Атенуйований вірус класичної лихоманки свиней, що містить модифікований глікопротеїн е2

Реферат: Винахід належить до рекомбінантного вірусу класичної лихоманки свиней, що містить ДНК, яка кодує глікопротеїн (CSFV) Е2 вірусу класичної лихоманки свиней, де амінокислоти 829-837 вказаного глікопротеїну Е2 замінюються послідовністю TSFNMDTLR (SEQ ID NО: 6) або послідовністю TSFNMDTLA (SEQ ID NО: 7). Винахід також належить до вакцини, що містить вказаний вірус, способу імунізації, способу захисту тварин від CSFV, способу одержання вірусу CSFV тощо. UA 98620 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід належить до виділення і характеристики нових детермінант вірулентності вірусу класичної лихоманки свиней (CSFV) в межах структурного глікопротеїну Е2 і до застосування цих нових детермінант вірулентності для конструювання живих атенуйованих вакцин CSF. Класична лихоманка свиней (CSF) є високо контагіозним захворюванням свиней, яке за природою може бути або гострим, або хронічним (van Oirschot, J. T. 1986. In: Diseases of Swine, 6th edition, Leman et al., eds., Iowa State University Press, Ames, Iowa, page 289). Збудник, вірус CSF (CSFV), є дрібний вірус з оболонкою з позитивним однонитковим РНК-геномом, і, паралельно з вірусом вірусної діареї великої рогатої худоби (BVDV) і вірусом прикордонної хвороби овець (BDV), його класифікують як член роду Pestivirus в межах сімейства Flaviridae (Hulst et al. 2001. J. Virol. 75: 9585-9595). Геном CSFV 12,5 кб містить єдину відкриту рамку зчитування, яка кодує 4000-амінокислотний поліпротеїн і утворює від 11 до 12 кінцевих продуктів розщеплювання (NH2-Npro-C-Ems-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH) за допомогою котрансляційного і посттрансляційного процесінгу цього поліпротєїну клітинними і вірусними протеазами (Rice, С. М. 1996. In: Fundamental Virology, 3rd edition, Fields and Howley, eds., Lippincott Raven, Philadelphia, pp. 931-959). Вірулентність і спектр фенотипів господаря варіюють серед ізолятів CSFV і серед пестивірусів. Інфекція високо вірулентними штамами CSFV приводить до загибелі інфікованих тварин, тоді як ізоляти з вірулентністю від помірної до слабкої викликають тривале хронічне захворювання (van Oirschot, див. вище). Крім того, BVDV і BDV, хоча вони є збудниками захворювань у видів великої рогатої худоби і овець, відповідно, можуть також інфікувати свиней, не викликаючи клінічного захворювання (van Oirschot, див. вище). Не дивлячись на доступність геномних послідовностей з CSFV фенотипів, що розрізняються за вірулентністю, BVDV і BDV, генетична основа вірулентності CSFV у природного господаря залишається слабко зрозумілою (van Oirschot, див. вище). Використання "зворотної генетики" дало можливість ідентифікації вірусних детермінант вірулентності, що сприяло розробці живих атенуйованих вакцин-кандидатів CSF (Mayer et al. 2004, Vaccine 22: 317-328; Meyers et al. 1999, J. Virol. 73: 10224-10235; Moorman et al. 1996, J. Virol. 70: 763-770; Moser et al. 2001, Virus Genes 23: 63-68; Risatti et al. 2005È, J. Virol. 79: 3787-3796; Risatti et al. 2005b, Virology 343: 116-117; Ruggli et al. 1996, J. Virol. 70: 3478-3487; Tratschin et al. 1998, J. Virol. 72: 7681-7684; van Gennip et al. 2000, Vaccine 19: 447-459). Капсидний білок і глікопротеїни Ems E1 і Е2 є структурними компонентами віріону CSFV, де E1 і Е2 розміщують в оболонці своїми карбокси-кінцями, a Ems слабко сполучений з оболонкою вірусу (Thiel et al. 1991, J. Virol. 