорганізмів, яку містить композиція, виражається у колонієутворюючій здатності (КУО) такої кількості мікроорганізмів, якби всі мікроорганізми були живими, незважаючи на те, чи є вони насправді такими, що не реплікуються, наприклад, інактивованими або мертвими, фрагментованими або комбінацією з будь-яких або всіх зазначених станів. Переважно мікроорганізми наявні в кількості, що еквівалентна 104-109 КУО/г композиції в сухій вазі, навіть переважніше в кількості, еквівалентній 105 – 108 КУО/г композиції в сухій вазі. Композиція згідно даного винаходу може бути композицією будь-якого виду. Наприклад, її можна вводити орально, ентерально, парентерально (черезшкірно або внутрішньом'язово), локально або наочно. Наприклад, це може бути фармацевтична композиція, нутрацевтик, харчова добавка, .косметична композиція, корм для тварин, харчовий продукт або напій. Харчові продукти відповідно до даного винаходу включають, наприклад, молочні продукти, наприклад, ферментовані молочні продукти, наприклад, йогурти, вершки, тощо; морозиво; концентроване молоко; молоко; молочні вершки; ароматизовані молочні напої; напої на основі сироватки; топпінги; кавові вершки; шоколад; сирні продукти; супи; соуси; пюре; заправки; пудинги; заварний крем; дитяче харчування; поживні суміші, наприклад, призначені для повноцінного харчування, наприклад, для немовлят, дітей, підлітків, дорослих, людей похилого віку або критичних хворих; зернові продукти та зернові батончики. Напої включають, наприклад, напої на основі молока або йогурту, ферментоване молоко, білкові напої, каву, чай, енергетичні напої, соєві напої, фруктові і/або овочеві напої, фруктові і/або овочеві соки. Косметичні композиції можуть включати, наприклад, лосьйони, шампуні, краплі для очей, креми. Харчова добавка або медикамент можуть мати форму таблеток, капсул, пастилок, саше, гелів або рідини, наприклад, поживних розчинів. Такі композиції можуть додатково містити захисні гідроколоїди (наприклад, камеді, білки, модифіковані крохмалі), зв'язувачі, плівкоутворюючі агенти, інкапсулюючі агенти/матеріали, стінкові/оболонкові матеріали, матричні сполуки, покриття, емульгатори, поверхнево-активні агенти, солюбілізатори, (олії, жири, воски, лецитин тощо), адсорбенти, носії, наповнювачі, косполуки, диспергатори, змочувачі, агенти обробки (солвенти), агенти текучості, агенти маскування смаку, обважувачі, гелеутворюючі агенти, антиоксиданти, антимікробні препарати. Вони також можуть містити звичайні фармацевтичні добавки і ад'юванти, ексципієнти та розріджувачі, включаючи, але не обмежуючись, воду, желатин будь-якого погодження, рослинні камеді, лігнінсульфонат, тальк, цукор, крохмаль, гуміарабік, рослинні олії, поліалкіленгліколі, 5 UA 109112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ароматизатори, консерванти, стабілізатори, емульгатори, буфери, любриканти, барвники, зволожувачі, наповнювачі або що. Крім того, композиції можуть містити органічні або неорганічні носії, придатні для орального або ентерального введення, а також вітаміни, мінеральні мікроелементи та інші мікроелементи у відповідності із рекомендаціями урядових установ, наприклад, USRDA. Композиція згідно даного винаходу може містити інші агенти, залежно від призначеного застосування композиції. Наприклад, може застосовуватись препарат для зменшення болю або жару для сприяння у мінімізації дискомфортного відчуття, викликаного запальним захворюванням. Для стабілізації композиції та її складових може бути доданий стабілізатор. Для регулювання присмаку і надання композиції кольору, за яким її легко ідентифікувати, і/або приємного кольору може бути доданий ароматизатор і /або барвник. Можуть бути додані пребіотики. Пребіотики можуть підтримувати зростання пробіотиків до того, як вони стають нереплікативними. Пребіотики можуть також синергетично діяти разом із життєздатними пробіотичними бактеріями, що наявні і/або можуть бути додані у композицію. "Пребіотик" – це неперетравлювані харчові речовини.