Спосіб відбору сполук, які зв’язуються з рецептором edb-домену фібронектину, та спосіб відбору сполук, які зв’язуються з edb-доменом фібронектину

Даний винахід стосується білка (протеїну), який специфічно зв'язується з EDb-доменом фібронектину. Фібронектини представляють собою важливий клас матриксних глікопротеїнів. їх основна роль полягає в забезпеченні прилипання клітин до різноманітних позаклітинних матриксів. Той факт, що фібронектини присутні на поверхні нетрансформованих клітин у культурі і відсутні у трансформованих клітинах, дозволив ідентифікувати фібронектини як адгезійні білки, які мають важливе значення. Вони взаємодіють з численними різноманітними іншими молекулами, наприклад, колагеном, гепаринсульфатпротеогліканами і фібрином, і тим самим регулюють форму клітини і формування цитоскелета. Крім того, фібронектини відповідають за міграцію і диференціацію клітин у процесі ембріогенезу. Крім цього вони відіграють важливу роль у процесі загоєння ран, забезпечуючи переміщення макрофагів та інших імунних клітин в уражену ділянку, а також в утворенні згустків крові, забезпечуючи прилипання тромбоцитів до ушкоджених ділянок кровоносних судин. Фібронектини представляють собою димери двох подібних пептидів, при цьому довжина кожного ланцюга становить приблизно 60-70нм. На сьогоднішній момент ідентифіковано принаймні 20 різних ланцюгів фібронектинів, при цьому усі вони можуть бути отримані за допомогою альтернативного сплайсингу транскрипту РНК єдиного гена фібронектину. Аналіз протеолітичного розщеплення фібронектину дозволив встановити, що поліпептиди складаються із шести доменів, які характеризуються великим ступенем складчастості, причому кожний домен у свою чергу містить так звані повторювані послідовності ("повтори"), які на основі подібності їх амінокислотних послідовностей можна розділити на три типи (тип І, II, III). Центральна ділянка обох ланцюгів димеру являє собою ділянку, яка складається з так званих повторів типу III, які містять у середньому по 90 амінокислот [Kornblihtt A.R, Vibe-Pedersen К. і Baralle F.E., Isolation and characterization of cDNA clones for human and bovine fibronectins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 (1983), cтop.3218-3222]. Ha основі структурних досліджень було встановлено, що кожний повтор типу III складається із семи бета-ланцюгів, укладених у дво х антипаралельних площинах, при цьому короткі петльові ділянки являють собою потенційні місця взаємодії типу білок-білок [Leahy D.J., Hendrickson W.A., Aukhil I. і Erickson H.P. Structure of fibronectin type III domain from tenascin phased by MAD analysis of the selenomethionyl protein. Science, 258 (1992), стор.987-991]. Завдяки подібним повторам типу III фібронектини виконують функцію адгезійних молекул, які взаємодіють з присутніми на клітинній поверхні молекулами, так званими "інтегринами". Термін "інтегрини" вперше було використано в 1987р. в огляді [Hynes R.O., Cell 48 (1987), стор.549-550], для позначення групи споріднених гетеродимерних молекул клітинної поверхні, які функціонують як посередники між позаклітинним матриксом і внутрішньоклітинним цитоскелетом і таким шляхом індукують адгезію та міграцію клітин. Таким чином, такі гетеродимерні рецептори "інтегрують" або передають сигнали від зовнішнього середовища, яке оточує клітину, що виявляють специфічні впливи на клітину. В даний час відомі 17 бета-субодиниць, які мають здатність специфічно та нековалентно взаємодіяти з більше, ніж 20 альфа-субодиницями, утворюючи, таким чином, понад 20 різних родин [Plow E. F. І ін., L Biol. Chem., 275 (2000), стор.21785-21788]. Взаємодія фібронектину принаймні з 8 різними інтегринами опосередковується насамперед послідовністю RGDS, яка присутня у десятому повторі типу III фібронектину (III-10). Крім того, було встановлено, що принаймні чотири інтегрини можуть взаємодіяти з фібронектином незалежно від RGDS [Plow E.F. і ін., J. Biol. Chem., 275 (2000), стор.21785-21788]. До групи повторюваних послідовностей типу III, окрім ІІІ7-, ІІІ8-, ІІІ9- і III10-послідовностей, відносяться також повтори ЕllІВ і ΕΙllΑ (EDb і EDa). Функції обох цих повторюваних послідовностей у даний час не з'ясовані або відомі лише в незначній мірі. Результати дослідження Jarnagin W.H. ін. [Jarnagin W., Rockey D., Koteliansky V., Wang S. і Bissell D., Expression of variant fibronectins in wound healing: cellular source and biological activity of the ΕΙΠΑ segment in rat hepatic fibrogenesis, J. Cell Biol., 127 (1994), стор.2037-2048] свідчать про те, що EDaдомен бере участь у ранній реакції печінки на пошкодження і, крім того, очевидно, EDa-домен бере участь в опосередковуванні процесів клітинної адгезії. Хоча та ізоформа фібронектину, яка містить послідовність EDb (EDb-ΦΗ або ED-B або EDB), не виявляється у здоровій тканині дорослих