Композиції, що містять гібридні білки-аналоги glp-1

1. Стійка розчинна композиція, що містить терапевтично ефективну кількість гібридного білка GLP-1-Fc при рН у межах від приблизно рН 6 до приблизно рН 8,5, яка відрізняється тим, що до складу гібридного білка GLP-1-Fc входить аналог GLP-1, що містить послідовність, вибрану з групи, яка включає: a) (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1) His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-TrpLeu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly, де Xaa8 вибраний з Gly і Val; b) (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2) His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-TrpLeu-Lys-Asn-Gly-Gly-Gly, де Xaa8 вибраний з Gly і Val; c) (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3) His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-TrpLeu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro, де Xaa8 вибраний з Gly і Val; d) (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4) His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp 2 (19) 1 3 87009 4 4. Стійка розчинна композиція за п. 3, яка відріз8. Стійка розчинна композиція за п. 1, яка додатконяється тим, що рН знаходиться у межах від приво містить Твін 80®. близно рН 6 до приблизно рН 6,5. 9. Стійка розчинна композиція за п. 1, яка додатко5. Стійка розчинна композиція за п. 4, яка відрізво містить NaCl. няється тим, що рН дорівнює приблизно рН 6. 10. Стійка розчинна композиція за п. 1, яка додат6. Стійка розчинна композиція за п. 4, яка відрізково містить м-крезол. няється тим, що рН дорівнює приблизно рН 6,5. 11. Стійка розчинна композиція за п. 1, яка додат7. Стійка розчинна композиція за п. 1, яка додаткоково містить Твін 20®, NaCl та м-крезол. ® во містить Твін 20 . 12. Стійка розчинна композиція за п. 1, яка додатково містить Твін 80®, NaCl та м-крезол. Цей винахід має відношення до композицій, що містять аналоги глюкагоноігодібного пептиду, злиті з білками, що мають ефект стабілізування гібридних білків. Ці композиції можуть бути застосовані для лікування діабету, а також ряду інших станів або розладів. Під час клінічних випробувань аналоги і похідні глюкагоноподібного пептиду-1 (GLP-1) продемонстрували придатність для лікування діабету типу 2. GLP-1 індукує численні біологічні ефекти, наприклад, стимулювання секреції інсуліну, пригнічення секреції глюкагону, пригнічення випорожнювання шлунка або кишечнику, пригнічення рухової функції шлунка або перистальтики кишечнику і індукування втрати маси тіла. Суттєвою характеристикою GLP-1 є його здатність до стимулювання секреції інсуліну без пов'язаного із цим ризику гіпоглікемії, що спостерігається у разі проведення інсулінотерапії або застосування пероральних методів лікування деяких типів, під час здійснення яких відбувається підвищення експресії інсуліну. Придатність методів лікування із залученням пептидів GLP-1 обмежується тим, що GLF-1 1(137) має низьку активність, а два природні "укорочені" пептиди, GLP-1(7-37)OH та GLP-1(7-36)NH2, швидко виводяться in vivo і мають надзвичайно короткий період напіввиведення in vivo. Відомо, що ендогенно продукована дипептидилпептидаза IV (DPP-IV) інактивує циркулюючі пептиди GLP-1 шляхом видалення N-кінцевих залишків гістидину та аланіну і є головною причиною короткого періоду напіввиведення in vivo. Вдавались до різних способів подовження періоду напіввиведення пептиду GLP-1 або уповільнення виведення згаданого пептиду з організму з одночасним збереженням біологічної активності. Один із варіантів підходу включає злиття пептиду GLP-1 з Fc-фрагментом імуноглобуліну. Імуноглобуліни, як правило, мають довгий період напіввиведення in vivo із системи кровообігу. Тривалість періоду напіввиведення молекул IgG у людей, наприклад, може досягати 23 днів. Відповідальність за цю стійкість in vivo частково несе Fc-фрагмент згаданого імуноглобуліну. Перевага гібридних білків GLP-1-Fc полягає у стабільності, що надається їм Fc-фрагментом імуноглобуліну, з одночасним збереженням біологічної активності молекули GLP-1. Хоча цей варіант підходу є прийнятним для одержання лікарських засобів на основі GLP-1 [див. WO 02/46227], залишається, однак, загальна проблема, що полягає у антигенності різних гібридних білків у разі їх повторного введення впродовж тривалих періодів часу. Ця проблема набуває особливої гостроти у разі лікарських засобів на основі гібридних - білків GLP-1-Fc, оскільки хворий на діабет, після діагностування цього захворювання, повинен лікуватись впродовж усього життя. Окрім того, лікарські засоби на основі гібридних білків, що містять Fc-фрагмент, можуть викликати проблеми у разі, якщо згаданий Fc-фрагмент зберігає небажані ефекторні функції. Цей варіант підходу знаходиться у центрі уваги PCT/US 04/15595 [WO 2005/000892], у якій проблеми, пов'язані з потенційною імуногенністю і ефекторною активністю, які можуть виникати у разі введення гібридних білків GLP-1-Fc, долаються шляхом ідентифікування конкретних гібридних білків GLP-1-Fc, які мають зменшений ризик індукування імунної реакції після повторного і тривалого введення і більше не мають ефекторної функції. Гібридні білки цієї природи є, у технічному відношенні, занадто великими і складними для продукування синтетичним або рекомбінантним шляхом у бактеріальних клітинах. Ці гібридні білки, як правило, продукуються у клітинах ссавців, наприклад, СНО (клітини яєчника китайського хом'ячка), 293 або NS0. Спостерігалось, що гібридні білки, які продукуються у клітинах ссавців, були більш сприйнятливими до розкладу під впливом ендогенних протеаз та хімічних змін, аніж негібридні білки, які продукуються у бактеріальних клітинах. Цю проблему намагалися подолати цим винаходом. Було встановлено, що композиція, яка містить гібридний білок GLP-1-Fc і забуферена до рівня рН у межах від приблизно рН 6 до приблизно рН 8,5, забезпечувала підвищену хімічну стійкість. З метою подолання проблеми хімічної стійкості гібридних білків GLP-1-Fc, винахідники розробили стійку розчинну композицію. Винахідники, зокрема, відкрили, що композиція, яка містить терапевтично ефективну кількість гібридного білка GLP-1-Fc при рН у межах від приблизно рН 6 до приблизно рН 8,5, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, у межах від приблизно рН 6 до приблизно рН 7,5, у межах від приблизно рН 6 до приблизно рН 7, у межах від приблизно рН 6,5 до приблизно рН 7,5 або у межах від приблизно рН 6 до приблизно рН 6,5, та відповідно до варіанта, якому віддається ще більша перевага, при рН на рівні приблизно рН 6 або приблизно рН 6,5, забезпечувала неочікувану і значно більшу хімічну 5 87009 6 Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leuстійкість, порівняно з гібридними білками GLP-1-Fc Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Valпри рН за межами згаданих діапазонів. Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-AsnДо складу цього винаходу входять також споTrp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lysсоби лікування хворих, які страждають як на інсуThr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Xaa80-Ser-Thr-Tyrлінонезалежний, так і на інсулінозалежний цукроArg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Aspвий діабет, ожиріння та ряд інших розладів та Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Serстанів, що включають введення композицій, які Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Serмістять гібридні білки GLP-1-Fc. Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-TyrГібридні білки містять GLP-1, злитий з FcThr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asnділянкою імуноглобуліну, аналогом Fc-ділянки імуGln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyrноглобуліну або фрагментом Fc-ділянки імуноглоPro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Glyбуліну. С-кінець GLP-1 може бути злитим безпосеGln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Valредньо або через пептидний лінкер із N-кінцем Fc Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Argбілка. Ці гібридні білки є біологічно активними і Leu-Thr-Val-Аsр-Lуs-Sеr-Аrg-Тrp-Gln-Glu-Glу-Аsnмають підвищений період напіввиведення, порівVаl-Рhе-Sеr-Суs-Sеr-Vаl-Met-His-Glu-Ala-Leu-Hisняно з нативним GLP-1. Сполуки GLP-1, які станоAsn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leuвлять частину гібридного білка, включають поліпеGly-Xaa230 (Послідовність №7), птиди, що мають від приблизно двадцяти п'яти до де: приблизно тридцяти дев'яти природних або штучXaa у положенні 16 - Pro або Glu; них амінокислот із достатнім рівнем гомології з Xaa у положенні 17 - Phe, Val або Ala; нативним GLP-1(7-37)OH, завдяки чому вони деXaa у положенні 18 - Leu, Glu або Ala; монструють інсулінотропну активність шляхом Xaa у положенні 80 - Asn або Ala; і зв'язування з рецептором GLP-1 на b-клітинах Xaa у положенні 230 - Lys або відсутня. підшлункової залози. До складу GLP-1, як правиС-кінець складової частини, що являє собою ло, входить поліпептид, що має амінокислотну аналог GLP-1, і N-кінець Fc-фрагмента гібридних послідовність GLP-1(7-37)OH, аналога GLP-1(7білків за варіантом, якому віддається перевага, 37)OH, фрагмента GLP-1(7-37)OH або фрагмента зливають через 1, 1,5 або 2 повтори Gаналога GLP-1(7-37)OH. збагаченого пептидного лінкера, що має послідовПрикладами гібридних білків, придатних для ність Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Glyзастосування у композиціях, є гібридні білки, до Gly-Gly-Gly-Ser (Послідовність №8). складу яких входить аналог GLP-1, що містить Гібридні білки, придатні для застосування у послідовність, вибрану з групи, яка включає: композиціях відповідно до цього винаходу, вклюa) (Послідовність №1) чають складову частину, що являє собою аналог His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-SerGLP-1, і Fc-фрагмент. Складова частина, що являє Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileсобою аналог GLP-1, і Fc-фрагмент включають Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly, заміни у послідовності нативного GLP-1 і послідоде Хаа8 вибраний з Gly і Val; вності людського IgG4, відповідно, які забезпечуb) (Послідовність №2) ють можливість одержання білка з підвищеною His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Serактивністю і стабільністю in vivo, порівняно з натиSer-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileвним GLP-1 або аналогами GLP-1, не злитими з Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Gly, послідовністю Fc, з одночасним зменшенням поде Xaa8 вибраний з Gly і Val; тенціалу індукування утворення антитіл після триc) (Послідовність №3) валого і повторного введення людям. His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-SerНативний GLP-1 обробляють in vivo таким чиSer-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileном, що перші 6 амінокислот від молекули відщеAla-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro, плюються. За традицією, прийнятою у цій галузі, де Xaa8 вибраний з Gly і Val; аміно-кінець GLP-1 має номер 7, у той час як карd) (Послідовність №4) боксильний кінець має номер 37. Інші амінокислоHis-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Serти поліпептиду нумеруються послідовно, як покаSer-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileзано у Послідовнoстi №9. Наприклад, положення 8 Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro, займає аланін, а положення 22 займає гліцин. Підде Xaa8 вибраний з Gly і Val; даний обробці пептид може бути додатково модиe) (Послідовність №5) фікований in vivo таким чином, що С-кінцевий заHis-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Serлишок гліцину видаляється і замінюється на Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileамідну групу. Таким чином, GLP-1(7-37)OH і GLРAla-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly, 1(7-36)амід являють собою дві нативні форми моде Xaa8 вибраний з Gly і Val; лекули. GLP-1(7-37)OH має амінокислотну посліf) (Послідовність №6) довність, представлену Послідовністю №9: His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser7 His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Tlir-Ser-15Asp-ValSer-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-DeSer-Ser-Tyr-20Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-GluAla-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly, Phe-Ile-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg-37Gly (Поде Xaa8 вибраний з Gly і Val; слідовність №9). злитий з Fc-фрагментом імуноглобуліну, що Складова частина гібридного білка, що являє містить Послідовність №7: собою аналог GLP-1, включає три головні заміни у Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Proположеннях 8, 22 і 36, відносно нативного GLPCys-Pro-Ala-Pro-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Gly-Gly-Pro-Ser 7 87009 8 1(7-37). Заміна у положенні 8 зменшує швидкість, з що IgG4 виснажує клітини-мішені у людей [Іссакс якою ендогенний фермент дипептиділпептидаза IV (Issacs) та інші, (1996) Clin. Exp. Immunol. 