Очищені білки, послідовності рекомбінантної днк і спосіб приготування продуктів, що не містять кофеїну

Дана заявка стосується очищених білків, послідовностей рекомбінантної ДНК, хазяйських клітин, трансформованих шляхом їх використання, і способів одержання напоїв і продуктів харчування, які не містять кофеїну. Більш детально, дана заявка стосується очищених білків і послідовностей рекомбінантної ДНК, які інгібують експресію кофеїну в рослинах кави та їх плодах. Цей винахід дає стабільні лінії рослин кави, які не містять кофеїну, плоди яких після обсмажування та перемелювання можуть використовуватися для приготування кави, яка не містить кофеїну. Передбачається, що даний винахід можна використовувати для інгібування синтезу кофеїну у чаї (Camellia sinensis) та колі (Cola acuminanta), а також родинних алкалоїдів у шоколаді (Theobroma cacao). Каву готують з обсмажених і перемелених зерен рослин роду Coffea, як правило, виду арабіка (С. arabica). Рослини кави продукують алкалоїд кофеїн, який присутній в їх висушених плодах, кавових зернах. У зв'язку з тим, що багато споживачів кави віддають перевагу каві без кофеїну, були розроблені способи видалення кофеїну з кавових зерен. Усі ці способи приводять до видалення із зерен, крім кофеїну, й інших речовин, що приводить до погіршення смаку кави, приготовленої із оброблених такими способами кавових зерен. Хоча відомі декілька сортів рослин кави, що зустрічаються у природі і не містять кофеїну, і близькі до них види (Mascarocoffea spp. і Coffea bengalensis), вони не мають комерційного значення. (Charrier і Berthaud, "Variation Of Caffeine Content In The Coffea Genus", Cafe' Cacao The', 14:251-264 (1975)). Отже, існує необхідність у способі одержання кавових зерен, які не містять кофеїну, у результаті якого із зерен не будуть видалятися інші речовини, крім кофеїну. Кофеїн - це природний пуриновий алкалоїд, який продукується у числі інших рослинами кави й чаю. Вважається, що синтез кофеїну захищає рослини від шкідників. Рослини кави синтезують кофеїн із нуклеозиду ксантозину шляхом чотирьох послідовних реакцій, показаних на Фігурі 1. Див. Suzuki, Т., Ashihara, Η. і Waller, G.R., Phytochemistry 31: 2575 (1992). Перша стадія синтезу - це метилування нуклеозиду ксантозину S-аденозилметіоніном, що каталізується ферментом ксантозин-N7метилтрансферазою (ХМТ). Продукт реакції, 7-метилксантозин, гідролізується до 7- метилксантину (видаляється рибоза), і піддається подальшому метилуванню з одержанням теоброміну та кофеїну. Очікується, що перериванням цієї послідовності реакцій можна запобігти синтезу кофеїну. Отже, стратегія вибіркового видалення кофеїну з кавових зерен полягає в запобіганні синтезу особливих ферментів у ході біосинтезу кофеїну. В одній реалізації цей винахід стосується генетичної зміни рослин кави з метою усунення синтезу ХМТ. У кращій реалізації синтез ХМТ пригнічується в результаті трансформування рослин кави за допомогою послідовності ДНК, яка кодує транскрипцію матричної РНК (мРНК), що є антисмисловою до мРНК, яка кодує експресію ХМТ. Винахід можна узагальнити для одержання напоїв і продуктів харчування, що не містять кофеїну, які включають чай, какао та інші напої й продукти на основі шоколаду. Очищені білки, послідовності ДНК, що кодують експресію, і молекули рекомбінантної ДНК, включаючи трансформовані при їх використанні хазяйські клітини для трансформування рослин кави з метою пригнічення експресію кофеїну складають суть даного винаходу. Послідовності ДНК і молекули рекомбінантної ДНК