65: 4705-4712; Weiland et al. 1990, J. Virol. 64: 3563-3569; Weiland et al. 1999, J. Gen. Virol. 80: 1157-1165). Всі три глікопротеїни сполучені з вірулентністю CSFV (Meyers, див. вище; Risatti et al. 2005 a, b, див. вище). Глікопротеїн Е2 вважають важливим для реплікації CSFV, оскільки мутанти вірусу, що містять часткові або повні делециі гену Е2 виявилися нежиттєздатними (van Gennip et al. 2002, Vaccine 20: 1544-1556). E2 застосовується паралельно з Ems (Mayer et al., див. вище) і E1 (Wang et al. 2004, Virology 330: 332-341) у адсорбцію вірусу до клітин-господарів; дійсно, хімерні пестивіруси проявляють інфективність і фенотипи клітинного тропізму відповідно до донора гену Е2 (van Gennip et al. 2000, 2002, див. вище). Е2 є найбільш імуногенним серед глікопротеїнів CSFV (Konig et al. 1995, J. Virol. 69: 6479-6486; Weiland et al. 1990, див. вище), індукуючі нейтралізуючі антитіла і захист проти летального зараження. CSFV E2 також містить між залишками 829 і 837 епітоп, що розпізнається моноклональним антитілом (mAb) WH303 (Lin et al. 2000, J. Virol. 74: 11619-11625), реагент, який нездатний реагувати з Е2 BVDV або BDV, і його застосовують в звичайній практиці для діагностики CSF. Автори винаходу описали ефекти мутацій в межах епітопу WH303 Е2 CSFV, де дані мутації змінюють амінокислотну послідовність вірулентного Брешиа CSFV прогресивно у бік гомологічної амінокислотної послідовності штаму NADL BVDV, демонструючи аддитивний ефект вірулентності вірусу у свиней і повне атенуювання після шести амінокислотних замін. Такі атенуйовані віруси дають можливість раціонального конструювання живих атенуйованих вакцин CSF. Тварини, інфіковані мутантами вірусу, були захищені при контрольному зараженні вірулентним вірусом Брешиа на 3 і 21 добу після вакцинації. Модифікація в даному сайті в межах епітопу WH303 дає можливість розробки діагностичного тесту для диференціації вакцинованих і інфікованих тварин. Автори винаходу ідентифікували нову детермінанту вірулентності CSFV в межах глікопротеїну Е2. Відповідно до цього відкриття метою винаходу є розробка рекомбінантного вірусу класичної лихоманки свиней (CSFV), що містить кодуючу ДНК, модифікований глікопротеїн Е2 CSFV. 1 UA 98620 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Метою винаходу також є розробка рекомбінантного вірусу класичної лихоманки свиней, що містить кодуючу ДНК, глікопротеїн Е2 CSFV, який модифікований шляхом прогресивної мутації ділянки гену Е2 високо патогенного штаму Брешиа, що приводить в результаті до мутації Е2 вірусу, що більше нагадує послідовність епітопу WH303 гомологічного гену Е2 з BVDV, дана модифікація приводить до атенуювання CSFV. Додатковою метою винаходу є розробка імуногенних композицій, що містять життєздатний рекомбінантний вірус класичної лихоманки свиней, що містить модифікований глікопротеїн Е2 CSFV. Додатковою метою винаходу є розробка раціонально сконструйованої живої атенуйованої вакцини CSFV, яка зменшує тяжкість CSF. Додатковою метою винаходу є розробка раціонально сконструйованої живої атенуйованої вакцини CSFV, ефективної для захисту тварини від клінічного захворювання CSF при зараженні вірулентним CSFV Брешиа. Додатковою метою винаходу є розробка маркерної вакцини, яка дає можливість серологічної відмінності між вакцинованими тваринами і тваринами, інфікованими CSFV. Ще однією додатковою метою винаходу є розробка способу захисту тварини проти CSF шляхом введення ефективної кількості раціонально сконструйованої живої атенуйованої вакцини CSFV. Інші цілі і переваги даного винаходу повинні стати очевидними на підставі подальшого опису. Короткий опис графічних матеріалів На фіг. 1 зображене порівняння CSFV Брешиа, BVDV штаму NADL і вірусів, мутантів CSFV Т1-5 у епітопній області mAb WH303 глікопротеїну Е2. Вказані положення амінокислотних залишків в поліпротеїні CSFV. Курсивом вказані залишки, що відрізняються від залишків в Е2 Брешиа, як в BVDV штам NADL, так і в T1v-T5v CSFV. На фіг. 2А і 2Б приведено порівняння характеристик мутантів T1v-T5v і BICv. На фіг. 2А показані характеристики росту in vitro мутантів T1v-T5v і BICv. Моношари SK6 були інфіковані (МІ [множинність інфекції] = 0,01) T1v, T2v, T3v, T4v, T5v або BICv і вихід вірусу, титрованого за проміжком часу після інфекції. У даних представлені середні значення і стандартні відхилення з двох незалежних експериментів. На фіг. 2Б показане утворення бляшок і реактивність mAb мутантів T1v-T5v і BICv. Моношари SK6 інфікували 50-100 ТСID50 (інфекційної дози тканинної культури), покривали 0,5 % агарозою і інкубували при 37 °C протягом 3 діб. Чашки фіксували 50 % (об/об) етанолом-ацетоном і диференціально фарбували на імуногістохімію з mAb WH303 і mAb WH308. На фіг. 3 показані клінічні бали, зареєстровані у свиней, інфікованих рекомбінантними вірусами T1v-T5v і BICv. Клінічні бали обчислювали, як описано вище, з модифікаціями, і засновували на спостереженні двох (T1v, T2v, T3v і T4v) або шести (T5v і BICv) тварин. На фіг. 4А-Б показані периферичні формули лейкоцитів (фіг. 4А) і тромбоцитів (фіг. 4Б) у свиней, інфікованих рекомбінантними вірусами T1v-T5v і BICv. Формули виражені у вигляді числа/мл, і кожна крапка виражає середнє значення і стандартну помилку для двох (T1v, T2v, T3v і T4v) або шести (T5v і BICv) тварин. На фіг. 5А-В зображені титри вірусів в крові (фіг. 5А), мазок з носу (фіг. 5Б) і зіскоб з мигдалин (фіг. 5В) від свиней, інфікованих мутантами T1v-T5v або BICv. Кожна крапка представляє середнє значення ТСID50/мл і стандартне відхилення для двох (T1v, T2v, T3v і T4v) або шести (T5v і BICv) тварин. На фіг. 6А-Б показані периферичні формули лейкоцитів (фіг. 6А) і тромбоцитів (фіг. 6Б) у свиней, помилково вакцинованих або вакцинованих T5v і підданих контрольному зараженню на 3 або 21 добу після інфекції BICv. Значення для контрольних, помилково вакцинованих і контрольно заражених тварин представлені суцільними квадратами. Формули виражені у вигляді числа/мл і представляють середнє для чотирьох індивідуумів з планками погрішностей, що показують стандартну помилку. Розробка стратегій боротьби із захворюванням у разі спалаху CSFV вимагає раннього початку захисту, який стає важливішим параметром якості вакцини, ніж, наприклад, тривалість захисту. При розробці таких вакцин слід використовувати раціонально сконструйовані живі атенуйовані вакцини штамів CSFV. Генетична основа і молекулярні механізми, що лежать в основі вірулентності пестивірусів, залишаються не відомими. У разі CSFV в різних повідомленнях описані зв'язки між вірусними білками або специфічною областю геному і вірулентністю. Мутації одного або двох кодонів, що анулюють РНКазну активність глікопротеїну Ems штаму Alfort CSFV, атенуювали вірус у свиней (Meyers et al., див. вище). Подібні результати також спостерігали шляхом мутації домену 2 UA 98620 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 РНКази глікопротеїну Ems BVDV (Meyer et al. 2002, J. Virol. 