індивідуумів, вона виявляє сильну експресію в ембріональній тканині, а також у пухлинній тканині, а також в процесі загоєння ран. В процесі розвитку пухлини відбувається обумовлена протеолітичним розкладанням вже існуючих компонентів матриксу перебудова позаклітинного матрикса тканини, в якій відбувається ріст пухлини. При цьому утворюється індукований пухлиною позаклітинний матрикс, який відрізняється від матриксу здорових тканин, створює більш сприятливе для росту пухлини навколишнє середовище та сприяє ангіогенезу. Ангіогенез представляє собою один з найважливіших процесів при рості пухлини, і цим поняттям позначається процес, під час якого з існуючих судин, покритих ендотелієм, утворюються нові судини. Ангіогенез являє собою інвазивний процес, необхідними умовами для протікання якого є протеоліз позаклітинного матриксу, проліферація, спрямована міграція та диференціація ендотеліальних клітин з утворенням нових капілярів, що сприяють розростанню пухлини понад певних розмірів. В даний момент встановлений зв'язок між ED b-доменом фібронектину (EDb-FN) та ростом пухлини. Крім того, у процесі ангіогенезу відбувається нагромадження EDb-FN у нових кровоносних судинах, що є показовою ознакою ангіогенезу [Castellani P., Viale G., Dorcaratto Α., Nicolo G., Kaczmarek J., Querze G., Zardi L. Int. J. Cancer 59 (1994), стор.612-618]. EDb-домен являє собою повторювану послідовність типу III, яка складається з 91 амінокислоти та має дуже високий ступінь гомології з послідовностями фібронектину щурів і курей, що складає від 96 до 100%. У домені відсутні RGDS-послідовності або інші амінокислотні послідовності, у відношенні яких відомо, що вони опосередковують взаємодію з інтегринами. Точна функція ED-B-домену в даний час остаточно не встановлена. У трьох опублікованих по даній тематиці роботах, що вказані нижче, були зроблені припущення стосовно загальної стимулювальної функції у відношенні адгезії/проліферації різних типів клітин. У роботі [Chen і Culp, Exp. Cells Res. 223 (1996), стор.9-19], було встановлено, що клітинні фібронектини містять EDb-домен та суміжні повторювані послідовності типу III як послідовності, що забезпечують при певних умовах адгезію послідовностей, які можна регулювати шля хом альтернативного сплайсингу первинного транскрипту фібронектину в клітинах. За результатами більш пізнього дослідження [Chen і Culp, Clin. Exp. Metast, 16, 1 (1998), стор.30-42] було встановлено, що EDb індукує сигнал активації клітин, який приводить до фосфорилювання тирозину фокальних адгезійних білків, а саме: згідно з механізмом, що відрізняється від механізму, який опосередковується повторюваними послідовностями типу lll8-9-10, що розпізнають інтегрини. При цьому серед великої кількості спеціалістів переважає думка, що адгезія клітин до позаклітинного матриксу, відповідно до інших клітин, є важливим джерелом сигналів активації клітин, і, таким чином, відповідає за регуляцію багатьох процесів, таких, наприклад, як ріст, диференціація і трансформація клітин. Індуковані адгезією сигнали полягають в активації протеїн-тирозинкіназ та включають каскад фосфорилювання тирозину різних сигнальних молекул. Автори вищевказаного дослідження відзначають те, що в цьому процесі передачі сигналу основну роль грає фокальна адгезійна кіназа (ФАК) з молекулярною масою 125кДа, що дозволяє встановити зв'язок між взаємодією клітин з матриксними білками та активацією внутрішньоклітинних сигнальних молекул, наприклад, Src [Xing Z., Chen H.C., Nowlen J.K., Taylor S.J., Shalloway D. і Guan J.L., Direct interaction of v-Src with the focal adhesion kinase mediated by the Src SH2 domain, Моl. Biol. Cell, 5 (1994), стор.413-21], Grb2 [Schlaepfer D.D., Hanks S.K., Hunter T. і van der Geer P., Integrin-mediated signal transduction linked to Ras pathway by GRB2 binding to focal adhesion kinase, Nature, 372 (1994), стор.786-791] і РІ-3-кінази [Chen Η.С. і Guan J.L., Association of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (1994), стор.10148-10152]. Стосовно іншого фокального адгезійного білка pl30cas також передбачається, що він бере участь в опосередковуваній адгезією паредачі сигналів і специфічній онкогенній активності, хоча його функція на даний час повністю не з'ясована [Sakai R., Iwamatsu Α., Hirano N., і ін., A novel signaling molecule, p130, forms stable complexes in vivo with v-Crk and c-Src in a tyrosine phosphorylation-dependent manner, EMBO J. 13 (1994), стор.3748-3756; Petch L.A., Bockholt S.M., Bouton Α., Parsons J.T. і Burridge К., Adhesion-induced tyrosine phosphorylation of the pl30 SRC substrate, J. Cell. Sci., 108 (1995), стор.1371-1379; Polte T.R. і Hanks S.K., Interaction between focal adhesion kinase and Crk-associated tyrosine kinase substrate pl30Cas, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92 (1995), стор.10678-10682]. За результатами досліджень, проведених Chen і Culp (1998, див. ви ще) встановлено, що білок EDb, який має один повтор, стимулював проліферацію клітин лінії Balb/c 3T3, а також фосфорилювання тирозину за участю ФАК більш інтенсивно, ніж суміжні повтори III8 і т.