характеризуються тим, що вони кодують експресію ферменту ксантозин-N7метилтрансферази (ХМТ), який каталізує першу стадію синтезу кофеїну в рослинах кави. Забезпечується основна послідовність ДНК і передбачена послідовність амінокислот ХМТ. Рослини кави трансформуються за допомогою молекул ДНК, що кодують транскрипцію мРНК, яка є антисмисловою до мРНК, що кодує експресію принаймні одного ферменту у процесі біосинтезу кофеїну. Антисмислова РНК зв'язується з ХМТ мРНК, інактивуючи, таким чином, мРНК, що кодує першу стадію біосинтезу кофеїну. У результаті цього трансформовані рослини кави не здатні синтезувати кофеїн, причому на інші сторони їх метаболізму це не впливає. Фігура 1 є схемою процесу біосинтезу кофеїну у каві арабіка (Coffea arabica). Фігура 2 є фотографією поліакриламідного гелю після електрофорезу очищеної ксантозин-N7 метилтрансферази у присутності додецилсульфату натрію (SDS PAGE), забарвленого сріблом. Фігура 3 представляє собою хроматограмму елюювання триптичних фрагментів очищеної ксантозинN7-метилтрансферази після розділення за допомогою ВЕРХ. Фігура 4 представляє собою олігонуклеотидні праймери, які використовуються для скринінга кДНК із бібліотеки кДНК, що кодує ксантозин-N7 -метилтрансферазу. Фігура 5 представляє собою основну послідовність кДНК, що кодує ксантозин-N7 -метилтрансферазу. Фігура 6 представляє собою передбачену послідовність амінокислот ксантозин-N7-метилтрансферази. Для кращого розуміння цього винаходу пропонується наступний докладний опис, у якому використовуються терміни: Нуклеотид - Мономерна одиниця ДНК або РНК, що складається з вуглеводу (пентози), залишку фосфорної кислоти та азотистої гетероциклічної основи. Основа зв'язана з вуглеводною частиною через глікозидний атом вуглецю (1' атом вуглецю пентози), ця комбінація основи й вуглеводу називається нуклеозидом. Основа характеризує нуклеотид. Чотири основи ДНК - це аденін ("А"), гуанін ("G"), цитозин ("С") і тимін ("Т"). Чотири основи РНК - це А, С, G і урацил ("U"). Послідовність ДНК - Лінійний ланцюг нуклеотидів, зв'язаних один з одним фосфодіефірними зв'язками між 3' і 5' атомами вуглецю сусідніх пентоз. Кодон - Послідовність ДНК із трьох нуклеотидів (триплет), що кодує через мРНК амінокислоту, сигнал початку трансляції або сигнал термінації трансляції. Наприклад, триплети нуклеотидів ТТА, TTG, СТТ, СТС, СТА і СТ кодують амінокислоту лейцин (Leu), TAG, TAA і TGA є сигналами термінації трансляції, ATG є сигналом початку трансляції і також кодує амінокислоту метіонін (Met). Поліпептид - Лінійна послідовність амінокислот, зв'язаних між собою пептидними зв'язками між аміно- і карбоксильними групами сусідніх амінокислот. Геном - повна ДНК клітини або вірусу. Він включає структурний ген, що кодує поліпептиди речовини, а також сайти промотору, початку та термінації транскрипції й трансляції. Ген - Послідовність ДНК, що кодує через її матричну РНК (мРНК) послідовність амінокислот, характерних для специфічного поліпептиду. Транскрипція - Процес одержання мРНК із гену або послідовності ДНК. Трансляція - Процес одержання поліпептиду з мРНК. Експресія - Процес одержання поліпептиду при використанні гену, або послідовності ДНК. Поєднання транскрипції й трансляції. Плазміда - нехромосомна дволанцюгова послідовність ДНК, що включає інтактний "реплікон", такий, що плазміда реплікується у клітині-хазяїні. Коли плазміду вводять в одноклітинний організм, характеристики цього організму можуть змінитися або бути трансформовані в результаті введення ДНК плазміди. Наприклад, плазміда, що