які стимулюють зростання корисних для здоров'я мікроорганізмів і/або пробіотиків у кишечнику. Вони не розщеплюються у шлунку і /або верхньому кишечнику або не всмоктуються у шлунково-кишечний тракт особи, яка їх споживає, однак, ферментуються шлунково-кишечною мікробіотою і/або пробіотиками. Пребіотики, наприклад, визначені у Glenn R. Gibson and Marcel B. Roberfroid, Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics, J. Nutr. 1995 125: 14011412. Пребіотики, що можуть застосовуватись відповідно до даного винаходу, практично не обмежені, і включають будь-які харчові речовини, що сприяють зросту пробіотиків і/або корисних для здоров'я бактерій у кишечнику. Переважно, їх можна обрати з групи, до якої входять олігосахариди, можливо, фруктоза, галактоза, манноза; харчові волокна, наприклад, розчинні волокна, соєві волокна, інулін; або їх суміші. Переважними пробіотиками є фруктоолігосахариди (ФОС), галактоолігосахариди (ГОС), ізомальтоолігосахариди (IMO), ксилоолігосахариди (КOС), арабіноксилоолігосахариди (AКOС), маннанолігосахариди (MOС), олігосахариди сої, глікозилсахароза (ГС), лактосахароза (ЛС), лактулоза (ЛА), палатінозаолігосахариди (ПAO), мальтоолігосахариди, камеді і/або їх гідролізати, пектини, крохмалі, і/або їх гідролізати. До композиції можуть бути додані додаткові пробіотики. Можна додатково додавати всі пробіотичні мікроорганізми. Переважно, для цієї мети пробіотики обирають з групи, до якої входять Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Kluyveromyces, Saccharoymces, Candida, Escherichia, зокрема, з групи, до якої входять Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus lactis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Enterococcus faecium, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Escherichia coli або їх суміші, переважно, з групи, що якої входять Bifidobacterium longum NCC 3001 (ATCC BAA-999), Bifidobacterium longum NCC 2705 (CNCM I-2618), Bifidobacterium longum NCC 490 (CNCM I-2170), Bifidobacterium lactis NCC 2818 (CNCM I-3446), Bifidobacterium breve NCC 2950 (CNCM I-3865), Lactobacillus paracasei NCC 2461 (CNCM I-2116), Lactobacillus johnsonii NCC 533 (CNCM I-1225), Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC53103), Lactobacillus rhamnosus NCC 4007 (CGMCC 1.3724), Enterococcus faecium SF68 (NCC 2768; NCIMB10415), та їх суміші. Композиція згідно даного винаходу може бути призначена для будь-якого ссавця, однак, переважно призначена для людей або тварин. Композиція також може містити всі вітаміни і мінерали, які є незамінними для щоденного раціону, у достатніх для споживання кількостях. Встановлено мінімальні вимоги для певних вітамінів та мінералів. Прикладами мінералів, вітамінів та інших харчових компонентів, необов'язково наявних в композиції, є вітамін A, вітамін B1, вітамін B2, вітамін B6, вітамін B12, вітамін E, вітамін K, вітамін C, вітамін D, фолієва кислота, інозит, ніацин, біотин, пантотенова кислота, холін, кальцій, фосфор, йод, залізо, магній, мідь, цинк, марганець, хлорид, калій, натрій, селен, хром, молібден, таурин і L-карнітин. Мінерали, як правило, додають у формі солей. Наявність та кількості окремих мінералів та інших вітамінів можуть змінюватися в залежності від споживача, для яких вони призначені. Композиція згідно даного винаходу може містити принаймні одне джерело білку, принаймні одне джерело вуглеводів і принаймні одне джерело ліпідів. 6 UA 109112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Може застосовуватись будь-який придатний харчовий білок, наприклад, тваринний білок (молочний білок, м'ясний білок та білок яйця); рослинні білки (наприклад, соєві білки, пшеничні білки, рисові білки, білки гороху); суміші вільних амінокислот; або їх комбінації. Особливо переважними є молочні білки, наприклад, казеїнові, сироваткові, а також соєві білки. Що стосується сироваткових білків, основою джерела білку може бути кисла сироватка або солодка сироватка або їх суміші, воно також може включати альфа-лактальбумін і беталактоглобулін у будь-яких бажаних пропорціях. Переважно, однак, зокрема, якщо композиція є сумішшю для дитячого харчування, основою джерела білка є модифікована солодка сироватка. Солодка сироватка є наявним на ринку субпродуктом сироваріння і часто застосовується у виробництві дитячих сумішей на основі коров'ячого молока. Білки можуть бути інтактними або гідролізованими або сумішшю інтактних і гідролізованих білків. Може бути бажаним включення частково гідролізованих білків (ступінь гідролізу становить між 2 і 20 %). Якщо необхідні гідролізовані білки, процес гідролізу може здійснюватися будь-яким бажаним способом, відомим з рівня техніки. Наприклад, сироватковий білковий гідролізат може бути приготованих шляхом ферментативного гідролізу сироваткової фракції в одну або декілька стадій. Якщо композиція згідно даного винаходу містить джерело білку, кількість білку або білкового еквіваленту в композиції, як правило, становить в діапазоні 1.6-7.5 г/100 ккал