106: 427(DPP-IV) інактивує аналог. DPP-IV розщеплює на433]. Оскільки гібридні білки за цим винаходом тивний GLP-1 між другою та третьою амінокислоспрямовуються на бета-клітини підшлункової затами (між положенням 8 і положенням 9), і одерлози для індукування експресії інсуліну, застосужана молекула є менш активною. Таким чином, вання фрагмента IgG4 у гібридному білку Fc могло гібридні білки за цим винаходом є стійкими до б ініціювати імунну реакцію проти панкреатичних DPP-IV. Заміна у положенні 22 зменшує потенціал бета-клітин шляхом взаємодії згаданого гібридного молекули до агрегування і підвищення активності білка з рецептором GLP-1, присутнім на панкреамолекули. Заміна у положенні 36 у контексті анатичних бета-клітинах. Таким чином, Fc-фрагмент лога із замшами у положенні 8 і положенні 22, а IgG4, що є складовою частиною гібридних білків за також у контексті гібридного білка у цілому, зменцим винаходом, включає заміни, що ліквідують шує ризик того, що згаданий гібридний білок буде ефекторну функцію. Fc-фрагмент IgG4 гібридних індукувати нейтралізуючу імунну реакцію після білків за цим винаходом може включати одну або повторного і тривалого введення людям. декілька із наведених нижче замін: заміну глутаС-кінець аналога GLP-1, відповідно до варіанмату на пролін (залишок 233), фенілаланіну на та, якому віддається перевага, являє собою одну з аланін або валін (залишок 234) і лейцину на аланін наведених нижче послідовностей: Trp-Leu-Val-Lysабо глутамат (залишок 235) [нумерація ЄвросоюGly-Gly-Gly (Послідовність №10); Trp-Leu-Lys-Asnзу, Кабат Е.А. (Rabat Е.А.) та інші, (1991) Gly-Gly-Gly (Послідовність №11); Τrp-Leu-Val-LysSequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Gly-Gly-Pro (Послідовність №12); Trp-Leu-Lys-AsnEd., U.S. Dept. of Health and Human Services, Gly-Gly-Pro (Послідовність №13); Trp-Leu-Val-LysBethesda, штат Меріленд, публікація НаціональноGly-Gly (Послідовність №14); та Trp-Leu-Lys-Asnго інституту здоров'я (США) № 91-3242]. Ці залишGly-Gly (Послідовність №15). ки відповідають положенням 16, 17 і 18 у ПослідоГібридні білки, придатні для застосування у вності №7. Далі, видалення N-зв'язаного сайту композиціях відповідно до цього винаходу, містять глікозилування з Fc-фрагмента IgG4 шляхом заміFc-фрагмент, одержаний з людського IgG4, який ни Asn на Ala (залишок 297, нумерація Євросоювключає, однак, одну або декілька замін, порівнязу), що відповідає положенню 80 Послідовності но з людською послідовністю дикого типу. Слово№7, є іншим способом забезпечення ліквідації сполучення "Fc-фрагмент імуноглобуліну", що залишкової ефекторної активності у контексті гібвживається у цьому описі, має значення, яке цьоридного білка. му словосполученню традиційно надають у галузі На додаток до цього, Fc-фрагмент IgG4 гібриімунології. Зокрема, цей термін означає фрагмент дних білків містить заміну, що стабілізує утворення антитіла, що не містить двох антигензв'язуючих димеру важкого ланцюга і запобігає утворенню ділянок (Fab-фрагментів) антитіла. Fc-фрагмент напів-IgG Fc ланцюгів. Гібридні білки відповідно до складається з константних ділянок обох важких варіанта, якому віддається перевага, існують у ланцюгів антитіла, що зв'язуються між собою невигляді димерів, об'єднаних дисульфідними зв'язковалентними і дисульфідними зв'язками. Fcками і різними нековалентними зв'язками. IgG4 фрагмент може включати шарнірні ділянки і продикого типу містить мотив Рrо-Рrо-Cys-Pro-Ser-Cys ходити через домени СН2 і СН3 до С-кінця антиті(Послідовність №16), що розпочинається на залила. Fc-фрагмент може додатково включати один шку 224 (нумерація Євросоюзу). Цей мотив у одабо декілька сайтів глікозилування. ному ланцюзі аналога GLP-1-Fc утворює дисульІснує п'ять типів людських імуноглобулінів із фідні зв'язки з відповідним мотивом у іншому різними ефекторними функціями і фармакокінетиланцюзі аналога GLP-1-Fc. Однак присутність сечними властивостями. IgG є найстабільнішим із рину у згаданому мотиві спричинює утворення п'яти типів і його період напіввиведення із сироваодноланцюгових гібридних білків. Цей винахід має тки людей становить приблизно 23 дні. Існує чотивідношення до гібридних білків Fc, де послідоври підкласи IgG (G1, G2, G3 і G4), кожен з яких має ність IgG додатково модифікована таким чином, різні біологічні функції, відомі як ефекторні функції. що серин у положенні 228 (нумерація Євросоюзу) Ці ефекторні функції, як правило, опосередковузамінюють на пролін (амінокислотний залишок 11 у Послідовності №7). ються через взаємодію з рецептором Fc (FcgR) С-кінцевий залишок лізину, присутній у нативабо шляхом зв'язування C1q і комплементу. Насній молекулі, може бути видалений у Fc-фрагменті лідком зв'язування з FcgR може бути антитілоза(що походить з IgG4) гібридних білків, що обговолежний клітинно-опосередкований цитоліз, у той рюються у цьому описі (положення 230 Послідовчас як наслідком зв'язування з факторами комності №7; видалений лізин позначається як des-K). плементу може бути клітинний лізис, опосередкоГібридні білки, що експресуються клітинами деваний комплементом. При конструюванні гібридяких типів (наприклад, клітинами NS0), де лізин них білків Fc, де Fc-фрагмент застосовується кодується С-кінцевим кодоном, є гетерогенними, виключно з огляду на його здатність до подовженоскільки частина молекул має лізин, як С-кінцеву ня періоду напіввиведення, важливо звести до амінокислоту, а у частини молекул лізин видалемінімального рівня будь-яку ефекторну функцію. ний. Згадане видалення у клітинах ссавців деяких Так, гетерологічні гібридні білки за цим винаходом типів обумовлюється дією протеаз під час експреодержують із застосуванням Fc-фрагмента людсьсії. Таким чином, для запобігання цієї гетерогеннокого IgG4 завдяки його ослабленій здатності до сті, перевагу віддають тому, щоб генно-інженерні зв'язування FcgR і факторів комплементу, порівняно з іншими підтипами IgG. Було показано, однак, 9 87009 10 конструкції для експресії гібридних білків Fc були являє собою Fc-фрагмент. Лінкер, позначений як позбавлені С-кінцевого кодону для лізину. 