Анти-vegf одиничний варіабельний домен імуноглобуліну

Реферат: UA 102993 C2 (12) UA 102993 C2 Винахід належить до анти-VЕGF одиничного варіабельного домену імуноглобуліну, який включає амінокислотну послідовність, яка є ідентичною амінокислотній послідовності DОМ1526-593, як представлено на Фігурі 5, або відрізняється від амінокислотної послідовності DОМ1526-593 в 1 або 2 амінокислотних положеннях. Зазначений домен є стійким до протеази, застосовується у фармацевтичних композиціях, а також у виробництві лікарського засобу для лікування або профілактики раку, запалення, аутоімунного захворювання або вікової макулярної дегенерації, опосередкованого VEGF захворювання, хронічного обструктивного захворювання легень або пневмонії. Винахід також належить до нуклеїнової кислоти, що кодує анти-VЕGF одиничний варіабельного домен імуноглобуліну, до вектора, що містить нуклеїнову кислоту та клітини-хазяїна. UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявлений винахід стосується резистентних до протеази антагоністів поліпептидів, одиничних мінливих доменів імуноглобулінів (антитіл) та судинно-ендотеліального фактору росту (VЕGF). Винахід крім того стосується застосування, композицій та пристроїв, що охоплюють подібні анти-VЕGF ліганди. Поліпептиди та пептиди стали значною мірою важливими агентами при різних застосовуваннях, охоплюючи промислові застосування та застосування як медичних, терапевтичних та діагностичних агентів. Однак, у деяких фізіологічних станах, як-то рак та запальні стани (наприклад, СОРD), кількість протеази у тканині, органі або тварині (наприклад, у легенях, у пухлині чи поруч з нею) може збільшуватися. Це збільшення протеази може призводити до прискореного розкладання та інактивації ендогенних білків та терапевтичних пептидів, поліпептидів та білків, що застосовують для лікування хвороб. Відповідно, деяк агенти, що мають потенцію для іn vіvо застосування (наприклад, застосування у лікуванні, діагностиці або попередженні хвороб) мають тільки обмежену ефективність оскільки вони швидко розкладаються та інактивуються протеазами. Резистентні до протеази поліпептиди забезпечують кілька переваг. Наприклад, резистентні до протеази поліпептиди залишаються активними іn vіvо довше, ніж чутливі до протеази агенти та, відповідно, залишаються функціональними протягом часу, що є достатнім для продукування біологічної дії. Існує також потреба у поліпшених способах селекції поліпептидів, що є резистентними до розкладання протеази та також мають бажану біологічну активність. VЕGF: VЕGF є секретованим, зв'язуючим гепарин, гомодимерним глікопротеїном, існуючим у кількох змінних формах внаслідок альтернативного сплайсингу його первісного транскрипту (Lеung еt аl., 1989, Sсіеnсе 246: 1306). VЕGF є також відомим як фактор судинної проникності (VРF) внаслідок його здатності індукувати просочування судин, процес, важливий у запаленні. Важливим патофізіологічним процесом, що полегшує утворення пухлини, метастазу та рецидиву, є ангіогенез пухлин. Цей процес є опосередкованим виробленням ангіогенних факторів, експресованих пухлиною, як-то VЕGF, котрі індукують утворення кров'яних судин, що поставляють поживні речовини до пухлин. Відповідно, підходом для лікування деяких типів раку є інгібування ангіогенезу пухлин, опосередкованого VЕGF, таким чином виснажуючи пухлину. АVАSТІN (бевацизумаб; Gеnеtесh, Іnс.) є гуманізованим антитілом, що зв'язує VЕGF людини, що санкціоновано для лікування колоректального раку. Антитіло, позначене як антитіло 2С3 (АТСС Ассеssіоn № РТА 1595), як повідомлено, зв'язує VЕGF та інгібує зв'язування VЕGF з рецептором 2 епідермального фактору росту. Націлювання VЕGF за допомогою усіх зараз існуючих доступних терапевтичних засобів не є ефективним для усіх пацієнтів, або для усіх типів раку. Таким чином, існує потреба у поліпшених агентах для лікування раку та інших патологічних станів, опосередкованих VЕGF, наприклад, судинних проліферативних хвороб (якто пов'язана з віком макулярна дегенерація (АМD)). VЕGF також задіяно у запальних розладах та автоімунних хворобах. Наприклад, ідентифікація VЕGF у синовіальних тканинах RА-пацієнтів висвітлила потенційну роль VЕGF у патології RА (Fаvа еt аl., 1994, J. Ехр. Меd. 180: 341: 346; Nаgаshіmаеt аl., 1995, J. Rhеumаtоl. 22: 1624-1630). Роль VЕGF у патології RА підтвердили нижченаведені дослідження, у котрих анти-VЕGF антитіла були застосовуваними у моделі індукованого колагеном артриту миші (СІА). У цих дослідженнях експресія VЕGF у суглобах є збільшеною при індукуванні хвороби, та застосування сироватки анти-VЕGF блокувало розвинення артриту та полегшувало хворобу (Sоnе еt аl, 2001, Віосhеm. Віорhуs. Rеs. Соmm. 281: 562-568; Lu еt аl., 2000, J. Іmmunоl. 164: 5922-5927). Звідси націлювання VЕGF може також бути корисним у лікуванні RА та інших станів, наприклад, асоційованих із запаленням та/або автоімунною хворобою. В одному аспекті винахід стосується поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність, що є принаймні на 97 % ідентична амінокислотній послідовності DОМ15-26-593 (показано у Фіг. 5). В одному втіленні, процент ідентичності є принаймні 98 або 99 %. В одному втіленні, поліпептидом є DОМ15-26-593. Винахід крім того стосується (по суті) чистого мономеру DОМ1526-593. В одному втіленні, DОМ15-26-593 є принаймні на 98, 99, 99,5 % чистим або 100 % чистим мономером. В одному аспекті винахід стосується поліпептиду (наприклад, що є резистентним до протеази), що кодовано амінокислотною послідовністю, що є принаймні на 80 % ідентична амінокислотній послідовності DОМ15-26-593 (показано у фіг. 5). В одному втіленні, процент ідентичності є принаймні 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 %. В одному втіленні цей резистентний до протеази поліпептид є досяжним способом, описаним тут для виділення резистентних до протеази поліпептидів. 1 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В одному аспекті винахід стосується поліпептиду, кодованого амінокислотною послідовністю, що є принаймні на 55 % ідентична нуклеотидній послідовності нуклеотидної послідовності DОМ15-26-593, де поліпептид містить амінокислотну послідовність, що є принаймні на 97 % ідентична амінокислотній послідовності DОМ15-26-593. В одному втіленні, процент ідентичності нуклеотидної послідовності є принаймні 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 %. В одному втіленні, процент ідентичності амінокислотної послідовності є принаймні, 98 або 99 % або 100 %. Наприклад, нуклеотидна послідовність може бути оптимізованою кодоном версією нуклеотидної послідовності DОМ15-26-593. Кодоноптимізація послідовностей є відомою у рівні техніки. В одному втіленні, нуклеотидна послідовність є оптимізованою для експресії у бактеріальних клітинах (наприклад, Е. соlі або Рsеudоmоnаs, наприклад, Р fluоrеsсеns), клітинах ссавців (наприклад, СНО) або клітинах дріжджів (наприклад, Ріссhіа або Sассhаrоmусеs, наприклад, Р. раstоrіs або S. сеrеvіsіае). В одному аспекті винахід стосується конденсованого білку, що містить поліпептид винаходу. В одному аспекті винахід стосується одиничного мінливого домену анти-VЕGF імуноглобуліну, що містить амінокислотну послідовність, що є принаймні на 80 % ідентична амінокислотній послідовності DОМ 15-26-593. В одному втіленні, процент ідентичності є принаймні 98 або 99 %. В одному втіленні, одиничний мінливий домен імуноглобуліну містить валін у позиції 6, де нумерування відповідає Каbаt ("Sеquеnсеs оf Рrоtеіns оf Іmmunоlоgісаl Іntеrеst", US Dераrtmеnt оf Неаlth аnd Нumаn Sеrvісеs 1991). В одному втіленні, одиничний мінливий домен імуноглобуліну містить лейцин у позиції 99, де нумерування відповідає Каbаt. В одному втіленні, одиничний мінливий домен імуноглобуліну містить лізин у позиції 30, де нумерування відповідає Каbаt. В одному аспекті винахід стосується одиничного мінливого домену анти-VЕGF імуноглобуліну, що містить амінокислотну послідовність, що є ідентичною амінокислотній послідовності DОМ15-26-593. В одному аспекті винахід стосується одиничного мінливого домену анти-VЕGF імуноглобуліну, кодованого нуклеотидною послідовністю, що є принаймні на 80 % ідентична амінокислотній послідовності DОМ15-26-593. В одному втіленні, процент ідентичності є принаймні 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 %. В одному аспекті винахід стосується одиничного мінливого домену анти-VЕGF імуноглобуліну, кодованого амінокислотною послідовністю, що є принаймні на 55 % ідентична нуклеотидній послідовності нуклеотидної послідовності DОМ 15-26-593 та, де мінливий домен містить амінокислотну послідовність, що є принаймні на 97 % ідентична амінокислотній послідовності DОМ 15-26-593. В одному втіленні, процент ідентичності нуклеотидної послідовності є принаймні 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 %. В одному втіленні, процент ідентичності амінокислотної послідовності є принаймні 98 або 99 % або 100 %. Наприклад, нуклеотидна послідовність може бути оптимізованою кодоном версією нуклеотидної послідовності DОМ15-26-593. Кодон-оптимізація послідовностей є відомою у рівні техніки. В одному втіленні, нуклеотидна послідовність є оптимізованою для експресії у бактеріальних клітинах (наприклад, Е, соlі або Рsеudоmоnаs, наприклад, Р fluоrеsсеns), клітинах ссавців (наприклад, СНО) або клітинах дріжджів (наприклад, Ріссhіа або Sассhаrоmусеs, наприклад, Р. раstоrіs або S. сеrеvіsіае). В одному аспекті винахід стосується одиничного мінливого домену анти-VЕGF імуноглобуліну, кодованого послідовністю, що ідентична амінокислотній послідовності DОМ1526-593. В одному аспекті винахід стосується анти-VЕGF антагоністу, що містить одиничний мінливий домен анти-VЕGF імуноглобуліну, відповідний винаходу. В одному втіленні, антагоніст містить перший та другий одиничні мінливі домени імуноглобуліну, де кожний мінливий домен є відповідним винаходу. Наприклад, де антагоніст містить мономер вказаного одиничного мінливого домену або гомодимер вказаного одиничного мінливого домену. В одному втіленні, амінокислотна послідовність кожного одиничного мінливого домену є ідентичною амінокислотній послідовності DОМ15-26-593. В одному аспекті винахід стосується одиничного мінливого домену анти-VЕGF імуноглобуліну, що містить амінокислотну послідовність, що є ідентичною амінокислотній послідовності DОМ15-26-593 або відрізняється від амінокислотної послідовності DОМ15-26-593 у не більше, ніж 14 амінокислотних позиціях та має СDR1-послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR1 DОМ15-26-593. В одному втіленні, різниця є не більше, ніж 2 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 у 13, 12, 11,10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотній позиції. В одному втіленні, ідентичність СDR-послідовності є принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,96, 97, 98 або 99 %. В одному аспекті винахід стосується одиничного мінливого домену анти-VЕGF імуноглобуліну, що містить амінокислотну послідовність, що є ідентичною амінокислотній послідовності DОМ15-26-593 або відрізняється від амінокислотної послідовності DОМ15-26-593 у не більше, ніж 14 амінокислотних позиціях та має СDR2 послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR2 DОМ15-26-593. В одному втіленні, різниця є не більше, ніж у 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотній позиції. В одному втіленні, ідентичність СDR-послідовності є принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. В одному аспекті винахід стосується одиничного мінливого домену анти-VЕGF імуноглобуліну, що містить амінокислотну послідовність, що є ідентичною амінокислотній послідовності DОМ15-26-593 або відрізняється від амінокислотної послідовності DОМ15-26-593 у не більше, ніж 14 амінокислотних позиціях та має СDR3 послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR3 DОМ15-26-593. В одному втіленні, різниця є не більше, ніж у 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотній позиції. В одному втіленні, ідентичність СDR-послідовності є принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. В одному аспекті винахід стосується одиничного мінливого домену анти-VЕGF імуноглобуліну, що містить амінокислотну послідовність, що є ідентичною амінокислотній послідовності DОМ15-26-593 або відрізняється від амінокислотної послідовності DОМ15-26-593 у не більше, ніж 14 амінокислотних позиціях та має СDR1-послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR1 DОМ15-26-593 та має СDR2 послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR2 DОМ15-26-593. В одному втіленні, різниця є не більше, ніж у 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотній позиції. В одному втіленні, ідентичності одної або обох СDR-послідовностей є відповідно принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. В одному аспекті винахід стосується одиничного мінливого домену анти-VЕGF імуноглобуліну, що містить амінокислотну послідовність, що є ідентичною амінокислотній послідовності DОМ15-26-593 або відрізняється від амінокислотної послідовності оf D DОМ15-26593 у не більше, ніж 14 амінокислотних позиціях та має СDR1-послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR1 DОМ15-26-593 та має СDR3 послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR3 DОМ15-26-593. В одному втіленні, різниця є не більше, ніж у 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотній позиції. В одному втіленні, ідентичності одної або обох СDR-послідовностей є відповідно принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. В одному аспекті винахід стосується одиничного мінливого домену анти-VЕGF імуноглобуліну, що містить амінокислотну послідовність, що є ідентичною амінокислотній послідовності DОМ15-26-593 або відрізняється від амінокислотної послідовності DОМ15-26-593 у не більше, ніж 14 амінокислотних позиціях та має СDR2 послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR2 DОМ15-26-593 та має СDR3 послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR3 DОМ15-26-593. В одному втіленні, різниця є не більше, ніж у 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотній позиції. В одному втіленні, ідентичності одної або обох СDR-послідовностей є відповідно принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. В одному аспекті винахід стосується одиничного мінливого домену анти-VЕGF імуноглобуліну, що містить амінокислотну послідовність, що є ідентичною амінокислотній послідовності DОМ15-26-593оr відрізняється від амінокислотної послідовності DОМ15-26-593 у не більше, ніж 14 амінокислотних позиціях та має СDR1-послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR1 DОМ 15-26-593 та має СDR2 послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR2 DОМ15-26-593аnd має СDR3 послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR3 DОМ15-26-593. В одному втіленні, різниця є не більше, ніж у 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5,4, 3, 2 або 1 амінокислотній позиції. В одному втіленні, , ідентичність одної, двох або кожної СDR-послідовності є принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. В одному аспекті винахід стосується анти-VЕGF антагоністу, що має СDR1-послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR1 DОМ15-26-593. В одному втіленні, ідентичність СDR-послідовності є принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. Антагоніст може бути резистентним до протеази, наприклад, одної або більше з протеаз, які тут описані, наприклад, у сукупності умов, які тут описані. 