д. Було висловлене припущення, що при фізіологічних концентраціях клітинного фібронектину зв'язування тетрапептиду RGDS, що входить у склад III10, з інтегринами, очевидно, індукує недостатньо інтенсивний для клітинної адгезії сигнал, у результаті чого механізм, опосередковуваний взаємодією III10 з інтегрином, не приводить до реакції фосфорилювання тирозину. Крім того, передбачається, що відмінності в реакціях на різним чином опосередковувану різними факторами клітинну адгезію зумовлені різною активацією різноманітних невеликих ГТФ-зв'язувальних білків. Три таких білки, cdc42, гас і rho, які є представниками надродини ras, відіграють важливу роль у морфологічних змінах клітин. Ген cdc42 розташовується в послідовності проти ходу транскрипції відносно гас і він безпосередньо індукує утворення філоподій [Nobes CD. і Hall Α., Rho, rac, und cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia, Cell, 81 (1995), стор.53-62]. У цьому випадку активація гас відповідає за утворення ламелліподій і сітки актинових філаментів між філоподіями. Розташований нижче за ходом транскрипції ген rho може активуватися під впливом rас і індукувати фокальну адгезію та утворення актинових філаментів. Усі ці явища залежать від активації тирозинкінази, і передбачається, що ФАК бере участь у ци х процесах. У роботі Chen і Culp висловлене припущення про те, що морфологічні відмінності між клітинами, що мають адгезію, зумовлену 7-EDb-8, і клітинами, що мають адгезію, зумовлену 8-9-10, базуються на різній активації невеликих білків, що зв'язують ГТФ. З цього випливає, що адгезія, обумовлена 8-9-10, за допомогою опосередковуваного інтегрином шляху передачі сигналу в результаті приводить до активації rho, викликаючи фокальну адгезію й утворення актинових філаментів, у той час як адгезія клітин лінії Balb/c-3Т3, обумовлена 7-EDb-8, приводить лише до активації cdc42- і rac-білків, але не до активації гена rho. Однак у жодній із вказаних дво х робіт не наведені дані, що підтверджують вказані вище припущення. За результатами іншого дослідження [Hashimoto-Uoshima і ін., J. Cell Sci. 110 (1997), стор.2271-2280] було встановлено, що клітинна адгезія культивованих фібробластів підсилюється в присутності фрагментів фібронектину, які включають ЕDb-домен фібронектину. З цього випливає, що підданий сплайсингу EDbдомен може мати важливу біологічну активність у відношенні посилення адгезії та проліферації клітин. На відміну від цього включення EDa-домену у вказані фрагменти за відсутності EDb перешкоджає виникненню нормальної фокальної адгезії клітин. На основі цього автори розглянутого дослідження роблять висновок про те, що включення обох доменів у молекулу фібронектину може представляти собою механізм, завдяки якому адгезія клітин досягає такого рівня, що полегшує процес їх міграції, для здійснення якого необхідна як адгезія, так і припинення адгезії. Дослідження, проведені на курячих ембріонах і на дорослих мишах, дозволили встановити, що опосередковуваний EDb-доменом ангіогенез можна блокувати шля хом інгібування інтегрину a3b1 ендотеліальних клітин [Renato і ін., AACR, LB-60 (2001)]. У жодному з вказаних досліджень не дана чітка відповідь щодо функції EDb-домену і не наведені дані стосовно ідентифікації можливого(-их) рецептора(-ів) EDb-домену. Виходячи з вищевикладеного, в основу даного винаходу була покладена задача подальшого виявлення функції EDb-домену. Ще одна задача винаходу полягала в ідентифікації специфічного рецептора EDbдомену. Наступна задача винаходу полягала у виявленні специфічного, характерного для EDb механізму адгезії та взаємодії з рецепторними молекулами, які можуть брати участь у процесі ангіогенезу. Ще одна задача винаходу полягала у виявленні ділянки EDb, що відповідає за специфічне зв'язування. Вказана задача вирішується за допомогою білка, а) який має здатність специфічно зв'язуватися з EDb-доменом фібронектину, б) який специфічно експресується або активується в ендотеліальних клітинах, в) який специфічно експресується або активується в стромальних клітинах пухлини, г) який специфічно експресується або активується в пухлинних клітинах, д) зв'язування якого з EDb-доменом піддається інгібуванню за допомогою поліпептиду та e) позірна молекулярна маса якого, визначена електрофорезом у поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (ДСН), становить від 120 до 130кДа для легкого ланцюга і від 150 до 160кДа для важкого ланцюга. Переважним є насамперед білок, а) який має здатність специфічно зв'язуватися з EDb-доменом фібронектину, при