1,5L, означає послідовність Gly-Ser-Gly-Gly-GlyВідповідно до варіанта, якому віддається пеGly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Serревага, С-кінцева амінокислота складової частини, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (Послідовність №17). IgG4 що являє собою аналог GLP-1 і обговорюється у означає аналог послідовності Fc-фрагмента людцьому описі, зливається з N-кінцем складової часського IgG4, позначеної як Послідовність №7. Затини, що являє собою Fc-фрагмент IgG4, через міни у складовій частині гібридного білка, що явзбагачений гліцином лінкер. In vivo функція і стабіляє собою Fc-фрагмент IgG4, вказуються у льність гібридних білків можуть оптимізуватись дужках. Амінокислота дикого типу вказується пришляхом додання невеликих пептидних лінкерів йнятим для неї скороченням із подальшим номедля запобігання потенційно небажаних взаємодій ром положення у контексті послідовності IgG4 у доменів. Окрім того, збагачений гліцином лінкер цілому (із застосуванням нумерації Євросоюзу), з забезпечує певну структурну гнучкість, завдяки подальшим указанням амінокислоти, що замінючому складова частина, що являє собою аналог ється у цьому положенні, із застосуванням прийнGLP-1, може продуктивно взаємодіяти з рецептоятого для цієї кислоти скорочення. ром GLP-1 на клітинах-мішенях, наприклад, бетаГібридні білки мають біологічну активність. клітинах підшлункової залози. Ці лінкери, однак, Біологічна активність означає здатність гібридного можуть значно підвищити ризик того, що гібридний білка зв'язуватись із рецептором GLP-1 in vivo, білок виявиться імуногенним in vivo. Таким чином, активувати його і викликати реакцію. Реакціями є за варіантом, якому віддається перевага, довжина (але ними не обмежуються) секреція інсуліну, прицих лінкерів повинна бути не більшою за необхідну гнічення глюкагону, пригнічення апетиту, втрата для запобігання небажаних взаємодій доменів маси тіла, викликання відчуття пересичення, прита/або оптимізації біологічної активності та/або гнічення апоптозу, індукування проліферації панстабільності. За варіантом, якому віддається пекреатичних бета-клітин і диференціації панкреатиревага, збагачений гліцином лінкер включає послічних бета-клітин. Репрезентативну кількість довність: Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Serгібридних білків GLP-1 випробували на активність Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (Послідовність №8). Незважаяк in vitro, так і in vivo. Була продемонстрована in ючи на те, що у гібридних білках може застосовуvitro активність, що базується на здатності гібридватись більша кількість копій цього лінкера, за ваного білка до взаємодії з людським рецептором ріантом, якому віддається перевага, GLP-1 і його активізації. [Див. PCT/US 04/15595 застосовується одна копія цього лінкера для зве(WO 2005/000892)]. Використовували клітини дення ризику імуногенноеті, пов'язаної з тривалим НЕК293 (культура клітин нирки людського ембріоі повторним введеннями, до мінімального рівня. на), що надекспресують людський рецептор GLPДо гібридних білків GLP-1-Fc, яким віддають 1. Активація рецептора GLP-1 у цих клітинах виперевагу, належать білки, наведені нижче: Gly8кликає активацію аденілатциклази, яка, у свою Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P), Gly8чергу, індукує експресію репортерного гена, що Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, стимулюється цАМФ-реагуючим елементом (CRE). L235A), Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 Рівень рН композицій, до складу яких входить (S228P, N297A), Gly8-Glu22-Gly36-GLΡ-1(7-37)-1Lгібридний білок GLP-1-Fc, регулюють для забезпеlgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A), Gly8-Glu22чення прийнятної стійкості, для підтримки розчинGly36-GLP-1(7-37)-1,5L-IgG4 (S228P), Gly8-Glu22ності та інсулінотропної активності гібридного білGly36-GLP-1(7-37)-1,5L-IgG4 (S228P, F234A, ка GLP-1-Fc і прийнятності для парентерального L235A), Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1,5L-IgG4 введення. Відповідно до варіанта, якому віддаєть(S228P, N297A), Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1,5Lся перевага, рН композицій, що містять гібридний IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A), Gly8-Glu22білок GLP-1-Fc, регулюють у межах від приблизно Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P), Gly8-Glu22рН 6 до приблизно рН 8,5, відповідно до варіанта, Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), якому віддається перевага, у межах від приблизно Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, рН 6 до приблизно рН 7,5, у межах від приблизно N297A), Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4 рН 6 до приблизно рН 7, у межах від приблизно рН (S228P, F234A, L235A, N297A) та Val8 і усі вищеза6,5 до приблизно рН 7,5 або у межах від приблиззначені білки з видаленим лізином (форми des-K). но рН 6 до приблизно рН 6,5, та відповідно до ваНоменклатура, що вживається у цьому описі, ріанта, якому віддається ще більша перевага, на для позначення конкретних гібридних білків, вирівні приблизно рН 6 або приблизно рН 6,5. значається таким чином: конкретні заміни у склаВідповідно до факультативного варіанта, до довій частині гібридного білка, що являє собою складу композицій, які містять гібридний білок GLP-1, позначаються шляхом указання конкретної GLP-1-Fc відповідно до цього винаходу, може вхоамінокислоти, що замінюється, з подальшим нодити фармацевтично прийнятний буфер. Вибір та мером залишку. GLP-1(1-37) означає, що складова концентрація згаданого буфера, однак, повинні частина зрілого гібридного білка, що являє собою здійснюватись таким чином, щоб характеристики GLP-1, починається з His у положенні 7 і закінчузгаданої композиції відповідали описаним діапазоється Gly у положенні 37. L означає лінкер із понам, що забезпечувало б прийнятну стійкість та слідовністю Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Glyінсулінотропну активність. Прикладами фармацевSer-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (Послідовність №8). Число, тично прийнятних буферів є фосфатні буфери, яке безпосередньо передує L, означає кількість наприклад, двохосновний фосфат натрію, трис, лінкерів, що відокремлюють складову частину, що ацетат, наприклад, ацетат натрію, цитрат, наприявляє собою GLP-1, від