3 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному аспекті винахід стосується анти-VЕGF антагоністу, що має СDR2 послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR1 DОМ15-26-593 В одному втіленні, ідентичність СDR-послідовності є принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. Антагоніст може бути резистентним до протеази, наприклад, одної або більше з протеаз, які тут описані, наприклад, у сукупності умов, які тут описані. В одному аспекті винахід стосується анти-VЕGF антагоністу, що має СDR3 послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR1 DОМ15-26-593. В одному втіленні, ідентичність СDR-послідовності є принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. Антагоніст може бути резистентним до протеази, наприклад, одної або більше з протеаз, які тут описані, наприклад, у сукупності умов, які тут описані. В одному аспекті винахід стосується анти-VЕGF антагоністу, що має СDR1-послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR1 DОМ15-26-593 та послідовність СDR2, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR2 DОМ15-26-593. В одному втіленні, ідентичність СDR-послідовності одного або обох СDR є принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. Антагоніст може бути резистентним до протеази, наприклад, одної або більше з протеаз, які тут описані, наприклад, у сукупності умов, які тут описані. В одному аспекті винахід стосується анти-VЕGF антагоністу, що має СDR1-послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR1 DОМ15-26-593 та послідовність СDR3, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR3 DОМ15-26-593. В одному втіленні, ідентичність СDR-послідовності одного або обох СDR є принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. Антагоніст може бути резистентним до протеази, наприклад, одної або більше з протеаз, які тут описані, наприклад, у сукупності умов, які тут описані. В одному аспекті винахід стосується анти-VЕGF антагоністу, що має СDR2 послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR2 DОМ15-26-593 та послідовність СDR3, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR3 DОМ15-26-593. В одному втіленні, ідентичність СDR-послідовності одного або обох СDR є принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. Антагоніст може бути резистентним до протеази, наприклад, одної або більше з протеаз, які тут описані, наприклад, у сукупності умов, які тут описані. В одному аспекті винахід стосується анти-VЕGF антагоністу, що має СDR1-послідовність, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR1 DОМ15-26-593 та послідовність СDR2, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR2 DОМ15-26-593 та послідовність СDR3, що є принаймні на 50 % ідентична послідовності СDR3 DОМ15-26-593. В одному втіленні, ідентичність СDR-послідовності одного, обох або кожного з СDR є принаймні 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 %. Антагоніст може бути резистентним до протеази, наприклад, одної або більше з протеаз, які тут описані, наприклад, у сукупності умов, які тут описані. В одному аспекті винахід стосується анти-VЕGF антагоністу, що містить одиничний мінливий домен імуноглобуліну, що містить послідовність СDR1, СDR2, та/або СDR3 (наприклад, СDR1, СDR2, СDR3, СDR1 та 2, СDR1 та 3, СDR2 та 3 або СDR1, 2 та 3) DОМ15-26-593. Антагоніст може бути резистентним до протеази, наприклад, одної або більше з протеаз, які тут описані, наприклад, у сукупності умов, які тут описані. В одному аспекті винахід стосується анти-VЕGF антагоністу, що конкурує із DОМ 15-26-593 стосовно зв'язування до VЕGF. Таким чином, антагоніст може зв'язувати той же епітоп, як DОМ15-26-593 або перекривальний епітоп. В одному втіленні антагоніст містить одиничний мінливий домен імуноглобуліну, що має амінокислотну послідовність, що є принаймні на 97 % ідентична амінокислотній послідовності DОМ15-26-593. В одному втіленні, процент ідентичності є принаймні 98 або 99 %. В одному втіленні, мінливим доменом є DОМ15-26-593. Антагоніст може бути резистентним до протеази, наприклад, одної або більше з протеаз, які тут описані, наприклад, у сукупності умов, які тут описані. В одному втіленні, антагоністом є антитіло або його антиген-зв'язувальний фрагмент, як-то моновалентний антиген-зв'язувальний фрагмент (наприклад, sсFv, Fаb, Fаb', dАb), що має специфічність стосовно зв'язування VЕGF. Іншими прикладами антагоністів є ліганди, описані тут, що зв'язують VЕGF. Ліганди можуть містити одиничний мінливий домен імуноглобуліну або антитіло домену (dАb), що має специфічність стосовно зв'язування VЕGF, або визначення комплементарності регіонів подібного dАb у придатному форматі. У деяких втіленнях лігандом є мономер dАb, що складається по суті або складається з одиничного мінливого домену імуноглобуліну або dАb, що має специфічність стосовно зв'язування VЕGF. В інших втіленнях лігандом є поліпептид, що містить dАb (або СDR dАb) у придатному форматі, як-то у форматі антитіла. Ці VЕGF-ліганди, наприклад, dАb, можна форматувати до більшого гідродинамічного розміру, наприклад, приєднанням групи ПЕГ, альбуміну сироватки, трансферину, рецептору трансферину або принаймні його трансферин-зв'язувальної частини, регіону антитіла Fс, або 4 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кон'югацією з доменом антитіла. Наприклад, агент (наприклад, поліпептид, мінливий домен або антагоніст), що і) зв'язує VЕGF (іі) антагонізує активацію опосередкованої VЕGF трансдукції сигналу, та (ііі) не інгібує зв'язування VЕGF з його рецептором, як-то мономером dАb, можна форматувати як більший антиген-зв'язувальний фрагмент антитіла (наприклад, форматувати як Fаb, Fаb', F(аb)2, F(аb')2, ІgG, sсFv). Гідродинамічний розмір ліганду та його період напівперетворення у сироватці можна також збільшувати кон'югацією або приєднанням VЕGFзв'язувального агенту (антагоніст, мінливий домен) до зв'язувального домену (як-то антитіло або фрагмент антитіла), що зв'язує антиген або епітоп, що збільшує період напівперетворення іn vіvо, що описано тут (дивись, Аnnех 1 °F WО2006038027, що уведено як посилання). Наприклад, VЕGF-зв'язувальний агент (наприклад, поліпептид, наприклад, dАb) може бути кон'югованим або зв'язаним з анти-сироваточним альбуміном або анти-неонатальним антитілом або фрагментом антитіла Fс-рецептору, наприклад, анти-SА або анти-неонатальним dАb, Fаb, Fаb' або sсFv Fс-рецептору, або з анти-SА афітілом або анти-неонатальним афітілом Fсрецептору. Приклади придатного альбуміну, фрагментів альбуміну або варіантів альбуміну для застосування у VЕGF-зв'язувальнмх лігандах згідно з винаходом, є описаними у WО 2005/077042А2 та WО2006038027, котрі є уведеними як посилання. В інших описаних тут втіленнях винаходу замість застосування "dАb" в антагоністі або ліганді винаходу, розглянуто, що спеціаліст може застосувати домен, що містить dАb СDR, що зв'язує VЕGF (наприклад, СDR. прищеплений на придатний білковий каркас або основу, наприклад, афітіло, каркас SрА, домен LDL-рецептору класу А або домен ЕGF) або може бути доменом білку, що містить сайт зв'язування з VЕGF, наприклад, де домен є вибраним з групи: афітіло, домен SрА, домен LDL-рецептору класу А або домен ЕGF. Це відповідно забезпечує розкриття антагоністів, лігандів та способів, застосовуючи подібні домени замість dАb. Поліпептиди, одиничні мінливі домени імуноглобуліну та антагоністи винаходу можуть бути резистентними до одного або більше з нижченаведеного: серин-протеаза, цистеїн-протеаза, аспартат-протеази, тіол-протеази, матриксна металопротеаза, карбоксипептидаза (наприклад, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, хімотрипсин, пепсин, папаїн, еластаза, лейкозим, панкреатин, тромбін, плазмін, катепсини {наприклад, катепсин G), протеїназа (наприклад, протеїназа 1, протеїназа 2, протеїназа 3), термолізин, хімозин, ентеропептидаза, каспаза {наприклад, каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), калпаїн, фікаїн, клострипаїн, актинідаїн, бромелаїн, та сепараза. В окремих втіленнях протеазою є трипсин, еластаза або лейкозим. Протеаза може також бути забезпеченою біологічним екстрактом, біологічним гомогенатом або біологічним препаратом. В одному втіленні, протеазою є протеаза, виявлена у слині, слизу (як-то шлунковий слиз, назальний слиз, бронхіальний слиз), бронхоальвеолярному лаважі, гомогенаті легень, екстракті легень, панкреатичному екстракті, шлунковій рідині, слині. В одному втіленні, протеазою є виявлена в очах та/або розривах. Приклади подібних протеаз, виявлені в очах, охоплюють каспази, калпаїни, матриксні металопротеази, дезинтегрин, металопротеїнази (АDАМ) та АDАМ з мотифами тромбоспондину, протеосоми, плазміногенний активатор тканин, секретази, катепсин В та D, цистатин С, серин-протеаза РRSS1, шлях обміну убіквітину протеосом (UРР). В одному втіленні, протеазою є небактеріальна протеаза. У втіленні протеазою є протеаза тварини, наприклад, ссавців, наприклад, людини. У втіленні протеазою є протеаза шлунково-кишкового тракту або протеаза тканини легень, наприклад, протеаза шлунково-кишкового тракту або протеаза тканини легень, виявлена у людей. Подібні протеази, перераховані тут можна також застосовувати у способах, описаних тут, що охоплюють піддавання дії бібліотек протеаз. В одному аспекті винахід стосується резистентного до протеази одиничного мінливого домену імуноглобуліну, що містить сайт зв'язування VЕGF, де мінливий домен є резистентним до протеази, при інкубуванні з (і) концентрацією (с) принаймні 10 мкг/мл протеази при 37 °C протягом часу (t) принаймні одна година; або (іі) концентрацією (с') принаймні 40 мкг/мл протеази при 30 °C протягом часу (t) принаймні одна година. В одному втіленні, співвідношення (на молярній основі) протеази, наприклад, трипсину, до мінливого домену є 8000-80000 протеаза:мінливий домен, наприклад, коли С = 10 мкг/мл, співвідношення є 800-80000 протеаза:мінливий домен; або, коли С або С = 100 мкг/мл, співвідношення є 8000-80000 протеаза:мінливий домен. В одному втіленні співвідношення (на основі мас) протеази (наприклад, трипсину) до мінливого домену є 16000-160000 протеаза:мінливий домен, наприклад, коли С = 10 мкг/мл, співвідношення є 1,600-160000 протеаза:мінливий домен; або, коли С або С = 100 мкг/мл, співвідношення є 1,6000-160000 протеаза:мінливий домен. В одному втіленні, концентрація (с або с') є принаймні 100 або 1000 мкг/мл протеази. В одному втіленні, концентрація (с або с') є принаймні 100 або 1000 мкг/мл протеази. Посилання зроблено для 5 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 опису умов, відповідних протеолітичній активності протеази для застосування, при роботі з наборами або бібліотеками пептидів або поліпептидів (наприклад, за мас-параметрами). Ці умови можна застосовувати для визначення резистентності до протеази певного одиничного мінливого домену імуноглобуліну. В одному втіленні, час (t) є або приблизно є одна, три або 24 години або протягом ночі (наприклад, приблизно 12-16 годин). В одному втіленні, мінливий домен є резистентним при умовах (і) та концентрації (с) є або приблизно є 10 або 100 мкг/мл протеази та час (t) є 1 годин. В одному втіленні, мінливий домен є резистентним при умовах (іі) та концентрації (с') є або приблизно є 40 мкг/мл протеази та час (t) є або приблизно є 3 години. В одному втіленні, протеаза є вибраною з групи: трипсин, еластаза, лейкозим та панкреатин. В одному втіленні, протеазою є трипсин. В одному втіленні, протеазою є протеаза, виявлена у слині, слизі (як-то шлунковий слиз, назальний слиз, бронхіальний слиз), бронхоальвеолярному лаважі, гомогенаті легень, екстракті легень, панкреатичному екстракті, шлунковій рідині, слині або очах або розривах. В одному втіленні, протеаза є виявленою в очах та/або розривах. В одному втіленні, протеазою є небактеріальна протеаза. У втіленні протеазою є протеаза тварини, наприклад, ссавців, наприклад, людини. У втіленні протеазою є протеаза шлунковокишкового тракту або протеаза тканини легень, наприклад, протеаза шлунково-кишкового тракту або протеаза тканини легень, виявлена у людей. Подібні протеази, перераховані тут, можна також застосовувати у способах, описаних тут, що охоплюють піддавання дії бібліотек протеаз. В одному втіленні, мінливий домен є резистентним до трипсину та/або принаймні одної іншої протеази, вибраної з групи: еластаза, лейкозим та панкреатин. Наприклад, резистентність є до трипсину та еластази; трипсину та лейкозиму; трипсину та панкреатину; трипсину, еластази та лейкозиму; трипсину, еластази та панкреатину; трипсину, еластази, панкреатину та лейкозиму; або трипсину, панкреатину та лейкозиму. В одному втіленні, мінливим доменом є виявлений на бактеріофазі, при інкубуванні в умовах 613 812 (і) або (іі), наприклад, з бібліотекою фагів розміром 10 10 , наприклад, 10 10 реплікативних одиниць (інфекційних віріонів). В одному втіленні, мінливий домен специфічно зв'язує VЕGF після інкубації в умовах (і) або (іі), наприклад, оцінених, застосовуючи ВіаСоrе ТМ або ЕLІSА, наприклад, фаг ЕLІSА або моноклональний фаг ЕLІSА. В одному втіленні мінливі домени винаходу специфічно зв'язують білок А або білок L. В одному втіленні, специфічне зв'язування з білком А або L є присутнім після інкубації в умовах (і) або (іі). В одному втіленні, мінливі домени винаходу можуть мати зчитування ОD450 у ЕLІSА, наприклад, фаг ЕLІSА або моноклональний фаг ЕLІSА) принаймні 0,404, наприклад, після інкубації в умовах (і) або (іі). В одному втіленні, мінливі домени винаходу виявляють (по суті) одиничну смугу у гельелектрофорезі, наприклад, після інкубації в умовах (і) або (іі). У деяких втіленнях винахід стосується антагоністу VЕGF, що є подвійно специфічним лігандом, що містить перший dАb згідно з винаходом, що зв'язує VЕGF, та другий dАb, що має таку ж або відмінну специфічність стосовно зв'язування першого dАb. Другий dАb може зв'язувати ціль, вибрану з групи: АроЕ, Аро-SАА, ВDNF, Кардіотрофін-1, СЕА, СD40, ліганд СD40, СD56, СD38, СD138, ЕGF, рецептор ЕGF, ЕNА-78, Еотаксин, Еотаксин-2, Екзодус-2, Ара, FGF-кислотний, FGF-основний, фактор росту фібробластів 10, ліганд FLТ3, Фракталкін (СХ3С), GDNF, G-СSF, GМ-СSF, GF-β1, альбумін сироватки людини, інсулін, ІFN-γ, ІGF-І, ІGF-ІІ, ІL-1α, ІL-1β, рецептор ІL-1, рецептор ІL-1 типу 1, ІL-2, ІL-3, ІL-4, ІL-5, ІL-6, ІL-7, ІL-8 (72 а.а.), 1L-8 (77 а.а.), ІL-9,1L-10, ІL-11, ІL-12,1L-13, ІL-15, ІL-16, ІL-17, ІL-18 (ІGІF), Інгібін α, Інгібін β, ІР-10, фактор росту кератиноцитів 2 (КGF-2), КGF, Лептин, LІF, Лімфотактин, інгібіторна речовина Міллеріана, інгібіторний фактор колоній атрактантний білок моноцитів, М-СSF, МDС (67 а.а.), МDС (69 а.а.), МСР-1 (МСАF), МСР-2, МСР-3, МСР-4, МDС (67 а.а.), МDС (69 а.а.), МІG, МlР-1α, МІР-1β, МІР3а, МІР-3р, МІР-4, фактор-1 інгібітору мієлоїдного попереднику (МРІF-1), NАР-2, Нейртурин, фактор росту нервів, β-NGF, NТ-3, NТ-4, Онкостатин М, РDGF-АА, РDGF-АВ, РDGF-ВВ, РF-4, RАNТЕS, SDF1α, SDF1β, SСF, SСGF, фактор стовбурних клітин (SСF), ТАRС, ТGF-α, ТGF-β, ТGF-β2, ТGF-β3, фактор некрозу пухлин(ТNF), ТNF-α, ТNF-β, рецептор І ТNF, рецептор ІІ ТNF, ТNІL-1, ТРО, VЕGF, VЕGF А, VЕGF В, VЕGF С, VЕGF D, рецептор 1 VЕGF, рецептор 2 VЕGF, рецептор 3 VЕGF, GСР-2, GRО/МGSА, GRО-β, GRО-γ, НСС1, І-309, НЕR 1, НЕR 2, НЕR 3, НЕR 4, альбумін сироватки, vWF, амілоїдні білки (наприклад, амілоїд альфа), ММР12, РDК1, ІgЕ, ІL13Rаl, ІL-13Rа2, ІL-15, ІL-15R, ІL-16, ІL-17R, ІL-17, ІL-18, ІL-18R, ІL-23 ІL-23R, ІL-25, СD2, СD4, СDllа, СD23, СD25, СD27, СD28, СD30, СD40, СD40L, СD56, СD138, АLК5, ЕGFR, FсЕR1, ТGFb, ССL2, ССL18, СЕА, СR8, СТGF, СХСL12 (SDF-1), чімаза, FGF, Фурин, Ендотелін-1, Еотаксини 6 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, Еотаксин, Еотаксин-2, Еотаксин-3), GМ-СSF, ІСАМ-1, ІСОS, ІgЕ, ІFNα, І-309, інтегрини, L-селектин, МІF, МІР4, МDС, МСР-1, ММР, нейтрофіл-еластаза, остеопонтин, ОХ-40, РАRС, РD-1, RАNТЕS, SСF, SDF-1, сиглек8, ТАRС, ТGFb, Тромбін, Тіm-1, ТNF, ТRАNСЕ, Триптаза, VЕGF, VLА-4, VСАМ, а4р7, ССR2, ССR3, ССR4, ССR5, ССR7, ССR8, альфавбета6, альфавбета8, сМЕТ, СD8, vWF, амілоїдні білки (наприклад, амілоїд альфа), ММР12, РDК1, та ІgЕ. В одному прикладі подвійно специфічний ліганд містить перший dАb, що зв'язує перший епітоп на VЕGF, та другий dАb, що зв'язує епітоп на відмінній цілі. У ще одному прикладі другий dАb зв'язує епітоп на альбуміні сироватки. В інших втіленнях лігандом є поліспецифічний ліганд, що містить перший епітопзв'язувальний домен, що має специфічність стосовно зв'язування VЕGF та принаймні один інший епітоп-зв'язувальний домен, що має специфічність стосовно зв'язування, відмінну від першого епітоп-зв'язувального домену. Наприклад, першим епітоп-зв'язувальним доменом може бути dАb, що зв'язує VЕGF, або може бути домен, що містить СDR-dАb, що зв'язує VЕGF (наприклад, СDR. прищеплений на придатний білковий каркас або основу, наприклад, афітіло, каркас SрА, домен LDL-рецептору класу А або домен ЕGF) або може бути домен, що зв'язує VЕGF, де домен є вибраним з групи: афітіло, домен SрА, домен LDL-рецептору класу А або домен ЕGF). У деяких втіленнях поліпептид, антагоніст, ліганд або анти-VЕGF мономер dАb характеризується одним або більше з наступного: 1) відокремлюється від VЕGF людини з -1 -7 -1 константою дисоціації (КD) 50 нМ - 20 пМ, та константою швидкості Коff 5 × 10 - 1 × 10 с ; як визначено резонансом поверхневих плазмонів; 2) інгібує зв'язування VЕGF з VЕGFR2 з ІК 50 500 нМ - 50 пМ; 3) нейтралізує VЕGF людини у стандартному випробуванні клітин НUVЕС із ND50 500 нМ - 50 пМ; 4) антагонізує активність VЕGF у стандартному випробуванні клітин із ND50 < 100 нМ (5) інгібує або зменшує ріст пухлин у моделі ксенотрансплантату миші; 6) протистоїть агрегації; 7) секретується у кількості приблизно принаймні 0,5 мг/л, при експресуванні у системі експресії штамів Е. соlі або Рісhіа (наприклад, Р. раstоrіs) або клітин ссавців, як-то СНО; 8) виявляє оборотність; або 9) має ефективність у лікуванні, стримуванні або попередженні запальної хвороби. Посилання зроблено на WО2006038027 та WО 2006059108 та WО 2007049017 стосовно деталей випробувань та тестів, та параметрів, застосовних для умов (1) до (9). В окремихвтіленнях поліпептид, антагоніст, ліганд або мономер dАb відокремлюється від -1 VЕGF людини з константою дисоціації (КD) 50 нМ - 20 пМ, та константою швидкості Коff 5 × 10 -7 -1 1 × 10 с ; як визначено резонансом поверхневих плазмонів; інгібує зв'язування VЕGF з VЕGFR2 (рецептор 2 VЕGF) з ІК50 500 нМ - 50 пМ; та нейтралізує VЕGF людини у стандартному випробуванні клітин НUVЕС із ND50 500 нМ – 50 пМ. В інших конкретних втіленнях поліпептид, антагоніст, ліганд або мономер dАb відокремлюється від VЕGF людини з константою дисоціації -1 -7 -1 (КD) 50 нМ – 20 пМ, константою швидкості Коff 5 × 10 - 1 × 10 с ; як визначено резонансом поверхневих плазмонів; інгібує зв'язування VЕGF з VЕGFR2 з ІК50 500 нМ - 50 пМ. Резистентні до протеази поліпептиди, одиничні мінливі домени імуноглобуліну та антагоністи винаходу застосовувані у терапії, профілактиці та діагностиці хвороб або станів у ссавців, наприклад, людей. Зокрема, вони застосовувані як основа ліків, що можуть зустрітися з протеазою при застосуванні до пацієнта, як-то людини. Наприклад, при застосуванні до шлунково-кишкового тракту (наприклад, перорально, сублінгвально, ректально) поліпептиди, одиничні мінливі домени імуноглобуліну та антагоністи можуть бути підданими дії протеази в одному або більше з нижченаведеного: вищий шлунково-кишковий тракт, нижчий шлунковокишковий тракт, рот, шлунок, тонкий кишечник та товстий кишечник. Одне втілення тому, забезпечує резистентний до протеази поліпептид, одиничний мінливий домен або антагоніст імуноглобуліну для застосування перорально, сублінгвально або ректально до шлунковокишкового тракту пацієнта