76: 8494-8503). Більше недавно показано, що делеція Npro з вірулентних штамів Alfort/187 і Eystrup CSFV привела в результаті до атенуйованих вірусів у свиней (Mayer et al., див. вище). Амінокислотна заміна в глікопротеїні Е2 CSFV в сполуці з трьома амінокислотними замінами в Erns привела в результаті до пониженої вірулентності у свиней (van Gennip et al. 2004, J. Virol. 78: 8812-8823). Крім того, інсерція в рамці зчитування 19 амінокислот в гені Е1 штаму Брешиа CSFV привела до атенуювання in vivo (Risatti et al. 2005b, див. вище). E2 CSFV також залучений у вірулентність. Заміщення гену Е2 у штамі Брешиа CSFV геном Е2 з вакцинного штаму CS привело в результаті до химерного вірусу, який володів значним атенуюванням in vivo (Risatti et al. 2005a, див. вище). Одна з 22 амінокислотних замін в білці Е2 вакцинного вірусу CS в порівнянні з послідовністю білка Е2 Брешиа впливає на епітоп mAb WH303. Всі три типи вірусу, Брешиа, CS і хімерний, сильно реагували з mAb 303, що дозволяє припустити існування іншої генетичної детермінанти, пов'язаної з атенуюванням CSFV. Тут автори винаходу показали, що мутації, введені в епітоп mAb WH303 у глікопротеїні Е2 високо патогенного штаму Брешиа CSFV, приводять в результаті до атенуювання вірусу. У епітоп WH303 Брешиа CSFV були введені прогресивні зміни (TAVSPTTLR; SEQ ID NO:1), що нагадують залишки, що знаходяться в тому ж положенні (TSFNMDTLA; SEQ ID NO:2) в глікопротеїні Е2 штаму NADL BVDV. Цікаво, що у TSFNMDTLR (T4v) або TSFNMDTLA (T5v) відсутня реактивність до mAb WH303, вони проявляють дрібну морфологію бляшок і в значній мірі атенуйовані in vivo. На відміну від гострого смертельного захворювання, викликаного BICv, інфекція T4v і T5v була субклінічною, що характеризується пониженою реплікацією вірусу, в органах-мішенях і зменшеним вірусовиділеням. Релевантність WH303 як основного імунодомінантного епітопу недавно спостерігали в процесі характеристики нейтралізуючих моноклональних антитіл до Е2 і Ems CSFV, використовуючи статистичну пептидну бібліотеку фагового дисплею (Zhang et al. 2006, Archives of Virology 151 (1): 37-54). Було виявлено, що ці моноклональні антитіла сполучає загальний мотив SPTxL, який також картований в епітопі WH303 (SPTTL). Крім того, мультипептидні вакцини, що містять епітоп WH303, що складаються з шести пептидів, що перекриваються, в інтервалі довжини між 20-25 амінокислотами, індукували імунітет проти CSFV (Dong et al. 2005, Vaccine 23:3630-3633). У атенуювання T5v у свиней, залучають деякий аспект прикріплення вірусу і/або проникнення у важливі клітини-мішені in vivo. Ems E1 і Е2 є структурними глікопротеїнами в оболонці віріону CSFV (Thiel et al., див. вище). Розміщений в епітопі Е2 зустрічається у виді як гомо-, так і гетеродімерів, сполучених дисульфідними містками (Thiel et al., див. вище; Weiland et al. 1990, 1999, див. вище), і показаний паралельно з Ems (Hulst et al. 1997, J. Gen. Virol. 78: 2779-2787) і E1 (Wang et al., див. вище) він важливий для рецепції вірусу. Пестивіруси, сконструйовані генно-інженерним шляхом, що містять хімерні білки Е2, мали змінений спектр господарів. Хімерний BVDV, несучий повнорозмірний ген Е2 від вірусу прикордонної хвороби овець (BDV), пестівіруса овець, втрачав свою здатність до утворення бляшок в клітинах нирок корови (MDBK), але зберігав свою здатність до утворення бляшок в клітинах вівці (Lian et al. 2003. J. Gen. Viol. 84: 1269-1274). Однак, клітини MDBK були все ж таки пермісивними до хімерного вірусу, хоча відмінність у виході вірусного