Спосіб одержання біоспецифічних адсорбентів для виділення фібронектину та колагеназ

Изобретение относится к химии полимеров и позволяет получать биоспецифические адсорбенты для выделения фибронектина и коллагеназ, имеющие емкость по выделяемым веществам 2,0-2,6 мг/мг лиганда. Это достигается использованием в способе получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ путем активирования нерастворимой матрицы и последующего ковалентного связывания ее со сцецифическим лигандом фрагментов oL -цепи молекулы коллагена или о 1СВ7-бромб цианового пептида коллагена в качестве лигандов. 1 табл. CO Y 1419717 Изобретение относится к химии полимеров, а именно к способу получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и колла- , генаэ, и может быть использовано в биохимии и медицине. Целью изобретения является повышение емкости адсорбентов по фибронектину и коллагеназам. 1Q В качестве специфических лигандов в способе используются б£ -цепи коллагена или о 1GB7 пептид, получаемый б бромциановым щеплением и. I -цепи коллагена. 15 П р и м е р 1. 140 мг лиофилизованного коллагена из кожи крыс растворяют в 70 мл 0,5 М уксусной кислоты в течение 16 ч при 4 С. Раствор диализуют против 8 л 0,06 M натрий-аце- 20 татного буфера, рН 4,8, за 16 ч при 4°С и затем нагревают при 45 С в течение 30 мин. Полученный раствор фильтруют, вводят на колонку с целлюлозной КМ-5 2 (2,5x25 с м ) , уравнове- 25 шениой 0,06 М натрий-ацетатным буфером, рН 4,8 и элюируют линейным градиентом NaCl (0 —* 0,1 М) в том же буфере. Смеситель для градиента двухкамерный, по 400 мл в каждой камере, 30 общий объем - 800 мл. Хроматографию проводят при 42 С. Скорость тока 200 мл/ч. Фракции анализируют по поглощению при 230 нм. Соответствующие фракции, содержащие oi, , о£, + 35 + П>„ , в, 2 и Ы.г -компоненты, диализуют против 0,1 И уксусной кислотой и лиофилизуют. Суммарный выход по белку 50,2% ( Ы., цепь - 9,52 мг, U2 18,4 мг, р ( 1 - 7,76 мг, (Ьп- 22,5 мг, 40 *, + / , - 12,09 мг). і, Лиофилизованные о£,- или /3« фрагменты (по 180 мг) растворяют в 40 мл 70% меравьиной кислоты и инкубируют 4 ч при 37 С под азотом с 45 0,5 г BrCN. Затем смесь вводят на колонку с сефадексом С-25 (1,8 х х 60 см), уравновешенным 0,1 М уксусной кислотой. Скорость тока 45 мл/ч. Фракцию, выходящую с исключающим _ft объемом колонки, лиофилизуют и получают 165 мг смеси бромциановых пептидов о£| -цепи коллагена. Получено 7,5 мг о 1 СВ7-пептида коллагена. £ Лиофилизованный oL 1СВ7-пептид _ _ коллагена (20 мг) растворяют в 10 мл 0,1 М NaHCO 5 , рН 8,4, содержащего 0,15 М NaCl, добавляют 10 мл бромциан-активированной сефарозы 4В и суспензию перемешивают в течение 16 ч при 4 С. Затем сорбент промывают 50 мл того же буфера, 50 мл воды и перемешивают 2 ч при 20 С с10 мл 1 М раствора этаноламина, оттитрованного 6 н, НС1 до рН 9. Сорбент отделяют и промывают по 50 мл 0,1 М натрий-ацетатного буфера с 1 М NaCl, рН 4,5 и 0,1 М натрий-боратного буфера с 1 М NaCl, рН 9,0 (операцию повторяют трижды). Затем = сорбент промывают водой и хранят в виде суспензии в воде при 4 С в присутствии 0,02% азида натрия. Количество присоединенного oL 1СВ7пептида определяют по содержанию оксипролина в гидролизате аликвоты адсорбента. П р и м е р ы 2-9. Аналогично получают адсорбенты на основе сефарозы 4В или CL-4B, сферона 1000 и тойопала HW-65 с о£, - и Ы-2 -цепями, /3„ - и / , -компонентами, oi 1СВ832 бромциановым пептидом и желатином, , Свойства полученных сорбентов представлены в таблице. П р и м е р 10. К 6 г силикагеля МСА-750 добавляют 35 мл толуола и 2,5 мл 3-(2,3-эпоксипропокси)пропилтриметоксисилана, вакуумируют на роторном испарителе 5 мин и кипятят при перемешивании 10 ч при 110 С. Сорбент, промывают на фильтре 70 мл толуола, 140 мл ацетона и высушивают. К полученному продукту добавляют 167 мл 0,1 н.