для лікування та/або попередження хвороби або стану у пацієнта. Наприклад, перорального застосування до пацієнта (наприклад, людини) для лікування та/або попередження VЕGF-опосередкованого стану або хвороби, як-то рак, наприклад, тверда пухлина; запалення та/або автоімунна хвороба. У ще одному прикладі поліпептид, мінливий домен або антагоніст може зустрітися з протеазою при застосуванні (наприклад, інгаляцією або інтраназально) до тканини легень (наприклад, легень або дихальних шляхів). Одне втілення тому, забезпечує застосування резистентного до протеази поліпептиду, одиничного мінливого домену або антагоністу імуноглобуліну до пацієнта (наприклад, до людини) інгаляцією або інтраназально до тканини легень пацієнта для лікування та/або попередження хвороби або стану у пацієнта. Подібним станом може бути астма (наприклад, алергічна астма), СОРD, грип або будь-яка інша легенева 7 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хвороба або стан, розкриті у WО2006038027, що уведено як посилання. У ще одному прикладі поліпептид, мінливий домен або антагоніст може зустрітися з протеазою при застосуванні (наприклад, інтраокулярною ін'єкцією або краплями для очей) до очей пацієнта. Одне втілення тому забезпечує окулярне застосування резистентного до протеази поліпептиду, одиничного мінливого домену або антагоністу імуноглобуліну до пацієнта (наприклад, до людини) для лікування та/або попередження хвороби або стану (наприклад, хвороби або стану очей) у пацієнта. Застосування могло б бути місцевим застосуванням до очей у формі крапель для очей або ін'єкцією в очі. Одне втілення винаходу забезпечує резистентний до протеази поліпептид, одиничний мінливий домен або антагоніст імуноглобуліну для застосування до очей, наприклад, у формі крапель для очей або гелю, або, наприклад, в імплантаті, наприклад, для лікування та/або попередження VЕGF-опосередкованого стану або хвороби очей, як-то АМD (пов'язана з віком макулярна дегенерація). У ще одному прикладі поліпептид, мінливий домен або антагоніст може зустрітися з протеазою при застосуванні (наприклад, інгаляцією або інтраназально) до тканини легень (наприклад, легень або дихальних шляхів). Одне втілення тому, забезпечує застосування до пацієнта (наприклад, до людини) інгаляцією або інтраназально до тканини легень пацієнта для лікування та/або попередження хвороби або стану у пацієнта. Подібним станом може бути рак (наприклад, тверда пухлина, наприклад, рак легень, колоректальний, голови та шиї, панкреатичний, молочної залози, простати або яєчнику), астма (наприклад, алергічна астма), СОРD, або будь-яка інша легенева хвороба або стан, розкриті у WО2006038027, що уведено як посилання. Антагоністи, поліпептиди та одиничні мінливі домени імуноглобуліну згідно з винаходом можуть виявляти поліпшені або відносно високі температури плавлення (Тп), забезпечуючи посилену стабільність. Висока афінність зв'язування цілей може також або альтернативно бути особливістю антагоністів, поліпептидів та мінливих доменів. Одна або більше з цих особливостей, комбінована з резистентністю до протеази, робить антагоністи, мінливі домени та поліпептиди придатними для застосування як ліків у ссавців, як-то людей, де протеази найчастіше можна зустріти, наприклад, для застосування до шлунково-кишкового тракту або тканини легень, або застосування до очей. Таким чином, в одному аспекті винахід стосується антагоністу VЕGF для перорального поставляння. В одному аспекті винахід стосується антагоністу VЕGF для поставляння до шлунково-кишкового тракту пацієнта. В одному аспекті винахід стосується застосування антагоністу VЕGF у виробництві медикаменту для перорального поставляння. В одному аспекті винахід стосується застосування антагоністу VЕGF у виробництві медикаменту для поставляння до шлунково-кишкового тракту пацієнта. В одному втіленні, мінливий домен є резистентним до трипсину та/або принаймні одної іншої протеази, вибраної з групи: еластаза, лейкозим та панкреатин. Наприклад, резистентність є до трипсину та еластази; трипсину та лейкозиму; трипсину та панкреатину; трипсину, еластази та лейкозиму; трипсину, еластази та панкреатину; трипсину, еластази, панкреатину та лейкозиму; або трипсину, панкреатину та лейкозиму. В одному аспекті винахід стосується поставляння у легені антагоністу VЕGF. В одному аспекті винахід стосується застосування антагоністу VЕGF у виробництві медикаменту для поставляння у легені. В одному аспекті винахід стосується застосування антагоністу VЕGF у виробництві медикаменту для поставляння у легені пацієнта. В одному втіленні, мінливий домен є резистентним до лейкозиму. В одному аспекті винахід стосується способу перорального поставляння або поставляння медикаменту до шлунково-кишкового тракту пацієнта, або у легені чи тканину легень або очі пацієнта, де спосіб полягає у застосуванні до пацієнта фармацевтично ефективної кількості антагоністу VЕGF винаходу. В одному аспекті винахід стосується антагоністу VЕGF винаходу для лікування та/або профілактики раку, наприклад, твердої пухлини. В одному втіленні, тверда пухлина є вибраною з групи: рак легень, колоректальний, голови та шиї, панкреатичний, молочної залози, простати або яєчнику. В одному аспекті винахід стосується антагоністу VЕGF винаходу для лікування та/або профілактики судинних проліферативних хвороб, як-то ангіогенез, атеросклероз, та судинних проліферативних хвороб очей, як-то АМD (пов'язана з віком макулярна дегенерація). В одному аспекті винахід стосується антагоністу VЕGF винаходу для лікування та/або профілактики запального стану. В одному аспекті винахід стосується застосування антагоністу VЕGF у виробництві медикаменту для лікування та/або профілактики запального стану. В одному втіленні, стан є вибраним з групи: артрит, розсіяний склероз, запальна хвороба 8 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кишечнику та хронічна обструктивна хвороба легень. Наприклад, в одному аспекті винахід стосується антагоністу VЕGF для лікування та/або профілактики респіраторної хвороби. В одному аспекті винахід стосується застосування антагоністу VЕGF у виробництві медикаменту для лікування та/або профілактики респіраторної хвороби. Наприклад, вказана респіраторна хвороба вибрана з групи: запалення легень, хронічна обструктивна хвороба легень, астма, пневмонія, пневмоніт з гіперчутливістю, легеневий інфільтрат з еозинофілією, хвороба легень внаслідок забруднення оточуючого середовища, пневмонія, бронхоектазія, кістозний фіброз, інтерстиціальна хвороба легень, первісна гіпертензія легень, тромбоемболія легень, розлади плеври, розлади медіастинуму, розлади діафрагми, гіповентиляція, гіпервентиляція, приступи апное уві сні, гострий респіраторний дистрес синдром, мезотеліома, саркома, відторгнення трансплантату, хвороба трансплантат проти хазяїна, рак легень, алергічний риніт, алергія, азбестоз, аспергілома, аспергілоз, бронхоектазія, хронічний бронхіт, емфізема, еозинофільна пневмонія, ідіопатичний фіброз легень, інвазивна пневмококова хвороба, грип, нетуберкульозні мікобактерії, плевральний вилив, пневмоконіоз, пневмоцитоз, пневмонія, актиномікоз легень, альвеолярний диспротеїноз легень, карбункул легень, набряк легень, ембол легень, запалення легень, гістоцитоз Х легень, гіпертензія легень, нокардіоз легень, туберкульоз легень, облітеруючий ендофлебіт легень, ревматоїдна хвороба легень, саркоїдоз, та грануломатоз Вегенера. Наприклад, хворобою є хронічна обструктивна хвороба легень (СОРD). Наприклад, хворобою є астма. Антагоніст винаходу, що містить агент, що інгібує VЕGF (наприклад, де агент є вибраним з групи: фрагменти антитіл (наприклад, Fаb-фрагмент, Fаb’-фрагмент, Fv-фрагмент (наприклад, sсFv, дисульфід-зв'язані Fv), F(аb')2-фрагмент, dАb), ліганди та мономери та полімери dАb (наприклад, гомо- або гетеродимери) може бути локально застосовуваним до тканин або органів, наприклад, до тканини легень (наприклад, легені) або очей суб'єкта, застосовуючи будь-який придатний спосіб. Наприклад, агент може бути локально застосовуваним до тканини легень інгаляцією або інтраназальним застосуванням. Для інгаляції або інтраназального застосування антагоніст VЕGF можна застосовувати, застосовуючи розпилювач, інгалятор, розприскувач, аерозольний розпилювач, інгалятор сухого порошку, дозувальний інгалятор, дозувальний розпилювач, дозувальний розприскувач, або інший придатний інгалятор або інтраназальний пристрій поставляння. Таким чином, в одному втіленні, винахід стосується пристрою поставляння у легені, що містить антагоніст VЕGF. В одному втіленні, пристроєм є інгалятор або інтраназальний пристрій поставляння. В одному втіленні, агент може бути локально застосовуваним до очей за допомогою вживлюваного пристрою поставляння. Таким чином, в одному втіленні, винахід стосується вживлюваного пристрою поставляння, що містить антагоніст VЕGF В одному аспекті винахід стосується пероральної композиції, що містить антагоніст VЕGF. Композицією може бути таблетка, пілюля, капсула, рідина або сироп. В одному аспекті винахід стосується композиції для очей, що містить антагоніст VЕGF, наприклад, композиція може бути рідкими краплями для очей або гелем. В одному втіленні, винахід стосується композиції для поставляння у легені, де композиція містить антагоніст, поліпептид або мінливий домен винаходу з розміром частинок у межах менше, ніж 5 мкм, наприклад, менше, ніж 4,5, 4, 3,5 або 3 мкм (наприклад, у буфері БриттонРобінсона, наприклад, при рН 6,5-8,0, наприклад, при рН 7-7,5, наприклад, при рН 7 або при рН 7,5). В одному втіленні, композиції винаходу є запропонованими при рН від 6,5-8,0, наприклад, 77,5, наприклад, 7, наприклад, 7,5. Мінливі домени згідно з будь-яким аспектом винаходу можуть мати Тп принаймні 50 °C, або D принаймні 55 °C, або принаймні 60 °C, або принаймні 65 С, або принаймні 70 °C. Антагоніст, застосування, спосіб, пристрій або композиція винаходу можуть містити подібний мінливий домен. В одному аспекті винаходу, поліпептиди, мінливі домени, антагоністи або композиції винаходу є по суті стабільними після інкубації (при концентрації поліпептиду або мінливого домену 1 мг/мл) при 37-50 °C для 14 доби у буфері Бриттон-Робінсона або РВS буфер. В одному втіленні, принаймні 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % поліпептиду, антагоністу або мінливого домену залишаються неагрегованими після подібної інкубації при 37 °C. В одному втіленні, принаймні 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % поліпептиду або мінливого домену залишаються мономерними після подібної інкубації при 37 °C. В одному втіленні, принаймні 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % поліпептиду, антагоністу або мінливого домену залишаються неагрегованими після подібної інкубації при 50 °C. В 9 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одному втіленні, принаймні 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % поліпептиду або мінливого домену залишаються мономерними після подібної інкубації при 50 °C. В одному втіленні, не спостерігають агрегації поліпептидів, мінливих доменів, антагоністів після будь-якої подібної інкубації. В одному втіленні, рІ поліпептиду або мінливого домену залишається незмінним або по суті незмінним після інкубації при 37 °C при концентрації поліпептиду або мінливого домену 1 мг/мл у буфері Бриттон-Робінсона. В одному аспекті винаходу, поліпептиди, мінливі домени, антагоністи або композиції винаходу є по суті стабільними після інкубації (при концентрації поліпептиду або мінливого домену 100 мг/мл) при 4 °C протягом 7 діб у буфері Бриттон-Робінсона або РВS при рН 7-7,5 (наприклад, при рН 7 або рН7,5). В одному втіленні, принаймні 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 або 99,5 % поліпептиду, антагоністу або мінливого домену залишаються неагрегованими після подібної інкубації. В одному втіленні, принаймні 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 або 99,5 % поліпептиду або мінливого домену залишаються мономерними після подібної інкубації. В одному втіленні не спостерігають агрегації поліпептидів, мінливих доменів, антагоністів після будь-якої подібної інкубації. В одному аспекті винаходу, поліпептиди, мінливі домени, антагоністи або композиції винаходу є по суті стабільними після розпилення (наприклад, при концентрації поліпептиду або мінливого домену 40 мг/мл), наприклад, при кімнатній температурі, 20 °C або 37 °C, протягом 1 години, наприклад, струминним розпилювачем, наприклад, Раrі LС+ сuр. В одному втіленні, принаймні 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 або 99,5 % поліпептиду, антагоністу або мінливого домену залишаються неагрегованими після подібного розпилення. В одному втіленні, принаймні 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 або 99,5 % поліпептиду або мінливого домену залишаються мономерними після подібного розпилення. В одному втіленні, не спостерігають агрегації поліпептидів, мінливих доменів, антагоністів після будь-якого подібного розпилення. В одному аспекті винахід стосується виділеної або рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, що містить одиничний мінливий домен імуноглобуліну згідно з будь-яким аспектом винаходу, або кодує поліпептид, антагоніст або мінливий домен згідно з будь-яким аспектом винаходу. В одному аспекті винахід стосується вектору, що містить нуклеїнову кислоту. В одному аспекті винахід стосується клітини хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту або вектор. В одному аспекті винахід стосується способу отримання поліпептиду, що містить одиничний мінливий домен імуноглобуліну, спосіб полягає у підтримуванні клітин хазяїна в умовах, придатних для експресії вказаної нуклеїнової кислоти або вектору, за допомогою чого отримують поліпептид, що містить одиничний мінливий домен імуноглобуліну. Спосіб може крім того полягати у виділенні поліпептиду, мінливого домену або антагоністу та як варіант, отриманні варіанту, наприклад, мутованого варіанту, що має поліпшену афінність та/або ND50, ніж мінливий домен або антагоніст виділеного поліпептиду. Способи поліпшення зв'язувальної афінності імуноглобуліну одиничним мінливим доменом є відомими у рівні техніки, наприклад, способи розвинення афінності. В одному аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить одиничний мінливий домен імуноглобуліну, поліпептид або антагоніст за будь-яким аспектом винаходу, та фармацевтично прийнятний носій, наповнювач або розріджувач. В одному втіленні, одиничний мінливий домен або антагоніст імуноглобуліну за будь-яким аспектом винаходу містить сталий домен антитіла, наприклад, антитіла Fс, як варіант, де Nзакінчення Fс є зв'язаним (як варіант, безпосередньо зв'язаним) з С-закінченням мінливого домену. Амінокислотна послідовність придатного Fс є показаною у Фіг. 52b. Поліпептид або мінливий домен винаходу можуть бути виділеними та/або рекомбінантними. В одному аспекті винахід стосується способу селекції резистентного до протеази пептиду або поліпептиду, наприклад, антагоністу судинно-ендотеліального фактору росту (VЕGF), наприклад, анти-VЕGF dАb. Спосіб полягає у забезпеченні набору пептидів або поліпептидів, комбінуванні набору та протеази в умовах, придатних для активності протеази, та отримання пептиду або поліпептиду, що має бажану біологічну активність, за допомогою чого вибирають резистентний до протеази пептид або поліпептид. Набір та протеазу загалом інкубують протягом принаймні 30 хвилин. Будь-яку бажану протеазу можна застосовувати у способі, як-то одну або більше з нижченаведеного: серинпротеаза, цистеїн-протеаза, аспартат-протеази, тіол-протеази, матриксна металопротеаза, карбоксипептидаза (наприклад, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, хімотрипсин, пепсин, папаїн, еластаза, лейкозим, панкреатин, тромбін, плазмін, катепсини (наприклад, катепсин G), протеїназа (наприклад, протеїназа 1, протеїназа 2, протеїназа 3), 10 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 термолізин, хімозин, ентеропептидаза, каспаза (наприклад, каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), калпаїн, фікаїн, клострипаїн, актинідаїн, бромелаїн, та сепараза. В окремих втіленнях протеазою є трипсин, еластаза або лейкозим. Протеаза може також бути забезпеченою біологічним екстрактом, біологічним гомогенатом або біологічним препаратом. Якщо потрібно, спосіб крім того полягає у додаванні інгібітору протеази до комбінації набору та протеази після закінчення інкубації. У деяких втіленнях пептид або поліпептид, що має бажану біологічну активність отримують на основі активності стосовно зв'язування. Наприклад, пептид або поліпептид можна отримувати на основі загального зв'язувального ліганду, як-то білок А, білок Gабо білок L. Активність стосовно зв'язування може також стосуватися специфічного зв'язування з цільовим лігандом. Зразкові цільові ліганди охоплюють АроЕ, Аро-SАА, ВDNF, Кардіотрофін-1, СЕА, СD40, ліганд СD40, СD56, СD38, СD138, ЕGF, рецептор ЕGF, ЕNА-78, Еотаксин, Еотаксин-2, Екзодус-2, FАРα, FGF-кислотний, FGF-основний, фактор росту фібробластів 10, ліганд FLТ3, Фракталкін (СХ3С), GDNF, G-СSF, GМ-СSF, GF-β1, альбумін сироватки людини, інсулін, ІFN-γ, ІGF-І, ІGF-ІІ, ІL-1α, ІL-1β, рецептор ІL-1, рецептор ІL-1типу 1, ІL-2, ІL-3, ІL-4, ІL-5, ІL-6, ІL-7, ІL-8 (72 а.а.), ІL-8 (77 а.а.), ІL-9, ІL-10, ІL-11, ІL-12, ІL-13, ІL-15, ІL-16, ІL-17, ІL-18 (ІGІF), Інгібін α, Інгібін β, ІР-10, фактор росту кератиноцитів 2 (КGF-2), КGF, Лептин, LІF, Лімфотактин, інгібіторна речовина Міллеріана, інгібіторний фактор колоній атрактантний білок моноцитів, М-СSF, МDС (67 а.а.), МDС (69 а.а.), МСР-1 (МСАF), МСР-2, МСР-3, МСР-4, МDС (67 а.