цьому ділянка зв'язування характеризується наявністю принаймні однієї послідовності, вибраної з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-3, б) який специфічно експресується або активується в ендотеліальних клітинах, в) який специфічно експресується або активується в стромальних клітинах пухлини, г) який специфічно експресується або активується в пухлинних клітинах, д) зв'язування якого з ЕDь-доменом фібронектину піддається інгібуванню за допомогою поліпептиду, який містить послідовність, вибрану з гр упи, яка включає SEQ ID NO: 1-3, і e) позірна молекулярна маса якого, визначена шляхом електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію, становить від 120 до 130кДа для легкого ланцюга і від 150 до 160кДа для важкого ланцюга. Найбільш бажаним є білок, а) який має здатність специфічно зв'язуватися з ЕDь-доменом фібронектину і містить a2b1-ланцюг інтегрину, б) який специфічно експресується або активується в ендотеліальних клітинах, в) який специфічно експресується або активується в стромальних клітинах пухлини, г) який специфічно експресується або активується в пухлинних клітинах, д) зв'язування якого з EDb-доменом фібронектину піддається інгібуванню за допомогою поліпептиду та який містить a-ланцюг інтегрину і e) позірна молекулярна маса якого, визначена шляхом електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію, становить від 120 до 130кДа для легкого ланцюга і від 150 до 160кДа для важкого ланцюга. Відповідно до одного з переважних варіантів ендотеліальні клітини являють собою проліферуючі ендотеліальні клітини. Згідно із ще одним переважним варіантом стромальні клітини являють собою стромальні клітини пухлини. Поставлена у винаході задача вирішується також за допомогою білка, специфічне зв'язування якого з EDb-доменом фібронектину опосередковує адгезію ендотеліальних клітин, стромальних клітин пухлини і пухлинних клітин. У цьому випадку ділянка зв'язування може характеризуватися наявністю принаймні однієї послідовності, вибраної з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-3, і насамперед містить a2b1-ланцюг інтегрину. Поставлена у винаході задача вирішується також за допомогою білка, специфічне зв'язування якого з EDb-доменом фібронектину індукує проліферацію ендотеліальних клітин. У цьому випадку ділянка зв'язування може характеризуватися наявністю принаймні однієї послідовності, вибраної з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-3, і насамперед містить a2b1-ланцюг інтегрину. Поставлена у винаході задача вирішується, крім того, за допомогою білка, специфічне зв'язування якого з EDb-доменом фібронектину індукує проліферацію ендотеліальних клітин у колагеновому матриксі, їх міграцію в колагеновий матрикс та їх диференціацію в колагеновому матриксі. У цьому випадку ділянка зв'язування може характеризуватися наявністю принаймні однієї послідовності, вибраної з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-3, і насамперед містить a2b1-ланцюг інтегрину. Поставлена у винаході задача вирішується також за допомогою білка, який зв'язується з EDb-доменом фібронектину та індукує специфічні шляхи трансдукції сигналу, при цьому індукується принаймні один ген, який кодує білок, вибраний із групи, яка включає - фокальну адгезійну кіназу, - CD6-ліганд (ALCAM), - a-ланцюг рецептора вітронектину, - інтегровану альфа-8-субодиницю і - попередник родинного фолістатину білка. Ділянка зв'язування в цьому випадку може характеризуватися наявністю принаймні однієї послідовності, вибраної з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-3, і насамперед містить a2b1-ланцюг інтегрину. Бажано, щоб при індукції специфічних шляхів трансдукції сигналу принаймні один із вказаних генів індукувався принаймні однократно. Бажано при цьому, щоб принаймні один із вказаних генів індукувався двічі. Поставлена у винаході задача вирішується далі за допомогою антитіла, яке має здатність зв'язуватися із запропонованим у винаході білком. Поставлена у винаході задача вирішується, крім того, за допомогою антитіла, яке має здатність зв'язуватися з білком, який має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 і SEQ ID NO: 4 . В одному з переважних варіантів антитіло має здатність інгібувати впливи, які є специфічними для EDbдомену. Переважно, щоб таке зв'язування та інгібування відбувалося in vitro і/або in vivo. Згідно із ще одним переважним варіантом антитіло є моноклональним або рекомбінантним. У наступному переважному варіанті антитіло представляє собою scFv-фрагмент. Поставлена у винаході задача вирішується також за допомогою клітини, яка експресує запропонований у винаході білок. Крім цього поставлена у винаході задача вирішується за допомогою клітини, яка експресує запропоноване у винаході антитіло. Поставлена у винаході задача вирішується далі за допомогою