потомства через 24 години після інфекції складала в 100 разів менше, ніж у вірусу дикого типу BVDV. Так само часткове заміщення аміно-кінця Е2 штаму С CSFV гомологічною послідовністю BVDV привело в результаті до 10кратного зниження виходу вірусного потомства в клітинах нирок свині (SK6). Клітини SK6 схожі пермісивностю до хімери і до BVDV донора Е2; однак, хімера не набувала здатності BVDV до інфікування фетальних епітеліальних клітин теляти (van Gennip et al. 2000, див. вище). Так само у T4v і T5v було представлене 10-кратне зниження виходу вірусного потомства в клітинах SK6 в порівнянні з BICv T1v, T2v і T3v (фіг. 2А) і відсутність здатності до ефективної реплікації в клітинах нирок корови (MDBK) (дані не представлені). T4v і T5v проявляли приблизно 70 % зменшення розміру бляшок в порівнянні з початковим BICv в клітинах SK6 (фіг. 2Б). Подібний фенотип дрібних бляшок спостерігали з штамом NADL BVDV на клітинах SK6 (дані не представлені), що дозволяє припустити, що дані віруси мають змінену здатність до сполучення і/або розповсюдженню in vitro. Хоча зв'язок між зменшенням розміру бляшок in vitro і атенуюванням CSFV in vivo ще слід встановлювати, існують деякі спостереження, які дозволяють припустити цей зв'язок. Hulst et al. (J. Virol 74: 9553-9561; Hulst et al. 2001, див. вище) спостерігали, що варіанти Брешиа CSFV, залежні від сполуки гепарину сульфату, одержані після серійних пасажів в культивованих клітинах нирок свині, мали зменшений розмір бляшок. Ці варіанти, що містять мутацію однієї амінокислоти в білці Ems, були вірулентними у свиней (Hulst et al. 2000, 2001, див. вище). Однак, два різні рекомбінантні 3 UA 98620 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 віруси, похідні від штаму Брешиа CSFV, що містять мутації в E1 (Risatti et al. 2005b, див. вище) і Е2 (Risatti et al. 2005a, див. вище), проявляли фенотип зменшеного розміру бляшок в культивованих клітинах нирок свині і були атенуйовані у свиней. Нарешті, ідентифікована нова генетична детермінанта вірулентності CSFV, сполучена з глікопротеїном Е2. Хоча механізм в основі атенуювання, залишається невідомим, але поступова втрата реактивності з mAb WH303 корелювала з втратою вірулентності in vivo, приводячи до остаточного атенуювання CSFV, що дозволяє припустити зв'язок між втратою послідовності епітопу і нездатністю викликати захворювання іншими пестивірусами (BVDV і BDV) у свиней. Покращене розуміння генетичної основи вірулентності CSFV дасть можливість раціонального конструювання живих атенуйованих вакцин CSF підвищеної безпеки, ефективності і користі. Крім того, в конкретному випадку вірусів T4v і T5v втрата реактивності з mAb WH303, яке розпізнає високоспецифічний і консервативний епітоп CSFV відкриває потенційну можливість застосування цих вірусних мутантів як атенуйовану маркерну вакцину. Приклади Описаний даний винахід, роз'яснюється посиланнями на деякі конкретні приклади, які включені тут тільки для додаткової ілюстрації винаходу і не призначені для обмеження об'єму винаходу, як визначено формулою винаходу. Приклад 1 Віруси і клітинні культури Клітини нирок свині (SK6) (29), вільні від BVDV, культивували в мінімальному підтримуючому середовищі Дульбекко (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY) з 10 % фетальною сироваткою теляти (FCS) (Atlas Biologicals, Fort Collins, CO). Штам Брешиа CSFV розмножували в клітинах SK6 і використовували для конструювання інфекційного клону кДНК (17). Титрування CSFV з клінічних