а.), МDС (69 а.а.), МІG, МlР-1α, МlР-1β, МІР-3α, МІР-3β, МІР-4, фактор-1 інгібітору мієлоїдного попереднику (МРІF1), NАР-2, Нейртурин, фактор росту нервів, β-NGF, NТ-3, NТ-4, Онкостатин М, РDGF-АА, РDGFАВ, РDGF-ВВ, РF-4, RАNТЕS, SDF1α, SDF1β, SСF, SСGF, фактор стовбурних клітин (SСF), ТАRС, ТGF-α, ТGF-β, ТGF-β2, ТGF-β3, фактор некрозу пухлин(ТNF), ТNF-α, ТNF-β, рецептор І ТNF, рецептор ІІ ТNF, ТNІL-1, ТРО, VЕGF, VЕGF А, VЕGF В, VЕGF С, VЕGF D, рецептор 1 VЕGF, рецептор 2 VЕGF, рецептор 3 VЕGF, GСР-2, GRО/МGSА, GRО-β, GRО-γ, НСС1, І-309, НЕR 1, НЕR 2, НЕR 3, НЕR 4, альбумін сироватки, vWF, амілоїдні білки (наприклад, амілоїд альфа), ММР12, РDК1, ІgЕ, ІL-13Rаl, ІL-13Rа2, ІL-15, ІL-15R, ІL-16, ІL-17R, ІL-17, ІL-18, ІL-18R, ІL-23 ІL-23R, ІL-25, СD2, СD4, СDllа, СD23, СD25, СD27, СD28, СD30, СD40, СD40L, СD56, СD138, АLК5, ЕGFR, FсЕR1, ТGFb, ССL2, ССL18, СЕА, СR8, СТGF, СХСL12 (SDF-1), чімаза, FGF, Фурин, Ендотелін-1, Еотаксини (наприклад, Еотаксин, Еотаксин-2, Еотаксин-3), GМ-СSF, ІСАМ-1, ІСОS, ІgЕ, ІFNα, І-309, інтегрини, L-селектин, МІF, МІР4, МDС, МСР-1, ММР, нейтрофілеластаза, остеопонтин, ОХ-40, РАRС, РD-1, RАNТЕS, SСF, SDF-1, сиглек8, ТАRС, ТGFb, Тромбін, Тіm-1, ТNF, ТRАNСЕ, Триптаза, VЕGF, VLА-4, VСАМ, а4(37, ССR2, ССR3, ССR4, ССR5, ССR7, ССR8, альфавбета6, альфавбета8, сМЕТ, СD8, vWF, амілоїдні білки (наприклад, амілоїд альфа), ММР12, РDК1, та ІgЕ. В окремих втіленнях пептид або поліпептид отримують пенінгом. У деяких втіленнях набір містить систему виявлення. Наприклад, системою виявлення може бути виявлення на бактеріофагах, виявлення на рибосомах, компартменталізація та виявлення на емульсіях, виявлення на дріжджах, виявлення на пуроміцині, виявлення на бактеріях, виявлення на плазмідах, або ковалентні виявлення. Зразкові системи зв'язують кодувальну функцію нуклеїнової кислоти та функціональні характеристики пептиду або поліпептиду, кодованих нуклеїновою кислотою. В окремих втіленнях система виявлення містить відтворювані генетичні комплекти. У деяких втіленнях систем виявлення полягає у виявленні бактеріофагу. Наприклад, бактеріофагом може бути fd, М13, lаmbdа, МS2 або Т7. В окремих втіленнях бактеріофагова система виявлення є багатовалентною. У деяких втіленнях пептид або поліпептид є виявленими як ріll-конденсований білок. В інших втіленнях спосіб крім того полягає в ампліфікації нуклеїнової кислоти, що кодує пептид або поліпептид, що має бажану біологічну активність. В окремих втіленнях нуклеїнову кислоту ампліфікують фаг-ампліфікацією, вирощуванням клітин або полімеразною ланцюговою реакцією. У деяких втіленнях набором є набір одиничних мінливих доменів імуноглобуліну, котрі, наприклад, зв'язуються з судинно-ендотеліальним фактором росту та є його антагоністами (VЕGF). В окремих втіленнях одиничним мінливим доменом імуноглобуліну є мінливий домен важкого ланцюга. У більш конкретних втіленнях мінливим доменом важкого ланцюга є мінливий домен важкого ланцюга людини. В інших втіленнях одиничним мінливим доменом імуноглобуліну є мінливий домен легкого ланцюга. В окремих втіленнях мінливим доменом легкого ланцюга є мінливий домен легкого ланцюга людини. У ще одному аспекті винахід стосується способу селекції пептиду або поліпептиду, що зв'язує цільовий ліганд, наприклад, VЕGF, з високою афінністю з набору пептидів або 11 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліпептидів. Спосіб полягає у забезпеченні набору пептидів або поліпептидів, комбінуванні набору та протеази в умовах, придатних для активності протеази, та отримання пептиду або поліпептиду, що зв'язує цільовий ліганд. Набір та протеазу загалом інкубують протягом принаймні 30 хвилин. Будь-яку бажану протеазу можна застосовувати у способі, як-то одну або більше з нижченаведеного: серинпротеаза, цистеїн-протеаза, аспартат-протеази, тіол-протеази, матриксна металопротеаза, карбоксипептидаза (наприклад, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, хімотрипсин, пепсин, папаїн, еластаза, лейкозим, панкреатин, тромбін, плазмін, катепсини (наприклад, катепсин G), протеїназа (наприклад, протеїназа 1, протеїназа 2, протеїназа 3), термолізин, хімозин, ентеропептидаза, каспаза (наприклад, каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), калпаїн, фікаїн, клострипаїн, актинідаїн, бромелаїн, та сепараза. В окремих втіленнях протеазою є трипсин, еластаза або лейкозим. Протеаза може також бути забезпеченою біологічним екстрактом, біологічним гомогенатом або біологічним препаратом. Якщо потрібно, спосіб крім того полягає у додаванні інгібітору протеази до комбінації набору та протеази після закінчення інкубації. Пептид або поліпептид можна отримувати на основі зв'язування будь-якого бажаного цільового ліганду, як-то цільових лігандів, розкритих тут. В окремих втіленнях пептид або поліпептид отримують пенінгом. У деяких втіленнях набір містить систему виявлення. Наприклад, системою виявлення може бути виявлення на бактеріофагах, виявлення на рибосомах, компартменталізація та виявлення на емульсіях, виявлення на дріжджах, виявлення на пуроміцині, виявлення на бактеріях, виявлення на плазмідах, або ковалентні виявлення. Зразкові системи зв'язують кодувальну функцію нуклеїнової кислоти та функціональні характеристики пептиду або поліпептиду, кодованих нуклеїновою кислотою. В окремих втіленнях система виявлення містить відтворювані генетичні комплекти. У деяких втіленнях систем виявлення полягає у виявленні бактеріофагу. Наприклад, бактеріофагом може бути fd, М13, lаmbdа, МS2 або Т7. У конкретних втіленнях бактеріофагова система виявлення є багатовалентною. У деяких втіленнях пептид або поліпептид є виявленими як ріll-конденсований білок. В інших втіленнях спосіб крім того полягає в ампліфікації нуклеїнової кислоти, що кодує пептид або поліпептид, що має бажану біологічну активність. В окремих втіленнях нуклеїнову кислоту ампліфікують фаг-ампліфікацією, вирощуванням клітин або полімеразною ланцюговою реакцією. У деяких втіленнях набором є набір одиничних мінливих доменів імуноглобуліну, наприклад, котрі зв'язуються з VЕGF та є його антагоністами. В окремих втіленнях одиничним мінливим доменом імуноглобуліну є мінливий домен важкого ланцюга. У більш конкретних втіленнях мінливим доменом важкого ланцюга є мінливий домен важкого ланцюга людини. В інших втіленнях одиничним мінливим доменом імуноглобуліну є мінливий домен легкого ланцюга. В окремих втіленнях мінливим доменом легкого ланцюга є мінливий домен легкого ланцюга людини. У ще одному аспекті винахід стосується способу отримання набору резистентних до протеази пептидів або поліпептидів. Спосіб полягає у забезпеченні набору пептидів або поліпептидів, комбінуванні набору пептидів або поліпептидів та протеази в умовах, придатних для активності протеази, та отримання багатьох пептидів або поліпептидів, що мають бажану біологічну активність, за допомогою чого отримують набір резистентних до протеази пептидів або поліпептидів. У деяких втіленнях набір та протеазу інкубують протягом принаймні 30 хвилин. Наприклад, протеаза, застосована у способі, може бути одною або більше з нижченаведеного: серинпротеаза, цистеїн-протеаза, аспартат-протеази, тіол-протеази, матриксна металопротеаза, карбоксипептидаза {наприклад, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, хімотрипсин, пепсин, папаїн, еластаза, лейкозим, панкреатин, тромбін, плазмін, катепсини {наприклад, катепсин G), протеїназа {наприклад, протеїназа 1, протеїназа 2, протеїназа 3), термолізин, хімозин, ентеропептидаза, каспаза {наприклад, каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), калпаїн, фікаїн, клострипаїн, актинідаїн, бромелаїн, та сепараза. В окремих втіленнях протеазою є трипсин, еластаза або лейкозим. Протеаза може також бути забезпеченою біологічним екстрактом, біологічним гомогенатом або біологічним препаратом. Якщо бажано, спосіб крім того полягає у додаванні інгібітору протеази до комбінації набору та протеази після закінчення інкубації. У деяких втіленнях багато пептидів або поліпептидів, що мають бажану біологічну активність, отримують на основі активності стосовно зв'язування. Наприклад, багато пептидів 12 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або поліпептидів можна отримувати на основі загального зв'язувального ліганду, як-то білок А, білок G або білок L. Активність стосовно зв'язування може також стосуватися специфічного зв'язування з цільовим лігандом, як-то цільовим лігандом, описаним тут. В окремих втіленнях багато пептидів або поліпептидів, що мають бажану біологічну активність, отримують пенінгом. У деяких втіленнях набір містить систему виявлення. Наприклад, системою виявлення може бути виявлення на бактеріофагах, виявлення на рибосомах, компартменталізація та виявлення на емульсіях, виявлення на дріжджах, виявлення на пуроміцині, виявлення на бактеріях, виявлення на плазмідах, або ковалентні виявлення. В окремих втіленнях систем виявлення зв'язує кодувальну функцію нуклеїнової кислоти та функціональні характеристики пептиду або поліпептиду, кодованих нуклеїновою кислотою. В окремих втіленнях система виявлення містить відтворювані генетичні комплекти. У деяких втіленнях систем виявлення полягає у виявленні бактеріофагу. Наприклад, бактеріофагом може бути fd, М13, lаmbdа, МS2 або Т7. В окремих втіленнях бактеріофагова система виявлення є багатовалентною. У деяких втіленнях пептид або поліпептид є виявленими як ріll-конденсований білок. В інших втіленнях спосіб крім того полягає в ампліфікації нуклеїнової кислоти, що кодує ряд пептидів або поліпептидів, що мають бажану біологічну активність. В окремих втіленнях нуклеїнові кислоти ампліфікують фаг-ампліфікацією, вирощуванням клітин або полімеразною ланцюговою реакцією. У деяких втіленнях набором є набір одиничних мінливих доменів імуноглобуліну, наприклад, котрі зв'язуються з VЕGF та є його антагоністами. В окремих втіленнях одиничним мінливим доменом імуноглобуліну є мінливий домен важкого ланцюга. У більш конкретних втіленнях мінливим доменом важкого ланцюга є мінливий домен важкого ланцюга людини. В інших втіленнях одиничним мінливим доменом імуноглобуліну є мінливий домен легкого ланцюга. В окремих втіленнях мінливим доменом легкого ланцюга є мінливий домен легкого ланцюга людини. У ще одному аспекті винахід стосується способу селекції резистентного до протеази поліпептиду, що містить одиничний мінливий домен імуноглобуліну (dАb), що зв'язує цільовий ліганд, наприклад, VЕGF, з набору. В одному втіленні, спосіб полягає у забезпеченні системи виявлення фагу, що містить набір поліпептидів, що містять одиничний мінливий домен імуноглобуліну, комбінуванні системи виявлення фагу та протеази, вибраної з групи: еластаза, лейкозим та трипсин, в умовах, придатних для активності протеази, та отримання фагу, що виявляє поліпептид, що містить одиничний мінливий домен імуноглобуліну, що зв'язує цільовий ліганд. У деяких втіленнях протеазу застосовують при 100 мкг/мл, та комбінаційну систему виявлення фагу та протеазу інкубують приблизно при 37 °C протягом ночі. У деяких втіленнях фаг, що виявляє поліпептид, що містить одиничний мінливий домен імуноглобуліну, що зв'язує цільовий ліганд, отримують зв'язуванням з вказаною ціллю. В інших втіленнях фаг, що виявляє поліпептид, що містить одиничний мінливий домен імуноглобуліну, що зв'язує цільовий ліганд, отримують пенінгом. Винахід також стосується виділеного резистентного до протеази пептиду або поліпептиду, селектовуваного або вибраного способами, описаними тут. В окремому втіленні винахід стосується виділеної протеази (наприклад, трипсину, еластази, лейкозиму) резистентного одиничного мінливого домену імуноглобуліну (наприклад, мінливого домену важкого ланцюга антитіла людини, мінливого домену легкого ланцюга антитіла людини) селектовуваного або вибраного способами, описаними тут. Винахід також стосується виділеної або рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує резистентний до протеази пептид або поліпептид (наприклад, резистентний до трипсину, еластази або лейкозиму одиничний мінливий домен імуноглобуліну) селектовуваний або вибраний способами, описаними тут, та векторів (наприклад, векторів експресії) та клітин хазяїна, що містять нуклеїнові кислоти. Винахід також стосується способу створення резистентного до протеази пептиду або поліпептиду (наприклад, резистентного до трипсину, еластази або лейкозиму одиничного мінливого домену імуноглобуліну) селектовуваного або вибраного способами, описаними тут, що полягає у підтримуванні клітин хазяїна, що містять нуклеїнову кислоту, що кодує резистентний до протеази пептид або поліпептид в умовах, придатних для експресії, за допомогою чого отримують резистентний до протеази пептид або поліпептид. Винахід також стосується резистентного до протеази пептиду або поліпептиду (наприклад, резистентного до трипсину, еластази або лейкозиму одиничного мінливого домену імуноглобуліну) селектовуваного або вибраного способами, описаними тут, для застосування у 13 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 медицині (наприклад, для терапії або діагностики). Винахід також стосується застосування резистентного до протеази пептиду або поліпептиду (наприклад, резистентного до трипсину, еластази або лейкозиму одиничного мінливого домену імуноглобуліну) селектовуваного або вибраного способами, описаними тут, для виробництва медикаменту для лікування хвороб. Винахід також стосується способу лікування хвороб, що полягає у застосуванні до суб'єкта при потребі цього, ефективної кількості резистентного до протеази пептиду або поліпептиду (наприклад, резистентного до трипсину, еластази або лейкозиму одиничного мінливого домену імуноглобуліну) селектовуваного або вибраного способами, описаними тут. Винахід також стосується діагностичного комплекту для визначення, чи є присутнім VЕGF у зразку або яким чином багато VЕGF є у зразку, що містить поліпептид, мінливий домен імуноглобуліну (dАb), або антагоніст винаходу та інструкції для застосування (наприклад, для визначення присутності та/або кількості VЕGF у зразку). У деяких втіленнях комплект крім того містить один або більше допоміжних реагентів, як-то придатний буфер або придатний визначальний реагент (наприклад, відкривно мічене антитіло або його антиген-зв'язувальний фрагмент, що зв'язує поліпептид або dАb винаходу або його асоційована або кон'югована частина. Винахід також стосується пристрою, що містить тверду поверхню, на котрій антагоніст поліпептиду або dАb винаходу є іммобілізованим так, що іммобілізований поліпептид або dАb зв'язує VЕGF. Будь-які придатні тверді поверхні, на котрих можна іммобілізувати антитіло або його антиген-зв'язувальний фрагмент, можна застосовувати, наприклад, скло, пластики, вуглеводи (наприклад, кульки агарози), Якщо потрібно, підкладка може містити або бути модифікованою для вмісту бажаних функціональних груп для полегшення іммобілізації. Пристрій та/або підкладка можуть мати будь-як придатну форму, наприклад, лист, стрижень, стрічка, планшет, слайд, кулька, диск, гель, туба, сфера, чіп або чашка, тощо. У деяких втіленнях пристроєм є мірний стрижень. Фіг. 1 є ілюстрацією кількох сайтів клонування рDОМ13 (аkа рDОМ33), котрі було застосовано для отримання набору виявлення фагу. Фіг. 2 показує кілька циклів з гелями Nоvех 10-20 % Тrісеnе зі зразками dАb від різних моментів часу, що інкубували з трипсином при 40 мкг/мл при 30 °C. Зразки були узятими негайно перед додаванням трипсину, та тоді при одну годину, три години та 24 години після додавання трипсину. Білки проявляли 1х SurеВluе. Гелі ілюструють, що обидва DОМ15-10 та DОМ15-26-501 були значно гідролізованими протягом перших трьох годин інкубації з трипсином. Розщеплення DОМ15-26, DОМ4-130-54 та DОМlh-131-511 тільки стало явним після 24 годин інкубації з трипсином. Фіг. 3 є ілюстрацією амінокислотних послідовностей DОМlh-131-511 та 24 вибраних варіантів. Амінокислоти, що відрізняються від вихідної послідовності у вибраних клонах, є висвітленими (ті, що є ідентичними є помітними за плямами). Петлі, що відповідають СDR1, СDR2 та СDR3, є обведеними рамками. Фіг. 4 є ілюстрацією амінокислотних послідовностей DОМ4-130-54 та 27 вибраних варіантів. Амінокислоти, що відрізняються від вихідної послідовності у вибраних клонах, є висвітленими (ті, що є ідентичними є помітними за плямами). Петлі, що відповідають СDR1, СDR2 та СDR3, є обведеними рамками. Фіг. 5 є ілюстрацією амінокислотної послідовності DОМ15-26-555 та 21 вибраного варіанту. Амінокислоти, що відрізняються від вихідної послідовності у вибраних клонах, є висвітленими (ті, що є ідентичними є помітними за плямами). Петлі, що відповідають СDR1, СDR2 та СDR3, є обведеними рамками. Фіг. 6 є ілюстрацією амінокислотної послідовності DОМ15-10 та 16 вибраних варіантів. Амінокислоти, що відрізняються від вихідної послідовності у вибраних клонах, є висвітленими (ті, що є ідентичними є помітними за плямами). Петлі, що відповідають СDR1, СDR2 та СDR3, є обведеними рамками. Фіг. 7А-7D є графіками ВІАсоrе, що показують зв'язок вихідних dАb, DОМlh-131-511 (Фіг. 7А) та трьох варіантів dАb, DОМlh-131-203 (Фіг. 7В), DОМlh-131-204 (Фіг. 7С) та DОМlh-131-206 (Фіг. 7D), з іммобілізованим ТNFR1 після інкубації з різними концентраціями трипсину у межах 0-100 мкг/мл) протягом ночі при 37 °C. Результати показують, що усі три варіанти є більш резистентними, ніж вихідні, до протеолізу при високих концентраціях трипсину (100 мкг/мл). Фіг. 8А-8С є графіками ВІАсоrе, що показують зв'язок dАb DОМlh-131-511 (Фіг. 8А), DОМlh131-202 (Фіг. 8В) та DОМlh-131-206 (Фіг. 8С) з іммобілізованим ТNFR1 після інкубації з еластазою та лейкозимом протягом ночі. dАb показав збільшену резистентність до протеолізу порівняно з вихідною проти еластази та лейкозиму. 