фага, який експресує запропоноване у винаході антитіло. Поставлена у винаході задача вирішується, крім того, за допомогою способу відбору сполук, що зв'язуються з рецептором EDb-домену фібронектину, який полягає в тому, що порівнюють реакцію клітин у присутності однієї або декількох вказаних сполук з контрольною реакцією цих же клітин за відсутності цих сполук, при цьому такі клітини експресують запропонований у винаході білок або містять нуклеїнову кислоту, яка кодує цей білок, а реакція, відповідно контрольна реакція опосередковуються рецептором EDbдомену фібронектину. Відповідно до одного з переважних варіантів реакція, відповідно контрольна реакція представляє собою прилипання клітин до поверхонь, які покриті EDb-доменом фібронектину або його фрагментами. Відповідно до ще одного переважного варіанту ділянка зв'язування EDb-домену фібронектину містить послідовності SEQ ID NO: 1-4 або їх фрагменти. Бажано, щоб реакція, відповідно контрольна реакція клітин являла собою їх проліферацію на поверхнях, покритих EDb-доменом фібронектину або його фрагментами. Згідно із ще одним з переважних варіантів реакція, відповідно контрольна реакція клітин являє собою проліферацію ендотеліальних клітин у колагеновому матриксі, їх міграцію в колагеновий матрикс та їх диференціацію в колагеновому матриксі, при цьому такий колагеновий матрикс містить EDb-домен фібронектину або його фрагменти. Сполуки в запропонованому у винаході способі переважно вибирають з групи, яка включає антитіла, фрагменти антитіл, штучні антитіла, пептиди, низькомолекулярні сполуки, аптамери та оптичні ізомери. Згідно із ще одним переважним варіантом антитіла представляють собою рекомбінантні антитіла. Антитіла переважно вибирати з групи, яка включає scFv та його фрагменти. Поставлена у винаході задача вирішується також за допомогою способу відбору сполук, що зв'язуються з EDb-доменом фібронектину, який полягає в тому, що а) клітини приводять у контакт у присутності різних концентрацій однієї або декількох сполук із присутнім у заданій концентрації білком, який містить EDb-домен фібронектину або білок з однієї з представлених у SEQ ID NO: 1-4 послідовностей, і б) виявляють відмінності між реакцією клітин на білок, який містить EDb-домен фібронектину або білок з однієї з представлених у SEQ ID NO: 1-4 послідовностей, що спостерігається в присутності вказаних сполук, і що спостерігається за відсутності цих сполук контрольною реакцією клітин на білок, який містить EDb домен фібронектину або білок з однієї з представлених у SEQ ID NO: 1-4 послідовностей, при цьому такі клітини експресують запропонований у винаході білок або містять нуклеїнову кислоту, яка кодує вказаний білок, а реакція, відповідно контрольна реакція клітин опосередковується рецептором EDb-домену фібронектину. При цьому бажано, щоб реакція, відповідно контрольна реакція клітин представляла собою їх прилипання до поверхонь, покритих EDb-доменом фібронектину або його фрагментами. Моноклональні антитіла створювали стандартними методами за технологією гібридом і їх характеристики визначали шляхом імуногістологічного аналізу на отриманих після глибокого охолодження зрізах людської пухлини (див. Фіг.13). Прикладом є антитіло (At) AM-EDBr-2 (мишачий IgG 1/каппа). Відповідно до одного з переважних варіантів реакція, відповідно контрольна реакція клітин представляє собою їх проліферацію на поверхнях, покритих EDb-доменом фібронектину або його фрагментами. Згідно з ще одним переважним варіантом реакція, відповідно контрольна реакція клітин представляє собою проліферацію ендотеліальних клітин у колагеновому матриксі, їх міграцію в колагеновий матрикс та їх диференціацію в колагеновому матриксі, при цьому такий колагеновий матрикс містить EDb-домен фібронектину або його фрагменти. У запропонованому у винаході способі сполуки бажано вибирати з групи, яка включає антитіла, штучні антитіла, фрагменти антитіл, пептиди, низькомолекулярні сполуки, аптамери й оптичні ізомери. Поставлена у винаході задача вирішується далі за рахунок застосування нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, що містить послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-4, для відбору сполук, які зв'язуються з рецептором EDb-домену фібронектину або з EDb-доменом фібронектину. Поставлена у винаході задача вирішується також за рахунок застосування запропонованого у винаході білка, відповідно запропонованого у винаході антитіла для відбору сполук, які зв'язуються з рецептором EDb-домену фібронектину або з EDb-доменом фібронектину. Поставлена у винаході задача вирішується крім цього за рахунок застосування запропонованої у винаході клітини для відбору сполук, які зв'язуються з рецептором EDb-домену фібронектину або EDbдоменом фібронектину. Поставлена у винаході задача вирішується, крім того, за рахунок