композиції. Зокрема, для сумішей для дитячого харчування, джерело білку має забезпечувати додержання мінімальних вимог щодо вмісту незамінних амінокислот. Якщо композиція містить джерело вуглеводів, вид застосовуваних вуглеводів не має принципових обмежень. Можуть застосовуватись будь-які придатні вуглеводи, наприклад, сахароза, лактоза, глюкоза, фруктоза, сухі речовини кукурудзяного сиропу, мальтодекстрини, крохмаль та їх суміші. Комбінації різних джерел вуглеводів також можуть застосовуватись. Переважно вуглеводи можуть забезпечувати 30 % - 80 % енергії композиції. Наприклад, композиція може містити джерело вуглеводів в кількості 9-18 г/100 ккал композиції. Якщо композиція містить джерело ліпідів, вид застосовуваного ліпіду практично не обмежений. Якщо композиція включає джерело ліпіду, воно може забезпечувати 5 % - 70 % енергії композиції. Можна додавати довго ланцюгові n-3 і/або n-6 поліненасичені жирні кислоти, наприклад, такі, як докозагексаєнова кислота, арахідонова кислота і/або ейкозапентаєнова кислота. Бажаний профіль жирів можна одержати, застосовуючи суміш з олії каноли, кукурудзяної олії, соняшникової олії із високим вмістом олеїнової кислоти, середньо ланцюгову тригліцеридну олію. Композиція може включати джерело ліпідів в кількості 1.5-7 г/100 ккал композиції. Також може бути додане харчове волокно. Воно може бути розчинним або не розчинним, як правило, переважною є суміш цих двох типів. Прийнятні джерела харчового волока включають сою, горох, овес, пектин, гуарову камідь, гуміарабік, фруктоолігосахариди, галактоолігосахариди, сіаліл-лактозу та олігосахариди з тваринного молока. Переважною сумішшю волокон є суміш інуліну із коротколанцюговими фруктоолігосахаридами. Така композиція може бути приготована будь-яким способом, відомим з рівня техніки. Наприклад, якщо композиція є сумішшю для дитячого харчування, наприклад, сумішшю для харчування немовлят, вона може бути приготована шляхом змішування разом джерела білку, вуглеводів і жиру у відповідних пропорціях. Якщо застосовуються емульгатори, їх також можна включити в суміш. Можна додати на цій стадії вітаміни і мінерали, однак, зазвичай їх додають пізніше для уникнення термічного розпаду. Будь-які ліпофільні вітаміни, емульгатори абощо можуть бути розчинені в джерелі жиру до змішування. Потім для утворення рідкої суміші додають воду, переважно, воду, піддану зворотному осмосу. Рідка суміш потім може бути термічно оброблена для зниження бактеріальних навантажень. Наприклад, рідку суміш можна швидко нагріти до температури в діапазоні приблизно 120 °C140 °C протягом приблизно 5-30 секунд. Це можна здійснити за допомогою інжекції пари або теплообмінника, наприклад, пластинчатого теплообмінника. Рідка суміш потім бути потім охолоджена до приблизно 60 °C-85 °C; наприклад, шляхом миттєвого охолодження. Потім рідку суміш можна гомогенізувати, наприклад, у дві стадії при приблизно 7 MПа - 40 MПa на першій стадії і приблизно 2 MПa-14 MПa на другій стадії. Гомогенізована суміш може бути потім охолоджена для додавання будь-яких теплочутливих компонентів, наприклад, вітамінів та мінералів. На цій стадії зручно регулювати pH і вміст сухих речовин у гомогенізованій суміші. Гомогенізовану суміш переносять до придатного сушильного апарату, наприклад, 7 UA 109112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розпилювального сушильного апарату, ліофілізатора, роликового сушильного апарату, і перетворюють на порошок. Порошок повинен мати вміст вологи менше приблизно 5 мас. %. Пробіотики можна культивувати будь-яким придатним способом, відомим фахівцям з рівня техніки, і їх готують для додавання до поживної композиції розпилювальною сушкою або сублімаційною сушкою. Пробіотики можуть бути додані до композиції до її теплової обробки з метою зниження бактеріального навантаження. Це автоматично зробить пробіотики нереплікативними. Альтернативно, звичайно, пробіотики можуть піддаватися тепловій обробці окремо, а потім додаватися до композиції як нереплікативні пробіотики, наприклад, у рідкій або порошковидній формі. Якщо до композиції слід додати будь-які пробіотики, обрані пробіотики можуть бути культивовані відповідно до будь-якого придатного способу і приготовані для додавання до композиції за допомогою, наприклад, сублімаційної або розпилювальної сушки. Альтернативно, бактеріальні препарати можуть бути придбані у спеціалізованих постачальників у вже готові для додавання до харчових продуктів формі. Шляхом аналізу імунних