несе ген стійкості до тетрацикліну (TETR), трансформує клітину, раніше чутливу до тетрацикліну, у клітину, стійку до нього. Клітина, трансформована плазмідою, називається "трансформантом". Фаг або Бактеріофаг - бактеріальні віруси, які, здебільшого, складаються з послідовностей ДНК, що розміщені у білковій оболонці ("капсид"). Клонуючий вектор - Плазміда, фаг ДНК, косміда, або інша послідовність ДНК, здатна реплікуватися у клітині-хазяїні, що характеризуються одним або невеликою кількістю сайтів впізнання ендонуклеази, у яких такі послідовності ДНК можуть бути розрізані визначеним способом без втрати необхідної біологічної функції ДНК, наприклад, реплікації, синтезу білків оболонок або втрати промотору, або сайтів зв'язування, і які містять маркер, що підходить для ідентифікації трансформованих клітин, наприклад, стійкість до тетрацикліну або ампіциліну. Клонуючий вектор часто називають вектором. Клонування - Процес одержання популяції організмів або послідовностей ДНК, узятих від одного з таких організмів, або послідовність безстатевої репродукції. Молекула рекомбінантної ДНК або гібридна ДНК - молекула, що складається із сегментів ДНК від різних геномів, які з'єднані кінець-у-кінець поза живою клітиною і здатні підтримуватися живими клітинами. кДНК - Ланцюг ДНК, комплементарний мРНК, що кодує специфічний поліпептид. Хоча стратегія одержання кави, яка не містить кофеїну, може бути поширена на інші ферменти у процесі біосинтезу кофеїну у каві й інших рослинах, що виробляють кофеїн, у даній кращій реалізації винаходу пригнічують експресію першого ферменту у процесі біосинтезу кофеїну - ксантозин-N7метилтрансферазу (ХМТ). Хоча роль ХМТ у синтезі кофеїну була показана методами радіоактивних міток, дотепер цей фермент не був очищений і не була визначена його амінокислотна послідовність. Тому цей винахід включає очищену ХМТ. Також винахід включає амінокислотну послідовність триптичних фрагментів, виділених з очищеної ХМТ. Були синтезовані кДНК-зонди, що базуються на фраґментах послідовностей амінокислот, отриманих із зразків очищеного ферменту, і фраґмент гену був ампліфікований, із використанням техніки ПЛР. ПЛРпродукти використовувалися для скринінга бібліотеки кДНК, синтезованої з мРНК молодих листків, для того, щоб ідентифікувати транскрипти, що кодують ХМТ. Позитивні транскрипти з'єднувалися в послідовність і було отримано близько 90% гену, який кодує ХМТ. ДНК, яка кодує експресію ХМТ, вводили у трансформуючий вектор рВІ-121, який включав ген стійкості до канаміцину. Успішне введення цього вектора у клітини рослин буде ппродемонстроване появою стійкості до антибіотиків. Такі конструкції використовували для трансформування соматичних ембріонів кави у тканинній культурі. Потім із трансформованих ембріонів вирощували нові рослини кави, які не виробляли кофеїну. Натуральну каву, що не містить кофеїну, готували з обсмажених перемелених плодів цих нових рослин. Більш конкретно, свіжу тканину листів із молодих листків кави арабіка (С. arabica) вимочували та виділяли з неї білок. Очищені на колонці екстракти випробували на ферментну активність шляхом контролю метилування ксантозину, використовуючи як субстрат мічений С 14 S-аденозилметіонін. Продукт реакції ідентифікували як 7-метилксантозин шляхом порівняння міграції міченого продукту реакції з міграцією 3метилксантину, 7-метилксантину, 8-метилксантину, 7-метилксантозину, ксантину й ксантозину в кожній з чотирьох хроматографічних систем. Чистота білкових ізолятів визначалася