застосування нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, який містить послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-4, для створення антитіл або злитих scFv-білків, призначених для використання з діагностичною або терапевтичною метою. Поставлена у винаході задача вирішується далі за рахунок застосування запропонованого у винаході білка для створення антитіл або злитих scFv-білків, призначених для використання з діагностичною або терапевтичною метою. Під поняттям "використання з терапевтичною метою" мається на увазі серед іншого спрямоване проти ангіогенезу лікування з використанням сполук, які інгібують специфічну взаємодію між EDb і його рецептором. У даному випадку розглядаються антитіла і до рецептора, і до EDb, при цьому застосовують пептиди з послідовністю SEQ ID NO: 1-3 та їх стабілізовані похідні, а також низькомолекулярні сполуки. Поставлена у винаході задача вирішується також за рахунок застосування запропонованої у винаході клітини для створення антитіл або злитих scFv-білків, призначених для використання з діагностичною або терапевтичною метою. Поставлена у винаході задача вирішується крім цього за рахунок застосування запропонованого у винаході фага для створення антитіл або злитих scFv-білків, призначених для використання з діагностичною або терапевтичною метою. Поставлена у винаході задача вирішується далі за рахунок застосування білка, який містить послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-4, для проангіогенної терапії. Поставлена у винаході задача вирішується також за рахунок застосування білка, який містить послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-4, у діагностичних цілях. Поставлена у винаході задача вирішується також за рахунок застосування білка, який містить послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-4, для генної терапії. Поставлена у винаході задача вирішується, крім того, за рахунок застосування білка, який містить послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQIDNO: 1-4, для покриття поверхонь, з якими зв'язуються ендотеліальні клітини. При цьому переважно, щоб таке покриття відбувалося in vitro або in vivo. Поставлена у винаході задача вирішується також за рахунок застосування білка, який містить послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-4, у клітинних культурах. Поставлена у винаході задача вирішується далі за рахунок застосування білка, який містить послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-4, разом принаймні з одним трансплантатом. Подібний трансплантат переважно вибирають із групи, яка включає судину(-и), шкіру, рогівку, нирки, печінку, кістковий мозок, серце, легені, кісткову тканину, тимус, тонкий кишечник, підшлункову залозу, інші внутрішні органи, а також їх частини і клітини. Поставлена у винаході задача вирішується також за рахунок застосування білка, який містить послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 1-4, разом принаймні з одним імплантатом. Такий імплантат переважно вибирають із групи, яка включає імплантати легені, кардіостимулятори, штучні серцеві клапани, імплантати судини, ендопротези, гвинти, шини, пластини, дроти, цвяхи, стрижні, штучні суглоби, імплантати молочної залози, штучні черепні пластинки, штучні зуби, зубні пломби і зубні мости. Під поняттям "впливи, специфічні для EDb-домену фібронектину", маються на увазі всі ті впливи, які зумовлені EDb-доменом фібронектину, але не ЕІІІ7, ЕІІІ8 і т.д. Один з таких впливів описаний, наприклад, у [Chen і ін., 1998 (див. вище)], тобто він полягає у швидкому фосфорилюванні тирозину великого числа внутрішньоклітинних білків на відміну від більш повільного фосфорилювання при адгезії, опосередкованій доменами ЕІІІ8-9-10. Під "низькомолекулярними сполуками" маються на увазі всі ті сполуки, відносна молекулярна маса яких становить менше приблизно 1000-1200. Під "аптамерами" маються на увазі молекули, які складаються з нуклеїнових кислот, які здатні виконувати функцію високоспецифічних лігандів для великого числа біомолекул. Під поняттям "проангіогенна терапія" мається на увазі будь-яка форма терапії, при якій потрібно стимулювати ангіогенез. Під поняттям "спрямоване/спрямована проти ангіогенезу лікування/терапія" мається на увазі будь-яка форма лікування/терапії, метою якого/якої є інгібування ангіогенезу. Під "генною терапією" мається на увазі будь-яка форма терапії, метою якої є виключення зумовленої геном дефектної функції, відповідно відновлення нормальної функції гена при захворюваннях, на які можна впливати усуненням або, навпаки, введенням певного білка. Така терапія може передбачати, але не обмежуючись лише цим, введення чужорідної ДНК у соматичні клітини. Поняття "клітинна культура" стосується середовищ для клітинних культур, а також посудин для клітинних культур. До таких посудин для клітинних культур переважно належать колби, чашки, лунки і пластини для клітинних культур, титрувальні мікропланшети, 96-лункові планшети, колби для клітинних культур та біореактори. Під поняттям "використання з діагностичною метою" мається на увазі будь-яка мета, яка служить для виявлення стану організму/органу/клітини, відповідно для віднесення фактичного стану організму/органу/клітини до певної категорії станів (наприклад до певного захворювання), що, наприклад, має на увазі використання (але не обмежуючись лише ними) певного набору/хімічних реактивів/вимірювального пристрою для визначення деякої фізичної величини, такої як температура і т.