профілей живих і підданих "короткотривалій високотемпературній" обробці пробіотиків, автори оцінили здатність пробіотиків стимулювати секрецію специфічних цитокінів із клітин крові людини. Імунні профілі життєздатних пробіотиків були порівняні із імунними профілями підданих "короткотривалій високотемпературній" обробці клітин. Було встановлено, що піддані "короткотривалій високотемпературній" обробці пробіотики викликають інші рівні секреції цитокінів, ніж їх живі аналоги. Піддані "короткотривалій високотемпературній" обробці пробіотики викликають менше прозапальних цитокінів (TNF-α, IFN-γ, IL-12p40) при збереженні або стимулюванні вищої секреції IL-10, ніж їх живі аналоги. Одержані співвідношення IL-12p40 / IL-10 були нижчими у будь-яких підданих "короткотривалій високотемпературній" обробці пробіотиків, ніж у відповідних живих клітин. На противагу, піддані тепловій обробці при 85 °C протягом 20 хвилин бактерії викликали більше прозапальних цитокінів і менше IL-10, ніж живі клітини, при вищому співвідношенні IL-12p40 / IL-10, демонструючи, що вид теплової обробки є істотним для даного винаходу. Співвідношення IL-12p40 / IL-10, одержане шляхом інкубації одноядерних периферичних клітин крові (PBMC) із пробіотиками in vitro прогнозує протизапальний ефект in vivo (Foligné, B., et al., 2007, World J.Gastroenterol. 13:236-243). Даний винахід також стосується композиції згідно даного винаходу для лікування або профілактики запальних захворювань. Відповідно, одним з варіантів втілення є застосування композиції згідно даного винаходу для одержання продукту, призначеного для лікування або профілактики запальних захворювань. Запальні захворювання, які підлягають лікуванню або профілактиці композицією згідно даного винаходу, не обмежені певним переліком. Наприклад, до них можуть належати гострі запальні процеси, такі, як сепсис, опіки, та хронічні запалення, такі, як запалення кишечника, наприклад, хвороба Крона, виразковий коліт, паучит, некротичний ентероколіт, запалення шкіри, наприклад, запалення шкіри, спричинене ультрафіолетом або хімічними речовинами, екзема, алергічні запалення на шкірі, синдром подразненого кишечника, запалення очей, алергія, астма, запалення, пов'язані із ожирінням, пов'язані із віком слабкі запалення та їх поєднання. Даний винахід також стосується способу одержання мікроорганізмів, наприклад, пробіотиків і/або культур молочних заквасок, зокрема, життєздатних пробіотиків і/або життєздатних культур молочних заквасок із протизапальних ефектом, або покращення протизапального ефекту мікроорганізмів, зокрема, життєздатних пробіотиків і/або життєздатних культур молочних заквасок, що включає стадію піддання мікроорганізмів короткотривалій високотемпературній обробці при принаймні 71.5 °C протягом принаймні 1 секунди, наприклад, високотемпературній обробці при приблизно 71.5-150 °C протягом короткого часу – приблизно 1-120 секунд. Якщо у даному способі застосовуються життєздатні пробіотики і/або культури молочних заквасок, "короткотривала високотемпературна" обробка призведе до того, що принаймні частина пробіотиків і/або культур молочних заквасок стане нереплікативною. "Короткотривала високотемпературна " обробка може призвести до того, що принаймні 90 %, переважніше принаймні 95 %, ще переважніше принаймні 98 %, найпереважніше принаймні 99 %, ідеально принаймні 99.9 %, в найідеальнішому варіанті всі пробіотики стають нереплікативними. 8 UA 109112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У переважному варіанті втілення даного винаходу спосіб включає стадію додавання життєздатних пробіотиків до композиції і піддання композиції із вмістом пробіотиків "короткотривалій високотемпературній" обробці. Мікроорганізми можуть бути піддані тепловій обробці до додавання в продукти Композиція може бути будь-якою композицію, однак, наприклад вона є харчовим або поживним продуктом або напоєм, які треба доповнити пробіотиками. Враховуючи вищезазначене, даний винахід також стосується способу одержання композиції, що містить мікроорганізми, наприклад, пробіотики і/або культури молочних заквасок, переважно, життєздатні пробіотики і/або культури молочних заквасок, із протизапальним ефектом, або способу покращення наявних протизапальних властивостей, що передбачає стадію піддання мікроорганізмів короткотривалій високотемпературній обробці при принаймні 71.5 °C протягом принаймні 1 секунди, наприклад, короткотривалій високотемпературній обробці при приблизно 71.5-150 °C