за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (SDS PAGE) і двомірного електрофорезу в гелі. Забарвлення сріблом двомірних SDS PAGE гелей показало присутність дублету з ферментною активністю ХМТ, із молекулярною вагою 36-37 кілодальтонів (кД), як показано на Фігурі 2. Потім кожний білок відокремлювали за допомогою ізоелектричного фокусування. Отримані дані показали наявність ізоферментів ХМТ, що можливо було результатом посттрансляційної модифікації білка, або результатом присутності родини генів, які кодують ферменти ХМТ. Дублет, що спостерігається у SDS PAGE гелях, використовували для секвенування білка. Очищену ХМТ піддавали частковому триптичному ферментативному розщепленню для одержання фраґментів для подальшого аналізу; за допомогою ВЕРХ одержали три піки, що розрізняються. Секвенування проводили в лабораторії структури білків Університету Каліфорнії (Protein Structure Laboratory of the University of California, Davis) із використанням автоматичної деградації Едмана (Edman, P. And Begg, G., Eur.J. Biochem. 1:80). Були отримані дві унікальні послідовності, що використовувалися для конструкції праймерів для синтезу зондів. РНК виділяли з листків кави. Потім очищали мРНК, що містить полі(А+)-послідовності. Одержували бібліотеку кДНК із полі(А+) мРНК, використовуючи зворотну транскриптазу. Одержували дволанцюгову ДНК, використовуючи полімеразу І ДНК, і виділяли осадженням. кДНК фракціонували та вводили у фаг для ампліфікації. Проводили скринінг бібліотеки кДНК за допомогою синтезованого ПЛР зонду, отриманого з використанням праймерів, що базуються на послідовності ДНК, передбаченої з амінокислотної послідовності очищеної ХМТ. Була ідентифікована кДНК, яка продукує клон, що містить усі послідовності, які кодують ХМТ. кДНК, що відповідає гену, який кодує ХМТ, використовується для трансформування ембріональних рослин кави. Плазміда рВІ-121 використовується як вектор для трансформації. Послідовності, які відповідають ДНК, яка кодує експресію ХМТ, вводили у плазміду у інвертованій орієнтації поруч із 35S промотором вірусу мозаїки цвітної капусти. Отримана в результаті транскрипції мРНК, буде комплементарною мРНК, що кодує амінокислотну послідовність ХМТ. Повні конструкції ампліфікуються в бактеріальних клітинах-хазяях. Хазяйські клітини руйнуються й ампліфікований вектор приєднується до колоїдних частинок золота. Частинки золота з приєднаними векторами вбудовували у протопласти рослин кави шляхом обробки клітин цими частинками з великою швидкістю, як описано в патентній публікації США 5,107,065. Успішно трансформовані рослини ідентифікували за стійкістю до антибіотиків. Трансформовані рослини не виробляли кофеїн. ПРИКЛАДИ. А. Очищення ксантозин-N7 -метилтрансферази з листків кави арабіка (С. arabica L. cv Guatemalan). Тканину молодих листків, довжиною менше 5мм (еквівалентних стадії В3 (Frischknecht, P.M., UlmerDufek, J. And Baumann, T.W. (1986) Phvtochemistrv 25:613) збирали з дерев, вирощених на дослідницькій станції (Waimanalo) Гавайського Університету, Оаху, Гавайї. Листя негайно поміщали в рідкий азот і зберігали до використання при температурі -70°С. Усі необхідні процедури проводили при температурі 4°С, якщо не буде вказано інше. Тканину листя розм'якшували уступці під рідким азотом і після заморожування поміщали у побутову кавомолку і перемелювали протягом 30 секунд із невеликим шматочком льоду. Здрібнену тканину листків поміщали у склянку, що містить 1,5 літра крижаного 80%-ного ацетону, 5мМ тіосечовини і 12,5мМ Р-меркаптоетанолу. Після