складової частини, що клад, цитрат натрію, тартрат натрію, основні амі 11 87009 12 нокислоти, наприклад, гістидин, лізин або аргінін кість та інсулінотропну активність. Засобами для чи нейтральні амінокислоти, наприклад, гліцин та регулювання ізотонічності є сполуки, що є фізіологліцил-гліцин. У цій галузі відомі інші фармацевтигічно стерпними і забезпечують відповідну ізотонічно прийнятні буфери. Відповідно до варіанта, чність композиції для запобігання результуючого якому віддається перевага, буфер вибраний з групотоку води через клітинні мембрани. Прикладами пи, до складу якої входить цитрат, фосфат та таких сполук є гліцерин, солі, наприклад, NaCl, та трис. Досвідченому фахівцю буде зрозуміло, що цукри, наприклад, декстроза, маніт і цукроза. Ці вибір буфера залежить від описаних діапазонів рН сполуки широко застосовують для таких цілей у та рKа буфера. Відповідно до варіанта, якому відвідомих концентраціях. Для регулювання іонної дається перевага, концентрація буфера знахосили або тонічності може додаватись один або диться у межах приблизно 1-30мМ. Відповідно до декілька засобів для регулювання ізотонічності. варіанта, якому віддається більша перевага, конЗасобом для регулювання ізотонічності, якому центрація дорівнює приблизно 4-14мМ або привіддається перевага, є NaCl. Концентрація NaCl, близно 5-20мМ. Відповідно до варіанта, якому відвідповідно до варіанта, якому віддається перевага, дається ще більша перевага, концентрація знаходиться у межах від приблизно 10мМ до дорівнює приблизно 10мМ або приблизно 20мМ. 500мМ, відповідно до варіанта, якому віддається Відповідно до факультативного варіанта, комбільша перевага, у межах від приблизно 50мМ до позиції відповідно до цього винаходу можуть міс200мМ і відповідно до варіанта, якому віддається тити консервант. Вибір та концентрація згаданого найбільша перевага, становить приблизно 150мМ. консерванта, однак, повинні здійснюватись таким Відповідно до іншого варіанта здійснення, засобом чином, щоб характеристики згаданої композиції для регулювання ізотонічності, якому віддається відповідали описаним діапазонам, що забезпечуперевага, є маніт. Концентрація маніту, відповідно вало б прийнятну стійкість та інсулінотропну актидо варіанта, якому віддається перевага, знаховність. Консервант є сполукою, яку додають до диться у межах від приблизно 1% (у відношенні фармацевтичної композиції для справляння дії як маси (w) до об'єму (ν)) до 10% (w/v) і відповідно до протимікробний засіб. Парентеральна композиція варіанта, якому віддається більша перевага, знаповинна задовольняти вимогам щодо ефективносходиться у межах від приблизно 2% (w/v) до 8% ті консерванта для того, щоб бути комерційно жит(w/v). Відповідно до іншого варіанта здійснення, тєздатним універсальним продуктом. До консерзасобом для регулювання ізотонічності, якому відвантів, відомих у цій галузі як такі, що є дається перевага, є гліцерин. Концентрація гліцеефективними та прийнятними для парентеральних рину, відповідно до варіанта, якому віддається композицій, належать фенольні консерванти, алкіперевага, знаходиться у межах від приблизно лпарабени, бензиловий спирт, хлорбутанол, резо12мг/мл до 25мг/мл, відповідно до варіанта, якому рцин та інші подібні консерванти та їх різноманітні віддається перевага, у межах від приблизно суміші. Прикладами фенолових похідних є крезоли 12мг/мл до 20мг/мл і відповідно до варіанта, якому і фенол або суміш крезолів і фенолу. Прикладами віддається більша перевага, становить приблизно крезолів є мета-крезол, орто-крезол, пара-крезол, 17мг/мл. хлоркрезол або їх суміші. Згаданим алкілпарабеВідповідно до факультативного варіанта, комном є С1-С4-алкілпарабени або їх суміші. Приклапозиції відповідно до цього винаходу можуть місдами алкілпарабенів є метилпарабен, етилпаратити підсилювач розчинності. Вибір та концентрабен, пропілпарабен або бутилпарабен. ція згаданого підсилювача розчинності, однак, Концентрація консерванта відома фахівцю у цій повинні здійснюватись таким чином, щоб характегалузі. Концентрація повинна бути достатньою для ристики згаданої композиції відповідали описаним підтримання ефективності консерванта шляхом діапазонам, що забезпечувало б прийнятну стійуповільнення розмноження мікробів. кість та інсулінотропну активність. Підсилювачі Консервантом, якому віддається перевага, є розчинності забезпечують стійкість, при якій гібримета-крезол або фенол. Як правило, концентрація дний білок GLP-1-Fc залишається розчинним мета-крезолу знаходиться у межах від приблизно впродовж тривалого періоду часу за умов збері2,0мг/мл до приблизно 8,0мг/мл, від приблизно гання. Відповідно до варіанта, якому віддається 2,5мг/мл до приблизно 4,5мг/мл та від приблизно перевага, підсилювачем розчинності є нікотинамід. 2,0мг/мл до приблизно 4,0мг/мл. Концентрація Як правило, концентрація нікотинаміду знаходитьконсерванта, якій віддається найбільша перевага, ся у межах 0,01-2моль. Іншими діапазонами онцестановить приблизно 2,7мг/мл. Відповідно до іннтрації нікотинаміду, яким віддається перевага, є: шого варіанта здійснення, концентрація фенолу у межах 0,05-1,5моль; у межах 0,1-1,0моль; у мезнаходиться у межах від приблизно 2,0мг/мл до жах 0,1-0,5моль; у межах 0,5-1,0моль; та у межах приблизно 10,0мг/мл та від приблизно 4,0мг/мл до 0,15-0,25моль. приблизно 8,0мг/мл. Концентрація консерванта у Відповідно до факультативного варіанта, до композиції, якій віддається найбільша перевага, композиції можуть додаватись інші домішки, настановить приблизно 5,0мг/мл. приклад, фармацевтично прийнятні солюбілізатоКомпозиції відповідно до цього винаходу мори, наприклад, Твін 20Ò (сорбітанмонолаурат пожуть факультативно містити засіб для регулюванліоксіетилену (20)), Твін 40Ò ня ізотонічності. Вибір та концентрація згаданого (сорбітанмонопальмітат поліоксіетилену (20)), Твін засобу для регулювання ізотонічності, однак, по80Ò (сорбітанмоноолеат поліоксіетилену (20)), винні здійснюватись таким чином, щоб характериПлуронік F68Ò (блок-співполімери поліоксіетилену стики згаданої композиції відповідали описаним та поліоксипропілену) та PEG (поліетиленгліколь). діапазонам, що забезпечувало б прийнятну стійВідповідно до варіанта, якому віддається перева 13 87009 14 ефект" включає один або декілька з наведених га, солюбілізатором є Твін 20Ò або Твін 80Ò. Як нижче пунктів: 1) поліпшення симптому(-ів), пов'яправило, концентрація