протягом короткотривалого періоду в приблизно 1-120 секунд. Таку стадію "короткотривалої високотемпературної" обробки зручно здійснювати на промислових потужностях, однак, вона може здійснюватися і в домашніх умовах, наприклад, із застосуванням пароварки. Таким способом можна надати продукту протизапального ефекту безпосередньо перед вживанням. Фахівці з рівня техніки розуміють, що вони можуть вільно поєднувати усі описані наразі характеристики даного винаходу, не виходячи за межі обсягу винаходу у даному описі. Зокрема, ознаки, що стосуються застосування і способу, можуть застосовуватися щодо композиції і способу згідно даного винаходу і навпаки. Додаткові переваги та ознаки даного винаходу очевидні із наступних прикладів і фігур. На фігурі 1 А та В зображено покращення протизапальних імунних профілів пробіотиків, підданих короткотривалим високотемпературним обробкам. На фігурі 2 зображено пробіотичні штами, які не мають протизапальних властивостей, та які набули протизапальних властивостей, тобто, які проявляють явні протизапальні імунні профілі in vitro, після того, як їх піддали короткотривалій високотемпературній обробці. Фігури 3 A і B зображують застосовувані у комерційно наявних продуктах штами пробіотиків, які демонструють покращений або новий протизапальний імунний профіль in vitro після "короткотривалої високотемпературної" обробки. На фігурі 4 А та В зображено штами молочних заквасок (наприклад, штами Lc1), які проявляють покращені або нові протизапальні імунні профілі in vitro, після того, як їх піддали тепловій обробці при високих температурах. На фігурі 5 зображено пробіотичні штами, які не мають протизапальних властивостей, але, які проявляють протизапальні імунні профілі in vitro, після того, як їх піддали короткотривалим високотемпературним обробкам. Фігура 6 є аналізом основних компонентів на основі даних про одноядерні клітини периферичної крові (IL-12p40, IFN-γ, TFN-α, IL-10), одержаних з живими пробіотичними штамами та штамами молочних заквасок та штамами, підданими тепловій обробці (140 °C протягом 15 секунд). Кожна точка представляє один штам, живий або підданий тепловій обробці, який ідентифікують за номером NСC номером або назвою. На фігурі 7 зображено співвідношення IL-12p40 / IL-10 штамів живих та після теплової обробки (85 °C, 20 хвилин). Загалом, теплова обробка при 85 °C протягом 20 хвилин веде до підвищення співвідношень IL-12p40 / IL-10 порівняно з короткотривалими високотемпературними обробками згідно даного винаходу (фігури 1, 2, 3, 4 та 5). Приклади Методологія Бактеріальні препарати Корисні ефекти для здоров'я, які виявляють живі пробіотики на імунну систему істоти-носія, зазвичай вважають штам-специфічними. Було виявлено, що пробіотики, які стимулюють in vitro високі рівні IL-10, та/або які стимулюють низькі рівні протизапальних цитокінів (дослідження одноядерних клітин периферичної крові), є сильними протизапальними штамами in vivo (Foligne, B., et al., 2007, World J.Gastroenterol. 13:236-243). Кілька пробіотичних штамів було застосовано для дослідження протизапальних властивостей пробіотиків, підданих тепловій обробці. Ними були Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus easel NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC6002 (NCC 1825), та Escherichia coli Nissle. Також протестували кілька штамів культур заквасок, включаючи деякі 9 UA 109112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 штами, які застосовуються на ринку для виробництва ферментованих продуктів Nestle Lc1, а саме: Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus bulgaricus NCC 15 і Lactococcus lactis NCC 2287. Бактеріальні клітини культивували за умов, оптимізованих для кожного штаму, у біореакторах ємністю 5-15 л. Прийнятними є усі типові бактеріальні поживні середовища. Такі середовища відомі фахівцям з рівня техніки. Після корекції рН до 5,5, поступово додали 30 % основного розчину (NaOH або Ca(OH)2). Після одержання відповідних анаеробних умов шляхом виділення у вільний простір газу СО2, штам E. coli культивували у стандартних аеробних умовах. Бактеріальні клітини зібрали за допомогою центрифугування (5,000 х г, 4 °C) та повторно розчинили у буферному фосфатному фізіологічному розчині (PBS) у відповідних об'ємах для одержання остаточної концентрації близько 109-1010 КУО/мл. Частину розчину заморозили при -80 °C 15 % із гліцерином. Іншу частину клітин піддали тепловій обробці за допомогою: Надвисокої температури: 140 °C протягом 