14 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 9 показує два цикли з гелями 4-12 % Nоvех-Тrіs зі зразками dАb DОМlh-131-511, DОМlh131-203, DОМlh-131-204, DОМlh-131-206, DОМlh-131-54, DОМlh-131-201, та DОМlh-131-202 перед інкубацією з трипсином та зразки після інкубації із 100 мкг/мл трипсину протягом 1 години, 3 годин та 24 годин. Фіг. 10А-10С є графіками ВІАсоrе, що показують зв'язок DОМ4-130-54 (Фіг. 10А), DОМ4-130201 (Фіг. 10В) та DОМ4-130-202 (Фіг. 10С) з іммобілізованим конденсованим білком ІL-1R1 після інкубації з різними концентраціями трипсину у межах 0-100 мкг/мл) протягом ночі при 37 °C. Результати показують, що обидва варіанти є більш резистентними, ніж вихідні, до протеолізу при високих концентраціях трипсину (100 мкг/мл). Фіг. 11А-11С є графіками ВІАсоrе, що показують зв'язок DОМ4-130-54 (Фіг. 11А), DОМ4-130201 (Фіг. 11В) та DОМ4-130-202 (Фіг. 11С) з іммобілізованим конденсованим білком ІL-1R1 після інкубації з еластазою та лейкозимом протягом ночі. dАb показав збільшену резистентність до протеолізу порівняно з вихідними проти обох тестованих протеаз. Фіг. 12 є ілюстрацією амінокислотної послідовності DОМ15-26-555 та 6 варіантів. Амінокислоти, що відрізняються від вихідної послідовності у вибраних клонах, є висвітленими (ті, що є ідентичними є помітними за плямами). Фіг. 13А та 13В є графіками ВІАсоrе, що показують зв'язок вихідних dАb, DОМ15-26-555 (Фіг. 13А) та найбільш резистентного до протеази варіанту, DОМ15-26-593 (Фіг. 13В) з іммобілізованим VЕGF. Лідер та варіант порівнювали на ВІАсоrе стосовно зв'язування hVЕGF при концентрації dАb 100 нМ після інкубації з трипсином при концентрації 200 мкг/мл. Реакцію проводили протягом трьох годин або 24 годин при 37 °C. Результати показують, що варіант є більш резистентним, ніж вихідний, до протеолізу після 24 годин обробки трипсином. Фіг. 14 є діаграмою, що показує дію обробки трипсином на зв'язування hVЕGF варіантами DОМ15-26-555. Результати ясно показують, що усі варіанти є більш резистентними, ніж вихідні (DОМ15-26-555) до протеолізу після 24 годин обробки трипсином. Фіг. 15 показує два гелі Nоvех 10-20 % Тrісіnе, що завантажували 15 мкг оброблених та необроблених зразків DОМ15-26-555 або DОМ15-26-593. Зразки були узятими негайно перед додаванням трипсину, та тоді через одну годину, три години та 24 години після додавання трипсину. Білки проявляли 1х SurеВluе. Гелі ілюструють, що профіль резистентності до трипсину DОМ15-26-593 відрізнявся від профілю, показаного ВІАсоrе-експериментом. Фіг. 16 є ілюстрацією амінокислотної послідовності DОМ15-10 та варіанту, DОМ15-10-11. Амінокислоти, що відрізняються від вихідної послідовності у варіанті, є висвітленими (ті, що є ідентичними є помітними за плямами). Фіг. 17А та 17В є графіками ВІАсоrе, що показують зв'язок вихідного, DОМ15-10 (Фіг. 17А) та варіанту, DОМ15-10-11 (Фіг. 17В), з іммобілізованим VЕGF. Вихідний та варіант порівнювали на ВІАсоrе стосовно зв'язування hVЕGF при концентрації dАb 100 нМ після інкубації з трипсином при концентрації 200 мкг/мл. Реакцію проводили протягом одної години, трьох годин та 24 годин при 37 °C. Результати показують, що варіант є більш резистентним, ніж вихідний, до протеолізу після 24 годин обробки трипсином. Фіг. 18 показує два гелі Nоvех 10-20 % Тrісеnе, що завантажували 15 мкг оf зразки DОМ1510 та DОМ15-10-11. Зразки були узятими негайно перед додаванням трипсину, та тоді через одну годину, три години, та 24 години після додавання трипсину. Білки проявляли SurеВluе (1х). Результати показують, що активність стосовно зв'язування у ВІАсоrе-дослідженні безпосередньо відображує цілісність білку. Фіг. 19А-19L ілюструють нуклеотидні послідовності кількох нуклеїнових кислот, що кодують dАb, що є варіантами DОМlh-131-511 або DОМ4-130-54. Нуклеотидні послідовності кодують амінокислотні послідовності, представлені у Фіг. 3 та Фіг. 4, відповідно. Фіг. 20А-20Е ілюструють нуклеотидні послідовності кількох нуклеїнових кислот, що кодують dАb, що є варіантами DОМ15-26-555 або DОМ15-10. Нуклеотидні послідовності кодують амінокислотні послідовності, представлені у Фіг. 5 та Фіг. 6, відповідно. Фіг. 21 показує генетичну карту вектору рDОМ 38. Фіг. 22: Показує гель-цикл на білках Lаbсhір DОМ10-53-474 та DОМ15-26-593, оброблених трипсином, при співвідношенні 25:1 dАb:трипсиня при 30 °C у різні моменти часу. Стрілки показують білок повної довжини. Фіг. 23: Є графіком хроматографії виключення за розміром, що показує високий рівень чистоти, отриманий для кожного зразку після очистки за допомогою ММС-хроматографії, а потім аніонообміном. УФ контролювали при 225 нм та колонку промивали у 1 х РВS із 10 % етанолу (за об'ємом). Процент мономеру розраховували інтегруванням площі піка з базовою корекцією. Фіг. 24: Показує стабільність протеази для DОМlh-131-511, DОМlh-131-202 та DОМlh-131206. 15 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фіг. 25: Є SЕС, що ілюструє 14-добову стабільність DОМlh-131-202, DОМlh-131-206 та DОМlh-131-511 у буфері Бриттон-Робінсона при 37 та 50 °C. Концентрація білку для усіх dАb була 1 мг/мл. SЕС було застосовано для визначення, чи відбулися будь-які зміни у білку при термічному стресі та кількості мономеру, що залишилася у розчині, відносно часу 0 (Т0) зразку. Фіг. 26 А – І: Показують графіки SЕС, що показують вплив термічного стресу (37 та 50 °C) на DОМlh-131-511 (до С),-202 (D – F) та -206 (G – І). Також показано процент мономеру, що залишився у розчині, відносно Т=0 у даний момент часу, Фіг. 27: Показує ІЕF-аналіз DОМlh-131-202, DОМlh-131-206 та DОМlh-131-511 при 24 годинах, 48 годинах та 7 та 14 добах термічного стресу. Зразки інкубували при 37 або 50 °C у буфері Бриттон-Робінсона. Фіг. 28: ТNFR-1 RВА, що показує вплив 14 діб інкубації DОМlh-131-202, DОМlh-131-206 та DОМlh-131-511 при 50 °C. Концентрація білку, як припускали, була 1 мг/мл. Негативний контроль dАb (VН-плацебо), що не зв'язує антиген, показано також. Фіг. 29: Ілюструє вплив зберігання А: DОМlh-131-202, В: DОМlh-131-206 та С: DОМlh-131-511 при 100 мг/мл протягом 7 діб у буфері Бриттон-Робінсона при +4 °C. УФ контролювали при 280 нм. Фіг. 30: Показує дані від тестування розпилювача DОМlh-131-202, DОМlh-131-206 та DОМlh131-511 у Раrі Е-flоw та LС+. Концентрація білку була 5 мг/мл у буфері Бриттон-Робінсона. Фіг. 31: Ілюструє відносні зміни концентрацій мономеру при розпиленні DОМlh-131-202, DОМlh-131-206 та DОМlh-131-511 у буфері Бриттон-Робінсона при 5 мг/мл. Фіг. 32: Показує графіки SЕС DОМlh-131-206 та DОМlh-131-511 у буфері Бриттон-Робінсона після розпилення з Раrі LС+. Фіг. 33: Показує графіки SЕС DОМlh-131-206 при розпиленні протягом 1 години при 40 мг/мл у РВS. Білок у чашковому та аерозольному розпилювачі є більш резистентним до впливу зсуву та термічного стресу, що можна бачити для dАb при розпиленні. Фіг. 34: Показує криві швидкості седиментації для кожного з трьох вихідних білків (DОМlh131-206 та DОМJh-131-511 та DОМlh-131-202) Бімодальний пік, помічений для нижчої концентрації зразку DОМlh-131-206 є артефактом внаслідок просочування зразку з клітин у цьому випадку. Фіг. 35: Показує вплив буферу та пристрою на розмір розпилених крапель GSК 1995056А(DОМlh-131-511). Фіг. 36: Стабільність GSК1995056А (DОМlh-131-511) після розпилення у різних пристроях, оцінена за утворенням димеру, що вимірювали за допомогою SЕС. Фіг. 37: Показує тестування розпилювача GSК1922567А (202), GSК1995057А (206) та GSК1995056А (511) у Раrі Е-flоw та LС+. А) тестування у буфері Бриттон-Робінсона, В) тестування у буфері ПЕГ1000/сахароза. Фіг. 38: Зображує криву дози ТNF-α у випробуванні зв'язування рецептору ТNFR1 людини. Кожний зразок тестували як чотири реплікати. Фіг. 39: Показує інгібувальну дію GSК1922567А(DОМlh-131-202), GSК1995057А (DОМlh-131206) та GSК1995056А (DОМlh-131-511) у випробуванні зв'язування рецептору ТNFR1 людини. Кожний зразок тестували як чотири реплікати. Фіг. 40: Ілюструє потужність DОМ15-26 та DОМ15-26-593 dАb у VЕGF RВА. Фіг. 41: Показує фармакокінетику DМS1529 (DОМ15-26-593) та DМS1545 (DОМ15-26-501) після внутрішньовенного застосування одиничної болюсної дози до щурів при 5 мг/мг Фіг. 42 а: Показує аналіз SЕС-МАLLs (Хроматографія виключення за розміром-багатокутове розсіювання світла лазера) DМS1529 Fс-конденсату (DОМ15-26-593 Fс-конденсат) підтверджуючи мономерні властивості. Показані дві різні партії, що демонструють подібні властивості відносно індексу рефракції (тобто, концентрації; переривчасті лінії) та розсіювання світла (суцільні лінії). Лінія, помічена стрілкою, означає розрахунок молекулярної маси. Фіг. 42b: Показує аналіз АUС (аналітичне ультрацентрифугування) DМS1529 Fс-конденсату (DОМ15-26-593 Fс-конденсат) підтверджуючи мономерні властивості. Одну партію матеріалу тестували при трьох різних концентраціях, апроксимуючи до 0,2, 0,5 & 1,0 мг/мл у РВS-буфері. Аналіз швидкості седиментації підтвердив молекулярну масу приблизно 80 кДа. Фіг. 43: Показує графіки DSС DМS1529 (DОМ15-26-593) та DОМ15-26-501. Фіг. 44: Є VЕGF-зв'язувальною ЕLІSА для DМS1529 (DОМ15-26-593) перед та після, 10 циклів заморожування/розморожування на двох різних партіях матеріалу. Фіг. 45: Показує профіль сумісності DОМ15-26-593 SЕС перед та після 10 циклів заморожування/розморожування. 16 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 46: Ілюструє результати прискореного дослідження стабільності конденсату DМS1529 (DОМ15-26-593 Fс-конденсат); зв'язувальна ЕLІSА, демонструючи активність після 7 діб інкубації при показаній температурі. Фіг. 47А: Показує стабільність DМS1529 (DОМ15-26-593) у циномолгусі людини після 14 & 15 діб інкубації при 37 °C. Фіг. 47В: Показує стабільність DМS1529 (DОМ15-26-593) у сироватці людини після 14 & 15 діб інкубації при 37 °C. Фіг. 48: Показує потужність DОМ15-26 & DОМ15-26-593 dАb як Fс-конденсатів (DМS1564 & 1529 відповідно) у VЕGF RВА. Фіг. 49: Ілюструє інгібування проліферації НUVЕС-клітин конденсатом DМS1529 (DОМ15-26593 Fс-конденсат). Фіг. 50: генетична карта вектору рDоm33. Фіг. 51 а: Зображує амінокислотні послідовності dАb, що зв'язують альбумін сироватки. Фіг. 51 b: Зображує послідовності нуклеїнових кислот dАb, що зв'язують альбумін сироватки. Фіг. 52а: Зображує амінокислотну послідовність DОМ15-26-593-Fс-конденсат Фіг. 52 b: Зображує амінокислотну послідовність антитіла Fс фіг. 52с: Зображує послідовність нуклеїнової кислоти DОМ15-26-593-Fс-конденсату. Винахід описано з посиланням на втілення, які пояснюють його. Слід пам'ятати, що втілення можуть бути по різному комбінованими або відокремленими без відходу від винаходу. Якщо не визначено інше, усі терміни, застосовані тут, мають ті ж значення як звичайно зрозуміло спеціалісту (наприклад, у культурі клітин, молекулярній генетиці, хімії нуклеїнових кислот, способах гібридизації та біохімії). Стандартні способи застосовують для молекулярних, генетичних та біохімічних процесів (дивись загалом, Sаmbrооk еt аt, Моlесulаr Сlоnіng: А Lаbоrаtоrу Маnuаl, 2d еd. (1989) Соld Sрrіng Наrbоr Lаbоrаtоrу Рrеss, Соld Sрrіng Наrbоr, N.Y. та th Аusubеl еt аl, Shоrt Рrоtосоls іn Моlесulаr Віоlоgу (1999) 4 Еd, Jоhn Wіlеу & Sоns, Іnс., котрі є уведеними як посилання) та хімічних процесів. Як застосовано тут, термін "антагоніст судинно-ендотеліального фактору росту (VЕGF)" або "анти-VЕGF-антагоніст", тощо стосується агенту (наприклад, молекули, сполуки), що зв'язує VЕGF та може інгібувати (тобто, одну або більше) функцію VЕGF. Як застосовано тут, "пептид" стосується приблизно 2-50 амінокислот, що є об'єднаними разом пептидними зв'язками. Як застосовано тут, "поліпептид" стосується приблизно принаймні 50 амінокислот, що є об'єднаними разом пептидними зв'язками. Поліпептиди загалом мають третинну структуру та згортаються у функціональні домени. Як застосовано тут, пептид або поліпептид (наприклад, антитіло домену (dАb)), що є "резистентним до розкладання протеазою" по суті не розкладається протеазою, при інкубуванні з протеазою в умовах, придатних для активності протеази. Поліпептид (наприклад, dАb) по суті не розкладається, коли не більше, ніж приблизно 25 %, не більше, ніж приблизно 20 %, не більше, ніж приблизно 15 %, не більше, ніж приблизно 14 %, не більше, ніж приблизно 13 %, не більше, ніж приблизно 12 %, не більше, ніж приблизно 11 %, не більше, ніж приблизно 10 %, не більше, ніж приблизно 9 %, не більше, ніж приблизно 8 %, не більше, ніж приблизно 7 %, не більше, ніж приблизно 6 %, не більше, ніж приблизно 5 %, не більше, ніж приблизно 4 %, не більше, ніж приблизно 3 %, не більше, ніж приблизно 2 %, не більше, ніж приблизно 1 %, або по суті жодного білку не розкладається протеазою після інкубації з протеазою протягом приблизно одної години при температурі, придатній для активності протеази. Наприклад, при 37 або 50 °C. Розкладання білку можна оцінити, застосовуючи будь-який придатний спосіб, наприклад, за допомогою SDS-РАGЕ або функціональним випробуванням (як-то, зв'язування ліганду), що описано тут. Як застосовано тут, "система виявлення" стосується системи, у котрій сукупність поліпептидів або пептидів є придатною для селекції на основі бажаних характеристик, як-то фізичних, хімічних або функціональних характеристик. Системою виявлення може бути придатний набір поліпептидів або пептидів (наприклад, у розчині, іммобілізованих на придатній підкладці). Системою виявлення може також бути система, що застосовує клітинну систему експресії (наприклад, експресії бібліотеки нуклеїнових кислот, наприклад, у трансформованих, інфікованих, трансфектованих або трансдукованих клітинах та виявлення кодованих поліпептидів на поверхні клітин) або ацелюлярну систему експресії (наприклад, компартменталізацію та виявлення на емульсіях). Зразкові системи пов'язують кодувальну функцію нуклеїнової кислоти та фізичні, хімічні та/або функціональні характеристики поліпептиду або пептиду, кодованого нуклеїновою кислотою. Коли застосовують подібну систему виявлення, поліпептиди або пептиди, що мають бажані фізичні, хімічні та/або 17 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 функціональні характеристики, можна вибирати, а нуклеїнову кислоту, що кодує вибраний поліпептид або пептид, можна легко виділяти або отримувати. Ряд систем виявлення, що пов'язують кодувальну функцію нуклеїнової кислоти та фізичні, хімічні та/або функціональні характеристики поліпептиду або пептиду, є відомими у рівні техніки, наприклад, виявлення на бактеріофагах (виявлення фагу, наприклад, виявлення фагеміду), виявлення на рибосомах, компартменталізація та виявлення на емульсіях, виявлення на дріжджах, виявлення на пуроміцині, виявлення на бактеріях, виявлення на плазмідах, ковалентне виявлення тощо. (Дивись, наприклад, ЕР 0436597 (Dуах), U.S. Раtеnt № 6,172,197 (МсСаffеrtу еt аl), U.S. Раtеnt № 6,489,103 (Grіffіths еt аl.).) Як застосовано тут, "набір" стосується сукупності поліпептидів або пептидів, що характеризуються відмінністю амінокислотних послідовностей. Індивідуальні члени набору можуть мати звичайні особливості, як-то звичайні структурні особливості (наприклад, звичайну структуру серцевини) та/або звичайні функціональні особливості (наприклад, дієздатність стосовно зв'язування звичайного ліганду (наприклад, загального ліганду або цільового ліганду)). Як застосовано тут, "функціональний" описує поліпептид або пептид, що має біологічну активність, як-то специфічну активність стосовно зв'язування. Наприклад, термін "функціональний поліпептид" охоплює антитіло або його антиген-зв'язувальний фрагмент, що зв'язує цільовий антиген через його сайт зв'язування антигену. Як застосовано тут, "загальний ліганд" стосується ліганду, що зв'язує суттєву частину (наприклад, по суті усі) функціональних членів даного набору. Загальний ліганд (наприклад, звичайний загальний ліганд) може зв'язувати багато членів даного набору, навіть хоча члени можуть не мати специфічності стосовно зв'язування звичайного цільового ліганду. Загалом присутність функціонального сайту зв'язування загального ліганду на поліпептиді (як показано здатністю зв'язувати загальний ліганд) показує, що поліпептид є коректно згорнутим та функціональним. Придатні приклади загальних лігандів охоплюють суперантигени, антитіла, що зв'язують епітоп, експресований на суттєвій частині функціональних членів набору, тощо. "Суперантиген" є термін рівня техніки, що стосується загальних лігандів, що взаємодіють з членами надродини імуноглобулінів на ділянці, що відрізняється від цільових сайтів зв'язування лігандів з цих білки. Стафілококові ентеротоксини є прикладами суперантигенів, котрі взаємодіють з рецепторами Т-клітин. Суперантигени, що зв'язують антитіла, охоплюють білок G, котрий зв'язує постійний регіон ІgG (Вjоrсk та Кrоnvаll, J. Іmmunоl, 133:969 (1984)); Білок А, котрий зв'язує постійний регіон ІgG та домени V Н (Fоrsgrеn та Sjоquіst, J. Іmmunоl., 97:822 (1966)); та білок L, котрий зв'язує домени Vі. (Вjоrсk, J. Іmmunоl., 740:1194(1988)). Як застосовано тут, "цільовий ліганд" стосується ліганду, котрий є специфічно або селективно зв'язаним з поліпептид або пептид. Наприклад, коли поліпептидом є антитіло або його антиген-зв'язувальний фрагмент, цільовий ліганд може бути будь-яким бажаним антигеном або епітопом. Зв'язування з цільовим антигеном є обумовленим функціональністю поліпептиду або пептиду. Як застосовано тут, антитіло стосується ІgG, ІgМ, ІgА, ІgD або lgЕ або фрагменту (як-то Fаb, F(аb')2, Fv, дисульфід-зв'язані Fv, sсFv, поліспецифічне антитіло із замкненою конформацією, дисульфід-зв'язані sсFv, діатіло) чи