проб проводили, використовуючи клітини SK6 у 96-лункових планшетах (Costar, Cambridge, MA). Інфективність вірусу визначали після 4 діб в культурі за допомогою імунопероксидазного аналізу, використовуючи моноклональні антитіла до CSFV WH303 або WH308 (1) і набір Vectastain ABC (Vector Laboratories, Buringames, CA) (25). Титри обчислювали, використовуючи метод Reed and Muench (14), і виражали у вигляді ТСID50/мл. Проведена таким чином контрольна чутливість складала >1,8 ТСID50/мл. Приклад 2 Конструювання інфекційних клонів Т1-Т5 CSFV Повнорозмірний інфекційний клон (ІС) вірулентного ізоляту Брешиа (рВІС) (17) використовували як матрицю, в якій шість залишків епітопу WH303 (TAVSPTTLR; SEQ ID NO:1) між залишками 829-837 Е2 мутували так, щоб вони відображали гомологічні залишки, присутні в ізоляті NADL BVDV (TSFNMDTLA; SEQ ID NO:2) (Lin et аl., див. вище). Мутації додавали прогресивно з одержанням п'яти ІС для порятунку наступних п'яти вірусних мутантів: T1v (TSFSPTTLR; SEQ ID NO:3), T2v (TSFNPTTLR; SEQ ID NO:4), T3v (TSFNMTTLR; SEQ ID NO:5), T4v (TSFNMDTLR; SEQ ID NO:6) і T5v (TSFNMDTLA; SEQ ID NO:7) (фіг. 1). Мутації вводили шляхом сайт-спрямованого мутагенезу, використовуючи набір для сайт-спрямованого мутагенезу QuickChange XL (Stratagene, Cedar Creek, TX), проведеного відповідно до інструкцій виробника і з використанням праймерів і плазмідних мішеней, описаних в таблиці 1. Таблиця 1 Праймери, використовувані для конструювання вірусів Т1-Т5 Праймери * T1F T2F T3F T4F T5F Послідовність 5'-GGGTGTTATAGAGTGCACGTCATTTAGCCCGACAA 5'-GGGTGTTATAGAGTGCACGTCATTTAATCCGACAA 5'-GGGTGTTATAGAGTGCACGTCATTTAATATGACAA 5'-GAGTGCACGTCATTTAATATGGACACTCTGAGAAC 5'-TCATTTAATATGGACACTCTGGCAACAGAAGTGGT SEQ ID NO: 8 9 10 11 12 *Приведені послідовності тільки прямого праймеру. Зворотні праймери відповідають комплементарній послідовності. 45 Інфекційні РНК транскрибували in vitro з повнорозмірних ІС штаму Брешиа CSFV або мутантів Т1-Т5 і використовували для трансфекції клітин SK6 (фіг. 1А). Вірус виділяли з трансфеційних клітин на 4-у добу після трансфекції. Нуклеотидні послідовності виділених 4 UA 98620 C2 5 10 15 20 25 30 вірусних геномів були ідентичні початковій ДНК плазмідам, що підтверджує, що тільки мутації в локусі, кодуючий епітоп WH303, були зазначені T1v-T5v. Приклад 3 Порятунок in vitro Брешиа і вірусів, мутантів Т1-T5v CSFV Повнорозмірні геномні інфекційні клони лінеарізували Srfl і транскрибували in vitro, використовуючи систему Т7 Megascript (Ambion, Austin, TX). Продукти РНК осаджували LiCI і трансфеціювали в клітини SK6 шляхом електропорациї при 500 В, 720 Ом, 100 Вт електропоратором ВТХ 630 (ВТХ, San Diego, СА). Клітини висівали в 12-лункові планшети і 2 флакони на 25 см і інкубували протягом 4 діб при 37 °C і атмосфері 5 % СО2. Вірус визначали за допомогою імунопероксідазного фарбування, використовуючи CSFV Е2-специфічне моноклональне антитіло (WH308). Концентровані розчини врятованих вірусів зберігали при 70 °C. Точність введених мутацій перевіряли шляхом секвенування гену Е2 мутованих вірусів. Приклад 4 Аналіз T1v-T5v in vitro і in vivo Характеристики росту in vitro T1v-T5v відносно початкового pBICv оцінювали на багатоступінчатій кривій росту (фіг. 2А). Культури клітин SK6 інфікували при множинності інфекції (МІ) 0,01 ТСID50 на клітину. Вірус абсорбували протягом 1 години (нульовий час), і зразки збирали через проміжки часу після інфекції через 72 години. Хоча мутанти T1v, T2v і T3v проявляли характеристики