Твін 20Ò або Твін 80Ò зназаного(-их) з хворобою або станом; 2) затримку ходиться у межах від 0,001% до 0,05%. Іншими появи симптомів, пов'язаних із хворобою або стадіапазонами концентрації Твін 20Ò або Твін 80Ò є: ном; 3) збільшення тривалості життя порівняно з у межах від 0,005% до 0,05%; у межах від 0,0075% відсутністю лікування; і 4) підвищення якості життя до 0,05%; та у межах від 0,01% до 0,05%. порівняно з відсутністю лікування. Наприклад, Введення композицій може здійснюватись "ефективною кількістю" гібридного білка GLP-1-Fc будь-яким шляхом, ефективність якого відома педля лікування діабету є кількість, що забезпечить ресічному лікарю. Одним із таких способів є ввепідвищену можливість регулювання концентрації дення периферичним парентеральним шляхом. глюкози крові, аніж за відсутності лікування, насПід парентеральним введенням у медичній літералідком чого буде затримка появи діабетичних турі традиційно розуміється ін'єкція дозованої ліускладнень, наприклад, ретинопатії, невропатії карської форми до організму за допомогою стериабо хвороби нирок. "Ефективною кількістю" гібрильного шприца або якогось іншого медичного дного білка GLP-1-Fc для запобігання діабету є пристрою, наприклад, насоса для вливання. Петака кількість, яка уповільнить, порівняно з відсутриферичні парентеральні шляхи можуть включати ністю лікування, появу підвищених рівнів глюкози внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, підшкіркрові, що потребує лікування антигіпоглікемічними ний і внутрішньоочеревинний шляхи введення. лікарськими засобами, наприклад, сульфонілсечоКомпозиції можуть також бути придатними для виною, тіазолідиндіонами, інсуліном та/або бісгуавведення пероральним, ректальним, назальним нідинами. шляхами або через нижні відділи дихальних шляДоза гібридного білка, ефективна для нормахів, які є непарентеральними шляхами. З цих нелізації рівня глюкози крові пацієнта, буде залежати парентеральних шляхів перевагу віддають ввевід ряду факторів, які включають, без обмеження, денню через нижні відділи дихальних шляхів і стать суб'єкта, масу і вік, тяжкість нездатності ревведенню пероральним шляхом. гулювання глюкози крові, шлях введення і біодосКомпозиції, до складу яких входить гібридний тупність, фармакокшетичний профіль гібридного білок GLP-1-Fc, можуть застосовуватись для лікубілка, активність і склад композиції. Дози можуть вання різноманітних захворювань і станів. Гібридні бути у межах від 0,01мг/кг до 1мг/кг маси тіла, за білки проявляють свої біологічні ефекти, головним варіантом, якому віддається перевага, у межах від чином, шляхом дії на рецептор, який у цьому описі 0,05мг/кг до 0,5мг/кг маси тіла. згадується як "рецептор GLP-1". Суб'єктів із хвоЗа варіантом, якому віддається перевага, гібробами та/або станами, що позитивно реагують на ридні білки повинні вводитись один раз на два стимуляцію рецептора GLP-1 або на введення тижні або один раз на тиждень. У залежності від сполук GLP-1, можна, таким чином, лікувати гібрихвороби, яку лікують, може виникнути необхідність дними білками GLP-1. Про цих суб'єктів кажуть, що частішого введення гібридного білка, наприклад, вони "потребують лікування сполуками GLP-1" або від двох до трьох разів на тиждень. "потребують стимулювання рецептора GLP-1". До Цей винахід далі буде описуватись як необїх числа належать суб'єкти з шсулінонезалежним межувальний приклад із посиланням на наведені діабетом, інсулінозалежним діабетом, інсультом нижче Приклади. [див. WO 00/16797], інфарктом міокарда [див. WO Приклади 98/08531], ожирінням [див. WO 98/19698], змінами In vitro аналіз активації рецептора GLP-1 катаболізму після хірургічного втручання [див. паКлітини НЕК-293, що експресують рецептор тент США №6,006,753], функціональною диспепсілюдського GLP-1, висівають (20000єю і синдромом подразненої товстої кишки [див. 40000клітин/лунку/100мкл модифікованого за споWO 99/64060]. До їх числа належать також суб'єксобом Дульбекко середовища Ігла (DMEM) з 10% ти, що потребують профілактичного лікування сироватки зародка великої рогатої худоби (FBS)) сполукою GLP-1, наприклад, суб'єкти з ризиком на сенсибілізований полі-d-лізином 96-лунковий розвитку інсулінонезалежного діабету [див. WO планшет чорного кольору з прозорим дном (із за00/07617]. Суб'єктами з ризиком розвитку інсуліностосуванням системи CRE-BLAM). Через день піснезалежного діабету є суб'єкти з порушеною толеля висівання середовище видаляють і додають рантністю до глюкози або порушеними рівнями 80мкл безплазмового DMEM. На третій день після глюкози крові натщесерце, суб'єкти, маса тіла яких висівання до кожної лунки додають 20мкл безплана приблизно 25% перевищує нормальну масу змового DMEM з 0,5% BSA (сироватковий альбутіла для росту та будови тіла цього суб'єкта, сумін великої рогатої худоби), що містить різні конб'єкти із частковою панкреатектомією, суб'єкти, центрації різних гібридних білків GLP-1-Fc, для один або обидва батьки яких страждають на інсуодержання дозозалежної кривої. Для одержання лінонезалежний діабет, суб'єкти з діабетом вагітдозозалежної кривої, за допомогою якої можуть них і суб'єкти, що хворіли на гострий або хронічний бути визначені значення ЕС50, застосовували в панкреатит. загальній кількості чотирнадцять розведень, що Ефективною кількістю гібридних білків GLP-1містили від 3нМ до 30нМ гібридного білка GLP-1Fc, опис яких наведено, є кількість, що забезпечує Fc. Після 5год інкубування з гібридним білком доодержання необхідного терапевтичного та/або дають 20мкл b-лактамазного субстрату (CCF2/AM, профілактичного ефекту без спричинення неPanVera LLC) і під час 1год інкубування на цитофприйнятних побічних ефектів у разі введення сулуорографі визначають рівень флуоресценції. Цей б'єкту, що потребує стимуляції рецептора -GLP-1. Словосполучення "необхідний терапевтичний 15 87009 16 аналіз додатково описано у роботі [Злокарнік вміщують до люмінометра Tri-lux і визначають сві(Zlokarnik) та інші (1998), Science, 278: 84-88]. тловіддачу, що є наслідком експресії люциферази. In vitro аналіз активації рецептора GLP-1 Вплив Твін. NaCl та рН на стійкість Gly8-Glu22Клітини НЕК-293, що стабільно експресують GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A): рецептор людського GLP-1, висівають Визначають вплив твін-20 (±0,01%), NaCl (30000клітин/лунку/80мкл модифікованого за спо(0мМ, 150мМ та 500мМ) та