похідного від будь-яких видів антитіл у природі, або створеного технологією рекомбінантної ДНК; чи виділеного з сироватки, В-клітин, гібридом, трансфектом, дріжджів або бактерій. Як застосовано тут, "формат антитіла" стосується будь-якої придатної структури поліпептиду, у котрій один або більше мінливих доменів антитіл можуть бути уведеними, щоб надати специфічності стосовно зв'язування антигену на структурі. Різні придатні формати антитіл є відомими у рівні техніки, як-то хімерні антитіла, гуманізовані антитіла, антитіла людини, одинично-ланцюгові антитіла, біспецифічні антитіла, антитіла з важкими ланцюгами, антитіла з легкими ланцюгами, гомодимери та гетеродимери антитіла антитіла з важкими ланцюгами та/або легкими ланцюгами, антиген-зв'язувальні фрагменти будь-чого з вищезгаданого (як-то, Fv-фрагмент (наприклад, одинично-ланцюгові Fv (sсFv), дисульфідзв'язані Fv), Fаb-фрагмент, Fаb’-фрагмент, F(аb')2-фрагмент), антитіла одиничного мінливого домену (наприклад, dАb, Vh, Vhh, Vl), та модифіковані версії будь-що з вищезгаданого (наприклад, модифікованого ковалентним приєднанням поліетиленгліколю або іншого придатного полімеру або гуманізованого Vhh). Вираз "одиничний мінливий домен імуноглобуліну" стосується мінливого домену антитіла (VН, VНН, VL), що специфічно зв'язує антиген або епітоп незалежно від інших регіонів або доменів V. Одиничний мінливий домен імуноглобуліну може бути присутнім у форматі (наприклад, гомо- або гетеро-полімер) з іншими мінливими регіонами або мінливими доменами, де інші регіони або домени не є потрібними для зв'язування антигену одиничним мінливим 18 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 доменом імуноглобуліну (тобто, де одиничний мінливий домен імуноглобуліну зв'язує антиген незалежно від додаткових мінливих доменів). "Антитіло домену" або "dАb" є таким же як "одиничний мінливий домен імуноглобуліну". "Одиничний мінливий домен імуноглобуліну" є таким же як "одиничний мінливий домен імуноглобуліну". "Антитіла одиничного мінливого домену" є таким же як "одиничний мінливий домен імуноглобуліну". Одиничним мінливим доменом імуноглобуліну є в одному втіленні мінливий домен антитіла людини, але також охоплює одиничні мінливі домени антитіл від іншого виду, як-то dАb гризунів (наприклад, як розкрито у WО 00/29004, вміст котрих є уведеними як посилання), вусатої акули-няньки та Саmеlіd Vhh. Саmеlіd Vhh є поліпептидами одиничних мінливих доменів імуноглобуліну, що є похідними від виду, у тому числі верблюда, лами, альпаки, дромадера, та гуанако, котрі продукують важко-ланцюгові антитіла у природі, позбавлені легких ланцюгів. Vhh може бути гуманізованим. "Домен" є згорнутою білковою структурою, котра має третинну структуру, незалежну від решти білку. Загалом, домени є відповідними за дискретні функціональні властивості білків, та у багатьох випадках їх можна додавати, видаляти або переносити до інших білків без втрати функції залишку білку та/або домену. "Одиничний мінливий домен антитіла" є згорнутим доменом поліпептиду, що містить послідовності, характеристичні для мінливих доменів антитіл. Це тому охоплює повні мінливі домени антитіл та модифіковані мінливі домени, наприклад, у котрих одна або більше петель заміщені послідовностями, котрі не є характеристичними для мінливих доменів антитіл, або мінливих доменів антитіл, котрі є скороченими або містять N- або С-кінцеві подовження, а також згорнуті фрагменти мінливих доменів, котрі залишають принаймні активність стосовно зв'язування та специфічність домену повної довжини. Термін "бібліотека" стосується суміші гетерогенних поліпептидів або нуклеїнових кислот. Бібліотека складається з членів, кожний з котрих має одиничний поліпептид або послідовність нуклеїнової кислоти. До цього ступеню, "бібліотека" є синонімом "набору." Різниці послідовностей між членами бібліотек є відповідними за відмінність присутню у бібліотеці. Бібліотека може мати форму простої суміші поліпептидів або нуклеїнових кислот, або може бути у формі організмів або клітин, як-то бактерії, віруси, клітини тварин або рослин тощо, трансформованих бібліотекою нуклеїнових кислот. В одному втіленні, кожний індивідуальний організм або клітина містить тільки один або обмежене число членів бібліотеки. В одному втіленні нуклеїнові кислоти є уведеними у вектори експресії, для дозволу експресії поліпептидів, кодованих нуклеїновими кислотами. В аспекті тому, бібліотека може мати форму сукупності організмів хазяїна, кожний організм містить одну або більше копій вектору експресії, що містить одиничний член бібліотеки у формі нуклеїнової кислоти, котра може бути експресованою для продукування її відповідного поліпептидного члена. Таким чином, сукупності організмів хазяїна можуть кодувати великий набір відмінних поліпептидів. "Універсальна структура" є структурною послідовністю одиничного антитіла, відповідною регіонам антитіла, збереженим у послідовності, яку визначено Каbаt ("Sеquеnсеs оf Рrоtеіns оf lmmunоlоgісаl Іntеrеst", US Dераrtmеnt оf Неаlth аnd Нumаn Sеrvісеs) або, набір або структур відповідної лінії зародків імуноглобуліну людини як визначено Сhоthіа та Lеsk, (1987) J. Моl. Віоl. 196:910-917. Бібліотеки та набори можуть застосувати одиничну структур, або сукупність подібних структур, котрі, як виявлено, дозволяють фактично будь-яку специфічність стосовно зв'язування, однак лише варіюванням у гіпермінливих регіонах. Як застосовано тут, термін "доза" стосується кількості ліганду, застосовуваної до суб'єкта за один раз (у формі одиничних доз), або у двох або більше застосуваннях протягом визначеного часу. Наприклад, доза стосується кількості ліганду (наприклад, ліганду, що містить одиничний мінливий домен імуноглобуліну, що зв'язує цільовий антиген), застосовуваної до суб'єкта протягом одної доби (24 годин) (добова доза), двох доби, одного тижня, двох тижнів, трьох тижнів або одного або більше місяців (наприклад, одиничним застосуванням, або двома або більше застосуваннями). Інтервал між дозами може бути будь-яким. Вираз, "період напівперетворення", стосується часу для зменшення концентрації ліганду у сироватці (наприклад, dАb, поліпептиду або антагоністу) на 50 %, іn vіvо, наприклад, внаслідок розкладання ліганду та/або кліренсу чи секвестрування ліганду за природними механізмами. Ліганди винаходу стабілізуються іn vіvо та їх період напівперетворення збільшується зв'язуванням з молекулами, котрі протистоять розкладанню та/або кліренсу або секвеструванню. Звичайно, подібні молекули є існуючими у природі білками, котрі самі мають довгий період напівперетворення іn vіvо. Період напівперетворення ліганду є збільшеним, якщо його функціональна активність зберігається, іn vіvо, довше, ніж подібного ліганду, котрий не є специфічним стосовно збільшення періоду напівперетворення молекул. Наприклад, ліганд, специфічний стосовно альбуміну сироватки людини (МАЄ) та цільову молекулу порівнюють з 19 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 таким же лігандом, де специфічності до НSА нема, що не є зв'язує НSА, але зв'язує ще одну молекулу. Наприклад, він може зв'язувати третю ціль на клітині. Звичайно, період напівперетворення є збільшеним на 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % або більше. Збільшення у межах 2х, 3х, 4х, 5х, 10х, 20х, 30х, 40х, 50х або більше періоду напівперетворення є можливим. Альтернативно, або на додаток, збільшення у межах до 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 150х періоду напівперетворення є можливим. Як застосовано тут, "гідродинамічний розмір" стосується видимого розміру молекули (наприклад, молекули білку, ліганду) на основі дифузії молекули через водний розчин. Дифузією білку через розчин можна визначити видимий розмір білку, де розмір дають "радіусом Стока" або "гідродинамічним радіусом" частинки білку. "Гідродинамічний розмір" білку залежить від маси та форми (конформації), так, що два білки, що мають ту ж молекулярну масу, можуть мати відмінні гідродинамічні розміри на основі конформації білку. Як позначено тут, термін "конкурує" означає, що зв'язування першої цілі з її упізнавальним зв'язувальним доменом є інгібованим у присутності другого зв'язувального домену, що є специфічним стосовно вказаної упізнаваної цілі. Наприклад, зв'язування може бути інгібованим стерично, наприклад, фізичним блокуванням зв'язувального домену або зміною структури або умов оточення зв'язувального домену так, що його афінність або авідність стосовно цілі є зменшеною. Дивись WО2006038027 стосовно деталей, яким чином провести експерименти ЕLІSА та ВІАсоrе для визначення конкуренції між першим та другим зв'язувальними доменами. Розрахунки "гомології" або "ідентичності" або "подібності" між двома послідовностями (терміни застосовують поперемінно) є проведеними таким чином. Послідовності орієнтують для оптимального порівняння (наприклад, гепи можна уводити в одну або обидві з першої та другої послідовності амінокислот або нуклеїнових кислот для оптимального орієнтування, а негомологічні послідовності можна ігнорувати для порівняння). У втіленні довжина контрольної послідовності, що орієнтували для порівняння, є принаймні 30 %, або принаймні 40 %, або принаймні 50 %, або принаймні 60 %, або принаймні 70 %, 80 %, 90 %, 100 % довжини контрольної послідовності. Амінокислотні залишки або нуклеотиди у відповідних позиціях амінокислот або позиціях нуклеотидів тоді порівнюють. Коли позиція у першій послідовності зайнята тим же амінокислотним залишком або нуклеотидом як відповідна позиція у другій послідовності, тоді молекули є ідентичними у цій позиції (як застосовано тут, "гомологія" амінокислоти або нуклеїнової кислоти є еквівалентною "ідентичності" амінокислоти або нуклеїнової кислоти). Процент ідентичності між двома послідовностями є функцією числа ідентичних позицій у послідовностях, у тому числі числа гепів, та довжини кожного гепу, ці потрібно для оптимального орієнтування двох послідовностей. Орієнтування та гомологію, подібність або ідентичність послідовності амінокислот та нуклеотидів, як визначено тут, можна отримувати та визначати, застосовуючи алгоритм ВLАSТ 2, застосовуючи параметри дефолту (Таtusоvа, Т. А. еt аl, FЕМS Місrоbіоl Lеtt, 774:187-188 (1999). Способи селекції Винахід в одному втіленні стосується поліпептидів та dАb, наприклад, анти-VЕGF dАb, вибраних способом селекції резистентних до протеази пептидів та поліпептидів, що мають бажану біологічну активність, наприклад, зв'язування з VЕGF. Два селективні впливи застосовують в ефективному способі селекції поліпептиди, що є більш стабільними та резистентними до розкладання протеазою та мають бажану біологічну активність. Як описано тут, резистентні до протеази пептиди та поліпептиди загалом залишають біологічну активність. На відміну, чутливі до протеази пептиди та поліпептиди розщеплюються або гідролізуються протеазою у способах, описаних тут, та тому, втрачають їх біологічну активність. Відповідно, резистентні до протеази пептиди або поліпептиди загалом вибирають на основі їх біологічної активності, як-то активності стосовно зв'язування. Способи, описані тут, забезпечують кілька переваг. Наприклад, як розкрито тут, мінливі домени, антагоністи, пептиди або поліпептиди, що є вибраними стосовно резистентності до протеолітичного розкладання одною протеазою (наприклад, трипсином), є також резистентними до розкладання іншими протеазами (наприклад, еластазою, лейкозимом). В одному втіленні резистентність до протеази корелює з вищою температурою плавлення (Тп) пептиду або поліпептиду. Вищі температури плавлення є показовими стосовно більш стабільних мінливих доменів, антагоністів, пептидів та поліпептидів. Резистентність до розкладання протеази також корелює в одному втіленні з високою афінністю зв'язування з цільовими лігандами. Таким чином, способи, описані тут, забезпечують ефективний шлях для селекції, виділення та/або отримання мінливих доменів, антагоністів, пептидів та поліпептидів, що мають бажану біологічну активність, та є добре придатними для іn vіvо терапевтичного та/або діагностичного застосування, оскільки вони є резистентними до протеази та стабільними. В одному втіленні 20 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 резистентність до протеази корелює з поліпшеним РК, наприклад, поліпшеним у порівнянні з n мінливим доменом, антагоністом, пептидом або поліпептидом, що не є резистентним до протеази. Поліпшений РК може бути поліпшеною АUС (площа під кривою) та/або поліпшеним періодом напівперетворення, в одному втіленні резистентність до протеази корелює з поліпшеною стабільністю мінливого домену, антагоністу, пептиду або поліпептиду до зсуву та/або термічного стресу та/або зменшеної схильності агрегувати при розпиленні, наприклад, поліпшеної у порівнянні з мінливим доменом, антагоністом, пептидом або поліпептидом, що не є резистентним до протеази. В одному втіленні резистентність до протеази корелює з поліпшеною стабільністю при зберіганні, наприклад, поліпшеною у порівнянні з мінливим доменом, антагоністом, пептидом або поліпептидом, що не є резистентним до протеази. В одному аспекті одна, дві, три, чотири або усі з переваг є запропонованими, перевагами є резистентність до розкладання протеазою, вища Тп та висока афінність зв'язування з цільовим лігандом. Способи селекції В одному аспекті запропоновано спосіб селекції, виділення та/або отримання пептиду або поліпептиду з бібліотеки або набору пептидів та поліпептидів (наприклад, системи виявлення), що є резистентним до розкладання протеазою (наприклад, одною або більше протеазами). В одному втіленні, спосіб є способом селекції, виділення та/або отримання поліпептиду з бібліотеки або набору пептидів та поліпептидів (наприклад, системи виявлення), що є резистентним до розкладання протеазою (наприклад, одною або більше протеазами). Загалом, спосіб полягає у забезпеченні бібліотеки або набору пептидів або поліпептидів, комбінування бібліотеки або набору з протеазою (як-то трипсин, еластаза, лейкозим, панкреатин, слина) в умовах, придатних для активності протеази, та селекції, виділення та/або отримання пептиду або поліпептиду, що є резистентним до розкладання протеазою та має бажану біологічну активність. Пептиди або поліпептиди, що розкладаються протеазою, загалом мають зменшену біологічну активність або втрачають їх біологічну активність внаслідок активності протеази. Відповідно, пептиди або поліпептиди, що є резистентними до розкладання протеази, можна вибирати, виділяти та/або отримувати, застосовуючи спосіб на основі їх біологічної активності, як-то активності стосовно зв'язування (наприклад, зв'язування загального ліганду, зв'язування специфічного ліганду, зв'язування субстрату), каталітичної активності або іншої біологічної активності. Бібліотеку або набір пептидів або поліпептидів комбінують з протеазою (наприклад, одною або більше протеазами) в умовах, придатних для протеолітичної активності протеази. Стани, що є придатними для протеолітичної активності протеази, та біологічні препарати або суміші, що мають протеолітичну активність, є добре відомими у рівні техніки або можуть бути легко визначеними спеціалістом. Якщо потрібно, придатні умови можна ідентифікувати або оптимізувати, наприклад, оцінюванням активності протеази у межах рН, концентрацій протеази, температур та/або варіюванням бібліотеки або набору, та протеазі дають змогу реагувати. Наприклад, у деяких втіленнях співвідношення (на молярній основі) протеази, наприклад, трипсин, до пептиду або поліпептиду (наприклад, мінливого домену) є 800-80,00 (наприклад, 8000-80000) протеаза:пептид або поліпептид, наприклад, коли 10 мкг/мл протеази застосовують, співвідношення є 800-80000 протеаза:пептид або поліпептид; або, коли 100 мкг/мл протеази застосовують, співвідношення є 8000-80000 протеаза:пептид або поліпептид. В одному втіленні співвідношення (на основі мас) протеази (наприклад, трипсин) до пептиду або поліпептиду (наприклад, мінливого домену) є 1,600-160000 (наприклад, 16000-160000) протеаза:пептид або поліпептид, наприклад, коли 10 мкг/мл протеази застосовують, співвідношення є 1,600-160000 протеаза:пептид або поліпептид; або, коли 100 мкг/мл протеази застосовують, співвідношення є 16000-160000 протеаза:пептид або поліпептид. В одному втіленні, протеазу застосовують при концентрації принаймні 100 або 1000 мкг/мл та співвідношення протеаза: пептид (на молярній основі) протеази, наприклад, трипсину до пептиду або поліпептиду (наприклад, мінливого домену) є 8000-80000 протеаза:пептид або поліпептид. В одному втіленні, протеазу застосовують при концентрації принаймні 10 мкг/мл та співвідношення протеаза: пептид (на молярній основі) протеази, наприклад, трипсин, до пептиду або поліпептиду (наприклад, мінливого домену) є 800-80000 протеаза:пептид або поліпептид. В одному втіленні співвідношення (на основі мас) протеази (наприклад, трипсин) до пептиду або поліпептиду (наприклад, мінливого домену) є 1600-160000 протеаза:пептид або поліпептид, наприклад, коли С = 10 мкг/мл; або, коли С або С = 100 мкг/мл, співвідношення є 16000-160000 протеаза: пептид або поліпептид. В одному втіленні, концентрація (с або с') є принаймні 100 або 1000 мкг/мл протеази. Для тестування індивідуального або виділеного пептиду або поліпептиду (наприклад, мінливого домену імуноглобуліну), наприклад, пептиду 21 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або поліпептиду, що вже виділено з набору або бібліотеки, протеазу можна додавати до розчину пептиду або поліпептиду у придатному буфері (наприклад, РВS) для продукування розчину пептид або поліпептид/протеаза, як-то розчину приблизно принаймні 