Прискорений спосіб діагностики класичної чуми свиней з використанням кролячого антисвинячого імуноглобуліну g, міченого пероксидазою хріну

1 Прискорений спосіб діагностики класичної чуми свиней (КЧС) з використанням кролячого антисвинячого імуноглобуліну G, міченого пероксидазою хріну, який включає підготовку мазківвідбитків патологічного матеріалу і їх фіксацію, фарбування клітин мазків, виявлення клітин, ура жених вірусом класичної чуми свиней, який відрізняється тим, що мазки-відбитки патологчного матеріалу готують у лунках пластикового планшета з внесенням пперімунної проти КЧС сироватки та кролячого антисвинячого імуноглобуліну G, міченого пероксидазою хріну, фіксацію проводять 40% розчином ацетону, а виявлення уражених клітин здійснюють за допомогою інвертованого або світлового мікроскопу із специфічним забарвленням цитоплазми червоного кольору та світлим ядром 2 Прискорений спосіб діагностики класичної чуми свиней, який відрізняється тим, що фарбування мазків-відбитків здійснюють З-амшо-9-етилкарбазолом протягом 10-15 хвилин Галузь техніки до якої відноситься винахід, ветеринарна вірусологія, зокрема для виявлення та ідентифікації вірусу класичної чуми свиней в патологічному матеріалі Рекомендації по діагностиці класичної чуми свиней методом імунофлуоресценцм затверджений Держ, департаментом ветеринарної медицини 28 грудня 1998р Реєстраційний №15-14307 1 Приготування препаратів мазків-відбитков та їх фіксація Для приготування препаратів використовують органи і тканини, з яких готують мазки-відбитки на знежирених спирт-ефіром покривних скельцях, які закріплюють в розщеплених паличках сірників з умовними номерами проб органів, послідовно прикладаючи покривне скло до поверхні зрізу досліджуваного органу Із кожної проби готують по 4 мазки-відбитки Препарати підсушують при кімнат втримують 3-5 хвилин при кімнатній температурі Потім кладуть мазком-відбитком вниз на краплі флуоресціюючих глобулінів, які наносять на чисті знежирені предметні скельця При цьому покривні скельця із сірниками розмішують так, щоб нижня поверхня з мазком-відбитком занурилась у флуоресцентний реактив Фарбування проводять у вологій камері (ексикаторі) при +37°С протягом ЗО хвилин Далі поступово пластинки знімають з предметних скелець і вільними кінцями сірників закріплюють в гніздах пінопластових штативів, які перевертають вниз та опускають в посудину із забуферним, фізіологічним розчином рН7,2-7,5 встановленому на магнітній мішалці Відмивання проводять в плаваючому стані штативу з препаратами на протязі 20 хвилин в темному МІСЦІ при одноразовій ЗМІНІ розчину через 10 хвилин Поля промивання препарати споліскують дистильованою водою і підсушують в темному МІСЦІ Далі препарат поміщають у забуферний гліцерин для імунофлуоресцентної мікроскопи Для цього на знежирені предметні скельця наносять краплі забуферного гліцерину для флуоресцентної мікроскопи кладуть на них покривні скельця мазками донизу та заливають краї розплавленим парафіном Мікроскопію проводять у відображеному синьому СВІТЛІ на люмінесцентних мікроскопах при ній температурі (5-1 Охв) і фіксують ХІМІЧНО ЧИСТИМ ацетоном Юхв при -20° 2 Фарбування препаратів ФІТЦ-імуноглобуліни КЧС для обробки препаратів беруть в робочому розведенні, яке вказане на етикетці ампули Для цього сухий ФІТЦімуноглобулін розчиняють в дистильованій воді до об'єму, який вказаний на етикетці ампули Препарат після фіксації ацетоном для його вилучення 00 (О 00 00 ю 58868 малому і середньому збільшенні під імерсійною системою, використовуючи нефлуоресціююче масло або гліцерин Антиген вірусу КЧС в мазкахвідбитках оброблених специфічним кон'югатом знаходять по смарагдовому або яскраво-зеленому СВІТІННЮ цитоплазми клітин Виявлення специфічного СВІТІННЯ в цитоплазми навіть в окремих клітинах препаратів, одержаних від підозрілих в захворюванні тварин, слід вважати позитивним результатом Але цей спосіб має недоліки виготовлення мазків-відбитків патологічного матеріалу на покривних скельцях є незручним, так як останні крихкі, небезпечні для дослідника, фіксація