рН (6,5, 7,5 та 8,5) на собом Дульбекко середовища Ігла (DMEM) F12 із хімічну стійкість Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 низьким вмістом сироватки) на 96-лункові планше(S228P, F234A, L235A) (0,5мг/мл). Повний набір ти (із застосуванням системи CRE-люцифераза). цих умов одержують шляхом змішування відповідЧерез день після висівання 20мкл аліквоти експеного 2´нерозбавленого буфера з розчином риментального білка, розчинені у 0,5% BSA, змі(1мг/мл) Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, шують і інкубують із клітинами впродовж 5год. Для F234A, L235A), розчиненим у 20мМ фосфаті, 20мМ одержання дозозалежної кривої, за допомогою Трис, рН 7,5. Наприкінці одержані розчини зі згаякої можуть бути визначені значення ЕС50, перед даними характеристиками фільтрують через доданням до клітин одержали в загальній кількості 0,2мкм фільтри Мillех-GV у хроматографічні пробі12 розведень (5´ концентрація), що містили від рки та інкубують при температурі 37°С. Через пев3пМ до 3нМ кожного експериментального білка. ні періоди часу відбирають зразки, які аналізують Після інкубування безпосередньо до кожного засобами гель-хроматографії за розміром молепланшета додають 100мкл люциферази з обережкул, хроматографії з оберненою фазою та гельним перемішуванням впродовж 2хв. Планшети електрофорезу. Ідентифікування компонентів композиції для зразків A-R (всі містять (0,5мг/мл) Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), 20мМ фосфат та 20мМ Трис) Код композиції А В С D Ε F G Η I J К L Μ Ν О Ρ Q R Твін-20 (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 NaCl (мМ) 0 0 0 150 150 150 500 500 500 0 0 0 150 150 150 500 500 500 РН 6,5 7,5 8,5 6,5 7,5 8,5 6,5 7,5 8,5 6,5 7,5 8,5 6,5 7,5 8,5 6,5 7,5 8,5 Відсоткова зміна головного піка при температурі 37°С для розчинів GLP-Fc різного складу за результатами контролювання засобами гель-хроматографії за розміром молекул Код композиції ® Час (тижні/37°С) 0 0,57 1 2 3 Код композиції ® Час (тижні/37°С) 0 0,57 1 2 3 А В С D Ε F 98,96 98,87 98,36 97,9 97,77 98,96 98,73 98,63 98,39 98,39 98,96 98,95 98,69 98,53 98,74 98,96 98,89 98,39 98,09 98,01 98,96 98,89 98,4 98,2 97,94 98,96 98,58 98,48 98,25 98,32 G Η I J K L 98,96 98,85 98,53 98,27 98,19 98,96 98,69 98,96 98,37 98,5 98,28 98,22 98,96 98,67 98,13 97,54 97,42 98,96 98,42 98,2 97,81 97,74 98,96 98,63 98,33 98,13 98,15 98,02 97,96 17 Код композиції ® Час (тижні/37°С) 0 0,57 1 2 3 87009 18 Μ N О Ρ Q R 98,96 98,25 97,78 97,28 96,94 98,96 98,24 97,85 97,48 97,18 98,96 97,91 98 97,66 97,52 98,96 98,15 97,88 97,73 97,49 98,96 98,15 97,8 97,81 97,53 98,96 97,79 97,6 97,47 97,22 Відсоткова зміна головного піка при температурі 37°С для розчинів GLP-Fc різного складу за результатами контролювання за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою Код композиції ® Час (тижні/37°С) 0 0,57 1 2 3 Код композиції ® Час (тижні/37°С) 0 0,57 1 2 3 Код композиції ® Час (тижні/37°С) 0 0,57 1 2 А В С D Έ F 78,2 77,3 70,2 67,2 65,2 78,2 77,1 69,4 66,1 62,6 78,2 75,8 69,2 62 57,3 78,2 77,9 73,4 73,3 66 78,2 75,3 73,6 67,5 61,2 78,2 76,4 69,1 63,6 58,8 G Η І J K L 78,2 77,4 72,6 73,2 64,8 78,2 76,9 73,3 66,6 62,4 78,2 75,8 72,5 65,8 58,9 78,2 74,9 69,5 65,4 63,6 78,2 75,3 69 63,9 60,4 78,2 75,4 70,7 61,96 57,7 Μ Ν O Ρ Q R 78,2 76,2 71,4 67,5 78,2 75,9 72,3 63,5 78,2 73,9 69,8 59,4 78,2 75 75,7 65,2 78,2 72,9 71,2 68,5 78,2 75,3 71 61,4 Лінійна швидкість розкладу (відсоткова зміна головного піка/тиждень у разі інкубації при температурі 37°С) за результатами контролювання засобами гель-хроматографії за розміром молекул або високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою Код композиції А В С D Ε F G Η I J К L Μ Ν О Ρ Q R Відсоткова зміна головного піка/тиждень у разі інкубації при температурі 37°С Дані гель-хроматографії за розміром моле- Дані високоефективної рідинної хроматогкул рафії з оберненою фазою -0,44 -9,8 -0,19 -10,8 -0,1 -11,2 -0,35 -5,8 -0,36 -5,9 -0,2 -11,2 -0,28 -6,9 -0,36 -6,1 -0,2 -7,2 -0,55 -10,9 -0,39 -11,5 -0,27 -9,4 -0,65 -8,5 -0,56 -7,4 -0,4 -10,6 -0,42 -3,4 -0,4 -9,2 -0,47 -9,1 Спосіб із застосуванням гель-хроматографії за розміром молекул Зразки вводять до колонки Tosohas TSK3000SW-XL (5мкм, 7,8мм´300мм), попередньо зрівно 19 87009 20 важеної 1´PBS (забуферений фосфатом фізіоло50 25 гічний розчин), рН 7,4 плюс протоковий буфер, 65 25 10% (у об'ємному відношенні) розчин ацетонітрилу (протоковий буфер А). Ізократичний розчин Спосіб із застосуванням гель-електрофорезу протокового буфера пропускають зі швидкістю Зразки, які відбирали у певні часові точки, 0,5мл/хв; білок виявили при 214нм. розбавляли 4´буфером для зразків NuPage LDS Спосіб із застосуванням високоефективної (1´кінцева концентрація) і нагрівали при темперідинної хроматографії з оберненою фазою ратурі 95°С впродовж 5хв. Охолоджені зразки Зразки вводять до колонки Zorbax 300SB-C8 наносили на 4-12% біс-трис гель NuPage. Елект(4,6мм´50мм), попередньо зрівноваженої проторофорез здійснюють із постійною напругою ковим буфером, 0,1% (у об'ємному відношенні) (200В) впродовж 50-60хв у буфері MOPS (2-(Nрозчином TFA (трифтороцтова кислота) (протоморфоліно)-пропансульфонова кислота) із забаковий буфер А). Протоковий буфер В містить рвлюванням SimplyBlue SafeStain. 0,085% розчин TFA у ацетонітрилі (у об'ємному Стійкість Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 відношенні). Пропускають наведені нижче градіє(S228P, F234A, L235A) та вплив Твін-20 нти; матеріал було виявлено при 214нм. Стійкість Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) (0,3мг/мл) у 1´PBS при рН Час % протокового буфера В 7,5 оцінюють шляхом контролювання посилення 0 30 помутніння при 350нм за прискорених стресових 5 30 умов (перемішування гідрофобним стрижнем для перемішування у PBS при температурі 37°С). 