0,01 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно 0,01 % – 5 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно 0,05 % – 5 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно 0,1 % – 5 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно 0,5 % – 5 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно 1 % – 5 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,01 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,02 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,03 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,04 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,05 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,06 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,07 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,08 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,09 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,1 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,2 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,3 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,4 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,5 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,6 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,7 %» (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,8 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 0,9 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 1 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 2 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 3 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, приблизно принаймні 4 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид, або приблизно 5 % (за масою) протеаза/пептид або поліпептид. Суміш можна інкубувати при температурі, придатній для активності протеази (наприклад, при кімнатній температурі, приблизно 37 °C) та зразки можна брати при інтервалах часу (наприклад, 1 години, 2 години, 3 години тощо). Зразки можна аналізувати стосовно розкладання білку, застосовуючи будь-який придатний спосіб, як-то аналіз SDS-РАGЕ або зв'язування ліганду, та результати можна застосовувати для встановлення часу розкладання. Будь-яку бажану протеазу або протеази можна застосовувати у способах, описаних тут. Наприклад, можна застосовувати одиничну протеазу, будь-які бажані комбінації різних протеаз, або будь-який біологічний препарат, біологічний екстракт, або біологічний гомогенат, що має протеолітичну активність. Не є необхідним, щоб була відомою ідентичність протеази або протеази, що застосовують. Придатні приклади протеаз, що можна застосовувати у будь-якій бажаній комбінації, охоплюють: серин-протеаза, цистеїн-протеаза, аспартат-протеази, тіолпротеази, матриксна металопротеаза, карбоксипептидаза (наприклад, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, хімотрипсин, пепсин, папаїн, еластаза, лейкозим, панкреатин, тромбін, плазмін, катепсини (наприклад, катепсин G), протеїназа (наприклад, протеїназа 1, протеїназа 2, протеїназа 3), термолізин, хімозин, ентеропептидаза, каспаза (наприклад, каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), калпаїн, фікаїн, клострипаїн, актинідаїн, бромелаїн, сепараза тощо. Придатні біологічні екстракти, гомогенати та препарати, що мають протеолітичну активність, охоплюють слину, слиз (як-то шлунковий слиз, назальний слиз, бронхіальний слиз), бронхоальвеолярний лаваж, гомогенат легень, екстракт легень, панкреатичний екстракт, шлункову рідину, слину, розриви тощо. Протеазу застосовують у кількості, придатній для протеолітичного розкладання. Наприклад, що описано тут, протеазу можна застосовувати приблизно при 0,01 % – 5 % (за масою, протеаза/пептид або поліпептид). Коли протеаза є комбінованою з системою виявлення, що містить набір пептидів або поліпептидів (наприклад, системою виявлення фагу), протеазу можна застосовувати при концентрації приблизно 10 мкг/мл – 3 мг/мл, приблизно 10 мкг/мл, приблизно 20 мкг/мл, приблизно 30 мкг/мл, приблизно 40 мкг/мл, приблизно 50 мкг/мл, приблизно 60 мкг/мл, приблизно 70 мкг/мл, приблизно 80 мкг/мл, приблизно 90 мкг/мл, приблизно 100 мкг/мл, приблизно 200 мкг/мл, приблизно 300 мкг/мл, приблизно 400 мкг/мл, приблизно 500 мкг/мл, приблизно 600 мкг/мл, приблизно 700 мкг/мл, приблизно 800 мкг/мл, приблизно 900 мкг/мл, приблизно 1000 мкг/мл, приблизно 1,5 мг/мл, приблизно 2 мг/мл, приблизно 2,5 мг/мл або приблизно 3 мг/мл. Протеазу інкубують з сукупністю пептидів або поліпептидів (бібліотекою або набором) при температурі, що є придатною для активності протеази. Наприклад, протеазу та сукупність пептидів або поліпептидів можна інкубувати при температурі приблизно 20 °C – 40 °C 22 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, при кімнатній температурі, приблизно 20 °C, приблизно 21 °C, приблизно 22 °C, приблизно 23 °C, приблизно 24 °C, приблизно 25 °C, приблизно 26 °C, приблизно 27 °C, приблизно 28 °C, приблизно 29 °C, приблизно 30 °C, приблизно 31 °C, приблизно 32 °C, приблизно 33 °C, приблизно 34 °C, приблизно 35 °C, приблизно 36 °C, приблизно 37 °C, приблизно 38 °C, приблизно 39 °C, приблизно 40 °C). Протеазу та сукупність пептидів або поліпептидів інкубують разом протягом часу, достатнього для протеолітичного розкладання. Наприклад, сукупність пептидів або поліпептидів можна інкубувати разом з протеазою протягом приблизно 30 хвилин – 24 або приблизно 48 годин. Y деяк приклади, сукупність пептидів або поліпептидів інкубують разом з протеазою протягом ночі, або протягом приблизно принаймні 30 хвилин, приблизно 1 годин, приблизно 1,5 годин, приблизно 2 годин, приблизно 3 годин, приблизно 4 годин, приблизно 5 годин, приблизно 6 годин, приблизно 7 годин, приблизно 8 годин, приблизно 9 годин, приблизно 10 годин, приблизно 11 годин, приблизно 12 годин, приблизно 13 годин, приблизно 14 годин, приблизно 15 годин, приблизно 16 годин, приблизно 17 годин, приблизно 18 годин, приблизно 19 годин, приблизно 20 годин, приблизно 21 годин, приблизно 22 годин, приблизно 23 годин, приблизно 24 годин, приблизно 48 годин, або довше Загалом бажано, принаймні у ранніх циклах селекції (наприклад, коли застосовують систему виявлення), щоб протеаза зменшувала число клонів, що мають бажану біологічну активність, що вибрано для принаймні одного значення порядку, у порівнянні з селекціями, що не охоплюють інкубації з протеазою. Зокрема приклади, кількість протеаз та умов, застосованих у способах, є достатніми для зменшення числа отриманих клонів приблизно принаймні на один lоg (фактор 10), приблизно принаймні на 2 lоg (фактор 100), приблизно принаймні на 3 lоg (фактор 1000) або приблизно принаймні на 4 lоg (фактор 10000). Придатні кількості протеази та умови інкубації, що повинні призводити до бажаного зменшення отриманих клонів, можуть бути легко визначеними, застосовуючи звичайні способи, запропоновані тут. Протеазу та сукупність пептидів або поліпептидів можна комбінувати та інкубувати, застосовуючи будь-який придатний спосіб (наприклад, іn vіtrо, іn vіvо або ех vіvо). Наприклад, протеазу та сукупність пептидів або поліпептидів можна комбінувати у придатному контейнері та тримати нерухомо, струшувати, тощо, при температурі, придатній для активності протеази. Якщо потрібно, протеазу та сукупність пептидів або поліпептидів можна комбінувати у системі іn vіvо або ех vіvо, як-то уведеннням сукупності поліпептидів (наприклад, виявленням бібліотеки фагів або набору) у придатній тварині (наприклад, миші), та після достатнього часу для пасивації активності протеази, отримують сукупності пептидів або поліпептидів. У ще одному прикладі орган або тканину обприскують сукупністю поліпептидів {наприклад, виявленням бібліотеки фагів або набором), та після достатнього часу для пасивації активності протеази, отримують сукупності пептидів або поліпептидів. Після інкубації резистентний до протеази пептид або поліпептид можна вибирати на основі бажаної біологічної активності, як-то активності стосовно зв'язування. Якщо потрібно, інгібітор протеази можна додавати перед селекцією. Будь-який придатний інгібітор протеази (або комбінація двох або більше інгібіторів протеази), що повинні по суті не перешкоджати процесу селекції, можна застосовувати. Приклади придатних інгібіторів протеази охоплюють: а1-антитрипсин, а2-макроглобулін, амастатин, антипаїн, антитромбін ІІІ, апротинін, 4-(2Аміноетил)бензенсульфонілфлуорид гідрохлорид (АЕВSF), (4-Амідино-феніл)-метансульфонілфлуорид (АРМSF), бестатин, бензамідин, хімостатин, 3,4-дихлорізокумарин, діізопропілфлуорфосфат (DІFР), Е-64, етилендіамін тетраоцтову кислоту (ЕДТА), еластатиналь, лейпептин, N-Етилмалеїнімід, фенілметилсульфонілфлуорид (РМSF), пепстатин, 1,10фенантролін, фосфорамідон, інгібітори серин-протеази, N-тозил-L-лізин-хлорметилкетон (ТLСК), Nа-тозил-фе-хлорметилкетон (ТРСК) тощо. На додаток, багато препаратів, що містять інгібітори кількох класів протеази, є комерційно доступними (наприклад, повний інгібітор протеази Роше (Rосhе Dіаgnоstісs Соrроrаtіоn; Іndіаnароlіs, Y, USА), котрий інгібує хімотрипсин, термолізин, папаїн, проназу, панкреатичний екстракт та трипсин). Резистентний до протеази пептид або поліпептид можна вибирати, застосовуючи спосіб селекції за бажаною біологічною активністю, котрий дозволяє розрізняти пептиди та поліпептиди, що мають бажану біологічну активність, та вибирати серед пептидів та поліпептидів, що не мають бажану біологічну активність. Загалом, пептиди або поліпептиди, що розщеплені або гідролізовані протеазою, позбавлені їх біологічної активності, тоді як резистентні до протеази пептиди або поліпептиди залишаються функціональними. Таким чином, придатні випробування біологічної активності можна застосовувати для селекції резистентних до протеази пептидів або поліпептидів. Наприклад, звичайну зв'язувальну функцію (наприклад, зв'язування загального ліганду, зв'язування специфічного ліганду, або зв'язування субстрату) можна оцінити, застосовуючи придатні випробування зв'язування 23 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, ЕLІSА, пенінг). Наприклад, поліпептиди, що зв'язують цільовий ліганд або загальний ліганд, як-то білок А, білок L або антитіло, можна вибирати, виділяти та/або отримувати пенінгом або, застосовуючи матрикс з придатною афінністю. Пенінгу можна досягати додаванням розчину ліганду (наприклад, загального ліганду, цільового ліганду) до придатної посудини (як-то туба, чашка Петрі) та надання змоги ліганду покрити стінки посудини. Надлишок ліганду можна змити та поліпептиди (наприклад, виявлення бібліотеки фагів) можна додавати до посудини та посудину тримати в умовах, придатних для зв'язування поліпептидами іммобілізованого ліганду. Незв'язаний поліпептид можна змити, а зв'язані поліпептиди можна отримувати, застосовуючи будь-який придатний спосіб, як-то вискоблювання або зниження рН, наприклад. Коли застосовують систему виявлення фагу, зв'язування можна тестувати у фаг-ЕLІSА. ФагЕLІSА можна проводити будь-яким придатним способом. В одному прикладі популяції фагу, отримані на кожному циклі селекції можна скринувати стосовно зв'язування за допомогою ЕLІSА відносно вибраного цільового ліганду або загального ліганду для ідентифікації фагу, що виявляє резистентність до пептидів або поліпептидів протеази. Якщо потрібно, розчинні пептиди та поліпептиди можна тестувати стосовно зв'язування з цільовим лігандом або загальним лігандом, наприклад, за допомогою ЕLІSА, застосовуючи реагенти, наприклад, проти С- чи N-кінцевої мітки (дивись, наприклад, Wіntеr еt аl. (1994) Аnn. Rеv. Іmmunоlоgу 12, 433-55 та посилання звідти). Відмінність вибраного фагу можна також оцінювати гель-електрофорезом продуктів РСR (Маrks еt аl. 1991, вище; Nіssіm еt аl. 1994 вище), зондуванням (Тоmlіnsоn еt аl, 1992)./. Моl. Віоl. 227, 776) або секвенсуванням вектору ДНК. На додаток до специфічності стосовно VЕGF, антагоніст або поліпептид (наприклад, подвійно специфічний ліганд), що містить анти-VЕGF резистентний до протеази поліпептид [наприклад, одиничний мінливий домен антитіла) може мати специфічність стосовно зв'язування загального ліганду або будь-якого бажаного цільового ліганду, як-то білки людини або тварин, охоплюючи цитокіни, фактори росту, рецептори цитокіну, рецептори фактору росту, ферменти (наприклад, протеази), кофактори для ферментів, ДНК-зв'язувальні білки, ліпіди та вуглеводи. У деяких втіленнях резистентний до протеази пептид або поліпептид (наприклад, dАb) або антагоніст зв'язує VЕGF у тканині легень. В одному втіленні, антагоніст або поліпептид також зв'язує наступну ціль у тканині легень. Коли систему виявлення (наприклад, систему виявлення, що зв'язує кодувальну функцію нуклеїнової кислоти та функціональні характеристики пептиду або поліпептиду, кодованих нуклеїновою кислотою) застосовують у способах, описаних тут, вона може бути часто сприятливою стосовно ампліфікації або збільшення числа копій нуклеїнових кислот, що кодують вибрані пептиди або поліпептиди. Це забезпечує ефективний шлях отримання достатньої кількості нуклеїнових кислот та/або пептидів або поліпептидів для додаткових циклів селекції, застосовуючи способи, описані тут, або інші придатні способи, або для отримання додаткових наборів (наприклад, наборів розвинення афінності). Таким чином, у деяких втіленнях способи полягають у застосуванні систем виявлення (наприклад, що зв'язує кодувальну функцію нуклеїнової кислоти та функціональні характеристики пептиду або поліпептиду, кодованих нуклеїновою кислотою, як-то виявлення фагу) та крім того полягає в ампліфікації або збільшенні числа копій нуклеїнової кислоти, що кодує вибраний пептид або поліпептид. Нуклеїнові кислоти можна ампліфікувати, застосовуючи будь-які придатні способи, як-то фаг-ампліфікацією, вирощуванням клітин або полімеразною ланцюговою реакцією. Способи, описані тут, можна застосовувати як частину програми виділення резистентних до протеази пептидів або поліпептидів, наприклад, dАb, що може містити, якщо потрібно, інші придатні способи селекції. У цих ситуаціях, способи, описані тут, можна застосовувати коли завгодно у програмі, як-то перед або після інших способів селекції. Способи, описані тут, можна також застосовувати для забезпечення двох або більше циклів селекції, що описано тут. В одному прикладі запропоновано спосіб селекції пептиду або поліпептиду (наприклад, dАb), що специфічно зв'язує VЕGF та є резистентним до розкладання трипсином, що полягає у забезпеченні бібліотеки або набору пептидів або поліпептидів, комбінуванні бібліотеки або набору з трипсином в умовах, придатних для протеолітичного розщеплення трипсином, та селекції, виділення та/або отримання пептиду або поліпептиду, що є резистентним до розкладання трипсином та специфічно зв'язує VЕGF. В окремих втіленнях запропоновано спосіб селекції одиничного мінливого домену імуноглобуліну (dАb), що є резистентним до розкладання трипсином та специфічно зв'язує VЕGF. У цих втіленнях бібліотеку або набір, що містить dАb, запропоновано та комбіновано з трипсином (або біологічним препаратом, екстрактом або гомогенатом, що містить трипсин) в 24 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 умовах, придатних для протеолітичного розщеплення трипсином. Резистентні до трипсину dАb, що зв'язують VЕGF, є вибраними. Наприклад, резистентний до трипсину dАb по суті не розкладається при інкубуванні при 37 °C у 0,04 % (за масою) розчині трипсину протягом принаймні 2 годин. В одному втіленні, резистентний до трипсину dАb по суті не розкладається при інкубуванні при 37 °C у 0,04 % (за масою) розчині трипсину протягом принаймні 3 годин. В одному втіленні, резистентний до трипсину dАb по суті не розкладається при інкубуванні при 37 °C у 0,04 % (за масою) розчині трипсину протягом принаймні 4 годин, приблизно принаймні 5 годин, приблизно принаймні 6 годин, приблизно принаймні 7 годин, приблизно принаймні 8 годин, приблизно принаймні 9 годин, приблизно принаймні 10 годин, приблизно принаймні 11 годин, або приблизно принаймні 12 годин. У зразковому втіленні запропоновано спосіб селекції одиничного мінливого домену імуноглобуліну (dАb), що є резистентним до розкладання трипсином та специфічно зв'язує VЕGF. Спосіб полягає у забезпеченні системи виявлення фагу, що містить набір поліпептидів, що містять одиничний мінливий домен імуноглобуліну, комбінуванні системи виявлення фагу з трипсином (100 мкг/мл) та інкубуванні суміш приблизно при 37 °C, наприклад, протягом ночі (наприклад, приблизно 12-16 годин), та тоді селекції фагу, що виявляє dАb, що специфічно зв'язує VЕGF. У ще одному прикладі спосіб є для селекції пептиду або поліпептиду, наприклад, dАb, що є резистентним до розкладання еластазою, що полягає у забезпеченні бібліотеки або набору пептидів або поліпептидів, комбінуванні бібліотеки або набору з еластазою (або біологічним препаратом, екстрактом або гомогенатом, що містить еластазу) в умовах, придатних для протеолітичного розщеплення еластазою, та селекції, виділенні та/або отриманні пептиду або поліпептиду, що є резистентним до розкладання еластазою та має VЕGF-активність стосовно зв'язування. В окремих втіленнях запропоновано спосіб селекції одиничного мінливого домену імуноглобуліну (dАb), що є резистентним до розкладання еластазою та зв'язує VЕGF. У цих втіленнях бібліотеку або набір, що містить dАb, запропоновано та комбіновано з еластазою (або біологічним препаратом, екстрактом або гомогенатом, що містить еластазу) в умовах, придатних для протеолітичного розщеплення еластазою. Резистентні до еластази dАb, що специфічно зв'язують VЕGF, є вибраними. Наприклад, резистентний до еластази dАb по суті не розкладається при інкубуванні при 37 °C у 