д., або хімічного параметра, такого як концентрація і т.д. Під поняттям "використання з терапевтичною метою" мається на увазі будь-яка мета, яка служить для полегшення, відповідно лікування хворобливого стану організму/органу/клітини. Під поняттям "застосування білка разом з імплантатом" мається на увазі поєднане або в часі, або в просторі застосування. Так, наприклад, білкові молекули можна імобілізувати на імплантаті і разом з ним "вживляти" в організм або їх можна вводити в організм просторово окремо від імплантату, але одночасно з його "вживлянням" (ін'єкції і т.д.). Нижче винахід більш докладно розглянуто на прикладах з посиланням на додані креслення, на яких показано: на Фіг.1 - схематичне зображення повторюваних послідовностей типу III, які використовували при проведенні досліджень відповідно до винаходу, на Фіг.2 - результати аналізу проліферації під впливом EDb-домену фібронектину (ED-B) на ендотеліальні клітини, відповідно на людські стромальні клітини при використанні різних субстратів, на Фіг.3 - результати тесту на розростання (тест на формування "трубочок") ендотеліальних клітин під впливом ED-B, на Фіг.4 - результати тесту на прилипання (адгезію), у якому досліджували прилипання ендотеліальних клітин до поверхонь, покритих ED-B, на Фіг.5 - результати тесту, аналогічного до тесту, результати якого представлені на Фіг.4, за винятком того, що клітини піддавали попередній інкубації з різними синтетичними пептидами, послідовності яких являли собою часткові послідовності EDb-домену фібронектину, на Фіг.6 - часткові послідовності синтетичних пептидів EDb-домену фібронектину, які використовувалися в тесті, результати якого представлені на Фіг.5, на Фіг.7 - результати тесту з прилипання ендотеліальних клітин до різних синтетичних ED-B-пептидів, на Фіг.8 - розташування синтетичних пептидів, вказаних на Фіг.6-7, на моделі структури основного пептидного ланцюга ED-B, на Фіг.9 - вплив EDb-домену фібронектину і розташованого на петлі 5 пептиду (SEQ ID NO: 2) на формування капіляроподібних структур, виявлене в тесті на розростання клітин (тест на формування "трубочок"), на Фіг.10 - результати двох аналізів, які проводилися за допомогою афінної хроматографії з використанням Fn-7-8-9, відповідно Fn-7-B-8-9, які отримані з клітинних лізатів ендотеліальних клітин шкіри людини, що несуть мітку на зовнішній поверхні, на Фіг.11 - результати двох аналізів, які проводилися за допомогою афінної хроматографії з використанням Fn-7-8-9, відповідно Fn-7-B-8-9, які отримані з клітинних лізатів стромальних клітин шкіри людини, що несуть мітку на зовнішній поверхні, на Фіг.12 - результати очищення EDbВ-рецептора за допомогою афінної хроматографії і на Фіг.13 - зображення отриманих після глибокого охолодження зрізів людської пухлини, характеристики яких визначали шляхом імуногістологічного аналізу. На Фіг.1 представлені різні застосовувані в даному дослідженні рекомбінантні фрагменти фібронектину, які мають різні структури доменів, що характеризуються різними повторюваними послідовностями типу III. При цьому Fn-7-B-8-9 включає домени 7, EDb, 8 і 9, Fn-7-8-9 включає домени 7, 8 і 9, ED-B включає домени EDb, Fn-10 включає домен 10 і Fn-6 включає домен 6 фібронектину. Ці білки експресували в Е. соІі у вигляді мічених за допомогою His-Tag білків і очищали на нікель-хелат-сефарозній колонці. Використовувані в даному дослідженні числові позначення відповідають тим, які використовуються в науковій літературі. При цьому скорочення FN-B, ED-B, EDB і EDb усі стосуються EDb-домену фібронектину та їх слід розглядати як синонімічні. На Фіг.2 представлені результати аналізу проліферації, у якому оцінювали вплив EDb-домену фібронектину (ED-B) на проліферацію ендотеліальних клітин (ЕК), відповідно клітин строми (СК). У кожну лунку 96-лункового планшета вносили по 1000 клітин і здійснювали інкубацію. У процесі аналізу проліферації в середовище додавали розчинний ED-B (10мкг/л). Через три дні кількість клітин оцінювали за допомогою MTS-аналізу. Проліферацію клітин індукували за допомогою основного фактора росту фібронектину (bFGF). Встановлено, що ED-B не впливав на клітини за відсутності