15 с шляхом непрямого інжектування пари. Високої температури короткотривалої дії (HTST): 74 °C, 90 °C та 120 °C протягом 15 с шляхом непрямого інжектування пари. Низької температури тривалої дії (85 °C, 20 хв.) на водяній бані. Перед тепловою обробкою до застосування зразки тримали замороженими при –80 °C. Імунопрофілювання бактеріальних препаратів іn vitro: Провели оцінку імунних профілів живих та підданих тепловій обробці бактеріальних препаратів (тобто, здатності стимулювати іn vitro секрецію специфічних цитокінів з клітин крові людини). З фільтрів крові виділили одноядерні клітини периферичної крові людини (PBMC). Після відділення за допомогою градієнта щільності клітин одноядерні клітини зібрали та промили двічі збалансованим соляним розчином Хенка. Потім клітини повторно розчинили у середовищі Дульбекко, модифікованому за способом Іскова (IMDM, Sigma), доповненому 10 % ембріональної коров'ячої сироватки (Bioconcept, Париж, Франція), 1 % L-глутаміну (Sigma), 1 % пеніциліну/стрептоміцину (Sigma) та 0,1 % гентаміцину (Sigma). Пізніше, одноядерні клітини периферичної крові (PBMC) (7 × 105 клітин/лунка) проінкубували із живими та із підданими тепловій обробці бактеріями (еквівалент 7 × 106 КУО/лунка) на 48 лункових планшетах протягом 36 годин. Ефекти від живих та підданих тепловій обробці бактерій протестували на одноядерних клітинах периферичної крові від 8 різних донорів, поділених на дві групи за окремими дослідженнями. Після 36 годин інкубування культуральні планшети заморозили та утримували при -20 °C до моменту здійснення вимірювання цитокінів. Паралельно провели цитокін- профілювання (тобто під час одного й того ж експерименту на одній і тій же порції одноядерних клітин периферичної крові) для живих бактерій та їх аналогів, підданих тепловій обробці. Після 36 годин інкубування визначили рівні цитокінів (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α та IL-10) у супернатантах клітинних культур за допомогою імуноферментного аналізу ELISA (R&D DuoSet Human IL-10, BD OptEIA Human IL12p40, BD OptEIA Human TNFa, BD OptEIA Human IFN-y), дотримуючись інструкцій виробника. IFN-γ, IL-12p40 та TNF-α є прозапальними цитокінами, а IL10 – сильним протизапальним медіатором. Результати виражено як середнє значення (пг/мл) ± стандартна похибка для 4 різних донорів та є типовим для двох різних експериментів, проведених окремо для 4 донорів. Співвідношення 12p40 / IL-10 обчислюється для кожного штаму як передбачуване значення протизапального ефекту in vivo (Foligne, B., et al., 2007, World J.Gastroenterol. 13:236-243). Числові значення цитокінів (пг/мл), обчислені за допомогою імуноферментного аналізу (див. вище) для кожного штаму, перевели за допомогою програмного забезпечення BioNumerics v5.10 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Бельгія). На основі цих даних провели аналіз основних компонентів (РСА, спосіб вимірювань). До цього аналізу включили виділення серед показників середніх та ділення показників на величини відхилення. Результати Протизапальні профілі, утворені обробками надвисокою температурою / високою температурою короткотривалої дії. Пробіотичні штами, на яких проводилися дослідження, піддали ряду теплових обробок (надвисокотемпературною (UHT), високотемпературною короткотривалою (HTST) та при 85 °C протягом 20 хвилин), після чого їхні імунні профілі порівняли in vitro з імунними профілями живих клітин. Живі мікроорганізми (пробіотики та/або молочні початкові культури) стимулювали різні рівні виробництва цитокінів під час інкубування з одноядерними клітинами периферичної крові людини (фігури 1, 2, 3, 4 та 5). Теплова обробка цих мікроорганізмів змінила рівні цитокінів, які виробляються одноядерними клітинами периферичної крові залежно від 10 UA 109112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 температурних умов. В результаті короткотривалих високотемпературних обробок (120 °C або 140 °C протягом 15 с) одержують нереплікативні бактерії з протизапальними імунними профілями (фігури 1, 2, 3 та 4). Насправді, штами, піддані надвисокій тепловій обробці (140 °C, 15 с), стимулювали менше прозапальних цитокінів (TNF-α, IFN-γ, IL-12p40), проте підтримували або стимулювали додаткове виробництво IL-10 (порівняно з їхніми живими аналогами). Одержані співвідношення IL-12p40 / IL-10 були нижче для будь-якого штаму, обробленого надвисокою температурою, порівняно із живими клітинами (фігура 1, 2, 3 та 4). Результати даного дослідження були також