0,04 % (за масою) розчині еластази протягом принаймні 2 годин. В одному втіленні, резистентний до еластази dАb по суті не розкладається при інкубуванні при 37 °C у 0,04 % (за масою) розчині еластази протягом принаймні 12 годин. В одному втіленні резистентний до еластази dАb по суті не розкладається при інкубуванні при 37 °C у 0,04 % (за масою) розчині еластази протягом принаймні 24 годин, приблизно принаймні 36 годин, або приблизно принаймні 48 годин. У втіленні запропоновано спосіб селекції одиничного мінливого домену імуноглобуліну (dАb), що є резистентним до розкладання еластазою та зв'язує VЕGF. Спосіб полягає у забезпеченні системи виявлення фагу, що містить набір поліпептидів, що містять одиничний мінливий домен імуноглобуліну, комбінуванні системи виявлення фагу з еластазою (приблизно 100 мкг/мл) та інкубуванні суміші приблизно при 37 °C, наприклад, протягом ночі (наприклад, приблизно 12-16 годин), та тоді селекції фагу, що виявляє dАb, що специфічно зв'язують VЕGF. В одному прикладі запропоновано спосіб селекції пептиду або поліпептиду (наприклад, dАb), що є резистентним до розкладання лейкозимом, що полягає у забезпеченні бібліотеки або набору пептидів або поліпептидів, комбінуванні бібліотеки або набору з лейкозимом (або біологічним препаратом, екстрактом або гомогенатом, що містить лейкозим) в умовах, придатних для протеолітичного розщеплення лейкозимом, та селекції, виділенні та/або отриманні пептиду або поліпептиду, що є резистентним до розкладання лейкозимом та має специфічну VЕGF-активність стосовно зв'язування. В окремих втіленнях запропоновано спосіб селекції одиничного мінливого домену імуноглобуліну (dАb), що є резистентним до розкладання лейкозимом та зв'язує VЕGF. У цих втіленнях бібліотеку або набір, що містить dАb, запропоновано та комбіновано з лейкозимом (або біологічним препаратом, екстрактом або гомогенатом, що містить лейкозим) в умовах, придатних для протеолітичного розщеплення лейкозимом. Резистентні до лейкозиму dАb, що специфічно зв'язують VЕGF, є вибраними. Наприклад, резистентний до лейкозиму dАb по суті не розкладається при інкубуванні при 37 °C у 0,04 % (за масою) розчині лейкозиму протягом принаймні 2 годин. В одному втіленні, резистентний до лейкозиму dАb по суті не розкладається при інкубуванні при 37 °C у 0,04 % (за масою) розчині лейкозиму протягом принаймні 12 годин. В одному втіленні, резистентний до лейкозиму dАb по суті не розкладається при інкубуванні при 37 °C у 25 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 0,04 % (за масою) розчині лейкозиму протягом принаймні 24 годин, приблизно принаймні 36 годин, або приблизно принаймні 48 годин. У втіленні запропоновано спосіб селекції одиничного мінливого домену імуноглобуліну (dАb), що є резистентним до розкладання лейкозимом та специфічно зв'язує VЕGF. Спосіб полягає у забезпеченні системи виявлення фагу, що містить набір поліпептидів, що містять одиничний мінливий домен імуноглобуліну, комбінуванні системи виявлення фагу з лейкозимом (приблизно 100 мкг/мл) та інкубуванні суміш приблизно при 37 °C, наприклад, протягом ночі (наприклад, приблизно 12-16 годин), та селекції фагу, що виявляє dАb, що специфічно зв'язують VЕGF. У ще одному аспекті запропоновано спосіб отримання набору резистентних до протеази пептидів або поліпептидів (наприклад, dАb). Спосіб полягає у забезпеченні набору пептидів або поліпептидів; комбінуванні набору пептидів або поліпептидів та протеази в умовах, придатних для активності протеази; та отримання багатьох пептидів або поліпептидів, що специфічно зв'язують VЕGF, за допомогою чого отримують набір резистентних до протеази пептидів або поліпептидів. Протеази, системи виявлення, умови для активності протеази, та способи селекції пептидів або поліпептидів, що є придатними для застосування у способі, є описаними тут стосовно інших способів. У деяких втіленнях застосовують систему виявлення (наприклад, систему виявлення, що зв'язує кодувальну функцію нуклеїнової кислоти та функціональні характеристики пептиду або поліпептиду, кодованих нуклеїновою кислотою), що містить набір пептидів або поліпептидів, а спосіб крім того полягає в ампліфікації або збільшенні числа копій нуклеїнових кислот, що кодують багато вибраних пептидів або поліпептидів. Нуклеїнові кислоти можна ампліфікувати, застосовуючи будь-який придатний спосіб, як-то фаг-ампліфікацією, вирощуванням клітин або полімеразною ланцюговою реакцією. В окремому втіленні запропоновано спосіб отримання набору резистентних до протеази поліпептидів, що містять анти-VЕGF dАb. Спосіб полягає у забезпеченні набору поліпептидів, що містять анти-VЕGF dАb; комбінуванні набору пептидів або поліпептидів та протеази (як-то трипсин, еластаза, лейкозим) в умовах, придатних для активності протеази; та отримання багатьох поліпептидів, що містять dАb, що мають специфічність стосовно зв'язування VЕGF. Спосіб можна застосовувати для продукування простого набору, або набору, що є зміщеним до бажаної специфічності стосовно зв'язування, як-то розвинення афінності набору на основі лідерного dАb, що має специфічність стосовно зв'язування VЕGF. Системи виявлення поліпептидів В одному втіленні, набір або бібліотека пептидів або поліпептидів, запропонованих для застосування у способах, описаних тут містять придатну систему виявлення. Система виявлення може протистояти розкладання протеазою (наприклад, одиничною протеазою або комбінацією протеаз, та будь-яким біологічним препаратом, екстрактом або гомогенатом, що має протеолітичну активність (наприклад, слини, слизу (як-то шлунковий слиз, назальний слиз, бронхіальний слиз), бронхоальвеолярного лаважу, гомогенатуі легень, екстракту легень, панкреатичного екстракту, шлункової рідини, слини, розривів тощо). Система виявлення та зв'язок між системою виявлення та виявленим поліпептидом є в одному втіленні принаймні як резистентні до протеази як найбільш стабільні пептиди або поліпептиди набору. Це дозволяє легко виділяти та/або ампліфікувати нуклеїнову кислоту, що кодує вибраний виявлений поліпептид. В одному прикладі резистентний до протеази пептид або поліпептид, наприклад, dАb, можна вибирати, виділяти та/або отримувати з набору пептидів або поліпептидів, що є у розчині, або є ковалентно або нековалентно приєднаним до придатної поверхні, як-то пластик або скло (наприклад, мікротитрувальний планшет, поліпептидна матриця, як-то мікроматриця), Наприклад, можна застосовувати матрицю пептидів на поверхні, що розміщує кожний відмінний член бібліотеки (наприклад, унікальну послідовність пептиду) у дискретному попередньо визначеному знаходженні у матриці. Ідентичність кожного члена бібліотеки у подібній матриці можна визначати за його просторовим знаходженням у матриці. Знаходження у матриці, де відбуваються зв'язувальні взаємодії між цільовим лігандом, наприклад, та реактивними членами бібліотек, можна визначати таким чином для ідентифікації послідовностей реактивних членів на основі просторового знаходження. (Дивись, наприклад, U.S. Раtеnt № 5,143,854, WО 90/15070 та WО 92/10092). В одному втіленні, способи застосовують систему виявлення, що зв'язує кодувальну функцію нуклеїнової кислоти та фізичні, хімічні та/або функціональні характеристики поліпептиду, кодованого нуклеїновою кислотою. Подібна система виявлення може містити 26 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 багато відтворюваних генетичних комплектів, як-то бактеріофаг або клітини (бактерії). В одному втіленні, система виявлення містить бібліотеку, як-то бібліотеку виявлення бактеріофагів. Ряд придатних систем виявлення бактеріофагів (наприклад, системи моновалентного виявлення та багатовалентного виявлення) описані. (Дивись, наприклад, Grіffіths еt аl., U.S. Раtеnt № 6,555,313 Вl (уведено як посилання); Jоhnsоn еl аl., U.S. Раtеnt № 5,733,743 (уведено як посилання); МсСаffеrtу еt аl., U.S. Раtеnt № 5,969,108 (уведено як посилання); Мullіgаn-Кеhое, U.S. Раtеnt № 5,702,892 (Уведено як посилання); Wіntеr, G. еt аl. Аnnu. Rеv. Іmmunоl. 72:433-455 (1994); Sоumіllіоn, Р. еt аl, Аррl. Віосhеm. Віоtесhnоі 47(2-3):175-189 (1994); Саstаgnоlі, L. еt аl, Соmb. Сhеm. Ніgh Тhrоughрut Sсrееn, 4(2):І21-І33 (2001).) Пептиди або поліпептиди, виявлені системою виявлення бактеріофагів можуть бути виявленими на будь-якому придатному бактеріофазі, як-то волокнистий фаг (наприклад, fd, М13, Fl), літичний фаг (наприклад, Т4, Т7, lаmbdа), або РНК-фаг (наприклад, МS2), наприклад. Загалом, бібліотека фагу, що виявляє набір пептидів або поліпептидів фагу, як конденсовані білки з придатним білком оболонки фагу (наприклад, ріll-білок fd), отримують або пропонують. Конденсований білок може виявляти пептиди або поліпептиди на верхівці білку оболонки фагу, або якщо потрібно, у внутрішній позиції. Наприклад, виявлений пептид або поліпептид може бути присутнім у позиції, що є аміно-кінцевою до домену 1 ріll. (Домен 1 ріll також позначено як Nl.) Виявлений поліпептид може бути безпосередньо конденсованим з доменом-ріll (наприклад, N-закінченням домену 1 ріll) або конденсованим з доменом-ріll через лінкер. Якщо потрібно, конденсат може крім того містити мітку (наприклад, епітоп mус, мітку Ніs). Бібліотеки, що містять набір пептидів або поліпептидів, що є виявленими як конденсовані білки з білком оболонки фагу можна отримувати, застосовуючи будь-які придатні способи, як-то уведеннням бібліотеки векторів фагу або векторів фагеміду, що кодують виявлені пептиди або поліпептиди у придатних бактеріях хазяїна, та культивуванням утворених бактерій для продукування фагу (наприклад, застосовуючи придатний хелперний фаг або комплементувальну плазміду, якщо потрібно). Бібліотеку фагу можна отримувати з культур, застосовуючи будь-який придатний спосіб, як-то осадження та центрифугування. Система виявлення може містити набір пептидів або поліпептидів, що містять будь-який бажаний ступінь відмінності. Наприклад, набір може містити пептиди або поліпептиди, що мають амінокислотні послідовності, що відповідають існуючим у природі поліпептидам, експресованим організмом, групою організмів (наприклад, набір послідовностей Vіm dАb, виділених з Саmсlіd), бажаною тканиною або бажаним типом клітин, або може містити пептиди або поліпептиди, що мають випадкові або рандомізовані амінокислотні послідовності. Якщо потрібно, поліпептиди можуть мати звичайну серцевину або каркас. Поліпептиди у подібному наборі або бібліотеці можуть містити визначені регіони випадкової або рандомізованої амінокислотної послідовності та регіони звичайної амінокислотної послідовності. У деяких втіленнях усі або по суті усі поліпептиди у наборі є бажаного типу, як-то бажаний фермент (наприклад, полімераза) або бажаний антиген-зв'язувальний фрагмент антитіла (наприклад, Vh людини або VL людини). У втіленнях система виявлення поліпептидів містить набір поліпептидів, де кожний поліпептид містить мінливий домен антитіла. Наприклад, кожний поліпептид у наборі може містити VН, Vl або Fv (наприклад, одиничний ланцюг Fv). Амінокислотну послідовність відмінність можна уводити у будь-який бажаний регіон пептиду або поліпептиду або каркасу, застосовуючи будь-який придатний спосіб. Наприклад, відмінність амінокислотної послідовності можна уводити у цільовий регіон, як-то регіон визначення комплементарності мінливого домену антитіла або гідрофобного домену, отриманням бібліотеки нуклеїнових кислот, що кодують диверсифіковані поліпептиди, застосовуючи будь-які придатні способи мутагенезу (наприклад, РСR низької точності, олігонуклеотидопосередкований або сайт-спрямований мутагенез, диверсифікацію, застосовуючи кодони NNК) або будь-який інший придатний спосіб. Якщо потрібно, регіон поліпептиду для диверсифікації може бути рандомізовано. Розмір поліпептидів, що роблять набором є питанням вибору та одноманітний розмір поліпептиду не є потрібним. В одному втіленні, поліпептиди у наборі мають принаймні третинну структуру (утворюють принаймні один домен). Селекці/виділення/отримання Резистентний до протеази пептид або поліпептид (наприклад, популяцію резистентних до протеази поліпептидів) можна вибирати, виділяти та/або отримувати з набору або бібліотеки (наприклад, у системі виявлення), застосовуючи будь-який придатний спосіб. В одному втіленні, резистентний до протеази поліпептид вибрано або виділенона основі селектовуваної характеристики (наприклад, фізичної характеристики, хімічної характеристики, функціональної характеристики). Придатні селектовувані функціональні характеристики охоплюють біологічні 27 UA 102993 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 активності пептидів або поліпептидів у наборі, наприклад, зв'язування із загальним лігандом (наприклад, суперантигеном), зв'язування з цільовим лігандом (як-то антиген, епітоп, субстрат), зв'язування з антитілом (наприклад, через епітоп, експресований на пептиді або поліпептиді), та каталітична активність. (Дивись, наприклад, Тоmlіnsоn еt аl., WО 99/20749; WО 01/57065; WО 99/58655). В одному втіленні, селекція є на основі специфічного зв'язування з VЕGF. У ще одному втіленні, селекція є на основі вибраної функціональної характеристики для продукування другого набору, у котрому члени є резистентними до протеази, а потім селекції члену з другого набору, що специфічно зв'язує VЕGF. У деяких втіленнях резистентний до протеази пептид або поліпептид вибрано та/або виділено з бібліотеки або набору пептидів або поліпептидів, у котрому по суті усі резистентні до протеази пептиди або поліпептиди мають спільну звичайну селектовувану особливість. Наприклад, резистентний до протеази пептид або поліпептид можна вибирати з бібліотеки або набору, у котрих по суті усі резистентні до протеази пептиди або поліпептиди зв'язують звичайний загальний ліганд, зв'язують звичайний цільовий ліганд, зв'язують (або є зв'язаними) звичайне антитіло, або мають звичайну каталітичну активність. Цей тип селекції є особливо корисним для отримання набору резистентних до протеази пептидів або поліпептидів, що є на основі лідерного пептиду або поліпептиду, що має бажану біологічну активність, наприклад, при виконанні розвинення афінності одиничного мінливого домену імуноглобуліну. Селекція на основі зв'язування зі звичайним загальним лігандом може давати сукупність або популяцію пептидів або поліпептидів, що містять усі або по суті усі резистентні до протеази пептиди або поліпептиди, що були компонентами лідерної бібліотеки або набору. Наприклад, пептиди або поліпептиди, що зв'язують цільовий ліганд або загальний ліганд, як-то білок А, білок L або антитіло, можна вибирати, виділяти та/або отримувати пенінгом або застосовуючи матрикс з придатною афінністю. Пенінгу можна досягати додаванням розчину ліганду (наприклад, загального ліганду, цільового ліганду) до придатної посудини (як-то туба, чашка Петрі) та наданням змоги ліганду покривати стінки посудини. Надлишок ліганду можна змити та пептиди або поліпептиди (наприклад, набір, що інкубовано з протеазою) можна додавати до посудини та посудину тримати в умовах, придатних для зв'язування пептидами або поліпептидами іммобілізованого ліганду. Незв'язані пептиди або поліпептиди можна змивати, а зв'язані пептиди або поліпептиди можна отримувати, застосовуючи будь-який придатний спосіб, як-то вискоблювання або зниження рН, наприклад. Придатні матриці афінності ліганду загалом містять тверду підкладку або кульки (наприклад, агарози), до котрих ліганд є ковалентно або нековалентно приєднаним. Матрикс афінності можна комбінувати з пептидомами або поліпептидами (наприклад, набором, що інкубовано з протеазою), застосовуючи спосіб партій, колонковий спосіб або будь-як інший придатний спосіб в умовах, придатних для зв'язування пептидів або поліпептидів до ліганду на матриксі. Пептиди або поліпептиди, що не зв'язують матрикс афінності можна змивати та зв'язані пептиди або поліпептиди можна елювати та отримувати, застосовуючи будь-який придатний спосіб, як-то елювання буфером з нижчим рН, м'яким денатурувальним агентом (як-то сечовина), або з пептидом, що конкурує стосовно зв'язування з лігандом. В одному прикладі біотинілований цільовий ліганд є комбінованим з набором в умовах, придатних для пептидів або поліпептидів у наборі до зв'язування цільового ліганду (VЕGF). Зв'язані пептиди або поліпептиди отримують, застосовуючи іммобілізовані авідин або стрептавідин (наприклад, на кульках). У деяких втіленнях загальним лігандом є антитіло або його зв'язувальний фрагмент антигену. Антитіла або фрагменти зв'язування антигену, що зв'язують структурні особливості пептидів або поліпептидів, що є по суті збереженими у бібліотеках або наборах пептидів або поліпептидів, є особливо корисними як загальні ліганди. Антитіла та фрагменти зв'язування антигену, придатні для застосування як ліганди для виділення, селекції та/або отримання резистентних до протеази пептидів або поліпептидів можуть бути моноклональними або поліклональними та їх можна отримувати, застосовуючи будь-який придатний спосіб. Бібліотеки/набори В інших аспектах запропоновані набори резистентних до протеази пептидів та поліпептидів, бібліотеки, що кодують резистентні до протеази пептиди та поліпептиди, та способи отримання подібних бібліотек та наборів. Бібліотеки, що кодують та/або містять резистентні до протеази пептиди та поліпептиди можна отримувати, застосовуючи будь-який придатний спосіб. Бібліотека може бути призначеною для кодування резистентних до протеази пептидів або поліпептидів на основі цікавого пептиду або поліпептиду (наприклад, анти-VЕGF пептиду або поліпептиду, вибраного з бібліотеки) або його можна вибирати з ще одної бібліотеки, застосовуючи способи, описані тут. 28