bFGF, а також не виявлено впливу домену 10 типу III в присутності bFGF (дані не наведені). Вплив ED-B на проліферацію людських ендотеліальних клітин був виявлений для клітин, висіяних на желатин (ЕК/желатин), а також для клітин, висіяних на колаген (ЕК/колаген), однак в останньому випадку дія не була такою вираженою, як для клітин, висіяних на желатин. У випадку людських стромальних клітин, висіяних на желатин (СК/желатин), виявлено, що проліферація відбувається навіть за відсутності bFGF, при цьому її рівень помітно перевершує рівень проліферації людських ендотеліальних клітин. Додавання bFGF, відповідно bFGF + EDB не приводило до збільшення проліферації. Кількість клітин оцінювали на основі вимірювання оптичної густини при довжині хвилі 490нм. Для аналізу проліферації використовували наступний експериментальний метод: Матеріал: 96-лунковий планшет (із плоским дном), фірма Nunc. Середовище: MCDB 131, доповнене пеніциліном/стрептоміцином (Pen/Strep), амфотерицином (0,25мкг/мл), гепарином (20мкг/мл), інактивованій нагріванням ФТС (фетальна теляча сироватка) (5%) Методика: Клітини вносили в кількості 500-1000 на лунку (96-лункові планшети) у 100мкл середовища, яке містить bFGF (1-3нг/мл) або VEGF (30-50нг/мл) і культивували протягом 3 днів. Точну кількість для кожної партії визначали титруванням: оптимальною є мінімальна концентрація, яка забезпечує максимальне стимулювання проліферації. Синхронізація клітин перед експериментом не вимагається, проте є донустимою. Через 3 дні кількість клітин оцінювали за допомогою набору для аналізу типу MTS (фірма Promega), дотримуючись інструкцій виробника. Для виявлення максимальної абсорбції в лінійній області рекомендується робити вимірювання абсорбції в декілька моментів часу (через 0,5; 1; 2; 4год). Контролі: Негативний контроль - без мітогену (проліферація відсутня) (-bFGF/VEGF) Позитивний контроль - у присутності мітогену (максимальна стимуляція) (+bFGF/VEGF) На Фіг.3 представлені дані, які характеризують вплив ED-B на розростання ендотеліальних клітин зі сфероїдів. У цьому досліді HUVEC-сфероїди (Human Umbilical Vein Endothelial Cells = ендотеліальні клітини вени людської пуповини) вносили в колаген і шляхом додавання 10мкг/мл bFGF (основний фактор росту фібробластів), індукували їх розростання в присутності 6мкг/мл ED-B або без нього. Було встановлено, що додавання лише одного bFGF індукує розростання, яке потім додатково можна стимулювати шляхом додавання ED-B (+ bFGF + ED-B). В тесті на розростання (тест формування "трубочок") застосовували наступний експериментальний метод: Матеріал: метилцелюлоза, яка має максимальну в'язкість (фірма Sigma) трипсин/ЕДТК для клітинної культури (фірма Gibco) круглодонні 96-лункові планшети (фірма Greiner №650185) рекомбінантний bFGF (фірма Gibco №13256-029) рекомбінантний VEGF (фірма R & D System) антищурячий CD31 (фірма RDI, №RDI-CD31TLD) гепарин (фірма Gibco, №15077-027) Розчини: ЗФР/антибіотики: клітинна культура-ЗФР, 10-кратний пеніцилін/стрептавідин Pen/Strep, 2,5мкг/мл амфотерицину 1% желатин (фірма Difco), піддавали автоклавуванню і після охолодження змішували з пеніциліном/стрептавідином (Pen/Strep) і амфотерицином (0,25мкг/мл). Середовище: MCDB 131, глутамін, пеніцилін/стрептавідин (Pen/Strep), амфотерицин (0,25мкг/мл), гепарин (20мкг/мл), інактивована нагріванням ФТС (10%) Середовище для росту: середовище, доповнене 2нг/мл bFGF та 10нг/мл VEGF Клітини: HUVEC MVEC шкіри (кількість пасажів >4) Методика: Ендотеліальні клітини відокремлювали за допомогою трипсину/ЕДТК і розводили середовищем, яке містить 0,24% метилцелюлози до концентрації 5000клітин/мл. У кожну лунку планшета Грейнера вносили по 200мкл (1000 клітин) та інкубували протягом ночі. Круглі скупчення клітин (сфероїди) збирали за допомогою піпетки об'ємом 1мл з відрізаним кінчиком і піддавали центрифугуванню. Сфероїди ресуспещгували в суміші 1,2% метилцелюлози/ФТС і змішували з нейтралізованим колагеновим гелем. При цьому відбувалася співполімеризація EDb і bFGF. Представлені на кресленні дані чітко свідчать про те, що при додаванні ED-B спостерігається виражене посилення формування судин, що перевищує рівень, який індукується bFGF. На Фіг.4 приведені результати тесту прилипання ендотеліальних клітин до титрувальних мікропланшетів, покритих ED-B. У цьому досліді ендотеліальні клітини, які знаходилися у вихідній посудині для культивування, відокремлювали від субстрату шляхом обробки трипсином (трипсин/ЕДТК) і потім інкубували в ти трувальних мікропланшетах, вкритих ED-B у різних концентраціях (0, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 40мкг/мл) і залишали на годину для прилипання. Як негативний контроль використовували лунки, вкриті 1мг/мл БСА (бичачий сироватковий альбумін); з даних, отриманих в експерименті, віднімали рівень адгезії до БСА (