достовірні для бактерій, підданих високотемпературній короткотривалій обробці, тобто при 120 °C протягом 15 с (фігури 1, 2, 3 та 4), або 74 °C та 90 °C протягом 15 с (фігура 5). Теплові обробки (наприклад, над високотемпературні або високотемпературні короткотривалі) виявляють однаковий ефект на імунні профілі пробіотичних штамів in vitro (фігури 1, 2, 3 та 5) та культури молочних заквасок (фігура 4). В ході аналізу основних компонентів на основі даних одноядерних клітин периферичної крові, одержаних із живими та підданими тепловій обробці (140 °C, 15 с) пробіотичними штамами та штамами молочних заквасок, виявив, що живі штами розподілилися вздовж вісі х, що свідчить про те, що штами проявляють in vitro дуже різні імунні профілі: від слабких (зліва) до сильних (справа) індукторів прозапальних цитокінів. Кластер підданих тепловій обробці штамів на лівій частині діаграми демонструє, що прозапальні цитокіни значно менше стимулюються підданими тепловій обробці штамами (фігура 6). На противагу, піддані тепловій обробці бактерії при 85 °C протягом 20 хвилин стимулюють більше прозапальних цитокінів та менше IL-10, ніж живі клітини, результатом чого є більше співвідношення IL-12p40 / IL-10 (фігура 7). Протизапальні профілі можна покращити або утворити за допомогою надвисокотемпературних і високотемпературних короткотривалих обробок. Штами, піддані надвисокотемпературній і високотемпературній короткотривалій обробці, проявляють протизапальні профілі, незалежно від їхніх початкових імунних профілів (живі клітини). Було встановлено, що пробіотичні штами, які, як відомо, є протизапальними in vivo, та проявляють протизапальні профілі in vitro (B. longum NCC 3001, B. longum NCC 2705, B. breve NCC 2950, B. lactis NCC 2818), проявляють покращені протизапальні профілі in vitro після "короткотривалих високотемпературних" обробок. Як зображено на фігурі 1, співвідношення IL12p40 / IL-10 штамів Bifidobacterium, оброблених надвисокою температурою, були нижчими у порівнянні з їхніми живими аналогами, що свідчить про покращені протизапальні профілі зразків, оброблених надвисокою температурою. Несподіваним виявився той факт, що утворення протизапальних профілів в результаті обробок надвисокою температурою та високою температурою короткотривалої дії також було підтверджено для живих штамів, які не проявляли протизапальних властивостей. Обидві живі L. rhamnosus NCC 4007 та L. paracasei NCC 2461 демонструють високі співвідношення IL-12p40 / IL-10 in vitro (фігури 2 та 5). Було виявлено, що два живих штами не захищають від коліту, викликаного тринітробензолсульфоновою кислотою, у мишей. Співвідношення IL-12p40 / IL-10, викликані L.rhamnosus NCC 4007 та L. paracasei NCC 2461, значно зменшилися після високотемпературних короткотривалих обробок (надвисокою температурою або високою температурою короткотривалої дії) та досягли рівнів настільки низьких, які були одержані від штамів Bifidobacterium. Такі низькі співвідношення IL-12p40 / IL-10 є результатом низьких рівнів виробництва IL-12p40 без будь-яких змін L.rhamnosus NCC 4007) або значного стимулювання секреції IL-10 (L. paracasei NCC 2461) (фігура 2). Як наслідок: Протизапальні профілі живих мікроорганізмів можна покращити за допомогою надвисокотемпературних або високотемпературних короткотривалих обробок (наприклад, B. longum NCC 2705, B. longum NCC 3001, B. breve NCC 2950, B. lactis NCC 2818). Протизапальні профілі можна одержати з живих мікроорганізмів, які не виявляють протизапальних властивостей (наприклад, L. rhamnosus NCC 4007, L. paracasei NCC 2461, молочні закваски S. thermophilus NCC 2019) за допомогою надвисокотемпературних або високотемпературних короткотривалих обробок. Протизапальні профілі є також характерними для штамів, які відсутні у продуктах, наявних на ринку (фігури 3 А та В), включаючи пробіотичний штам E. Coli. Вплив надвисокотемпературних або високотемпературних короткотривалих обробок був однаковим для усіх досліджених пробіотиків та молочних заквасок наприклад, lactobacilli, bifidobacteria та streptococci. Надвисокотемпературні або високотемпературні короткотривалі обробки застосовували до кількох lactobacilli, bifidobacteria та streptococci, які виявляли in vitro різні імунні профілі. Усі штами стимулювали менше прозапальних цитокінів після надвисокотемпературних або 11 UA 109112 C2 5 високотемпературних короткотривалих обробок, ніж їх живі аналоги (фігури 1, 2, 3, 4, 5 та 6), що вказує на те, що вплив надвисокотемпературних або високотемпературних короткотривалих обробок на імунні профілі одержаних нереплікативних бактерії можна узагальнити для всіх пробіотиків, зокрема для lactobacilli та bifidobacteria, та специфічних штамів E. Coli, та для усіх молочних заквасок, зокрема, streptococci, lactoсocci та lactobacilli. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. Композиція, яка містить мікроорганізми, яка відрізняється тим, що мікроорганізми піддані високотемпературній обробці при 90-140 °С протягом короткого часу у приблизно 1-30 секунд, для застосування у лікуванні або профілактиці запальних захворювань, причому мікроорганізми обирають з групи, до якої входять харчові мікроорганізми, а саме, пробіотики, культури молочних заквасок або їх суміші. 2. Композиція для застосування за п. 1, яка відрізняється тим, що високотемпературна обробка є високотемпературною обробкою при приблизно 90-120 °С протягом короткого часу приблизно у 1-30 секунд, і переважно є короткотривалою високотемпературною (HTST) обробкою або надвисокотемпературною (UHT) обробкою. 3. Композиція для застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що принаймні 90 %, переважно принаймні 95 %, переважніше принаймні 98 %, найпереважніше принаймні 99 %, в ідеалі принаймні 99,9 %, в найідеальнішому варіанті всі пробіотики є нереплікативними. 4. Композиція для застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що пробіотики і/або молочні закваски обирають з групи, до якої входять біфідобактерії, лактобацили, пропіонобактерії, або їх суміші, наприклад, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Escherichia coli і/або їх суміші. 5. Композиція для застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що пробіотики і/або молочні закваски вибирають з групи, до якої входять Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgaricus NCC 15, Lactococcus lactis NCC 2287 або їх суміші. 6. Композиція для застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що композицію можливо вводити орально, ентерально, парентерально, наприклад черезшкірно або внутрішньом'язово, вагінально, ректально, локально, а саме, на око. 7. Композиція для застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що композиція призначена для людей або тварин. 8. Композиція для застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що композиція містить приблизно 0,005-1000 мг нереплікативних мікроорганізмів на добову дозу. 9. Композиція для застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, що запальним захворюванням є захворювання з групи, до якої входять гострі запалення, наприклад, сепсис; опіки; хронічні запалення, наприклад, запальні захворювання шлунковокишкового тракту, наприклад, хвороба Крона, виразковий коліт, паучит; нектротизуючий ентероколіт; синдром подразненого кишечника; запалення шкіри, наприклад, викликане ультрафіолетовим опромінюванням або хімічними речовинами, екзема, шкірна алергія; запалення очей; алергія, астма; запалення, пов'язані із ожирінням; пов'язані із віком слабкі запалення та їх комбінації. 10. Спосіб надання пробіотикам і/або культурам молочних заквасок протизапального ефекту або покращення протизапального ефекту пробіотиків і/або культур молочних заквасок, що включає стадію піддання пробіотиків і/або культур молочних заквасок високотемпературній обробці при принаймні 71,5 °С протягом принаймні 1 секунди. 11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що "короткотривала високотемпературна" обробка призводить до того, що принаймні 90 %, переважно принаймні 95 %, переважніше принаймні 98%, найпереважніше принаймні 99 %, в ідеалі принаймні 99,9 %, в найідеальнішому варіанті всі пробіотики і/або культури молочних заквасок стають нереплікативними. 12 UA 109112 C2 5 12. Спосіб за будь-яким з пп. 10, 11, який передбачає стадію додавання життєздатних пробіотиків і/або культур молочних заквасок до композиції і піддання композиції, що містить пробіотики і/або культури молочних заквасок, "короткотривалій високотемпературній" обробці. 13. Спосіб надання композиції, що містить пробіотики і/або культури молочних заквасок, протизапальних властивостей, або покращення їх наявних протизапальних властивостей, що передбачає стадію піддання пробіотиків і/або культур молочних заквасок високотемпературній обробці протягом короткого періоду часу при принаймні 71,5 °С протягом принаймні 1 секунди. 10 13 UA 109112 C2 14 UA 109112 C2 15 UA 109112 C2 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 16