перемішування на магнітній мішалці протягом 45 хвилин тканину відфільтровували у вакуумі на воронці Бюхнера через фільтрувальний папір Whatman №1. Потім тканину промивали 2,5 літрами крижаного 80%-ного ацетону, що містить тіосечовину і β-меркаптоетанол, як описано вище, сушили на повітрі протягом 20 хвилин і ліофілізували протягом 48 годин. Отриманий порошок змішували в міксері з 400мл екстракційного буфера (ЕБ) (0,1 Μ PIPES [pH 7,0], 0,5мМ Na2EDTA, 0,5мМ Na2EGTA, 5% аскорбінової кислоти, 5мМ дитіоетанолу [DTT], 5мМ тіосечовини, 12мМ L-цистеїну НСІ, 1% поліетиленгліколю (PEG) 20,000, 0,1мМ фенілметилсульфонілфториду [PMSF], і 20г полівінілполіпіролідону [PVPP]). Суміш перемішували протягом 10 хвилин із середньою швидкістю, розливали по центрифужним пробіркам на 250мл і центрифугували зі швидкістю 23,000об/хв. на центрифузі GSA (DuPont-Sorvall). До 350мл отриманого супернатанту протягом 30 хвилин при перемішуванні поступово додавали 79,86г сульфату амонію (AS) до одержання 40%-ного розчину, причому резервуар поміщали у баню з льодом. Потім суміш знову розливали по центрифужних пробіркам на 250мл і центрифугували протягом 30 хвилин із швидкістю 23,000об/хв., як описано вище. 350мл отриманого супернатанту завантажували в хроматографічну колонку Масrо-Рrер (Віо-Rad) об'ємом 40мл із метил-гідрофобною взаємодією зі швидкістю 2,5мл/хв. Усі фракції перевіряли на білок шляхом абсорбції при 280нм. Колонку спочатку врівноважували буфером, що містить 1,7 Μ сульфату амонію, 20мМ біс-Трис-пропану, (рН 6,8) і 5мМ DTT до встановлення базової лінії біля нуля. Потім через колонку пропускали буфер, що містить 10мМ гідроксиметиламінометану (Трису) (рН 7,0), 5мМ DTT, 1мМ МgСІ 2. Перші 15мл елюату відкидали, а 200мл елюату, що залишилися, пропускали самотечією через колонку об'ємом 100мл, заповнену афінним гелем Affi-Gel Blue (100-200, Bio-Rad), із матрицею якого ковалентно зв'язаний барвник Cibacron blue F3GA. Гель врівноважували буфером, що містить 10мМ Трису (рН 7,0), 5мМ DTT, 1мМ МgСІ 2 доти, поки базова лінія не встановлювалася біля нуля. Потім адсорбовані білки елюювали буфером, що містить 10мМ Трису (рН 7,0), 5мМ DTT і 1,5мМ хлориду натрію. До 142мл елюату з колонки з гелем Affi-Gel Blue додавали невеликими порціями 31,8г сульфату амонію до концентрації 1,7 Μ при перемішуванні протягом 30 хвилин, причому резервувар з елюатом була поміщена у баню з льодом. Потім суміш центрифугували у центрифужних пробірках на 250мл протягом 30 хвилин із швидкістю 23,000об./хв., як описане вище, і супернатант завантажували в колонку з фенілсефарозою (FPLC Phenyl-Sepharose column XK 26/20 (Pharmacia)) при 23°С. Колонку врівноважували буфером, що містить 1,7 Μ сульфату амонію, 20мМ біс-Трис-пропану, (рН 6,8) і 5мМ DTT. Після встановлення базової лінії біля нуля з колонки елюювали білки протягом 40 хвилин при зворотному градієнті концентрації буфера від 1,7 Μ до 0 Μ сульфату амонію зі швидкістю 5мл/хв., збираючи фракції по 1 хвилині. Елюент із 0 Μ сульфату амонію містив 10мМ Трису (рН 7,0), 5мМ DTT, 1мМ МgСІ 2. Випробування активності зібраних фракцій показало, що найбільшу ферментну активність ксантозинN7-метилтрансферази проявили фракції від 49 до 54. Ці фракції об'єднували і отриману кількість об'ємом 30мл: пропускали самотоком через колонку з АТР-агарозою (ATP-agarose (Sigma Chemicals A2767)) при 4°С. Колонку промивали буфером для врівноважування, який містить 10мМ Трису (рН 7,0), 5мМ DTT, 1мМ МgСl2. Після встановлення базової лінії колонку промивали 20мл буфера для врівноважування, який містить 100мкМ ксантозину, а потім ще 40мл буфера для врівноважування. Обидва елюати поєднували й завантажували в колонку Mono-P HR 5/20 FPLS (Pharmacia), врівноважену буфером, що містить 25мМ бісТрису (рН 6,0) і 9% бетаїну при 23°С. Після встановлення базової лінії колонку промивали 100мл полібуфера 74 [Polybuffer 74 (10мл:90мл Н2О, v:v) (рН 4,0) (Pharmacia)] і 9% бетаїну зі швидкістю 1мл/хв. Пробірки для збирання містили 100мкл 0,5 Μ трицину (рН 7,0) і 50мМ DTT для одержання кінцевої концентрації у 1мл 50мм трицину (рН 7,0) і 5мМ DTT у фракціях, зібраних за 1 хвилину. Це ефективно стабілізувало заключну кислотність середовища для білків, елюйованих при слабко кислому рН із Моnо-Р колонки. Найбільшу активність ксантозин-N7-метилгрансферази у пробірках для збирання спостерігали для фракцій 15 і 16 після градієнтного елюювання з колонки з рН 5,42 і 5,35 відповідно. Важливо не заморожувати зразки білків на будь-якій стадії очищення, тому що це негативно впливає на активність ксантозин-N7-метилтрансферази. В. Визначення ферментної активності. 100мкл стандартної суміші для аналізу містили 50мМ трицину (рН 7,0), 1200мкл ксантозину, 5мМ DTT, 7,5мкл S-аденозил-L-[метил-14С]-метіоніну (SAM) (60мКі/ммоль; DuPont NEN), і 1мМ Na2EDTA. Реакційну суміш (50мкл без ферменту) витримували 10 хвилин при 25°С, потім ініціювали реакцію додаванням 50мкл розчину ферменту і залишали на 1 годину при 25°С. Після цього відбирали три аліквоти реакційної суміші по 30мкл і обробляли 8мкл 0,6 Μ розчину хлорної кислоти (НСІО4). Аналогічні процедури проводили з контрольними пробами (із нульовим часом реакції) для одержання первинного значення ферментної активності. Суміш центрифугували на мікроцентрифузі 5 хвилин і додавали до 19мкл супернатанту 1,0мкл 33 Μ 7-метилксантозину. Ці суміші наносили на хроматографічний папір Whatman No. 1 і піддавали хроматографії у розчині н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:1). Положення 7-метилксантози визначали по її блакитній флуоресценції у короткохвильовому УФ-випромінюванні. Цю область вирізували з хроматограм і визначали радіоактивність вирахуванням сцинтиляцій, використовуючи 3мл сцинтиляційної рідини (Scintiverse scintillation fluid (Fisher Scientific)). Точність розрахунків складала 74,7 %. Значення фону і неспецифічної радіації, визначені для 7-метилксантозину в контрольних експериментах, відраховувалися. С. Ідентифікація продукту реакції. Сайт метилування ксантинового кільця ідентифікували шляхом гідролізу вуглеводу продукту реакції метилування ксантозину і розділення в чотирьох різних хроматографічних системах. Продукт із двох 100мкл проведених реакцій, як описано вище, що містить 6мкл 33мМ 7-метилксантозину як носій, наносили на хроматографічний папір Whatman No. 1. Хроматографували в розчині н-бутанол-оцтова кислота-вода (nВuОН-НОАс-Н2О) (4:1:1). Ділянки хроматограми, що відповідають метильованому ксантозину, визначали, як описано вище, розрізали на маленькі шматочки, поміщали в стерильні пробірки і витримували у 35мл деіонізованої води при 37°С протягом ночі при струшуванні. Екстракт фільтрували через два шари тканини, 0,22мкм фільтр і ліофілізували. Висушений екстракт розчиняли у 1,0мл деіонізованої води, поміщали в скляний резервуар та ліофілізували. Потім зразок розчиняли в 400мкл 1,0 Μ НСІ і витримували протягом 1 години при 100°С. Продукт ферментативного розщеплення ліофілізували, розчиняли в 400мкл 3мМ 7метилксантину і знову ліофілізували. Потім цей продукт розчиняли у 40мкл деіонізованої води і 10мкл розчину, хроматографували в кожній з чотирьох різних систем. 1-метилксантин, 3-метилксантин, 7метилкеантин, 8-метилксантин, 7-метилксантозин, ксантин і ксантозин наносили на кожну хроматограму для порівняння. Використовувалися наступні хроматографічні системи: (n-ВuОН-НОАс-Н2О) (4:1:1) на папері Whatman No. 1 і, або ізоаміловий спирт-вода-ацетонітрил (41:4:5), етанол-вода (4:1), або tert-BuOHHOAc-H2О (4:1:1) на С8 тонкошарових пластинах (Whatman KC18F). Після висушування на хроматограми напилювали En3Hance (DuPont NEN), знову висушували й експонували протягом 30 днів на попередньо опроміненій рентгенівській плівці (Fuji RXGCU) при -70°С. D. Ідентифікація білків за допомогою гель-електрофорезу. Екстракти, отримані як описано вище, використовували для одномірного (1D) електрофорезу (SDSPAGE) у міні гелях (основний гель: 12,5% акриламіду, 0,8% метилен-біс-акриламіду; гель для концентрації: 7,5% акриламіду, 0,21% метилен-біс-акриламіду), змішуючи їх із буфером Лемлі для зразків (Laemmli, U.K., Nature 227:680 (1970)), і для двомірного (2D) ізоелектрофокусування (ІЕF)/електрофорезу (SDS-PAGE) у міні гелях за допомогою модифікованого способу O'Farrell і ін. (O'Farre, P.Z., Goodman, H.M., O'Farrell P.H., Cell 12:1133 (1977)). Двомірний електрофорез проводили, осаджуючи білки 50 об'ємами 100% етанолу протягом 1 години і далі, розчиняючи їх у буфері для зразків для ізоелектрофокусування (IEF), що містить 5% амфолінів (1:1 (по об'єму), рН 3-10: рН 5-7, LKB-Pharmacia). Співвідношення об'ємів екстракту білків і IEF буфера для зразків підтримували на рівні 1:2 для впевненості в тому, що складові буфера, які залишилися після хроматографії, не будуть заважати IEF. Рівні кількості білкових зразків (1х106 бляшок/мкл) і витримували при 37°С 15 хвилин. Потім додавали 3мл середовища LB і витримували при 37°С 3 години при перемішуванні. Далі культуру нагрівали на водяній бані протягом 20 хвилин при 70°С і центрифугували зі швидкістю 1000об./хв. протягом 15 хвилин. 1мл супернатанту, що містить вирізану pBluescript фагеміду, спаковували як ниткоподібна частинку фага, переносили у стерильну мікроцентрифужну пробірку на 1,5мл і зберігали при 4°С як вихідний розчин. 25мкл цього вихідного розчину поміщали в мікроцентрифужну пробірку з 200мкл клітин Е. coli Solar, вирощених до щільності O.D.600=1,0. Після витримування при 37°С протягом 15 хвилин 200мкл клітин висівали в чашки розміром 100´15мм із середовищем ΝΖΥ, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Чашки витримували при 37°С протягом ночі до появи колоній. Одну колонію переносили в 10мл стерильного середовища LB, що містить 50мкг/мл ампіциліну, і вирощували при 37°С протягом ночі при струшуванні. 10мл культури клітин концентрували у стерильній мікроцентрифужній пробірці на 1,5мл, осад клітин очищали з використанням набору реактивів QIAGEN plasmid, як описано вище. Очищену плазмідну ДНК суспендували в 50мкл стерильної води. Проводили реакції автоматичного секвенування ДНК, змішуючи 8мкл цього зразка ДНК (8мкг) із 4мкл або Т3, або Т7 секвенуючих праймерів (0,8пмоль/мкл). Умови реакцій описані вище. Кожна реакція секвенування давала приблизно 350 основ послідовності. Послідовність представлена на Фігурі 5. Амінокислотна послідовність ксантозин-N7-метилтрансферази, передбачена з основної послідовності кДНК, представлена на Фігурі 6. Описані приклади служать тільки для ілюстрації, і їх не варто розглядати як такі, що обмежують об'єм охорони винаходу, визначений у формулі винаходу, приведеній далі.