35 45 40 90 45 90 Вплив Твін-20 на зниження ступеня агрегації Домішка, що підвищує розчинність Жодної 0,001% розчин Твін-20 0,005% розчин Твін-20 0,01% розчин Твін-20 0,02% розчин Твін-20 0,05% розчин Твін-20 Час до посилення помутніння ³0,05 (оптична густина) при 350нм 65год >65год >65год Розчинність Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) як функція рН розчину Розчинність Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) як функцію рН визначають шляхом розведення нерозбавленого розчину різними забуференими розчинами при різних значеннях рН з подальшим зрівноважуванням розчину, видаленням будь-якого осадженого матеріалу за допомогою центрифугування, з подальшим аналізуванням супернатанту для визначенням концентрації залишкового розчинного білка. Нерозбавлений розчин білка, заморожений у PBS, діалізують проти води приблизно при рН 8. Після діалізу нерозбавлений розчин білка фільтрували за допомогою 0,22мкм фільтру MillexGV і концентрували до ~12мг/мл за допомогою центрифуги Ultrafree (4мл, смуга пропускання молекулярної маси 5000Да при 7000´g). Цей концентрований розчин розбавляють 1:1 2´нерозбавленими буферними розчинами (кінцевий об'єм 50мкл у 0,5мл пробірках фірми Eppendorf) і зрівноважують впродовж 15-30хв при кімнатній температурі. Розчин центрифугують (14000´g впродовж 5хв) для осадження будьякого нерозчинного матеріалу. 10мкл супернатанту відбирають і об'єднують з 40мкл води (рН 8). Для кожного зразка здійснюють два повтори. Концентрацію розчинного GLP-Fc визначають за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою за стандартною кривою. Вплив характеристик розчину на розчинність Характеристика композиції 1 20мМ розчин цитрату, рН 3 20мМ розчин цитрату, рН 4 20мМ розчин цитрату, рН 5 20мМ розчин цитрату, рН 6 20мМ розчин фосфату, рН 6 20мМ розчин фосфату, рН 7 20мМ розчин фосфату, рН 7 (повтор №1) Концентрація білка (мг/мл) Середнє квадратичне відСереднє хилення (n=2) 2 3 5,8 0,4 4,1 0,3 4,5 0,0 5,5 0,0 5,8 0,1 5,8 0,4 6,0 0,1 21 87009 22 Вплив характеристик розчину на розчинність 1 20мМ розчин фосфату, рН 7 (повтор №2) 20мМ розчин фосфату, рН 8 20мМ розчин трис, рН 8 20мМ розчин цитрату, 15 мМ розчин NaCl, рН 3 20мМ розчин цитрату, 150мМ розчин NaCl, рН 4 20мМ розчин цитрату, 150мМ розчин NaCl, рН 5 20мМ розчин цитрату, 150мМ розчин NaCl, рН 6 20мМ розчин фосфату, 150мМ розчин NaCl, рН 7 20мМ розчин трис, 150мМ розчин NaCl, рН 8 20мМ розчин цитрату, розчин (3мг/мл) м-крезолу, рН 3 20мМ розчин цитрату, розчин (3мг/мл) м-крезолу, рН 4 20мМ розчин цитрату, розчин (3мг/мл) м-крезолу, рН 5 20мМ розчин цитрату, розчин (3мг/мл) м-крезолу, рН 6 20мМ розчин фосфату, розчин (3мг/мл) м-крезолу, рН 7 20мМ розчин трис, розчин (3мг/мл) м-крезолу, рН 8 Вплив рН розчину на стійкість за результатами контролювання за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою Розчин Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) діалізують проти води, рН якої доведено до рівня приблизно рН 8. Після діалізу цей нерозбавлений розчин білка фільтрують (0,2мкм фільтр Мillех GV) і концентрують до >2мг/мл за допомогою центрифуга Ultrafree із промиванням. Кінцеву концентрацію білка визначають за допомогою УФ-спектрофотометра, і одержують різні композиції шляхом розведення 2´нерозбавлених буферних розчинів до їх з підтримкою кінцевої концентрації білка на рівні 1мг/мл. Перевіряють рН розчину і, у разі необхідності, регулюють. Наприкінці ці розчини фільтрують (0,22мкм фільтр Millex-GV, 4мм) у стерилізовані хроматографічні пробірки місткістю 1,8мл із 2 5,8 5,5 6,1 0,4 2,8 6,0 5,3 5,9 6,0 5,8 1,0 1,3 5,5 6,2 6,0 3 0,0 0,0 0,1 0,0 0,1 0,0 0,1 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0 0,1 0,1 0,0 кришками з нарізкою. Пробірки зберігають при температурі 37°С, через певні періоди часу їх вміст об'єднують і аналізують за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою, гель-хроматографії за розміром молекул та гель-електрофорезу. Представлені відсоткові зміни головного піка за результатами контролювання засобами гель-хроматографії за розміром молекул та високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою. Наводиться зведена до табличної форми лінійна швидкість розкладу, яка визначалась шляхом приведення кривої часу інкубації при температурі 37°С у відповідність із чистотою головного піка для даних, які були одержані засобами гель-хроматографії за розміром молекул та високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою. Ідентифікування параметрів композиції Код композиції 3С 4С 5С 6С 6CN 6СС 6Р 7P-R1 7P-R2 7P-R3 7PN 7РС 8Р 8Т РН 3,0 4,0 5,0 6,0 6,0 6,0 6,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 8,0 8,0 Буфер (10мМ) Цитрат Цитрат Цитрат Цитрат Цитрат Цитрат Фосфат Фосфат Фосфат Фосфат Фосфат Фосфат Фосфат Трис Домішка Жодної Жодної Жодної Жодної 150мМ розчин Nad Розчин (3мг/мл) м-крезолу Жодної Жодної, повтор №1 Жодної, повтор №2 Жодної, повтор №3 150мМ розчин NaCl Розчин (3мг/мл) м-крезолу Жодної Жодної 23 87009 24 Відсоткова зміна головного піка у разі зберігання при температурі 37°С. Дані аналізовано за допомогою гель-хроматографії за розміром молекул Час (тижні) 0,43 1 2,43 3,43 3C 43,81 40,13 36,26 35,85 4С 0 0 0 0 5С 94,27 93,14 91,72 91,27 6С 95,74 94,73 94,22 93,84 6CN 94,37 92,98 92,29 91,51 6СС 94,45 92,79 90,77 89,44 6Р 94,7 93,85 93,1 92,51 Час (тижні) 0,43 1 2,43 3,43 7P-R1 95,98 95,22 94,71 94,05 7P-R2 95,95 95,03 94,5 93,65 7P-R3 96,02 95,22 94,84 94,09 7PN 93,93 92,95 91,76 91,24 7РС 95,86 95,18 94,76 94,02 8Р 95,89 95,26 94,94 94,67 8Т 97,08 96,92 97,05 97,02 Відсоткова зміна головного піка у разі зберігання при температурі 37°С. Дані аналізовано за допомогою хроматографії з оберненою фазою Час (тижні) 0,43 1 2,43 3,43 3С 34,04 26,64 33,09 28,17 4С 39,35 39,48 40,36 28,51 5С 51,93 49,85 44,61 36,78 6С 57,96 58,49 52,05 48,4 6CN 57,29 53,32 51,24 50,43 6СС 58,42 55,87 51,34 50,42 6Р -55,76 Час (тижні) 0,43 1 2,43 3,43 7P-R1 55,74 53,72 45,7 44,16 7P-R2 55,36 54 47 42 7P-R3 55,01 53,22 45,97 43,22 7PN 56,09 52,4 47,07 42,62 7РС 58,67 55,96 51,49 49,74 8Р 49,14 46,84 38,7 34,25 8Т 54,44 54,48 51,22 47,89 49,44 49,84 Швидкість розкладу при температурі 37°С за результатами контролювання за допомогою гельхроматографії за розміром молекул або високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою Код композиції 3С 4С 5С 6С 6Р 7P-R1 7P-R2 7P-R3 8Р 8Т 6CN 6СС 7PN 7РС Відсоткова зміна головного піка/тиждень у разі інкубування при температурі 37°С Дані гель-хроматографії за розміром моле- Дані високоефективної рідинної хроматогкул рафії з оберненою фазою -2,6 -0,71 Осаджений -3,0 -0,98 -4,9 -0,57 -3,5 -0,68 -2,1 -0,58 -4,1 -0,69 -4,6 -0,57 -4,1 -0,36 -5,1 0,003 -2,2 -0,85 -2,1 -1,6 -2,7 -0,87 -4,3 -0,55 -3,0 25 87009 26 27 87009 28 29 87009 30 31 87009 32 33 87009 34 35 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 87009 Підписне 36 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601