НСІ в ацетоне и перемешивают 2 ч при 20°С, Сорбент промывают 100 мл воды до рН 7 промывных вод и сушат в вакууме при 80°С. Полученный сорбент суспендируют в растворе 0,25b г периодата натрия в 200 мл воды и перемешивают в течение 1 ч при 20 С. Затем сорбент промывают 300 мл воды и перемешивают в течение 16 ч при 20 С с раствором 100 мг о£, -цепи в 50 мл воды, после чего продукт промывают 100 мл воды, суспендируют в 50 мл 0,1 М бикарбонатного буфера, рН 8,5, добавляют 0,05 г бромгидрида натрия и перемешивают в течение 1 ч при 20°С. Полученный адсорбент промывают 50 мл 0,1 М натрий-ацетатного буфера, рН 4,5, содержащего 1 М NaCl, и 50 мл 0,1 М натрий-боратного буфера, рН 9,0, содержащего 1 М NaCl (операцию повторяют трижды). Затем сорбент промывают водой и хранят при 4 С. 1419717 лагеназы проводят градиентом NaCl (0-*0,3 М) в 0,01 М трис-НСІ буфере, рН 7,5, с 0,001 М СаС1 2 со скоростью тока 0,1 мл/мин. Степень очист5 ки на стадии ионообменной хроматограна адсорбентах, содержащих фрагменты фии - 30 раз. Полученный препарат молекулы коллагена). коллагеназы используют далее для Инкубируют 1 ч при 20 С раствор аффинной хроматографии. Коллагеназную плазмы крови человека (лиофилиэованактивность определяют по гидролизу ную плазму из 60 мл крови растворяют ю [ с]-коллагена. в 30 мл 0,05 М трис-буфера, рН7,4, с 0,15 М NaCl, 0,5 мМ PMSF и 0,02% Б. Сорбенто£1СВ7-сефароза (5 мл азида натрия) с 10 мл o , -сефароd упакованного объема) инкубируют 1 ч зы 4В. Затем адсорбент упаковывают при 4°С с раствором Ш мг препарата в силиконизированную стеклянную ко- 15 коллагеназы, полученной в п.А, в лонку, которую промывают тем же бу|0 мл 0,05 М трис-НСІ буфера, рН7,4, ферным раствором до отсутствия поглосодержащего 0,1 М NaCl, 0,001 М щения при 280 нм в элюате. После СаС1 2 , 0,005 М FMSF и 0,05% Brij 35. этого колонку промывают уравновешиЗатем сорбент упаковывают в колонку вающим буферным раствором, содержащим 20 (1,2 х 4 см), которую промывают при 1 М мочевину (50 м л ) , и вымывают фиб4 С по 25 мл буфера А, буфера А с 1М ронектин тем же буфером с 4 М мочевиNaCl, 0,05 М натрий-ацетатного буфеной (14 м л ) . В заключение колонку ра, рН 5,2, содержащего 0,2 М NaCl, промывают тем же буфером с 8 М моче- , 0,001 СаС1 2 , 0,005 М PMSF и 0,05% виной. Функции анализируют по пагло- 25 Brij 3*5. Хроматографию проводят при щению при 280 нм. Фракции, содержащие скорости тока 20 мл/ч, объем фракфибронектин, диализуют против 0,1 М ций - 1 мл. Фракции анализируют по уксусной кислоты и лиофилизуют. Выход поглощению при 280 нм и по коллагефибронектина 17 мг (94,4%). Чистота назной активности. Коллагенолитичесполученного препарата подтверждена 30 кая активность распределялась в двух данными электрофореза в полиакрилафракциях, элюированных буфером А, мидном геле в присутствии додецилсодержащим 1 М NaCl, и натрий-ацетатсульфата натрия. ным буфером. Выход по активности 40%, П р и м е р f2. (Хроматография степень очистки 10 раз. коллагеназы из культуральной среды 35 фибробластов кожи человека на Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я оС1СБ7-сефарозе) . А. Коллагеназу выделяют из 5 л Способ получения биослецифических среды осаждением сульфатом аммония адсорбентов для выделения фибронекти(60% насыщения). В случае бессыворо- 40 на и коллагеназ путем активирования точной среды осаждение проводят в нерастворимого носителя и последующего присутствии сывороточного альбумина ковалентного связывания его со специфив концентрации 0,5%, Осадок отделяют ческим лигандом, о т л и ч а ю щ и й центрифугированием, растворяют в 0,01 М трис-НСІ буфере, рН 7,5, со- 45 с я тем, что, с целью повышения емкости адсорбентов по фиброиектину и колла— держанием 0,001 М СаС1 2 , и после геназам, в качестве специфического диализа против этого же буфера растлиганда используют oL -цепи молекулы вор, содержащий 300 мг белка, вводят коллагена иои oL 1СВ7~бромциановый на колонку с КМ-целлюлозой, уравновешенной тем же буфером. Элюцию кол- 50 пептид коллагена. Свойства адсорбента приведены в таблице. П р и м е р 11. (Хроматография фибронектина плазмы крови человека 6 1419717 Свойства адсорбентов с иммобилизованными коллагена Пример, № фрагментами молекулы Содержание иммобилиэо Адсорбент Емкость по фибронектину ганда, мг/мл мг-мг геля иммобилизованного , лиганда моль/моль иммобилизованного лиганда «1-СВ7-сефароза-4В 0,6 2,5 0,14 оС-сефароза 4В 0,6 2,5 0,57 о£-сефароза С -4В 0,7 2,25 0,51 ої,-сефароза 4В 1.4 2,0 0,45 5(контроль) ft-сефароза 4В 1,7 1,27 0,58 6(контроль) ft-сефароза 4В 1,1 0,5 7(контроль) ві1СВ8-сефароза 4В 0,86 0,13 0,0074 8 oL -сферой 0,8 2,6 0,59 9 й£.1СВ7-тойопал Н-60 0,5 2,25 0,13 oL -макропористый силикагель 3,5* 2,6 0,59 0,6 1,3 — Ю 11 1000 Желатин-сефароза 4В (сравнительный по прототипу) В мг/г сухого веса матрицы Редактор М, Бандура Составитель Л, Чупова Техред Л.Олийнык Корректор, А. Тяско Заказ 4266/10 Тираж 519 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгоррд, ул. Проектная, 4