росту, практично невідмітні від pBICv T4v і T5v проявляли 10-кратне зниження в кінцевому виході вірусу. T4v і T5v також проявляли 80-90 % зниження у розмірі бляшок щодо BICv T1v, T2v і T3v (фіг. 2Б). Нарешті, хоча імуноцитохимічна реактивність з MAb WH303 була еквівалентна T1v, T2v і pBICv, реактивність була частково втрачена в клітинах, інфікованих T3v, і повністю припинена в клітинах, інфікованих T4v і T5v (фіг. 2Б). Дані результати вказують на те, що мутації епітопу WH303, що впливають на здатність CSFV до реплікації in vitro, мають подібну дією на реактивність до WH303. Для дослідження ефекту прогресивної мутації епітопу WH303 на вірулентність CSFV у свиней порівнювали фенотипи вірулентності вірусів, мутантів T1v-T5v і вірусу дикого типу BICv в 6 групах Йоркширських свиней, інокульованих інтраназально 105 ТСID50 вірусу, і проводили моніторинг на клінічне захворювання. Результати цього експерименту представлені в таблиці 2 і на фіг. 3-5. Ідентичність і стабільність мутацій епітопу WH303 підтверджували аналізом нуклеотидної послідовності вірусу з мигдалин тварин, інфікованих T1v-T5v, на 6 добу після інфекції (дані не представлені). Таблиця 2 Виживаність і температурна реакція у свиней після інфекції Т1-T5v або BICV Вірус Виживші / Всього Средній час до загибелі, доба (CO) T1v T2v T3v T4v T5v BICv 0/2 0/2 0/2 4/4 # 6/6 0/2* 8,5 14,5 19,0 12,5 Середній час до появи темпер-ної реакції, доба (CO) 3,0(1,4) 4,5 (0,7) 5,0 (0,0) 5,0 (0,0) 4,5 (0,7) (2.1) Середня Середня тривалість макс. добова темпер-ної темп-pa (CO) реакції, доба (CO) 4,5(2,1) 107,2 9,5 (0,7) 106,6 6,0 (1,4) 105,7 2,5(2,1)* 106,2 104,8 4,5 (0,7) 105,8 (0.3) * У двох з 4 тварин була виражена температурна реакція. # Включені тварини, використані в дослідженні захисту. 35 40 Як очікували BICv був високо патогенним, ефективно викликаючи температурну реакцію, клінічні ознаки і загибель у свиней, але виявилось, що мутанти T1v-T5v мали фенотипи вірулентності, із ростаючим атенуюванням (таблиця 2, фіг. 3). T1v і T2v також були високо патогеними, викликаючи температурну реакцію і загибель у свиней подібно до BICv (таблиця 2); проте, для T2v продемонстрована деяка затримка в клінічних балах щодо BICv (таблиця 3). T3v викликав летальне захворювання, але із сповільненою кінетикою щодо BICv, оскільки смерть наступала на 4-8 діб пізніше (таблиця 2). Зазначено, що T4v і T5v були нездатні викликати летальне захворювання, причому T4v викликав тільки легку і швидкоминаючу температурну 5 UA 98620 C2 реакцію, і T5v майже не викликав клінічного захворювання (таблиця 2, фіг. 3). Так само, інфекція BICv T1v, T2v і T3v до 6 діб після інфекції призводила в результаті до різкого зниження числа лейкоцитів (WBC) і тромбоцитів, яке залишалося низьким аж до загибелі, тоді як інфекція T4v і T5v викликала швидкоминаючий і значно менш різкий ефект (фіг. 4). 5 Таблиця 3 Титри вірусу 1 в клінічних пробах і тканинах після інфекції T5v або BICv Вірус 2 СПІ Мазок з носу Зіскоб з мигдалин Кров Мигдалини Нижньощелепний лімфовузол Селезінка Нирки 2 4 3 Отр 1.97 Отр Отр 4 Отр АЛЕ 2,13 2,97 2,80 3,30 Отр 2,97 Отр 2,47 T5v 6 Отр 2,63 2,97 3,30 3,63 2,63 2,97 8 Отр Отр 3,97 1,97 2,47 3,47 3,13 14 Отр Отр Отр 2,80 3,30 2,80 2,13 2 Отр Отр Отр 1,97 1,80 Отр Отр 4 Отр Отр 3,13 4,63 2,80 2,13 Отр BICv 6 1,97 1,97 6,47 5,13 4,80 2,80 2,80 8 4,63 4,97 6,30 5,47 5,80 5,63 4,80 14 3,97 2,97 6,80 6,13 5,97 6,30 5,97 1 Титри, виражені ТСID50/мл 2 СПІ, доба після інфекції 3 Отр (негативний):