препаратів чистим ацетоном призводить до зморщення клітин, із-за властивості випаровуватись ацетон має токсичний вплив на органи дихання, проведення мікроскопи препаратів потребує спеціальної затемненої люмінесцентної кімнати, що виключає повну безпеку присутності науковців під час дослідження Даний аналог взято, як найближчий (прототип) В основу винаходу поставлена задача удосконалення прискореного способу діагностики класичної чуми свиней з використанням кролячого антисвинячого імуноглобуліну G міченого пероксидзою хріну, шляхом застосування пластикових планшет (замість покривних скелець), 40% розчину ацетону замість концентрованого та мікроскопи препаратів під світловим мікроскопом замість люмінесцентного, що дозволяє проводити прискорену діагностику класичної чуми свиней, тобто скорочення часу діагностики та и вірогідності Поставлена задача вирішується тим, що в прискореному способі діагностики класичної чуми свиней з використанням кролячого антисвинячого імуноглобуліну G міченого пероксидазою хріну, який включає підготовку мазків-відбитків патологічного матеріалу і їх фіксацію, фарбування клітин мазків, виявлення клітин уражених вірусом класичної чуми свиней, згідно винаходу мазки-відбитки патологічного матеріалу готують у лунках пластикового планшета, з внесенням пперімунної проти КЧС сироватки та кролячою антисвинячого імуноглобуліну G міченого пероксидазою хріну, фіксацію здійснюють 40% розчином ацетону, а виявлення уражених клітин здійснюють за допомогою інвертованого або світлового мікроскопу із специфічним забарвленням цитоплазми червоного кольору та світлим ядром Комп'ютерна верстка Н Лисенко У конкретному варіанті виконання способу фарбування здійснюють З-амшо-9-етил-карбазолом протягом 10-15 хвилин Процес постановки реакції заключається в наступному з патологічного матеріалу (шматочки органів) зігнутими ножицями проводиться зріз товщиною 0,4-0,5см, з якого дотиком до фільтрувального паперу видаляється наявна рідина Мазкивідбитки готують шляхом легкого доторкання до поверхні дна лунок планшета поверхнею зрізу шматочка органа за допомогою очного пінцету З одного досліджуваного органу роблять мазкивідбитки в 4-х лунках Мазки-відбитки кожної лунки фіксують внесенням 0,1см3 40% розчину ацетону (ЧДА, ХЧ) на протязі 15 хвилин після чого останній зливають у ємкість, а залишок видаляють шляхом струшування і залишають планшет на 5 хвилин для підсихання Дали в лунки вносять по 0,05см3 пперімунної свинячої сироватки проти КЧС, яка розводиться на 2% розчині сухого знежиреного молока у ФБР рН 1,2-1,А Для робочого розведення з розрахунку 1 планшет беруть 0,2см пперімунної антисвинячої сироватки на 5см 3 2% р-ну сухого знежиреного молока у ФБР рН 7,2-7 4 Планшет витримують в умовах СОг інкубатору або термостату при +37°С протягом ЗО хвилин Після чого сироватку видаляють, а лунки промивають 4-5 разів ФБР за допомогою восьмиканальної піпетки Потім ВНОСЯТЬ ПО 0,05СМ 3 робочого розведення кон'югату (кролячий антисвинячий IgG мічений пероксидазою хріну) і ставлять планшет у термостат на ЗО хвилин Для розведення робочого кон'югату теж, беруть 0,02см3 кролячого антисвинячого IgG міченого піросидазою хріну на 5см 3 2% р-ну сухого знежиреного молока у ФБР рН 1,2-1,А Знову кон'югат видаляють, а лунки відмивають 4-5 разів ФБР Далі в лунки вносять на 1015 хвилин по 0,05см3* барвник, розчин якого з розрахунку на 1 планшет готується так 0,002г 3амшо-9-етил-карбазолу розчиняють в 0,3см3 розчину димексиду і вносять 5см 3 Na-ацетатного буферу рН 5,0 після чого додають 0,05см3 3% розчину перекису водню (Н2О2) Стабілізатором реакції є фізіологічний розчин, який вносять по 0,1см3 в кожну лунку планшета Облік решеті проводять під інвертованим мікроскопом шляхом проглядання кожної лунки планшета Критерієм оцінки служить структура уражених клітин і ступіні їх зафарбовування У полі зору мікроскопа цитоплазма уражених вірусом клітин забарвлена у світло- або темно червоний колір з світлим ядром Підписано до друку 05 09 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна