Гуманізовані анти-egfl7-антитіла і способи їх застосування

Реферат: Даний винахід стосується антитіла проти EGFL7, способу його одержання, нуклеїнової кислоти, що його кодує, вектору, клітини-хазяїна, фармацевтичної композиції, а також способів, де застосовується зазначене антитіло. UA 105386 C2 (12) UA 105386 C2 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дана заявка являє собою непопередню заявку, подану згідно з 37 CFR 1.53(b)(1), по якій вимагається пріоритет згідно з 35 USC 119(е) попередньої заявки номер 61/176817, поданої 8 травня 2009 року, зміст якої включений в даний документ за допомогою посилання. Галузь техніки, якої стосується винахід Даний винахід, головним чином, стосується галузі молекулярної біології. Конкретніше, винахід стосується анти-EGFL7-антитіл, і їх застосувань. Рівень техніки Формування судинної мережі являє собою фундаментальну потребу для багатьох фізіологічних і патологічних процесів. Активно зростаючі тканини, такі як ембріони і пухлини, потребують адекватного постачання кров'ю. Вони задовольняють цю потребу синтезом проангіогенних чинників, які сприяють формуванню нових кровоносних судин з існуючих судин за допомогою процесу, який названого ангіогенезом; або з клітин-попередників за допомогою процесу, який називається васкулогенезом. Тубулогенез є важливою стадією в розвитку судин. Утворення судинної трубки є складним, але організованим біологічним процесом, що включає всі або багато які з наступних стадій: (а) проліферація ендотеліальних клітин (EC) від існуючих EC або їх диференціювання з клітин-попередників; (b) міграція EC; (с) злиття EC з утворенням структур в формі хордоподібних тяжів; (d) потім тубулогенез судинних тяжів з утворенням судин з центральною порожниною; (е) відходження від існуючих хордоподібних тяжів або судин відростків з утворенням вторинних судин (ангіогенез); (f) первинне судинне сплетення проходить подальше ремоделювання і набування форми і (g) рекрутинг періендотеліальних клітин з взяттям в оболонку ендотеліальних трубок, із забезпеченням судин підтримуючими і модуляторними властивостями; такі клітини включають перицити для невеликих капілярів, клітини гладкої мускулатури для більш великих судин і міокардіальні клітини для серця. Hananhan D., Science, 277:48-50 (1997); Hogan B.L. & Kolodziej P. A., Nature Reviews Genetics, 3:513-523 (2002); Lubarsky В. & Krasnow M., A. Cell, 112:19-28 (2003). У цей час встановлено, що ангіогенез, який включає утворення нових кровоносних судин з вже існуючого ендотелію, бере участь в патогенезі різних захворювань. Захворювання включають солідні пухлини і метастази, атеросклероз, ретролентальну фіброплазію, гемангіоми, хронічне запалення, внутрішньоочні неоваскулярні синдроми, такі як проліферативні ретинопатії, наприклад, діабетична ретинопатія, вікова макулярна дегенерація (AMD), неоваскулярна глаукома, імунне відторгнення трансплантованої рогівки і інших тканин, ревматоїдний артрит і псоріаз. Folkman et al., J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol., 53:217-239 (1991); і Garner А. "Vascular diseases", In: Pathobiology of nd Ocular Disease. А Dynamic Approach, Garner А., Klintworth GK, eds., 2 Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710. Виявилося, що у разі зростання пухлини ангіогенез є ключовим процесом для переходу з гіперплазії в неоплазію, а також для забезпечення живлення для зростання і метастазування пухлини. Folkman et al., Nature, 339:58 (1989). Неоваскуляризація дозволяє пухлинним клітинам набувати перевагу зростання і проліферативної автономії, в порівнянні з нормальними клітинами. Пухлина звичайно з'являється у вигляді одиничної аберантної клітини, яка може проліферувати тільки до розміру декількох кубічних міліметрів за рахунок віддаленості від доступного капілярного ложа, і вона може залишатися "дрімаючою" без подальшого зростання і дисемінації протягом тривалого періоду часу. Потім деякі пухлинні клітини "перемикаються" на ангіогенний фенотип з активацією ендотеліальних клітин, які проліферують і перетворюються в нові капілярні кровоносні судини. Такі знову сформовані кровоносні судини не тільки забезпечують подальше зростання первинної пухлини, але також сприяють дисемінації і реколонізації метастатичних пухлинних клітин. Так, спостерігали кореляцію між щільністю мікросудин в зрізах пухлин і виживаністю пацієнток з раком молочної залози, а також пацієнтів з деякими іншими пухлинами. Weidner et al., N. Engl. J. Med., 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet, 340:1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet, 340:145-146 (1992). Точні механізми, які контролюють ангіогенне "перемикання" залишаються невідомими, але вважають, що неоваскуляризація пухлинної маси є результатом загального балансу множини стимуляторів і інгібіторів ангіогенезу (Folkman, 1995, Nat. Med., 1(1):27-31). Процес розвитку судин ґрунтовнорегулюється. До даного часу показано, що велика кількість молекул, в основному секретовані чинники, які продукуються оточуючими клітинами, регулюють диференціювання, проліферацію, міграцію і злиття EC в хордоподібні тяжі. Наприклад, було встановлено, що фактор росту ендотелію судин (VEGF) бере участь в стимуляції ангіогенезу і в індукції проникності судин. Ferrara et al., Endocr. Rev., 18:4-25 (1997). Той факт, що втрата навіть одного алеля VEGF приводить до загибелі ембріонів, вказує на незамінну роль, яку даний фактор відіграє в розвитку і диференціації судинної системи. Крім 1 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 того, було показано, що VEGF є ключовим медіатором неоваскуляризації, пов'язаної з пухлинами і захворюваннями очей. Ferrara et al., Endocr. Rev., вище. мРНК VEGF надекспресується в більшості досліджених пухлин. Berkman et al., J. Clin. Invest., 91:153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol., 26:86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res., 53:4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73:931-934 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol., 146:1029-1039 (1995). Деякі стадії під час формування судинної трубки ще мало визначені. Зокрема, мало відомо про те, яким чином регулюється тубулогенез - яким чином судинні хордоподібні тяжі перетворюються в трубки, і які фактори регулюють даний перехід. З урахуванням ролі васкулогенезу і ангіогенезу в розвитку багатьох захворювань і розладів бажано мати на озброєнні засоби для придушення або інгібування одного або декількох біологічних ефектів, що викликають дані процеси. Всі джерела, цитовані в даному документі, включаючи заявки на патент і публікації, в повному об'ємі включені в даний документ за допомогою посилання. Суть винаходу Винахід частково ґрунтується на різноманітності антитіл проти EGFL7. EGFL7 являє собою важливу і переважну мішень для терапії, і винахід стосується антитіл як терапевтичних і діагностичних засобів для застосування в цілеспрямованому впливі на патологічні стани, асоційовані з експресією і/або активністю EGFL7. Отже, винахід стосується способів, композицій, наборів і виробів, пов'язаних з EGFL7. Наприклад, в деяких варіантах здійснення винахід стосується анти-EGFL7-антитіл. У деяких варіантах здійснення винахід стосується анти-EGFL7-антитіла, що включає варіабельний домен, що містить щонайменше одну, дві, три, чотири або п'ять послідовностей гіперваріабельної ділянки (HVR), вибраних з групи, яка складається з: (i) HVR-L1, що містить KX1SX2SX3DYX4GDSYX5S, де X1 представляє А або R; X2 представляє Н або Q; X3 представляє G або V; X4 вибраний з групи, яка складається з D, L, R, S і W; і X 5 представляє M або V (SEQ ID NO:210); (ii) HVR-L2, що містить GASX1 × 2EX3, де X1 представляє N або Y; X2 вибраний з групи, яка складається з L, R і Y; і X3 представляє Q або S (SEQ ID NO:211); (iii) HVR-L3, що містить QQNNEX1PX2T, де X1 представляє D або Е; і X2 представляє F або Y (SEQ ID NO:212); (iv) HVRH1, що містить GX1 × 2X3 × 4TYGX5S, де X1 представляє Н або V; X2 представляє R або Т; X3 вибраний з групи, яка складається з F, G, R і S; X 4 вибраний з групи, яка складається з D, G, R і Т; і X5 представляє M або Y (SEQ ID NO:213); (v) HVR-H2, що містить GWINX1 × 2SGVPTX3AX4 × 5X6 × 7X8, де X1 вибраний з групи, яка складається з I, M, Т і W; X 2 представляє Н або R; X3 вибраний з групи, яка складається з I, M, Т і Y; X 4 представляє D або Н; Х5 вибраний з групи, яка складається з D, M і Т; X6 представляє F або Y; X7 представляє K або S; і X8 представляє G або R (SEQ ID NO:214) і (vi) HVR-H3, що містить AX1LGSX2AVDX3, де X1 представляє N або R; X2 вибраний з групи, яка складається з С, S і Y; і X 3 представляє А або Y (SEQ ID NO:215). У деяких варіантах здійснення анти-EGFL7-антитіло містить всі шість вказаних вище HVR. У деяких варіантах здійснення HVR-L1 містить амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO:31 і 37-43; HVR-L2 містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:32 і 44-47; HVR-L3 містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:33 і 48; HVR-H1 містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:34 і 49-57; HVR-H2 містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:35 і 58-73; і HVR-H3 містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:36 і 74-77. У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг містить наступні каркасні послідовності: FR-H1 містить EX1QLVESGGGLVQPGGSLRLSСAAS, де X1 представляє I або V (SEQ ID NO:216); FR-H2 містить WVRQAPGKGLEWX1, де X1 представляє I або V (SEQ ID NO:217); FR-H3 містить RFTX1SX2DX3SX4 × 5TX6YLQMNSLRAEDTAVYX7CAR, де X1 представляє F або I; X2 представляє L або R; X3 представляє N або Т; X4 вибраний з групи, яка складається з А, Е, K і Т; X 5 представляє N або S; X6 вибраний з групи, яка складається з А, L, M, Т і V; і X 7 представляє F або Y (SEQ ID NO:218); і FR-H4 містить WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:219). У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг містить наступні каркасні послідовності: FR-H1 містить EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:197); FR-H2 містить WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:198); FR-H3 містить RFTISX1DNSKNTX2YLQMNSLRAEDTAVYYCAR, де X1 представляє L або R; X2 вибраний з групи, яка складається з А, L, M, Т і V (SEQ ID NO:220); і FR-H4 містить WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:200). У деяких варіантах здійснення легкий ланцюг містить наступні каркасні послідовності: FR-L1 містить DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:201); FR-L2 містить WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:202); FR-L3 містить GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:203); FR-L4 містить FGQGTKVEIK (SEQ ID NO:221) або FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:204). У деяких варіантах здійснення легкий 2 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ланцюг містить послідовність варіабельного домену 4F11.v17 або 4F11.v22, як показано на фігурі 15 (SEQ ID NO:82 і 83). У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг містить послідовність варіабельного домену 4F11.v17 або 4F11.v22, як показано на фігурі 16 (SEQ ID NO:84 і 85). У деяких варіантах здійснення винахід стосується антитіла, в якому легкий ланцюг містить послідовність варіабельного домену 4F11.v17, як показано на фігурі 15 (SEQ ID NO:82), і важкий ланцюг містить послідовність варіабельного домену 4F11.v17, як показано на фігурі 16 (SEQ ID NO:84). У деяких варіантах здійснення винахід стосується антитіла, в якому легкий ланцюг містить послідовність варіабельного домену 4F11.v22, як показано на фігурі 15 (SEQ ID NO:83), і важкий ланцюг містить послідовність варіабельного домену 4F11.v22, як показано на фігурі 16 (SEQ ID NO:85). У деяких варіантах здійснення винахід стосується анти-EGFL7-антитіла, що включає варіабельний домен, що містить щонайменше одну, дві, три, чотири або п'ять послідовностей HVR, вибраних з групи, яка складається з: (i) HVR-L1, що містить X1 × 2X3 × 4X5 × 6VX7 × 8X9 × 10ITYLX11, де X1 вибраний з групи, яка складається з L, Q, R, S і Т; X 2 вибраний з групи, яка складається з Р, Т і W; X3 представляє Н або S; X4 представляє D або Q; X5 представляє G і S; X6 представляє L і V; X7 представляє Н або Р; X8 вибраний з групи, яка складається з I, L, Р, Т і Y; X9 вибраний з групи, яка складається з N, Q і S; X 10 вибраний з групи, яка складається з А, G і S; і X11 представляє G або Н (SEQ ID NO:222); (ii) HVR-L2, що містить RVSNX1 × 2S, де Х1 представляє D або R; і X2 вибраний з групи, яка складається з А, G, F, I і Т (SEQ ID NO:223); (iii) HVR-L3, що містить X1QSX2 × 3VPLT, де X1 вибраний з групи, яка складається з А, G, I, K, L, N, S, Т і V; X2 представляє З або Т; і X3 представляє F або Н (SEQ ID NO:224); (iv) HVR-H1, що містить GYX1 × 2X3DX4YX5N, де X1 представляє N або Т; X2 представляє F або V; X3 вибраний з групи, яка складається з I, M, R і S; X 4 вибраний з групи, яка складається з Y, Q і K; і X5 представляє I або M (SEQ ID NO:225); (v) HVR-H2, що містить GDINX1 × 2X3 × 4X5 × 6НX7 × 8X9 × 10 × 11 × 12 × 13, де X1 вибраний з групи, яка складається з А, L, N і Р; X 2 вибраний з групи, яка складається з D, L і R; X3 вибраний з групи, яка складається з G, K, N, R, S і Y; X4 представляє G або S; X5 вибраний з групи, яка складається з G, I, K, R, S, Т і V; X 6 вибраний з групи, яка складається з G, R і Т; X7 вибраний з групи, яка складається з I, V і Y; X 8 представляє N або S; X9 вибраний з групи, яка складається з А, N і Q; X 10 представляє K або V; X11 представляє F або Q; X12 представляє K або Т; і X13 вибраний з групи, яка складається з G, Н, R і S; (SEQ ID NO:226); і (vi) HVR-H3, що містить X1REGVYHX2YDDYAX3DY, де X1 вибраний з групи, яка складається з А, N і Т; X2 представляє D або Р; і X3 представляє M або W; (SEQ ID NO:227). У деяких варіантах здійснення анти-EGFL7-антитіло містить всі шість вказаних вище HVR. У деяких варіантах здійснення HVR-L1 містить амінокислотну послідовність, вибрану з SEQ ID NO:100 і 106-124; HVR-L2 містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:101 і 125-129; HVR-L3 містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:102 і 130-145; HVR-H1 містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:103 і 146-153; HVR-H2 містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:104 і 154-187; і HVR-H3 містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:105 і 188-192. У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг містить наступні каркасні послідовності: FR-H1 містить EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:197); FR-H2 містить WVRQAPGKGLEWX1, де X1 представляє I або V (SEQ ID NO:228); FR-H3 містить RX1TX2SX3DX4SX5 × 6TX7YX8QMNSLRAEDTAVYYC, де X1 представляє F або V; X2 представляє I або L; X3 вибраний з групи, яка складається з L, R і V; X 4 представляє K або N; X5 вибраний з групи, яка складається з K, N, R і S; X 6 представляє N або S; X7 вибраний з групи, яка складається з А, L і V; і X8 представляє L або M (SEQ ID NO:229), і FR-H4 містить WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:200). У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг містить наступні каркасні послідовності: FR-H1 містить EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:197); FR-H2 містить WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:198); FR-H3 містить RFTISRDX1SKNTX2YLQMNSLRAEDTAVYYCAR, де X1 представляє N або K; і X2 вибраний з групи, яка складається з А, L і V (SEQ ID NO:230); і FR-H4 містить WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:200). У деяких варіантах здійснення легкий ланцюг містить наступні каркасні послідовності: FR-L1 містить DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:201); FR-L2 містить WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:202); FR-L3 містить GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:203); FR-L4 містить FGQGTKVEIK (SEQ ID NO:221) або FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:204). У деяких варіантах здійснення легкий ланцюг містить послідовність варіабельного домену 18F7.v6 або 18F7.v6k, як показано на фігурі 27 (SEQ ID NO:193 і 194). У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг містить послідовність варіабельного домену 18F7.v6 або 18F7.v6k, як показано на фігурі 28 (SEQ ID NO:195 і 196). У 3 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 деяких варіантах здійснення винахід стосується антитіла, в якому легкий ланцюг містить послідовність варіабельного домену 18F7.v6, як показано на фігурі 27 (SEQ ID NO:193) і важкий ланцюг містить послідовності варіабельного домену 18F7.v6, як показано на фігурі 28 (SEQ ID NO:195). У деяких варіантах здійснення винахід стосується антитіла, в якому легкий ланцюг містить послідовність варіабельного домену 18F7.v6k, як показано на фігурі 27 (SEQ ID NO:194), і важкий ланцюг містить послідовність варіабельного домену 18F7.v6k, як показано на фігурі 28 (SEQ ID NO:196). У деяких варіантах здійснення винахід стосується антитіла, в якому щонайменше частина каркасної послідовності представляє людську консенсусну каркасну послідовність. У деяких варіантах здійснення антитіло містить людську консенсусну каркасну послідовність ланцюга κ підгрупи I. В деяких варіантах здійснення антитіло містить людську консенсусну каркасну послідовність важкого ланцюга підгрупи III. У деяких варіантах здійснення винахід стосується анти-EGFL7-антитіла, яке є біспецифічним антитілом. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло зв'язується з фактором росту ендотелію судин (VEGF), наприклад, з тим же епітопом VEGF, що і бевацизумаб або ранібізумаб. У деяких варіантах здійснення винахід стосується нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло за винаходом. У деяких варіантах здійснення винахід стосується вектора, що містить таку нуклеїнову кислоту. У деяких варіантах здійснення винахід стосується клітини-хазяя, що містить нуклеїнову кислоту або вектор. У деяких варіантах здійснення винахід стосується композиції, що містить антитіло за винаходом. У деяких варіантах здійснення композиція містить носій. У деяких варіантах здійснення композиція представляє фармацевтичну композицію. У деяких варіантах здійснення винахід стосується способу отримання анти-EGFL7-антитіла експресією вектора у відповідній клітині-хазяїні, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло за винаходом, і виділенням антитіла. У деяких варіантах здійснення клітина-хазяїн представляє прокаріотичну клітину. У деяких варіантах здійснення клітина-хазяїн є еукаріотичною клітиною. У деяких варіантах здійснення винахід стосується способу лікування пухлини, раку або клітинно-проліферативного розладу, що включає введення ефективної кількості анти-EGFL7антитіла за винаходом індивідууму, який потребує такого лікування. У деяких варіантах здійснення винахід стосується анти-EGFL7-антитіла для застосування в лікуванні пухлини, раку або клітинно-проліферативного розладу. У деяких варіантах здійснення рак вибраний з групи, яка складається з раку молочної залози, раку ободової і прямої кишки, раку легень, раку стравоходу, раку сечового міхура, раку яєчників, раку підшлункової залози і гепатоклітинної карциноми. У деяких варіантах здійснення рак представляє рак молочної залози, рак ободової і прямої кишки або рак легень. У деяких варіантах здійснення клітинно-проліферативний розлад представляє рак. У деяких варіантах здійснення лікування також включає ефективну кількість другого лікарського засобу, де анти-EGFL7-антитіло є першим лікарським засобом. У деяких варіантах здійснення другий лікарський засіб представляє інше антитіло, хіміотерапевтичний препарат, цитотоксичний засіб, антиангіогенний препарат, імуносупресивний препарат, проліки, цитокін, антагоніст цитокіну, цитотоксичну променеву терапію, кортикостероїд, протиблювотний засіб, вакцину проти раку, анальгетик або інгібуючий ріст засіб. У деяких варіантах здійснення другий лікарський засіб представляє анти-VEGF-антитіло, наприклад, бевацизумаб. У деяких варіантах здійснення другий лікарський засіб вводять до або після введення анти-EGFL7-антитіла. У деяких варіантах здійснення другий лікарський засіб вводять одночасно з анти-EGFL7антитілом. У деяких варіантах здійснення винахід стосується способу зменшення або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має патологічний стан, пов'язаний з ангіогенезом, що включає введення суб'єкту антитіла за винаходом, із зменшенням або інгібуванням, таким чином, ангіогенезу у суб'єкта. У деяких варіантах здійснення винахід стосується антитіла за винаходом для застосування в лікуванні патологічного стану, пов'язаного з ангіогенезом. У деяких варіантах здійснення патологічний стан представляє неопластичне захворювання. У деяких варіантах здійсненні патологічний стан представляє ненеопластичне захворювання. У деяких варіантах здійснення ненеопластичне захворювання вибране з групи, яка складається з діабетичної і інших проліферативних ретинопатій, ретинопатії недоношених, неоваскулярної глаукоми, вікової макулярної дегенерації, діабетичного макулярного набряку, неоваскуляризації рогівки, неоваскуляризації трансплантата рогівки, неоваскуляризації рогівки/хороїдальної неоваскуляризації. 4 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення винахід стосується способу підвищення ефективності антиангіогенного засобу у суб'єкта, що має патологічний стан, пов'язаний з ангіогенезом, що включає введення суб'єкту ефективної кількості антитіла за винаходом в комбінації з антиангіогенним засобом, з підвищенням, таким чином, інгібуючої активності вказаного антиангіогенного засобу проти ангіогенезу. У деяких варіантах здійснення винахід стосується антитіла за винаходом для застосування в підвищенні ефективності антиангіогенного засобу у суб'єкта, що має патологічний стан, пов'язаний з ангіогенезом. У деяких варіантах здійснення патологічний стан, асоційований з ангіогенезом, представляє пухлину, рак або клітиннопроліферативний розлад. У деяких варіантах здійснення патологічний стан, пов'язаний з ангіогенезом, представляє ненеопластичне захворювання. У деяких варіантах здійснення ненеопластичне захворювання вибране з групи, яка складається з діабетичної і інших проліферативних ретинопатій, ретинопатії недоношених, неоваскулярної глаукоми, вікової макулярної дегенерації, діабетичного макулярного набряку, неоваскуляризації рогівки, неоваскуляризації трансплантата рогівки, неоваскуляризації рогівки/хороїдальної неоваскуляризації. У деяких варіантах здійснення антиангіогенний засіб вводять до або після введення анти-EGFL7-антитіла. У деяких варіантах здійснення антиангіогенний засіб вводять спільно з анти-EGFL7-антитілом. У деяких варіантах здійснення антиангіогенний засіб представляє засіб проти VEGF, анти-VEGF-антитіло, наприклад, бевацизумаб або ранібізумаб. У деяких варіантах здійснення винахід стосується способу зменшення або інгібування перфузії і проникності пухлини у суб'єкта, який включає введення суб'єкту антитіла за винаходом. У деяких варіантах здійснення винахід стосується антитіла за винаходом для застосування в зменшенні або інгібуванні перфузії і проникності пухлини у суб'єкта. У деяких варіантах здійснення спосіб або застосування додатково включає введення антиангіогенного засобу, наприклад, засоби проти VEGF (наприклад, анти-VEGF-антитіла, такого як бевацизумаб). Короткий опис фігур На фігурі 1 приведені амінокислотні послідовності EGFL7 миші (SEQ ID NO:1) і людини (SEQ ID NO:2). Вказане положення EMI1, EMI2, EGF і біспіральних доменів. У зрізаному EGFL7 відсутні біспіральні домени. Підкреслені послідовності пептидів EMI1 (SEQ ID NO:3), EMI2 (SEQ ID NO:4) і p2 (SEQ ID NO:5), p4 (SEQ ID NO:6), p5 (SEQ ID NO:7) і p6 (SEQ ID NO:8). На фігурі 2 показана амінокислотна послідовність варіабельного домену легкого ланцюга людського консенсусу Каппа I (SEQ ID NO:9) і 4F11.v1 (SEQ ID NO:10). Нумерація по Кебату і в прямокутниках виділені гіперваріабельні ділянки. На фігурі 3 показана амінокислотна послідовність варіабельного домену важкого ланцюга людського консенсусу підгрупи III (SEQ ID NO:11) і 4F11.v1 (SEQ ID NO:12). Нумерація по Кебату і в прямокутниках виділені гіперваріабельні ділянки. На фігурі 4 показані олігонуклеотиди, використані для toggle положень в бібліотеці каркасних областей Toggle. Показані ДНК-послідовність 4F11.v1 і олігонуклеотиди, використані для отримання toggle каркасних областей. Також показані амінокислотні послідовності вихідних і деяких отриманих toggle каркасних областей. У деяких випадках також були включені додаткові амінокислотні залишки в залежності від того, як були сконструйовані вироджені кодони. Номери послідовностей приведені в круглих дужках праворуч від відповідної послідовності (SEQ ID NO:13-28). На фігурі 5 приведені результати, які показують, що зв'язування mu4F11 з EGFL7 можна блокувати пептидом 2 (SEQ ID NO:5), але пептидами 1 або 3, що не перекриваються, (відповідно SEQ ID NO:29 або SEQ ID NO:30) або довільним контрольним пептидом. На фігурі 6 показано зв'язування фагу, що експонує 4F11.v1 Fab, зі зрізаним EGFL7, іммобілізованим на мікротитраційному планшеті. Обидва зразки фагу з 4F11.v1 демонструють підвищене зв'язування з іммобілізованим EGFL7, як функцію зростаючої концентрації фагу. Контрольний фаг показував фонове зв'язування, аналогічне для фагу з 4F11.v1 при низькій концентрації фагу, на основі чого можна передбачити про наявність певної неспецифічної взаємодії фаг-EGFL7. На фігурі 7 показано зв'язування фагу, що експонує 4F11.v1 Fab, з доменом EMI2 або пептидом р2, біотинільованим через вільну амінокислоту або вільний тіол. На фігурі 8 показана надмірність залишків, виявлених в кожному положенні каркасної області, під час отримання бібліотеки каркасних областей Toggle. Перераховані амінокислоти, введені в кожне положення каркасної області, під час отримання бібліотеки каркасних областей Toggle. На фігурі 9 показані зміни послідовності CDR, що спостерігаються в кожній з 6 "бібліотек одиничних положень" (SPL) для кожної з 3 каркасних областей. Бібліотеки розділяли 5 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використаною каркасною областю (4F11.v1, 4F11.v2 і 4F11.v3). Виділені зміни, отримані з кожної SPL, проти конкретної послідовності CDR. Послідовності VL і VH, за винятком даних змін, були ідентичні відповідній каркасній області, і вони не показані. Номери послідовностей приведені в круглих дужках праворуч від відповідної послідовності (SEQ ID NO:31-77). Окремі послідовності, які з'являються більше ніж один раз, не завжди можуть мати відповідний номер послідовності. На фігурі 10 показана каркасна область і конструювання бібліотеки варіабельних доменів легкого ланцюга обмежених бібліотек 1 і 2. Показані амінокислотні послідовності людського консенсусу Каппа I (SEQ ID NO:9) і 4F11.v1 (SEQ ID NO:10) в порівнянні з матрицею, використаною для бібліотеки 1 (SEQ ID NO:78) і бібліотеки 2 (SEQ ID NO:79). Косою межею через амінокислоту показані позиції, рандомізовані до всіх 20 амінокислот. На фігурі 11 показана каркасна область і конструювання бібліотеки варіабельних доменів важкого ланцюга обмежених бібліотек 1 і 2. Показана амінокислотна послідовність людського консенсусу підгрупи III (SEQ ID NO:11) і 4F11.v1 (SEQ ID NO:12) в порівнянні з матрицею, використаною для бібліотеки 1 (SEQ ID NO:80) і бібліотеки 2 (SEQ ID NO:81). Косою межею через амінокислоту показані положення, рандомізовані до всіх 20 амінокислот. На фігурі 12 показана частота змін, що спостерігаються в рандомізованих положеннях в обмежених бібліотеках 1 і 2. Показана преференція вибраних амінокислот в положеннях 53 і 54 в легкому ланцюгу і 29, 52 і 98 у важкому ланцюгу. Повідомлялося про преференцію (Sigma) для будь-якої амінокислоти у вигляді числа стандартних відхилень вище довільної імовірності появи даного залишку в бібліотеці, прийнявши біноміальний розподіл амінокислот. Оцінка в балах з використанням даного методу проводиться з урахуванням систематичної помилки для передбачуваних кодонів і статистику при встановленні консенсусу. На фігурах 13 і 14 показане інгібування адгезії клітин HUVEC з іммобілізованими людським або мишачим EGFL7 в умовах in vitro людськими варіантами 4F11. Клітинам HUVEC (20000 клітин/ямку) давали можливість адгезувати до 96-ямковим планшетів, покритих 5 мкг/мл людського або мишачого EGFL7 в присутності зростаючих концентрацій антитіла. Після промивання підраховували кількість все ще адгезованих до планшета клітин і розраховували процент від загального числа клітин, висіяних в кожну ямку. На фігурі 15 показана амінокислотна послідовність варіабельного домену легкого ланцюга людського консенсусу Каппа I (SEQ ID NO:9), 4F11.v1 (SEQ ID NO:10), 4F11.v17 (SEQ ID NO:82) і 4F11.v22 (SEQ ID NO:83). Нумерація положень по Кебату і в прямокутниках виділені гіперваріабельні ділянки. На фігурі 16 показана амінокислотна послідовність варіабельного домену важкого ланцюга людського консенсусу підгрупи III (SEQ ID NO:11), 4F11.v1 (SEQ ID NO:12), 4F11.v17 (SEQ ID NO:84) і 4F11.v22 (SEQ ID NO:85). Нумерація положень по Кебату і в прямокутниках виділені гіперваріабельні ділянки. На фігурі 17 показана амінокислотна послідовність варіабельного домену легкого ланцюга людського консенсусу Каппа I (SEQ ID NO:9) і 18F7-трансплантата (SEQ ID NO:86). Нумерація положень по Кебату і в прямокутниках виділені гіперваріабельні ділянки. На фігурі 18 показана амінокислотна послідовність варіабельного домену важкого ланцюга людського консенсусу підгрупи III (SEQ ID NO:11) і 18F7-трансплантата (SEQ ID NO:87). Нумерація положень по Кебату і в прямокутниках виділені гіперваріабельні ділянки. На фігурі 19 показані олігонуклеотиди, використані для toggle положень в бібліотеці каркасних областей Toggle. Показані ДНК-послідовність 18F7-трансплантата і олігонуклеотиди, використані для отримання каркасних областей toggle. Також показані амінокислотні послідовності вихідних і деяких отриманих каркасних областей toggle. У деяких випадках також були включені додаткові амінокислотні залишки в залежності від того, як були сконструйовані вироджені кодони. Номери послідовностей приведені в круглих дужках праворуч від відповідної послідовності (SEQ ID NO:88-99). На фігурі 20 приведені результати, які показують, що зв'язування mu18F7 з EGFL7 можна блокувати EMI1 (SEQ ID NO:3) або пептидом P5 (SEQ ID NO:7), але не пептидами P4 або P6 (відповідно SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:8). Ембріональні фібробласти курчати трансфікували плазмідою, що містить повнорозмірну кДНК EGFL7 людини з НА-міткою. Клітинний лізат, приготований з трансфікованих клітин, імунопреципітували з mu18F7 в присутності 200-кратного надлишку конкурентних пептидів. Імунопреципітати аналізували вестерн-блотингом з використанням анти-НА-антитіла. На фігурі 21 показано зв'язування фагу, що експонує 18F7-трансплантат Fab, зі зрізаним huEGFL7, іммобілізованим на мікротитраційному планшеті. Обидва зразки фагу з 18F7трансплантатом демонструють підвищене зв'язування з іммобілізованим EGFL7, як функцію зростаючої концентрації фагу. Контрольний фаг показував фонове зв'язування, аналогічне для 6 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 18F7-трансплантата при низькій концентрації фагу, на основі чого можна передбачити про наявність певної неспецифічної взаємодії фаг-EGFL7. На фігурі 22 показано зв'язування фагу, що експонує 18F7-трансплантат Fab, з доменом EMI1 або пептидом р5, біотинільованим через вільну амінокислоту або вільний тіол. На фігурі 23 показана надмірність залишків, виявлених в кожному положенні каркасної області, під час отримання бібліотеки каркасних областей Toggle. Перераховані амінокислоти, введені в кожне положення каркасної області, під час отримання бібліотеки каркасних областей Toggle. На фігурі 24 показані зміни послідовності CDR, що спостерігаються в кожній з 6 SPL для кожної з 3 каркасних областей. Бібліотеки розділяли використаною каркасною областю (18F7трансплантат, 18F7-K, 18F7-KV і 18F-KA). Виділені зміни, отримані з кожної SPL, проти конкретної послідовності CDR. Послідовності VL і VH, за винятком даних змін, були ідентичні відповідній каркасній області, і вони не показані. Номери послідовностей приведені в круглих дужках праворуч від відповідної послідовності (SEQ ID NO:100-192). Окремі послідовності, які мали місце більше ніж один раз, не завжди можуть мати відповідний номер послідовності. На фігурі 25 показане інгібування адгезії клітин HUVEC з іммобілізованими людським або мишачим EGFL7 в умовах in vitro гуманізованими варіантами 18F7. Клітинам HUVEC (20000 клітин/ямку) давали можливість адгезувати до 96-ямковим планшетів, покритих 5 мкг/мл людського або мишачого EGFL7 в присутності зростаючих концентрацій антитіла. Підраховували кількість все ще адгезованих до планшета клітин після промивання і розраховували процент від загального числа клітин, висіяних в кожну ямку. На фігурі 26 показане інгібування міжямкової міграції клітин HUVEC. Клітини HUVEC (50000 клітин/ямку) культивували протягом 16 год. у верхніх камерах міжямкових планшетів, і мембрани у верхній камері покривали 5 мкг/мл білка рекомбінантного людського EGFL7. Додавали різні концентрації контрольного антитіла (анти-IgE) або різних варіантів 18F7 в культуральне середовище верхніх і нижніх камер, в той час як в нижню ямку вносили 20 нг/мл рекомбінантного VEGF-165 для стимуляції міграції клітин HUVEC. Підраховували кількість клітин, що мігрували на зворотну сторону верхніх камер, і будували графік залежності від параметрів обробки (антитіла і концентрації). На фігурі 27 показана амінокислотна послідовність варіабельного домену легкого ланцюга людського консенсусу Каппа I (SEQ ID NO:9), 18F7.v6 (SEQ ID NO:193) і 18F7.v6k (SEQ ID NO:194). Нумерація положень по Кебату і в прямокутниках виділені гіперваріабельні ділянки. У тих випадках, коли послідовність 18F7.v6k не представлена (у другій і третій частинах вирівнювання), то відповідна послідовність ідентична послідовності 18F7.v6. На фігурі 28 показана амінокислотна послідовність варіабельного домену важкого ланцюга людського консенсусу підгрупи III (SEQ ID NO:11), 18F7.v6 (SEQ ID NO:195) і 18F7.v6k (SEQ ID NO:196). Нумерація положень по Кебату і в прямокутниках виділені гіперваріабельні ділянки. У тих випадках, коли послідовність 18F7.v6k не представлена (у другій і третій частинах вирівнювання), то відповідна послідовність ідентична послідовності 18F7.v6. На фігурі 29 показане інгібування зростання пухлинних ксенотрансплантатів Н1299 з використанням одного hu18F7.v6k і в комбінації з анти-VEGT-антитілом. На фігурі 30 показане інгібування зростання пухлинних ксенотрансплантатів LXFL 1674 з використанням одного hu18F7.v6k і в комбінації з анти-VEGF-антитілом. На фігурі 31 показане інгібування васкуляризації трахеї новонароджених мишей з використанням одного hu18F7.v6k і в комбінації з анти-VEGF-антитілом. Докладний опис винаходу Винахід стосується способів, композицій, наборів і виробів для анти-EGFL7-антитіл. У цьому документі описані дані способи, композиції, набори і вироби. Загальні методи Методи і методики, описані і цитовані в даному документі, добре відомі і звичайно використовуються фахівцями в даній галузі із застосуванням звичайної методології, наприклад, методологій, що широко застосовуються, описаних Sambrook et al., Molecular Cloning: А Laboratory Manual 3rd. edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel, et al., eds., (2003)); серії METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: А PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)); Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, А LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)). Визначення Термін "виділене" антитіло представляє антитіло, яке ідентифіковане і виділене, і/або відділене від компонента його природного середовища. Забруднюючі компоненти його 7 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 природного середовища представляють речовини, які впливають негативним чином на дослідницькі, діагностичні і/або терапевтичні застосування антитіла, і вони можуть включати ферменти, гормони і інші білкові або небілкові розчинені речовини. У деяких варіантах здійснення антитіло очищають (1) до більш ніж 95 % по масі антитіла, наприклад, як може бути визначено методом Лоурі, і найбільш переважно до більш ніж 99 % по масі; (2) до рівня, достатнього для отримання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності при використанні, наприклад, секвенатора з центрифугальними чашками або (3) до гомогенності, що оцінюється SDS-PAGE в редукуючих або нередукуючих умовах з використанням, наприклад, фарбування Кумассі синім або, переважно, срібним барвником. Виділене антитіло включає антитіло in situ в рекомбінантних клітинах, оскільки щонайменше один компонент природного середовища антитіла буде бути відсутнім. Однак, як правило, виділене антитіло отримують з використанням щонайменше однієї стадії очищення. Термін "виділена" молекула нуклеїнової кислоти представляє молекулу нуклеїнової кислоти, яка ідентифікована і відділена щонайменше від однієї іншої молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона звичайно асоційована, наприклад, в природному середовищі з антитіл нуклеїнової кислоти. Виділена молекула нуклеїнової кислоти відрізняється в формі і умовами, в яких вона знаходиться в природних клітинах. Виділена молекула нуклеїнової кислоти тому відрізняється від молекули нуклеїнової кислоти, як вона існує в природних клітинах. Однак, виділена молекула нуклеїнової кислоти включає молекулу нуклеїнової кислоти, що знаходиться в клітинах, які звичайно експресують антитіло, де, наприклад, молекула нуклеїнової кислоти знаходиться в положенні хромосоми, яке відрізняється від її положення в природних клітинах. Термін "анти-EGFL7-антитіло" або "антитіло, яке зв'язується з EGFL7" стосується антитіла, здатного зв'язуватися з EGFL7 з достатньою афінністю, так, щоб антитіло годилося як діагностичний і/або лікарський засіб при цілеспрямованому впливі на EGFL7. У деяких варіантах здійснення антитіло, яке зв'язується з EGFL7, має константу дисоціації (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ або ≤0,1 нМ. Загалом, термін "афінність зв'язування" стосується сили сумарних загальних нековалентних взаємодій між одним зв'язувальним сайтом в молекулі (наприклад, в антитілі) і його партнером по зв'язуванню (наприклад, антигеном). Якщо не указано інакше, то в тому значенні, в якому термін "афінність зв'язування" використовується в даному документі, він стосується природної афінності зв'язування, яка відображає взаємодію 1:1 між членами пари зв'язування (наприклад, антитіла і антигену). Афінність молекули Х для її партнера Y звичайно виражається константою дисоціації (Kd). Афінність можна визначити з використанням звичайних способів, відомих в даній галузі, включаючи описані в даному документі. Як правило, низькоафінні антитіла зв'язуються з антигеном повільно і мають тенденцію до швидкої дисоціації, в той час як високоафінні антитіла зв'язуються з антигеном швидше і мають тенденцію залишатися зв'язаними довше. У даній галузі відомі різні способи оцінки афінності зв'язування, будь-який з яких можна використовувати для цілей даного винаходу. Конкретні ілюстративні варіанти здійснення описані нижче. У одному варіанті здійснення "Kd" або "значення Kd" за даним винаходом визначають аналізом зв'язування міченого радіоактивною міткою антигену (RIA),, що проводиться з варіантом Fab цікавлячого антитіла і його антигеном, як описано наступним аналізом, в якому визначають афінність зв'язування в розчині Fab для антигену урівноважуванням Fab, що містить 125 мінімальну концентрацію ( I)-міченого антигену, в присутності титраційного ряду розведення неміченого антигену, потім захопленням зв'язаного антигену на планшеті, покритому анти-Fabантитілом (Chen et al., J. Mol. Biol, 293:865-881 (1999)). Для визначення умов проведення аналізу мікротитраційні планшети (Dynex) покривають протягом ночі 5 мкг/мл захоплюючого анти-Fab-антитіла (Cappel Labs) в 50 мМ карбонату натрію (рН 9,6), і потім блокують 2 % (мас./об.) бичачим сироватковим альбуміном в PBS протягом 2-5 год. при кімнатній температурі (при температурі приблизно 23ºС). В неадсорбуючому планшеті (Nunc#269620) 100 пМ або 26 125 пМ ( I)-міченого антигену змішують з серійним розведенням представляючого інтерес Fab (наприклад, як описано для анти-VEGF-антитіла, Fab-12, у Presta et al., (1997), Cancer Res., 57:4593-4599). Потім представляючий інтерес Fab інкубують протягом ночі; однак, інкубацію можна проводити довше (наприклад, протягом 65 год.) для гарантії досягнення рівноваги. Потім суміші переносять в планшет для захоплення і інкубують при кімнатній температурі (наприклад, ТМ протягом 1 год.). Потім розчин видаляють, і планшет промивають вісім разів 0,1 % твіном -20 в PBS. Після висушування планшетів додають сцинтиляційну рідину з розрахунку 150 мкл/ямку (MicroScintTM-20; Packard) і визначають радіоактивність планшетів на гамма-лічильнику TopCount (Packard) протягом 10 хв. Вибирають концентрації кожного Fab, які забезпечує менше або рівне 20 % від максимального зв'язування для застосування в тестах конкурентного 8 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язування. Згідно з ще одним варіантом здійснення "Kd" або "значення Kd" визначають поверхневим плазмонним резонансом з використанням BIAcore™-2000 або BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25ºC з антигеном, іммобілізованим на чипах СМ5, приблизно при 10 одиницях відгуку (RU). Коротко, біосенсорні чипи з карбоксиметилованого декстрану (CM5, BIAcore, Inc.) активують N-етил-N'-(3-диметиламінопропіл)карбодіімідом гідрохлориду (EDC) і N-гідроксисукцинімідом (NHS), слідуючи інструкціям виготовлювача. Антиген розводять 10 мМ ацетату натрію, рН 4,8 до концентрації 5 мкг/мл (≈0,2 мкМ) перед введенням зі швидкістю потоку 5 мкл/хв. для досягнення приблизно 10 одиниць відгуку (RU) кон'югованого білка. Після ін'єктування антигену вводять 1 М етаноламіну для блокування непрореагувавших груп. Для визначення кінетики серійне розведення Fab (від 0,78 нМ до 500 нМ) інжектують в суміші PBS з 0,05 % твіном-20™ (PBST) при 25ºC зі швидкістю потоку 25 мкл/хв. Розраховують швидкість асоціації (kon) і швидкість дисоціації (k off) з використанням ленгмюрівської моделі зв'язування один-в-один (BIAcore™ Evaluation Software version 3.2) при одночасній підгонці сенсорграм асоціації і дисоціації. Константу рівноваги дисоціації (Kd) розраховують, як співвідношення koff/kon. Дивись, наприклад, Chen, V., et al., J. Mol. Biol., 293:865-881 (1999). В тому випадку, якщо 6 -1 -1 швидкість асоціації перевищує 10 М сек за даними поверхневого плазмонного резонансу, описаного вище, то швидкість асоціації можна визначити з використанням методики гасіння флуоресценції, за допомогою якої можна визначити підвищення або зниження інтенсивності емісії флуоресценції (збудження = 295 нм; емісія = 340 нм, смуга пропускання 16 нм) при 25ºC для 20 нМ антитіла до анти-антигену (Fab-форми) в PBS, рН 7,2 в присутності зростаючих концентрацій антигену, визначених на спектрофотометрі, такому як спектрофотометр стопфлоу (Aviv Instruments) або спектрофотометрі 8000-series SLM-AMINCO (ThermoSpectronic) в кюветі з перемішуванням. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "вектор", він стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона пов'язана. Одним типом вектора є "плазміда", яка стосується циклічної дволанцюжкової ДНК, в яку можна лігувати додаткові ДНК-сегменти. Іншим типом вектора є фаговий вектор. Ще одним типом вектора є вірусний вектор, за допомогою якого додаткові ДНКсегменти можна лігувати у вірусний геном. Деякі вектори мають здатність до автономної реплікації в клітині-хазяїні, в яку їх вводять (наприклад, бактерійні вектори, що містять бактерійний оріджин реплікації, і епісомальні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомальні вектори ссавців) можуть інтегруватися в геном клітини-хазяя при введенні в клітину-хазяя, і тим самим забезпечувати їх реплікацію разом з геномом хазяя. Крім того, деякі вектори здатні регулювати експресію генів, з якими вони функціонально пов'язані. Такі вектори належать в даному документі до "рекомбінантних експресуючих векторів" (або просто до "рекомбінантних векторів" або "експресуючих векторів"). У цілому експресуючі вектори, що використовуються в методах рекомбінантної ДНК, часто знаходяться в формі плазмід. У даній заявці терміни "плазміда" і "вектор" можна використовувати взаємозамінно. У тому значенні, в якому в даному документі взаємозамінно використовуються терміни "полінуклеотид" або "нуклеїнова кислота", вони належать до полімерів з нуклеотидів будь-якої довжини, і вони включають ДНК і РНК. Нуклеотиди можуть бути дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифікованими нуклеотидами або основами, і/або їх аналогами, або будьяким субстратом, який може бути включений в полімер за участю ДНК- або РНК-полімерази або в реакції синтезу. Полінуклеотид може містити модифіковані нуклеотиди, такі як метиловані нуклеотиди і їх аналоги. Якщо вони присутні, то модифікацію нуклеотидної структури можна включити до або після зборки полімеру. Послідовність нуклеотидів може "уриватися" ненуклеотидними компонентами. Полінуклеотид може додатково містити модифікацію, зроблену після синтезу, таку як кон'югація з міткою. Інші типи модифікацій включають, наприклад, "кепи", заміну одного або декількох нуклеотидів, що зустрічаються в природі, на аналог, міжнуклеотидні модифікації, наприклад, за допомогою введення незаряджених зв'язків (наприклад, метилфосфонатів, фосфотриефірів, фосфоамідатів, карбаматів і т. д.) і заряджених зв'язків (наприклад, фосфоротіоатів, фосфородитіоатів і т. д.), модифікації, що містять бічні групи, наприклад, білки (наприклад, нуклеази, токсини, антитіла, сигнальні пептиди, полі-L-лізин і т. д.), модифікації, що містять інтеркалюючі агенти (наприклад, акридин, псорален і т. д.), модифікації, що містять хелатотвірні агенти (наприклад, метали, радіоактивні метали, бор, окислювальні метали і т. д.), модифікації, що містять алкілуючі агенти, модифікації з модифікованими зв'язками (наприклад, альфа-аномерні нуклеїнові кислоти і т. д.), а також немодифіковані форми полінуклеотиду(ів). Крім того, будь-яку гідроксильну групу, звичайно присутню в цукрах, можна замінити, наприклад, фосфонатними групами, фосфатними групами, захищеними звичайними захисними групами, або активувати з отриманням додаткових зв'язків 9 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в додаткових нуклеотидах, або які можна кон'югувати з твердою або напівтвердою підкладкою. 5'- і 3'-кінцеві ОН-групи можна фосфорилувати або замістити на аміни або органічні кепуючі групи з 1-20 атомів вуглецю. Інші гідроксильні групи також можна дериватизувати з використанням звичайних захисних груп. Також полінуклеотиди можуть містити аналоги цукрів рибози або дезоксирибози, добре відомі в даній галузі, наприклад, такі як 2'-О-метил-, 2'-О-аліл, 2'-фтор- або 2'-азидорибоза, карбоциклічні аналоги цукру, α-аномерні цукри, епімерні цукри, такі як арабіноза, ксилози або ліксози, цукри піранози, цукри фуранози, седогептулози, ациклічні аналоги і основні аналоги нуклеозидів, такі як метилрибозид. Один або декілька фосфодіефірних зв'язків можна замістити на альтернативні зв'язувальні групи. Дані альтернативні лінкерні групи включають, не обмежуючись цим, варіанти здійснення, в яких фосфат замінений Р(О)S ("тіоат"), Р(S)S ("дитіоат"), (О)NR 2 ("амідат"), Р(О)R, Р(О)OR', CO або CH2 ("формацеталь"), в яких кожний R або R' незалежно представляє Н або заміщений або незаміщений алкіл (1-20 С), що необов'язково містить простий ефірний зв'язок (-О-), арил, алкеніл, циклоалкіл, циклоалкеніл або аралдил. Не всі зв'язки в полінуклеотиді повинні бути ідентичними. Приведений вище опис стосується всіх полінуклеотидів, описаних в даному документі, включаючи РНК і ДНК. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "олігонуклеотид", в загальних рисах, він стосується коротких, звичайно одноланцюжкових, як правило, синтетичних полінуклеотидів, звичайно, але необов'язково, довжиною менше ніж приблизно 200 нуклеотидів. Терміни "олігонуклеотид" і "полінуклеотид" не є взаємовиключними. Приведений вище опис для полінуклеотидів однаково і повній мірі стосується олігонуклеотидів. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "EGFL7" (який взаємозамінно називається "EGF-подібний домен, множинний 7''»), він стосується, якщо не указано інакше або трактується по контексту, будь-якого природного або варіантного (природного або синтетичного) поліпептиду EGFL7. Термін "природна послідовність" специфічно включає зрізані або секретовані форми, що зустрічаються в природі (наприклад, послідовність позаклітинного домену), варіантні форми, що зустрічаються в природі (наприклад, альтернативно сплайсовані форми) і алельні варіанти, що зустрічаються в природі. Термін "EGFL7 дикого типу" загалом, стосується поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність білка EGFL7, що зустрічається в природі. Термін "послідовність EGFL7 дикого типу", загалом, стосується амінокислотної послідовності EGFL7, що зустрічається в природі. Терміни "антитіло" або "імуноглобулін" використовуються взаємозамінно в найширшому значенні, і включають моноклональні антитіла (наприклад, повнорозмірні або інтактні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла, полівалентні антитіла, поліспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла, при умові, що вони мають необхідну біологічну активність) і також можуть включати деякі фрагменти антитіла (більш детально описані нижче). Антитіло може бути людським, гуманізованим і/або афінно зрілим антитілом. Термін "варіабельні" стосується того факту, що деякі ділянки варіабельних доменів істотно розрізнюються по послідовності серед антитіл і визначають зв'язування і специфічність кожного конкретного антитіла для його конкретного антигену. Однак варіабельность нерівномірно розподілена у варіабельних доменах антитіл. Вона сконцентрована в трьох сегментах, які називаються визначаючими комплементарність або гіперваріабельними ділянками (CDR або HVR використовуються як взаємозамінні тут), у варіабельних доменах легкого ланцюга і важкому ланцюгу. Більш консервативні ділянки варіабельних доменів називаються каркасними ділянками (FR). Кожний з варіабельних доменів нативних важкого і легкого ланцюгів містить чотири FR, в основному приймаючих конфігурацію β-складок, з'єднаних трьома HVR, які утворюють петлі, що з'єднують, і в деяких випадках утворюють, частину β-складчастої структури. У кожному ланцюгу HVR підтримуються в тісній близькості за допомогою FR і HVR з іншого ланцюга, тим самим вносячи свій внесок в формування антигензв'язувального сайта антитіл (дивись Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Константні області не беруть безпосередньої участі в зв'язуванні антитіла з антигеном, але мають різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в антитілозалежній клітинній токсичності. В результаті розщеплення антитіл папаїном утворюється два ідентичних антигензв'язувальних фрагменти, які називаються "Fab-фрагментами", кожний з яких має один антигензв'язувальний сайт, і залишкову "Fc-область", назва якої відображає його здатність легко кристалізуватися. Обробка пепсином приводить до утворення F(ab') 2-фрагмента, який має два антигензв'язувальні сайти, і він як і раніше здатний зв'язуватися з антигеном. "Fv-фрагмент" являє собою мінімальний фрагмент антитіла, який містить повний антигенрозпізнавальний і антигензв'язувальний сайт. У дволанцюжковому Fv-фрагменті дана 10 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 область складається з димера варіабельного домену одного важкого ланцюга і одного легкого ланцюга, що знаходяться в тісномк, нековалентному зв'язку. У одноланцюжкових Fvфрагментах (scFv) варіабельні домени одного важкого ланцюга і одного легкого ланцюга можуть бути пов'язані ковалентно гнучким пептидним лінкером таким чином, що легкий і важкий ланцюги утворюють "димерну" структуру, аналогічну структурі, яка є в дволанцюжкових Fvфрагментах. Це означає, що в даній конфігурації три HVR кожного варіабельного домену взаємодіють з обмеженням антигензв'язувального сайта на поверхні димера VH-VL. У сукупності шість HVR додають антитілу специфічність зв'язування з антигеном. Однак, навіть один варіабельний домен (або половина Fv-фрагмента, що містить тільки три HVR, специфічних для антигену) має здатність впізнавати і зв'язуватися з антигеном, хоч, і з більш низькою афінністю в порівнянні з цілим зв'язувальним сайтом. Fab-фрагмент також містить константну область легкого ланцюга і перший константний домен (СН1) важкого ланцюга. Fab'-фрагменти відрізняються від Fab-фрагментів додаванням декількох залишків на карбоксикінці домену СН1 важкого ланцюга, що включають один або декілька залишків цистеїну з шарнірної області антитіла. Fab'-SH означає в даному документі Fab'-фрагмент, в якому залишок(и) цистеїну константних областей містить вільну тіолову групу. F(ab')2-фрагменти антитіла спочатку отримують у вигляді пари Fab'-фрагментів, які мають цистеїни шарнірної області між ними. Також відомі інші хімічні зв'язки між фрагментами антитіла. "Легкі ланцюги" антитіл (імуноглобулінів) від одного виду хребетних можна віднести до одного з двох типів, що чітко розрізнюються, які називаються каппа (κ) і лямбда (λ), ґрунтуючись на амінокислотних послідовностях їх константних областей. У залежності від амінокислотної послідовності константного домену їх важких ланцюгів, імуноглобуліни можна віднести до різних класів. Існує п'ять основних класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, і деякі з них можна додатково поділити на підкласи (ізотипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgА1 і IgА2. Константні домени важкого ланцюга, відповідні різним класам імуноглобулінів, називаються відповідно α, δ, ε, γ і μ. Структури окремих субодиниць і тривимірні конфігурації різних класів імуноглобулінів добре відомі. "Фрагменти антитіла" містять тільки фрагмент інтактного антитіла, в якому фрагмент переважно зберігає щонайменше одну, переважно більшу частину або всі функції, звичайно пов'язані з фрагментом, коли він знаходиться в інтактному антитілі. Приклади фрагментів антитіл включають Fab, Fab', F(ab')2 і Fv-фрагменти; діатіла; лінійні антитіла; одноланцюжкові молекули антитіл; і поліспецифічні антитіла, утворені фрагментами антитіл. У одному варіанті здійснення фрагмент антитіла містить антигензв'язувальний сайт інтактного антитіла і, таким чином, зберігає здатність зв'язуватися з антигеном. У ще одному варіанті здійснення фрагмент антитіла, наприклад, який складається з Fc-області, зберігає щонайменше одну з біологічної активності, звичайно пов'язаної з Fc-областю, коли вона знаходиться в інтактному антитілі, наприклад, зв'язування з FcRn, зміна періоду напіврозпаду антитіла, ADCC-активність і зв'язування комплементу. У одному варіанті здійснення фрагмент антитіла є моновалентним антитілом, яке має в умовах in vivo період напіврозпаду по суті аналогічний даному параметру інтактного антитіла. Наприклад, такий фрагмент антитіла може містити одне антигензв'язувальне плече, сполучене з Fc-послідовністю, здатною додавати фрагменту стабільності в умовах in vivo. У тому значенні, в якому в даному документі використовуються терміни "гіперваріабельна ділянка", "HVR" або "HV", вони стосуються ділянок варіабельного домену антитіла, які є гіперваріабельними по послідовності і/або утворюють структурно обмежені петлі. Як правило, антитіла містять шість HVR; три в VH (H1, H2, H3) і три в VL (L1, L2, L3). У нативних антитілах H3 і L3 виявляють найбільшу різноманітність шести HVR, і зокрема, вважають, що Н3 відіграє унікальну роль в забезпеченні тонкої специфічності антитіл. Дивись, наприклад, Xu et al., Immunity, 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology, 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Дійсно, природні camelid антитіла, які складаються тільки з важкого ланцюга, є функціональними і стабільними при відсутності легкого ланцюга. Дивись, наприклад, Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol., 3:733-736 (1996). Застосовують ряд систем, що визначають HVR, і вони включені в даний документ. Області, які визначають комплементарність по Кебату (CDR), основані на варіабельності послідовностей th і застосовуються найчастіше (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Замість цього, система Чотія основана на положенні структурних петель (Chothia and Lesk J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Визначення HVR в AbM представляють компроміс між HVR по Кебату і структурними 11 UA 105386 C2 петлями по Чотія, і такі визначення використовують в комп'ютерних програмах по моделюванню антитіл Oxford Molecular's AbM antibody. "Контактні області" HVR основані на аналізі наявних складних кристалічних структур. Нижче приводяться залишки кожного з даних HVR. Петля L1 L2 L3 H1 По Кебату L24-L34 L50-L56 L89-L97 H31-H35В H1 H31-H35 H2 H3 H50-H65 H95-H102 AbM По Чотіа L24-L34 L26-L32 L50-L56 L50-L52 L89-L97 L91-L96 H26-H35В H26-H32 (Нумерація по Кебату) H26-H35 H26-H32 (Нумерація по Чотіа) H50-H58 H53-H55 H95-H102 H96-H101 Контактна область L30-L36 L46-L55 L89-L96 H30-H35В H30-H35 H47-H58 H93-H101 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 HVR можуть включати наступні "подовжені HVR": 24-36 або 24-34 (L1), 46-56 або 50-56 (L2) і 89-97 або 89-96 (L3) в VL і 26-35 (Н1), 50-65 або 49-65 (Н2) і 93-102, 94-102 або 95-102 (Н3) в VH. Залишки варіабельного домену нумеруються по системі Кебата і інш., дивись вище, для кожного з даних визначень. Залишки "каркасної області" або "FR" представляють залишки варіабельного домену, інші, ніж залишки гіперваріабельної ділянки, визначені в даному документі. "Гуманізовані" форми антитіл, відмінних від людських (наприклад, мишачі), представляють химерні антитіла, які містять мінімальну послідовність, отриману з імуноглобуліну, який відрізняється від імуноглобуліну людини. У одному варіанті здійснення гуманізоване антитіло представляє людський імуноглобулін (реципієнтне антитіло), в якому залишки HVR реципієнта замінені на залишки HVR від виду, який відрізняється від людини (донорне антитіло), такого як миша, щур, кролик або примат, що має бажану специфічність, афінність і/або ефективність. У деяких випадках залишки FR людського імуноглобуліну заміщені на відповідні залишки, які відрізняються від людських залишків. Крім того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які відсутні в реципієнтному антитілі або донорному антитілі. Дані модифікації проводять для додаткового підвищення ефективності антитіла. Загалом гуманізоване антитіло буде містити весь щонайменше один і як правило, два варіабельних домени, в яких всі або по суті всі гіперваріабельні петлі відповідають петлям в імуноглобуліні, який відрізняється від людського імуноглобуліну, і всі або по суті всі FR представляють FR з послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло необов'язково також буде містити щонайменше частину константної області імуноглобуліну (Fc), як правило, імуноглобуліну людини. Додаткові деталі дивись, наприклад, у Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323329 (1988); і Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). Також дивись, наприклад, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol., 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech., 5:428-433 (1994); і патенти США №№ 6982321 і 7087409. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "моноклональне антитіло", він стосується антитіла, отриманого з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є ідентичними, за винятком можливих мутацій, наприклад, мутацій, що зустрічаються в природі, які можуть бути присутнім в мінорних кількостях. Таким чином, визначення "моноклональне" вказує на характер антитіла, а не на те, що це суміш окремих антитіл. У деяких варіантах здійснення таке моноклональне антитіло, як правило, включає антитіло, що містить поліпептидну послідовність, яка зв'язується з мішенню, де поліпептидна послідовність, що зв'язується з мішенню, отримана способом, який включає відбір поліпептидної послідовності, яка зв'язується з тільки однією мішенню, з множини поліпептидних послідовностей. Наприклад, процес відбору може представляти відбір унікального клону з множини клонів, такої як пул гібридомних клонів, фагових клонів або клонів рекомбінантної ДНК. Очевидно, зрозуміло, що відібрану послідовність, яка зв'язується з мішенню, можна додатково змінити, наприклад, з метою підвищення афінності для мішені, для гуманізації послідовності, що зв'язується з мішенню, для підвищення її продукції в клітинній культурі, для зниження її імуногенності в умовах in vivo, для отримання поліспецифічного антитіла і т. д., і що антитіло, яке містить змінену послідовність, що зв'язується з мішенню, також є моноклональним антитілом за даним винаходом. На противагу препаратам поліклональних антитіл, які звичайно включають різні антитіла до різних детермінантів (епітопів), кожне моноклональне антитіло в препараті моноклонального антитіла направлене до 12 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 однієї детермінанти на антигені. У доповнення до їх специфічності, препарати моноклональних антитіл є переважними в тому відношенні, що, як правило, вони не містять домішок інших імуноглобулінів. Визначення "моноклональне" вказує на природу антитіла, як отриманого по суті з гомогенної популяції антитіл, і при цьому не передбачається необхідності отримання антитіла яким-небудь конкретним методом. Наприклад, моноклональні антитіла, призначені для застосування за даним винаходом, можна отримати різними методами, включаючи, наприклад, гібридомний метод (наприклад, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14(3):253-260 (1995); Harlow et al., Antibodies: А Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1988); Hammerling et al., in Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas, 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), методи рекомбінантної ДНК (дивись, наприклад, патент США № 4816567), технології фагового дисплея (дивись, наприклад, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol., 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol., 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(34):1246712472 (2004) і Lee et al., J. Immunol. Methods, 284(1-2):119-132 (2004) і технології отримання людських і подібних людським антитіл у тварин, які містять фрагменти або всі локуси людських імуноглобулінів, або гени, що кодують послідовності імуноглобулінів людини (дивись, наприклад, міжнародні заявки WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993);патенти США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 і 5661016; Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol., 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol., 14:826 (1996); і Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)). Моноклональні антитіла, описані в даному документі, конкретно включають "химерні" антитіла, в яких фрагмент важкого і/або легкого ланцюга ідентичний або гомологічний відповідним послідовностям в антитілах, отриманих від конкретного виду, або які належать до певного класу або підкласу антитіл, в той час як інша частина ланцюга(ів) ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, отриманих від іншого виду, або які належать до іншого класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, при умові, що вони виявляють необхідну біологічну активність (дивись, наприклад, патент США № 4816567 і Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерні антитіла включають ® антитіла PRIMATIZED , в яких антигензв'язувальна ділянка антитіла отримана з антитіла, продукованого, наприклад, імунізацією макак цікавлячим антигеном. "Одноланцюжкові Fv" або "scFv" фрагменти антитіл містять домени VH і VL антитіла, в яких дані домени знаходяться в одному поліпептидному ланцюгу. Як правило, поліпептид scFv додатково містить поліпептидний лінкер між доменами VH і VL, який забезпечує утворення бажаної структури scFv для зв'язування антигену. Огляд по scFv дивись, наприклад, у Pluckthun в "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (SpringerVerlag, New York, 1994), pp. 269-315 (1994). Термін "антиген" представляє заздалегідь визначений антиген, з яким антитіло може вибірково зв'язуватися. Антиген-мішень може представляти поліпептид, вуглевод, нуклеїнову кислоту, ліпід, гаптен або іншу синтетичну або що зустрічається в природі сполуку. Термін "діатіла" стосується невеликих фрагментів антитіл з двома антигензв'язувальними сайтами, де дані фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), сполучений з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) в одному тому ж поліпептидному ланцюгу (VH-VL). При використанні лінкеру, який є дуже коротким для того, щоб мало місце спарювання двох доменів в одному і тому ж ланцюгу, домени "вимушені" спарюватися з комплементарними доменами іншого ланцюга, і в результаті утворюються два антигензв'язувальні сайти. Більш детально діатіла описані, наприклад, в EP 404097; міжнародній заявці WO 1993/1116; і Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Також описані триатіла і тетратіла, у Hudson et al., Nat. Med., 9:129-134 (2003). "Людське антитіло" представляє антитіло, яке має амінокислотну послідовність, відповідну послідовності антитіла, продукованого людиною і/або отримане з використанням будь-якого методу отримання людських антитіл, розкритих в даному документі. Таке визначення людського антитіла конкретно включає гуманізоване антитіло, що містить антигензв'язувальні залишки, які відрізняються від антигензв'язувальних залишків людини. Людські антитіла можна отримати з використанням різних способів, відомих в даній галузі, включаючи бібліотеки фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Також для отримання людських моноклональних антитіл є методи, описані Cole et al., 13 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, р. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Дивись також van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5:368-374 (2001). Людські антитіла можна отримати веденням антигену трансгенній тварині, яка модифікована для продукції таких антитіл у відповідь на введення антигену, але чиї ендогенні локуси блоковані, наприклад, імунізовані xenomice (дивись, наприклад, патенти США №№ 6075181 і 6150584, що стосуються технології XENOMOUSE™). Також дивись, наприклад, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006), де описуються людські антитіла, отримані з використанням гібридомної технології з людськими В-клітинами. Терміни "нумерація залишків варіабельного домену по Кебату" або "нумерація амінокислотних положень по Кебату" і їх варіації, стосуються системи нумерації, що використовується для варіабельних доменів важкого ланцюга або варіабельних доменів легкого ланцюга компіляції антитіл по Кебату і інш., вище. При використанні даної системи нумерації фактична лінійна амінокислотна послідовність може містити меншу кількість амінокислот або, навпаки, додаткові амінокислоти, що відповідає укорочуванню або інсерції FR або HVR варіабельного домену. Наприклад, варіабельний домен важкого ланцюга може містити один амінокислотний інсерт (залишок 52а по системі Кебат) після залишку 52 в Н2 і інсерційовані залишки (наприклад, залишки 82а, 82b і 82с і т. д. по системі Кебат) після залишку 82 важкого ланцюга FR. Нумерацію залишків по Кебату можна провести для даного антитіла вирівнюванням по областях гомології послідовності антитіла зі "стандартною" нумерованою послідовністю по Кебату. Як правило, систему нумерації по Кебату використовують при вказівці залишку у варіабельному домені (приблизно залишки 1-107 в легкому ланцюгу і залишки 1-113 у важкому ланцюгу) (наприклад, Кебат і інш., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)). "EU-систему нумерації" або "EUіндекс" звичайно використовують при вказівці залишку в константній області важкого ланцюга імуноглобуліну (наприклад, EU-індекс по Кебату і інш., вище). "EU-індекс по Кебату" стосується нумерації залишків людського IgG1 антитіла EU. Якщо не указано інакше, то номери залишків у варіабельному домені антитіл означають нумерацію залишків по системі нумерації Кебат. Якщо не указано інакше, то номери залишків в константній області антитіл означають нумерацію залишків по EU-системі нумерації (дивись, наприклад, попередню заявку на патент США № 60/640323, фігури для EU-нумерації). "Блокуюче антитіло" або "антитіло-антагоніст" представляє антитіло, яке інгібує або знижує біологічну активність антигену, з яким воно зв'язується. Деякі блокуючі антитіла або антитілаантагоністи суттєво або повністю інгібують біологічну активність антигену. У тому значенні, в якому в даному документі використовуються терміни "по суті аналогічне" або "по суті однакове", вони означають досить високий ступінь схожості між двома цифровими значеннями (наприклад, одне асоційоване з антитілом винаходу, і інше асоційоване з контрольним антитілом/антитілом порівняння), так, що фахівець в даній галузі буде розглядати відмінність між двома значеннями, як незначну або що не має біологічної і/або статистичної значущості в контексті біологічних характеристик, які виражаються вказаними значеннями (наприклад, значеннями Kd). Відмінність між двома вказаними значеннями складає, наприклад, менше ніж приблизно 50 %, менше ніж приблизно 40 %, менше ніж приблизно 30 %, менше ніж приблизно 20 % і/або менше ніж приблизно 10 %, як функція з контрольного антитіла/антитіла порівняння. У тому значенні, в якому в даному документі використовуються вирази "по суті знижене" або "по суті інше", вони означають досить високий ступінь відмінності між двома цифровими значеннями (звичайно одне асоційоване з молекулою, і інше асоційоване з контрольним антитілом/антитілом порівняння), так, що фахівець в даній галузі буде розглядати відмінність між двома значеннями, як статистично значущу в контексті біологічних характеристик, які виражаються вказаними значеннями (наприклад, значеннями Kd). Відмінність між двома вказаними значеннями складає, наприклад, більше ніж приблизно 10 %, більше ніж приблизно 20 %, більше ніж приблизно 30 %, більше ніж приблизно 40 % і/або більше ніж приблизно 50 %, як функція контрольного антитіла/антитіла порівняння молекули. Термін "ефекторні функції" антитіла стосується такої біологічної активності, за яку "відповідає" Fc-область (Fc-область з природною послідовністю або Fc-область з варіантною амінокислотною послідовністю) антитіла, і вони варіюють в залежності від ізотипу антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіл включають: зв'язування C1q і комплементзалежну цитотоксичність (CDC); зв'язування з Fc-рецептором; антитілозалежну клітиноопосередковану цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; негативну регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, рецепторів В-клітин) і активацію В-клітин. 14 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "Fc-область", він стосується С-кінцевої області важкого ланцюга імуноглобуліну, включаючи Fc-області з нативною послідовністю і варіантні Fc-області. Незважаючи на те, що межі Fc-області важкого ланцюга імуноглобуліну можуть варіювати, Fc-область важкого ланцюга IgG людини звичайно визначається, як ділянка від амінокислотного залишку в положенні Cys226 або від Pro230 до карбоксилкінця. С-кінцевий лізин (залишок 447 по EU-системі нумерації) Fc-області можна видалити, наприклад, під час отримання або очищення антитіла, або рекомбінантним конструюванням нуклеїнової кислоти, яка кодує важкий ланцюг антитіла. Отже, композиція інтактних антитіл може містити популяції антитіл з повністю видаленими залишками К447, популяції антитіл без видалення залишків К447 і популяції антитіл зі сумішшю антитіл з і без залишків К447. "Функціональна Fc-область" має "ефекторну функцією" Fc-області з нативною послідовністю. Приклади "ефекторних функцій" включають зв'язування з C1q; CDC; зв'язування з Fc-рецептором; ADCC; фагоцитоз; негативну регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, рецепторів В-клітин; BCR) і т. д. Звичайно для вияву таких ефекторних функцій потрібно, щоб Fc-область була з'єднана зі зв'язувальним доменом (наприклад, варіабельним доменом антитіла), і їх можна оцінити з використанням різних методів, наприклад, розкритих в розділі "Визначення" в даному документі. "Fc-область з природною послідовністю" містить амінокислотну послідовність, ідентичну амінокислотній послідовності Fc-області, що зустрічається в природі. Fc-області з природною послідовністю включають Fc-область з нативною послідовністю людського IgG1 (не-А і Аалотипи); Fc-область з нативною послідовністю людського IgG 2, Fc-область з нативною послідовністю людського IgG3 і Fc-область з нативною послідовністю людського IgG 4, а також їх варіанти, що зустрічаються в природі. "Варіантна Fc-область" включає амінокислотну послідовність, яка відрізняється від Fcобласті з нативною послідовністю щонайменше за рахунок однієї амінокислотної модифікації, переважно за рахунок однієї або більше амінокислотних замін. Переважно варіантна Fc-область містить щонайменше одну амінокислотну заміну в порівнянні з Fc-областю з нативною послідовністю або з Fc-областю вихідного поліпептиду, наприклад, приблизно від однієї до приблизно десяти амінокислотних замін, і переважно приблизно від однієї до приблизно п'яти амінокислотних замін в Fc-області з природною послідовністю або Fc-областю початкового поліпептиду. Варіантна Fc-область, описана в даному документі, буде мати щонайменше приблизно 80 % гомологію з Fc-областю з природною послідовністю і/або з Fc-областю вихідного поліпептиду, і найбільш переважно щонайменше приблизно 90 % гомологію з Fcобластю з природною послідовністю і/або з Fc-областю вихідного поліпептиду, більш переважно щонайменше приблизно 95 % гомологіє з Fc-областю з природною послідовністю і/або з Fcобластю вихідного поліпептиду. Терміни "Fc-рецептор" або "FcR" описують рецептор, який зв'язується з Fc-областю антитіла. У деяких варіантах здійснення FcR представляє нативний людський FcR. У деяких варіантах здійснення FcR представляє рецептор, який зв'язується з IgG-антитілом (гаммарецептор), і включає рецептори підкласів FcγRI, FcγRII і FcγRIII, в тому числі, алельні варіанти і альтернативно сплайсовані форми даних рецепторів. FcγRII-рецептори включають FcγRIIА ("активуючий рецептор") і FcγRIIB ("інгібуючий рецептор") з аналогічними амінокислотними послідовностями, що розрізнюються, головним чином, по їх цитоплазматичних доменах. Активуючий FcγRIIА-рецептор містить оснований на тирозині мотив активації імунорецептора (ITAM) в своєму цитоплазматичному домені. Інгібуючий FcγRIIВ-рецептор містить оснований на тирозині мотив інгібування імунорецептора (ITIM) в своєму цитоплазматичному домені (дивись, наприклад, Daеron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Огляд по FcR дивись, наприклад, у Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); і de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Інші FcR, включаючи такі, які будуть ідентифіковані в майбутньому, входять в поняття терміну "FcR", що використовується в даному документі. Терміни "Fc-рецептор" або "FcR" також включають неонатальний рецептор FcRn, який відповідає за перенесення материнських IgG до плоду (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) і Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)) і регуляцію гомеостазу імуноглобулінів. Відомі методи оцінки зв'язування з FcRn (дивись, наприклад, Ghetie and Ward, Immunol. Today, 18(2):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem., 279(8):6213-6216 (2004); міжнародну заявку WO 2004/92219 (Hinton et al.)). Зв'язування з FcRn людини в умовах in vivo і період напіврозпад поліпептидів, які зв'язують FcRn людини з високою афінністю можна аналізувати, наприклад, у трансгенних мишей або з 15 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 використанням трансфікованих людських клітинних ліній, які експресують FcRn людини, або у приматів, яким вводять поліпептиди з варіантною Fc-областю. У міжнародній заявці WO 2000/42072 (Presta) описані варіанти антитіл з підвищеним або зниженим зв'язуванням з FcR. Дивись також, наприклад, Shields et al., J. Biol. Chem., 9(2):6591-6604 (2001). "Ефекторні клітини людини" представляють лейкоцити, які експресують один або декілька FcR і здійснюють ефекторні функції. У деяких варіантах здійснення клітини експресують FcγRIII і здійснюють ефекторні функції ADCC. Приклади лейкоцитів людини, які опосередковують ADCC, включають мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC), і природні клітини-кілери (NK), моноцити, цитотоксичні Т-клітини і нейтрофіли. Клітини-ефектори можна виділити з природного джерела, наприклад, крові. "Антитілозалежна клітиноопосередкована цитотоксичність" або "ADCC" стосується форми цитотоксичності, при якій секретований Ig, пов'язаний з Fc-рецепторами (FcR), що знаходяться на деяких цитотоксичних клітинах (наприклад, NK-клітинах, нейтрофілах і макрофагах), здатний забезпечувати специфічне зв'язування даних цитотоксичних клітин-ефекторів з антигеннесучими клітинами-мішенями і потім приводити до загибелі клітин-мішеней під дією цитотоксинів. Основними клітинами, які опосередковують ADCC, є NK-клітини, які експресують тільки FcγRIII, в той час як моноцити експресують FcγRI, FcγRII і FcγRIII. Узагальнені дані по експресії FcR на гематопоетичних клітинах приведені в таблиці 3 на стор. 464 роботи Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Для оцінки ADCC-активності цікавлячої молекули можна провести тест ADCC в умовах in vitro, такий як описаний в патентах США № 5500362 або 5821337, або в патенті США № 6737056 (Presta). Прийнятні клітини-ефектори для постановки таких тестів, включають клітини PBMC і NK. Альтернативно або додатково, активність ADCC цікавлячої молекули можна оцінити в умовах in vivo, наприклад, на моделі тварин, такій як описана Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1998). "Комплементзалежна цитотоксичність" або "CDC" стосується лізису клітини-мішені в присутності комплементу. Активація класичного шляху комплементу ініціюється зв'язуванням першого компонента комплементної системи (C1q) з антитілами (відповідного підкласу), що знаходяться в комплексі зі своїм антигеном. Для оцінки активації комплементу можна провести аналіз CDC, наприклад, такий як описаний Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996). Описані поліпептидні варіанти із зміненою амінокислотною послідовністю Fc-області (поліпептиди з варіантною Fc-областю) з підвищеною або зниженою здатністю зв'язувати C1q, наприклад, в патенті США № 6194551 В1 і міжнародній заявці WO 1999/51642. Дивись також, наприклад, Idusogie et al., J. Immunol., 164:4178-4184 (2000). Термін "антитіло, що містить Fc-область" стосується антитіла, яке містить Fc-область. Скінцевий лізин (залишок 447 згідно з EU-системою нумерації) Fc-області можна видалити, наприклад, під час очищення антитіла або рекомбінантним конструюванням нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло. Отже, композиція, що містить антитіло, що має Fc-область за даним винаходом, може включати антитіло з K447, антитіло з повністю видаленим залишком K447, або суміш антитіл з і без залишку K447. "Акцепторна людська каркасна область" для цілей даної заявки, представляє каркасну область, що містить амінокислотну послідовність каркасної області VL або VH, отриману з каркасної області імуноглобуліну людини або людської консенсусної каркасної області. Акцепторна людська каркасна область, "отримана з" каркасної області імуноглобуліну людини або людської консенсусної каркасної області, може містити таку ж амінокислотну послідовність, або вона може включати раніше існуючі зміни амінокислотної послідовності. У тому випадку, коли заздалегідь існуючі зміни амінокислот мають місце, то їх число складає не більше 5 і переважно 4 або менше, або 3 або менше, заздалегідь існуючих змін амінокислот. У тому випадку, коли раніше існуючі зміни амінокислот знаходяться в VH, то переважно, щоб дані зміни мали місце тільки в трьох, двох або одному положеннях 71Н, 73Н і 78Н; наприклад, амінокислотні залишки в даних положеннях можуть являти собою 71А, 73Т і/або 78А. У одному варіанті здійснення акцепторна людська каркасна область VL ідентична послідовності каркасної області VL імуноглобуліну людини або людської консенсусної каркасної області. "Людська консенсусна каркасна область" являє собою каркасну область, в якій знаходяться амінокислотні залишки, що найчастіше зустрічаються при виборі послідовностей каркасної області VL або VH імуноглобуліну людини. Як правило, вибирають послідовності VL або VH імуноглобуліну людини з підгрупи послідовностей варіабельних доменів. Загалом, підгрупа послідовностей є підгрупою по Кебату і інш., вище. У одному варіанті здійснення, відносно VL, підгрупа представляє підгрупу каппа I по Кебату і інш., вище. У одному варіанті здійснення, відносно VH, підгрупа представляє підгрупу III по Кебату і інш. 16 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Консенсусна каркасна область VH підгрупи III" включає консенсусну послідовність, отриману з амінокислотних послідовностей в підгрупі III варіабельних доменів важкого ланцюга по Кебату і інш. "Консенсусна каркасна область VH підгрупи III" включає консенсусну послідовність, отриману з амінокислотних послідовностей варіабельних доменів важкого ланцюга каппа підгрупи III по Кебату і інш. У одному варіанті здійснення амінокислотна послідовність консенсусної каркасної області VH підгрупи III містить щонайменше фрагмент або повністю кожну з наступних послідовностей: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:197)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:198)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDAVYYC (SEQ ID NO:199)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:200). "Консенсусна каркасна область VL підгрупи I" включає консенсусну послідовність, отриману з амінокислотних послідовностей варіабельних доменів легкого ланцюга каппа підгрупи I по Кебату і інш. У одному варіанті здійснення амінокислотна послідовність консенсусної каркасної області VH підгрупи III містить щонайменше фрагмент або повністю кожну з наступних послідовностей: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:201)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:202)L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:203)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID NO:221). Термін "біологічна проба" включає (взаємозамінно з термінами "проба" або "зразок тканини або клітини") різні типи проб, отриманих від суб'єкта, і які можна використовувати для діагностичного тесту або моніторингу. Визначення включає кров і проби інших рідин біологічного походження, зразки твердої тканини, такі як біопсійний матеріал культури або тканин, або клітини, отримані з них, і їхнє потомство. Також визначення включає проби, з якими маніпулювали будь-яким чином після їх отримання, наприклад, обробка реагентами, солюбілізація або збагачення для визначених компонентів, таких як білки або полінуклеотиди, або занурення в напівтверду або тверду матрицю для готування зрізів. Термін "біологічна проба" включає клінічний зразок, і також включає клітини в культурі, клітинні супернатанти, клітинні лізати, сироватку крові, плазму крові, біологічну рідину і зразки тканини. Джерелом біологічної проби може бути тверда тканина, наприклад, свіжого, замороженого і/або законсервованого органа або тканини, або біопсійний матеріал, або аспірат; цільна кров або будь-які компоненти крові; рідини організму, такі як спинномозкова рідина, амніотична рідина, перитонеальна рідина або інтерстиціальна рідина; клітини на будь-якій стадії вагітності або розвитку суб'єкта. У деяких варіантах здійснення біологічну пробу одержують з первинної або метастазуючої пухлини. Біологічна проба може містити сполуки, що відсутні в тканині в природних умовах, наприклад, такі як консерванти, антикоагулянти, буфери, фіксатори, поживні речовини, антибіотики або тому подібне. У тому значенні, у якому в даному документі використовується термін "зріз" зразка тканини, він означає один або частину шматочок зразка тканини, наприклад, тонкий шар тканини або клітин, зрізаних зі зразка тканини. Очевидно, зрозуміло, що можна відібрати численні зрізи зразків тканини і піддати аналізу за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення той самий зразок тканини аналізують на морфологічному і молекулярному рівні, або аналізують на вміст білка або нуклеїнової кислоти. У тому значенні, у якому в даному документі використовується термін "мітка", він стосується сполуки або композиції, які кон'юговані прямо або опосередковано з реагентом, таким як нуклеїновокислотний зонд або антитіло, і сприяють детектуванню реагенту, з яким вони кон'юговані або злиті. Мітка може бути сама детектованою (наприклад, радіоізотопні мітки або флуоресцентні мітки) чи, як це має місце у випадку ферментативної мітки, вона може каталізувати хімічну зміну субстрату або композиції, які потім детектуються. "Лікарський препарат" представляє активний лікарський препарат для лікування конкретного розладу або його симптомів, або побічних ефектів. "Розлад" або "захворювання" означає будь-який стан, при якому буде корисне лікування з використанням субстанції/молекули або способу за винаходом. Такий стан включає хронічні і гострі розлади або захворювання, у тому числі, такі патологічні стани, що зумовлюють схильність ссавців до розглянутого розладу. Не обмежуючі приклади розладів, що піддаються лікуванню згідно із даним винаходом, включають злоякісні і доброякісні пухлини; карциному, бластому і саркому. Терміни "клітинно-проліферативний розлад" і "проліферативний розлад" стосуються порушень, які асоційовані з певним ступенем аномальної проліферації клітин. В одному варіанті здійснення проліферативним порушенням є рак. 17 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У тому значенні, у якому в даному документі використовується термін "пухлина", він стосується росту і проліферації всіх неопластичних клітин, незалежно від того, є вони злоякісними або доброякісними, а також усіх передзлоякісних і злоякісних клітин і тканин. Терміни "рак", "раковий", "клітинно-проліферативний розлад", "проліферативний розлад" і "пухлина" не є взаємовиключними при згадуванні в даному документі. Терміни "рак" і "раковий" стосуються або описують фізіологічний стан у ссавців, що звичайно характеризується нерегульованим ростом/проліферацією клітин. Приклади злоякісної пухлини включають, не обмежуючи цим, карциному, лімфому, бластому, саркому, і лейкози. Більш конкретні приклади таких злоякісних пухлин включають, не обмежуючи цим, плоскоклітинний рак, дрібноклітинний рак легень, рак гіпофіза, рак стравоходу, астроцитому, саркому м'яких тканин, недрібноклітинний рак легень, аденокарциному легень, плоскоклітинну карциному легень, рак очеревини, гепатоцелюлярний рак, рак органів шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчників, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак ободової кишки, рак прямої кишки, рак ободової і прямої кишки, карциному ендометрія або матки, карциному слинної залози, рак нирок, рак печінки, рак передміхурової залози, рак вульви, рак щитовидної залози, карциному печінки, рак мозку, рак ендометрія, рак яєчка, холангіокарциному, рак жовчного міхура, рак шлунка, меланому і різні типи раку голови і шиї. Порушення регуляції ангіогенезу може привести до багатьох розладівм, які можна лікувати композиціями і способами за винаходом. Дані розлади включають ненеопластичні і неопластичні захворювання. Неопластичні захворювання включають, не обмежуючи цим, описані вище. Ненеопластичні розлади включають, не обмежуючи цим, небажану або аномальну гіпертрофію, артрит, ревматоїдний артрит (RA), псоріаз, псоріатичні бляшки, саркоїдоз, атеросклероз, атеросклеротичні бляшки, діабетичні й інші проліферативні ретинопатії, включаючи ретинопатію недоношених, ретролентальну фіброплазію, неоваскулярну глаукому, вікову макулярну дегенерацію, діабетичний макулярний набряк, неоваскуляризацію рогівки, неоваскуляризацію трансплантата рогівки, відторгнення трансплантата рогівки, неоваскуляризацію сітківки/хороїдальну неоваскуляризацію ока, неоваскуляризацію райдужки і кута передньої камери (рубеоз), неоваскулярне захворювання ока, судинний рестеноз, артеріовенозні аномалії (AVM), менінгіому, гемангіому, ангіофіброму, гіперплазію щитовидної залози (включаючи хворобу Граве), трансплантацію рогівки й інших тканин, хронічне запалення, запалення легень, гостре ушкодження легень/ARDS, сепсис, первинну пульмонарну гіпертензію, злоякісні легеневі випоти, набряк мозку (наприклад, пов'язаний з гострим інсультом/закритою травмою голови/травмою), синовіальне запалення, утворення пануса при RA, осифіціюючий міозит, гіпертрофічне утворення кісток, остеоартрит (OA), рефракторний асцит, полікістоз нирок, ендометріоз, хвороби, пов'язані з утратою рідини в 3rd простір (панкреатит, синдром тривалого здавлювання, опіки, захворювання кишечнику), фіброзні пухлини матки, передчасні пологи, хронічне запалення, таке як IBD (хвороба Крона і виразковий коліт), відторгнення алотрансплантата нирок, запальне захворювання кишечнику, нефротичний синдром, небажане або аномальне збільшення маси тіла (незлоякісної природи), гемофілічні суглоби, гіпертрофічні рубці, зниження росту волосся, синдром Ослера-Вебера, піогенну гранульому, ретролентальну фіброплазію, склеродерму, трахому, васкулярні адгезії, синовіт, дерматит, прееклампсію, асцит, перикардіальний випіт (такий як має місце при перикардиті) і плевральний випіт. Термін "викликаючі виснаження" розлади (наприклад, синдром виснаження, кахексія, саркопенія) стосується розладу, викликаного небажаною і/або нездоровою втратою маси тіла, або втратою клітинної маси тіла. У літньому віці, а також у пацієнтів зі СНІДом і злоякісним захворюванням. Виснаження може привести до небажаної втрати маси тіла, включаючи кількість жиру і безжирових ділянок. Хвороби, що викликають виснаження, можуть бути результатом неадекватного прийому їжі і/або метаболічних порушень, пов'язаних із хворобою і/або старінням. У пацієнтів зі злоякісним захворюванням і СНІДом, а також у пацієнтів після великої хірургічної операції або страждаючих на хронічні інфекції, імунологічні захворювання, гіпертироїдизм, хворобу Крона, психогенне захворювання, хронічну серцеву недостатність або іншу тяжку травму, часто має місце виснаження, що іноді також називають кахексією, метаболічним розладом і іноді розладом прийому їжі. Кахексія додатково характеризується гіперметаболізмом або гіперкатаболізмом. Незважаючи на те, що терміни кахексія і виснаження часте використовують взаємозамінно стосовно станів, що викликають виснаження, є щонайменше один показник організму, за допомогою якого можна диференціювати кахексію і синдром виснаження в результаті втрати безжирової маси, і, зокрема, утрату клітинної маси організму (Mayer, 1999, J. Nutr. 129 (1S Suppl.): 256S-259S). Саркопенія, ще один такий розлад, що може мати місце в людей похилого віку, звичайно характеризується втратою м'язової маси. 18 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Кінцева стадія захворювання, що викликає виснаження, описане вище, може розвитися в суб'єктів, які страждають на кахексію або саркопенію. У тому значенні, у якому в даному документі використовується термін "лікування", він стосується клінічного втручання зі спробою змінити природний перебіг хвороби в індивідуума або в клітині, що піддаються лікуванню, і його можна проводити в профілактичних цілях або вже під час протікання клінічної патології. Бажані ефекти лікування включають попередження появу або рецидиву захворювання, ослаблення симптомів, зниження будь-яких прямих або опосередкованих патологічних наслідків захворювання, зменшення швидкості прогресування захворювання, ослаблення або пом'якшення протікання захворювання і ремісію або покращений прогноз результату захворювання. У деяких варіантах здійснення антитіла за винаходом використовують для придушення розвитку захворювання або розлади. "Антиангіогенний засіб" або "інгібітор ангіогенезу" стосується низькомолекулярної сполуки, полінуклеотиду, поліпептиду, виділеного білка, рекомбінантного білка, антитіла або їх кон'югатів або злитих білків, які інгібують ангіогенез, васкулогенез або небажану проникність судин, прямо або опосередковано. Наприклад, антиангіогенним засобом є антитіло або інший антагоніст ангіогенного фактора, який описаний вище, наприклад антитіла проти VEGF, антитіла проти рецепторів VEGF, невеликі молекули, що блокують передачу сигналу рецептора VEGF (наприклад, PTK787/ZK2284, SU 6668, SUTENT /SU1248 (сунитиніб малат), AMG706). Антиангіогенні засоби також включають природні інгібітори ангіогенезу, наприклад ангіостатин, ендостатин і т. д. Дивися, наприклад, Klagsbrun and D'амоrе, Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22: 3172-3179 (2003) (наприклад, таблицю 3, у якій перераховані антиангіогенні лікарські засоби для лікування злоякісної меланоми); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22: 6549-6556 (2003) (наприклад, таблицю 2, у якій перераховані антиангіогенні фактори) і Sato Int. J. Clin. Oncol., 8: 200-206 (2003) (наприклад, таблицю 1, у якій перераховані антиангіогенні засоби, що проходять клінічні дослідження). "Індивідуум", "суб'єкт" або "пацієнт" є хребетним. У деяких варіантах здійснення хребетне є ссавцем. Ссавці включають, не обмежуючи цим, сільськогосподарських тварин (таких як корови), спортивних тварин, домашніх тварин (таких як кішки, собаки або коні), приматів, мишей і щурів. У деяких варіантах здійснення ссавець є людиною. Термін "ефективна кількість" стосується кількості, ефективної, при дозуваннях і протягом періодів часу, необхідних для досягнення бажаного терапевтичного або профілактичного результату. "Терапевтично ефективна кількість" сполуки/молекули за винаходом, агоніста або антагоніста, може варіювати в залежності від таких факторів, як протікання захворювання, вік, стать і маса індивідуума, і здатності сполуки/молекули, агоніста або антагоніста, викликати необхідну відповідну реакцію в індивідуума. Терапевтично ефективна кількість також представляє кількість, при якій будь-які токсичні або негативні ефекти сполуки/молекули, агоніста або антагоніста, переважуються терапевтично корисними ефектами. Термін "профілактично ефективна кількість" стосується кількості, ефективної, при дозуваннях і протягом періодів часу, необхідних для досягнення необхідного профілактичного результату. Як правило, але необов'язково, оскільки профілактичну дозу використовують у суб'єктів до початку розвитку захворювання або на ранній стадії захворювання, то профілактично ефективна кількість буде нижчою терапевтично ефективної кількості. У тому значенні, у якому в даному документі використовується термін "цитотоксичний засіб", він стосується сполуки, яка інгібує або запобігає клітинній функції і/або викликає руйнування 211 131 125 90 клітин. Термін призначений для включення радіоактивних ізотопів (наприклад, At , I , I , Y , 186 188 153 212 32 Re , Re , Sm , Bi , P , і радіоактивні ізотопи Lu), хіміотерапевтичних препаратів, наприклад, таких як метотрексат, адріаміцин, препарати на основі алкалоїдів барвінку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалуючі агенти, ферменти і їхній фрагменти, такі як нуклеолітичні ферменти, антибіотики і токсини, такі як низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи їхні фрагменти і/або варіанти, і різні протипухлинні або протиракові препарати, розкриті нижче. Нижче описуються інші цитотоксичні засоби. Туморицидальний (протипухлинний) засіб викликає руйнування пухлинних клітин. "Токсин" являє собою будь-яка сполуку, здатну чинити негативну дію на ріст або проліферацію клітини. "Хіміотерапевтичний засіб" представляє хімічну сполуку, прийнятну для лікування раку. Приклади хіміотерапевтичних препаратів включають алкілуючі агенти, такі як тіотепа і 19 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 циклофосфамід (цитоксан); алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа й уредопа; етиленіміни і метиламеламіни, включаючи алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметиломеламін; ацетогенини (зокрема, булатацин і булатацинон); дельта-9тетрагідроканабінол (дронабінол, маринол ); бета-лапахон; лапахол; колхіцини; бетулінову кислоту; камптотецин (включаючи синтетичний аналог топотекан (гікамтин ), СРТ-11 (іринотекан, камптозар), ацетилкамптотецин, скополектин і 9-амінокамптотецин); бріостатин; калістатин; СС-1065 (включаючи його синтетичні аналоги адозелезин, карзелезин і бізедезин); подофілотоксин; подофілінову кислоту; теніпозид; криптофіцини (зокрема, криптофіцин 1 і криптофіцин 8); доластатин; дуокарміцин (включаючи синтетичні аналоги KW-2189 і CB1-TM1); елеутеробін; панкратистатин; саркодиктин; спонгістатин; азотисті іприти, такі як хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, мехлоретаміну оксид гідрохлорид, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, урациловий іприт; нітрозосчовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин і ранімустин; антибіотики, такі як енедіїнові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, зокрема, каліхеаміцин гама 1I і каліхеаміцин омега I1 (дивися, наприклад, Nicolaou et al., Angew. Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)); CDP323, інгібітор альфа-4-інтегрину для прийому усередину; динеміцин, включаючи динеміцин А; еспераміцин; а також неокарзиностатин хромофор і близькі хромопротеїнові енеїдинові антибіотики-хромофори, аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, карабіцин, карміноміцин, карзинофілін, хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6-діазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубіцин ® (включаючи адріаміцин , морфоліно-доксорубіцин, ціаноморфоліно-доксорубіцин, 2-піроліно® доксорубіцин, доксорубіцин HCl у ліпосомах для ін'єкцій (доксил ), ліпосомальний доксорубіцин ® ® TLC D-99 (міоцет ), пегильований ліпосомальний доксорубіцин (каелікс ) і дезоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, такі як мітоміцин С, мікофенолову кислоту, ногаламіцин, оливоміцини, пепломіцин, порфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, ® зиностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат, гемцитабін (гемзар ), тегафур ® ® (уфторал ), капецитабін (кселода ), епотилон і 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринів, такі як флударабін, 6-меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; аналоги піримідину, такі як анцитабін, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксиуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин; андрогени, такі як калустерон, дромостанолон пропіонат, епітіостанол, мепітіостан, тестолактон; засоби, які пригнічують функцію надниркових залоз, такі як аміноглютетимід, мітотан, трилостан; замінник фолієвої кислоти, такий як фролінова кислота; ацеглатон; альдофосфамід глікозид; амінолевулінову кислоту; енілурацил; амсакрин; бестрабуцил; бізантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазинон; елфорнітин; ацетат еліптинію; епотилон; етоглюцид; нітрат галію; гідроксисечовину; лентинан; лонидаїнін; майтанзиноїди, такі як майтанзин і ансамітоцини; мітогуазон; мітоксантрон; мопіданмол; нітраерин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лозоксантрон; 2-етилгідразид; прокарбазин; ® полісахаридний комплекс PSK (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофіран; спірогерманій; тенуазонову кислоту; тризиквон; 2,2",2’-трихлортриетиламін; трихотецени (зокрема, токсин Т-2, веракурин А, роридин А і ангуїдин); уретан; віндезин (елдизин, філдезин); дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("С"); тіотепа; таксоїд, наприклад, паклітаксел (таксол), композицію паклітакселу на основі наночастинок генно-інженерного альбуміну (абраксан) і доцетаксел (таксотер); хлоранбуцил; 6-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; препарати платини, такі як цисплатин, оксаліплатин (наприклад, елоксатин ) і карбоплатин; препарати на основі алкалоїдів барвінку, що запобігають полімеризації тубуліну зі скасуванням утворення мікротубул, що включають вінбластин (велбан), вінкристин (онковін), віндезин (елдизин, філдезин) і вінорелбін (навелбін); етопозид (VP-16); іфосфамід; мітоксантрон; лейковорин; новантрон; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; ібандронат; інгібітор топоізомерази RFS 2000; дифторметилорнітин (DMFO); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота, включаючи бексаротен (тагретин); бісфосфонати, такі як клодронат (наприклад, бонефос  або остак), етидронат (дидрокал), NE-58095, золедронову кислоту/золедронат (зомета ), алендронат (фозамакс ), памідронат (аредіа), тилудронат (скелід) або ризедронат (актонел); троксацитабін (1,3діоксолановий аналог нуклеозиду цитозину); антисмислові олігонуклеотиди, зокрема, інгібуючі експресію генів у сигнальних шляхах, які беруть участь в аномальній проліферації, наприклад, такі як PKC-альфа, Raf, H-Ras і рецептор епідермального фактора росту (EGF-R); вакцини, такі 20 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 як вакцина тераторе і вакцини для генної терапії, наприклад, вакцина аловектин , вакцина лейвектин і вакцина ваксид; інгібітор топоізомерази 1 (наприклад, луртотекан ); rmRH (наприклад, абарелікс); BAY439006 (сорафеніб; Bayer); SU-11248 (сунитиніб, сутент, Pfizer); перифозин, інгібітор СОХ-2 (наприклад, целекоксиб або еторикоксиб), інгібітор протеосоми (наприклад, PS341); бортезомиб (велкаде); CCI-779; типіфарніб (R11577); орафеніб, АВТ510; інгібітор Bcl-2, такий як облімерсен натрій (генасенс); піксантрон; інгібітори EGFR (визначення дивися нижче); інгібітори тирозинкінази (визначення дивися нижче); інгібітори серинтреонінкінази, такі як рапаміцин (сиролімус, рапамун ); інгібітори фарнезилтрансферази, такі як ™ лонафарніб (SCH 6636, сарасар ) і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будьякого з вказаних вище препаратів, а також комбінації двох або декількох вказаних вище препаратів, такі як CHOP, скорочена назва комбінованої терапії, що включає циклофосфамід, доксорубіцин, вінкристин і преднізолон; і FOLFOX, скорочена назва схеми лікування оксаліплатином (елоксатином) у комбінації с 5-FU і лейковорином. Хіміотерапевтичні засоби, значення яких визначено вище, включають "протигормональні препарати" або "ендокринні лікарські препарати", що регулюють, знижують, блокують або інгібують дію гормонів, що сприяють росту злоякісної пухлини. Вони самі можуть являти собою гормони, включаючи, не обмежуючи цим, антиестрогени зі змішаною агоністичною/антагоністичною дією, включаючи тамоксифен (нолвадекс ), 4гідрокситамоксифен, тореміфен (фарестон ), ідоксифен, дролоксифен, ралоксифен (евіста ), триоксифен, кеоксифен, і вибіркові модулятори рецепторів естрогенів (SERM), такі як SERM3; чисті антиестрогени без агоністичних властивостей, такі як фулвестрант (FASLODEX ) і EM800 (такі агенти можуть блокувати димеризацію рецепторів естрогенів (ER), інгібувати зв'язування ДНК, підвищувати обмін ER і/або знижувати зміст ER); інгібітори ароматази, включаючи інгібітори ароматази стероїдного типу, такі як форместан і ексеместан (аромазин ) і інгібітори ароматази нестероїдного типу, такі як (аримідекс , летрозол (фемара) і аміноглутетимід, і інші інгібітори ароматази включають ворозол (ривізор ), мегестрол ацетат (мегаза), фадразол і 4(5)-імідазоли; агоністи лютеїнізуючого гормону – вивільняючого гормону, включаючи лейпролід ® ® (люпрон і елігард ), гозерелін, бусерелін і триптерелін; статеві стероїди, включаючи прогестини, такі як мегестрол ацетат і медроксипрогестерон ацетат, естрогени, такі як діетилстилбестрол і премарин, андрогени/ретиноїди, такі як флуоксиместерон, повністю трансретиноєва кислота і фенретинід; онапристон; антипрогестерони; негативні регулятори рецепторів естрогенів (ERD); антиандрогени, такі як флутамід, нілутамід і бікалутамід; і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якого приведеного вище препарату, а також комбінації двох або декількох приведених вище препаратів. У тому значенні, в якому в даному документі використовується термін "інгібуючий ріст засіб", він стосується сполуки або композиції, які інгібують зростання клітини (такої як клітина, яка експресує EGFL7) в умовах in vitro або in vivo. Таким чином, інгібуючий ріст засіб може представляти сполуку, яка значною мірою зменшує процентну кількість клітин (клітин, які експресують EGFL7) в S-фазі. Приклади інгібуючих зростання засобів, включають сполуки, які блокують проходження клітинного циклу (в іншій фазі, ніж S-фаза), такі як засоби, що викликають зупинку в G1-фазі і зупинку в M-фазі. Класичні блокатори M-фази включають препарати на основі алкалоїдів барвінку (вінкристин і вінбластин), таксани і інгібітори топоізомерази II, такі як доксорубіцин, епірубіцин, даунорубіцин, етопозид і блеоміцин. Агенти, що викликають зупинку в G1-фазі, також спричиняють блокування S-фази, наприклад, до них належать ДНК-алкілуючі агенти, такі як тамоксифен, преднізон, дакарбазин, меклоретамін, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил і ара-С. Додаткову інформацію з даного питання можна знайти у Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs", Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995, наприклад, стор. 13). Таксани (паклітаксел і доцетаксел) є протипухлинними препаратами, ® отриманими з тису. Доцетаксел (таксотер , Rhone-Poulenc Rorer), отриманий з хвої ® європейського тиса, є напівсинтетичним аналогом паклітакселу (таксол , Bristol-Myers Squibb). Паклітаксел і доцетаксел індукують зборку мікротубул з димерів тубуліну і блокують мікротубули, тим самим попереджаючи деполімеризації тубуліну, що приводить до інгібування мітозу клітин. "Доксорубіцин" є антибіотиком антрациклінового ряду. Повна хімічні назва доксорубіцину: (8S-цис)-10-[(3-аміно-2,3,6-тридезокси-(-L-ліксогексапіранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагідро-6,8,11тригідрокси-8-(гідроксіацетил)-1-метокси-5,12-нафтаценедіон. Термін "поліпептид, що містить Fc-область" стосується поліпептиду, такого як антитіло або імуноадгезин (дивись визначення нижче), що містить Fc-область. С-кінцевий лізин (залишок 447 за EU-системою нумерації) Fc-області можна видалити, наприклад, під час очищення 21 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліпептиду або рекомбінантним конструюванням нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид. Відповідно композиція, що містить поліпептид, що має Fc-область, за винаходом може містити поліпептиди з повністю видаленими залишками К447, поліпептиди без видалення залишків К447 і суміші поліпептидів з і без залишків К447. По тексту опису і в формулі винаходу вираз "містити" або його варіації, такі як "містить" або "що містить", потрібно розуміти, як включаюче заявлене ціле число або групу цілих чисел, але не виключаюче будь-яке інше ціле число або групу цілих чисел. Отримання варіантних антитіл із зниженою HAMA-відповіддю або її відсутністю Зниження або усунення HAMA-відповіді представляє серйозний аспект клінічної розробки відповідних лікарських засобів. Дивись, наприклад, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst., 80:937 (1988); Jaffers et al., Transplantation, 41:572 (1986); Shawler et al., J. Immunol., 135:1530 (1985); Sears et al., J. Biol. Response Mod., 3:138 (1984); Miller et al., Blood, 62:988 (1983); Hakimi et al., J. Immunol., 147:1452 (1991); Reichmann et al., Nature, 332:323 (1988); Junghans et al., Cancer Res., 50:1495 (1990)). Як описано в даному документі, винахід стосується антитіл, гуманізованих таким чином, що HAMA-відповідь знижена або повністю усунена. Варіанти таких антитіл можна додатково отримати з використанням звичайних способів, відомих в даній галузі, деякі з яких додатково описані нижче. Наприклад, амінокислотна послідовність з антитіла, описаного в даному документі, може служити як вихідна (батьківська) послідовність для розширення різноманітності каркасної послідовності і/або гіперваріабельної послідовності(ей). Вибрана каркасна послідовність, з якою пов'язана гіперваріабельна послідовність, належить в даному документі до акцепторної людської каркасної послідовності. Незважаючи на те, що акцепторні людські каркасні послідовності можуть походити або можуть бути отримані з імуноглобуліну людини (його VLі/або VH-областях), переважно, щоб акцепторні людські каркасні послідовності походили або були отримані з людської консенсусної каркасної послідовності, оскільки такі каркасні послідовності мають, як було показано, мінімальну імуногенність для людей, або вона взагалі відсутня. У тому випадку, коли акцептор отриманий з імуноглобуліну людини, то можна необов'язково вибрати людську каркасну послідовність, основуючись на її гомології з донорною каркасною послідовністю, вирівнюванням донорної каркасної послідовності з різними людськими каркасними послідовностями в наборі людських каркасних послідовностей, і вибрати найбільш гомологічну каркасну послідовність як акцептор. У одному варіанті здійснення людські консенсусні каркасні області в даному документі походять або були отримані з консенсусних каркасних послідовностей VH підгрупи III і/або VL каппа підгрупи I. Таким чином, акцепторна людська каркасна послідовність VH може містити одну, дві, три або всі з наступних каркасних послідовностей: FR1, що містить EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:197); FR2, що містить WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:198); FR3, що містить FR3, включає в себе RFTISX 1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:205), в якій X1 представляє А або R, X2 представляє Т або N, і X3 представляє А або L; FR4, що містить WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:200). У одному варіанті здійснення VH акцепторна людська каркасна послідовність може містити одну, дві, три або всі з наступних каркасних послідовностей: FR1, що містить EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:197); FR2, що містить WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:198); FR3, що містить RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:231); RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:206); RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:207); RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS (SEQ ID NO:208) або RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR (SEQ ID NO:209); FR4, що містить WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:200). Таким чином, акцепторна людська каркасна послідовність VL може містити одну, дві, три або всі з наступних каркасних послідовностей: FR1, що містить DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:201); FR2, що містить WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:202); FR3, що містить GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:203); FR4, що містить FGQGTKVEIK (SEQ ID NO:221). Незважаючи на те, що акцепторна послідовність може бути ідентична вибраній людській каркасній послідовності, незалежно від того, походить вона від імуноглобуліну людини або 22 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 людської консенсусної каркасної послідовності, даний винахід передбачає, що акцепторна послідовність може містити вже існуючі амінокислотні заміни в порівнянні з послідовністю імуноглобуліну людини або людською консенсусною каркасною послідовністю. Дані вже існуючі амінокислотні заміни переважно є мінімальними; звичайно тільки чотири, три, дві або одна амінокислотна відмінність в порівнянні з послідовністю імуноглобуліну людини або консенсусною каркасною послідовністю. Залишки гіперваріабельних ділянок антитіла, яке відрізняється від антитіла людини, вводять в акцепторні людські каркасні послідовності VL і/або VH. Наприклад, можна включити залишки, які відповідають залишкам CDR по Кебату, залишкам гіперваріабельних петель по Чотія, залишки Abm і/або контактні залишки. Необов'язково включають наступні залишки подовженої гіперваріабельної ділянки: 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97 (L3), 26-35 (Н1), 50-65 або 49-65 (Н2) і 93-102, 94-102 або 95-102 (Н3). Незважаючи на те, що "включення" залишків гіперваріабельної ділянки обговорюється в даному документі, очевидно, зрозуміло, що цього можна досягнути різними шляхами, наприклад, можна отримати нуклеїнову кислоту, що кодує потрібну амінокислотну послідовність, мутацією нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність мишачого варіабельного домену таким чином, щоб його каркасні залишки були замінені залишками акцепторної людської каркасної послідовності, або мутацією нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність варіабельного домену людини таким чином, щоб гіперваріабельні залишки домену були замінені залишками, відмінними від людських залишків, або синтезом нуклеїнової кислоти, що кодує потрібну послідовність і т. д. У прикладах, приведених в даному документі, варіанти з трансплантованою гіперваріабельною ділянкою отримували мутагенезом по Кункелю нуклеїнової кислоти, що кодує людські акцепторні послідовності, з використанням окремого олігонуклеотиду для кожної гіперваріабельної ділянки. Kunkel et al., Methods Enzymol., 154:367-382 (1987). Можна ввести відповідні зміни в каркасну область і/або гіперваріабельну ділянку з використанням звичайних методів для корекції і відновлення правильних взаємодій гіперваріабельна ділянка-антиген. Можна використовувати фагове (мідне) представлення (що також належить в даному документі до фагового дисплея в деяких контекстах) як зручний і швидкий спосіб отримання і скринінгу багатьох різних потенційних варіантних антитіл в бібліотеці, отриманій рандомізацією послідовностей. Однак, фахівцям в даній галузі відомі інші способи отримання і скринінгу змінених антитіл. Технологія фагового (мідного) представлення є ефективним інструментом для створення і відбору нових білків, які зв'язуються з лігандом, таким як антиген. З використанням методів фагового (мідного) представлення можна створити великі бібліотеки варіантів білків, які можна швидко сортувати відносно послідовностей, які зв'язуються з молекулою-мішенню з високої афінністю. Як правило, нуклеїнові кислоти, що кодують варіантні поліпептиди, зливають з нуклеїновокислотною послідовністю, що кодує білок вірусної оболонки, такої як ген білка III або ген білка VIII. Були отримані моновалентні системи фагмідного представлення, в яких нуклеїновокислотну послідовність, що кодує білок або поліпептид, зливали з нуклеїновокислотною послідовністю, що кодує ген білка III (Bass S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman and Wells, Methods: А Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). У моновалентній системі фагмідного дисплея гібридний ген експресується на низькому рівні, і ген білка III дикого типу також експресується, в результаті інфекційність частинок зберігається. Способи отримання пептидних бібліотек і скринінгу даних бібліотек розкриті в багатьох патентах (наприклад, патентах США №№ 5723286, 5432018, 5580717, 5427908 і 5498530). Бібліотеки антитіл або антигензв'язувальних поліпептидів отримують різними шляхами, включаючи зміну одного гена інсерцією рандомізованих послідовностей ДНК або клонуванням сімейства споріднених генів. Способи представлення антитіл або антигензв'язувальних фрагментів з використанням фагового (мідного) дисплея описані в патентах США №№ 5750373, 5733743, 5837242, 5969108, 6172197, 5580717 і 5658727. Потім проводять скринінг бібліотеки на експресію антитіл або антигензв'язувальних білків з необхідними характеристиками. Способи заміни вибраної амінокислоти в матричній нуклеїновій кислоті добре відомі в даній галузі, деякі з яких описані в даному документі. Наприклад, залишки гіперваріабельної ділянки можна замінити з використанням методу Кункеля. Дивись, наприклад, Kunkel et al., Methods Enzymol., 154:367-382 (1987). Послідовність олігонуклеотидів включає один або декілька сконструйованих наборів кодонів для залишків гіперваріабельної ділянки, які потрібно змінити. Набір кодонів являє собою набір різних нуклеотидних триплетних послідовностей, що використовуються для кодування потрібних варіантних амінокислот. Набори кодонів можна представити з використанням 23 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 символів для позначення конкретних нуклеотидів або еквімолярних сумішей нуклеотидів, як показано нижче з використанням коду IUB. Коди IUB G гуанін А аденін Т тимін С цитозин R (А або G) Y (С або Т) M (А або С) K (G або Т) S (С або G) W (А або Т) Н (А або С або Т) В (С або G або Т) V (А або С або G) D (А або G або Т) N (А або С або G або Т) Наприклад, в кодоні DVK D можуть бути нуклеотиди А або G або Т; V може представляти А або G або С, і K може представляти G або T. Даний набір кодонів може представляти 18 різних кодонів, і може кодувати амінокислоти Ala, Trp, Tyr Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly і Cys. Набори олігонуклеотидів або праймерів можна синтезувати з використанням стандартних методів. Набір олігонуклеотидів можна синтезувати, наприклад, твердофазним синтезом, що містить послідовності, які представляють всі можливі комбінації нуклеотидних триплетів, що складають набір кодонів і кодуючу потрібну групу амінокислот. Синтез олігонуклеотидів з вибраною нуклеотидною "виродженістю" в деяких положеннях добре відомий в даній галузі. Такі набори нуклеотидів, що містять певні набори кодонів, можна синтезувати з використанням промислово доступних синтезаторів нуклеїнових кислот (наприклад, виробництва Applied Biosystems, Foster City, CA), або можна отримати промислово доступні продукти (наприклад, виробництва Life Technologies, Rockville, MD). Отже, синтезований набір олігонуклеотидів, що містить певний набір кодонів, як правило, буде включати множину олігонуклеотидів з різними послідовностями, де відмінності визначаються набором кодонів в послідовності в цілому. Олігонуклеотиди за винаходом мають послідовності, що дозволяють гібридизації з матричною нуклеїновою кислотою варіабельних доменів, і також можуть включати сайти рестрикції, прийнятні, наприклад, для клонування. У одному способі нуклеїновокислотні послідовності, що кодують варіантні амінокислоти, можна отримати з використанням опосередкованого олігонуклеотидного мутагенезу. Цей метод добре відомий в даній галузі і описаний Zoller et al., Nucleic Acids Res., 10:6487-6504 (1987). Коротко, нуклеїновокислотні послідовності, що кодують варіантні амінокислоти, отримують гібридизацією олігонуклеотидів, що кодують необхідні набори кодонів, з ДНК-матрицею, де матриця представляє одноланцюжкову форму плазміди, що містить матричну нуклеїнову кислоту варіабельної ділянки. Після гібридизації використовують ДНК-полімеразу для синтезу повного другого комплементарного ланцюга матриці, який буде, таким чином, включати олігонуклеотидний праймер і буде містити набори кодонів, забезпечених набором олігонуклеотиду. Як правило, використовують олігонуклеотиди довжиною щонайменше з 25 нуклеотидів. Оптимальний олігонуклеотид буде містити від 12 до 15 нуклеотидів, які є повністю комплементарними матриці з обох сторін нуклеотида(ів), що кодує мутацію(і). Це сприяє тому, що олігонуклеотид буде правильно гібридизуватися з одноланцюжковою молекулою матричної ДНК. Олігонуклеотиди можна легко синтезувати з використанням методів, відомих в даній галузі, таких як описані Crea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978). Матричну ДНК отримують з використанням векторів, які походять з бактеріофагових векторів М13 (прийнятними є промислово доступні вектори M13mp18 і M13mp19), або векторів, що містять одноланцюжковий фаговий оріджин реплікації, описаний Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Таким чином, ДНК, призначену для мутації, можна вбудувати в один з векторів для отримання одноланцюжкової матриці. Отримання одноланцюжкової матриці описане в розділах 4.21-4.41 керівництва Sambrook et al., дивись вище. Для зміни нативної послідовності ДНК олігонуклеотид гібридизують з одноланцюжковою матрицею у прийнятних умовах гібридизації. Потім додають ДНК-полімеризуючий фермент, 24 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 звичайно ДНК-полімеразу Т7 або фрагмент Кленова ДНК-полімерази I, для синтезу комплементарного ланцюга матриці з використанням олігонуклеотиду як праймера для синтезу. У отриманому гетеродуплексі один ланцюг ДНК кодує мутовану форму гена 1, і інший ланцюг (вихідна матриця) кодує нативну, не змінену послідовність гена 1. Потім гетеродуплекс трансформують у прийнятну клітина-хазяїн, звичайно прокаріот, такий як Е. coli JM101. Після культивування клітини висівають на планшети з агарозоюй і піддають скринінгу з використанням міченого радіоактивною міткою 32-фосфатом олігонуклеотидного праймера для ідентифікації колоній бактерій, що містять мутовану ДНК. Описаний вище спосіб можна модифікувати таким чином, щоб отримати гомодуплекс, в якому обидва ланцюги плазміди містять мутацію(ї). Модифікації полягають в наступному: одноланцюжковий олігонуклеотид відпалюють з одноланцюжковою матрицею, описаний вище. Суміш трьох дезоксирибонуклеотидів, дезоксирибоаденозину (dATP), дезоксирибогуанозину (dGTP) і дезоксириботимідину (dTT) об'єднують з модифікованим тіодезоксирибоцитозином, позначеним dCTP-(aS) (який можна отримати від Amersham). Дану суміш додають в комплекс матриця-олігонуклеотид. Після додавання до даної суміші ДНК-полімерази отримують ланцюг ДНК, ідентичний матриці, за винятком мутованих основ. Крім того, даний новий ланцюг ДНК буде містити dCTP-(aS) замість dCTP, який служить для його захисту від розщеплення під впливом ендонуклеази. Після нік-відщеплення ланцюга-матриці від дволанцюжкового гетеродуплекса з використанням відповідного ферменту обмеження, матричний ланцюг можна розщепити нуклеазою ExoIII або іншою прийнятною нуклеазою на ділянки після області, що містить сайт(и) для мутагенезу. Потім реакцію зупиняють з отриманням молекули, яка тільки частково є одноланцюжковою. Потім утворюється повний дволанцюжковий ДНК-гомодуплекс з використанням ДНК-полімерази в присутності всіх чотирьох дезоксирибонуклеотидтрифосфатів, АТП і ДНК-лігази. Потім даний гомодуплекс можна трансформувати у прийнятну клітина-хазяїн. Як вже відмічалося вище, послідовність набору олігонуклеотидів має достатню довжину для гібридизації з матричною нуклеїновою кислотою і також може, але необов'язкова, стримати сайти рестрикції. Матричну ДНК можна отримати з використанням векторів, які отримані з бактеріофагових векторів M13 або векторів, які містять одноланцюжковий фаговий оріджин реплікації, описаний Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Таким чином, ДНК, призначена для мутування, повинна бути вбудована в один з даних векторів для отримання одноланцюжкової матриці. Отримання одноланцюжкової матриці описане в розділах 4.21-4.41 керівництва Sambrook et al., дивись вище. Згідно з ще одним способом бібліотеку можна отримати забезпеченням вище- і нижчерозташованих наборів олігонуклеотидів, де кожний набір має множину олігонуклеотидів з різними послідовностями, різні послідовності визначаються наборами кодонів, присутніх в послідовності олігонуклеотидів. Набори вище- і нижчерозташованих олігонуклеотидів разом з матричною нуклеїновокислотною послідовністю, що кодує варіабельний домен, можна використовувати в полімеразній ланцюговій реакції для отримання "бібліотеки" ПЛР-продуктів. ПЛР-продукти можна назвати "касетами нуклеїнових кислот", оскільки їх можна злити з іншими спорідненими або неспорідненими нуклеїновокислотними послідовностями, наприклад, білків вірусних оболонок і доменівдимеризації з використанням відомих методів молекулярної біології. Послідовність ПЛР-праймерів включає один або декілька наборів кодонів для надавання білкам доступності для розчинника і положень, що дуже відрізняються в гіперваріабельній ділянці. Як описано вище, набір кодонів представляє набір різних нуклеотидних триплетних послідовностей, що використовуються для кодування необхідних варіантних амінокислот. Вибрані антитіла, які відповідають необхідним критеріям, відібрані на відповідних стадіях скринінгу/відбору, можна виділити і клонувати з використанням звичайних рекомбінантних методів. Фрагменти антитіл У об'єм даного винаходу включені фрагменти антитіл. Фрагменти антитіл можна отримати традиційними способами, такими як ферментативне розщеплення або рекомбінантні методи. У деяких обставинах переважно використовувати фрагменти антитіла, а не цілі антитіла. Більш дрібний розмір фрагментів дозволяє їм піддаватися швидкому кліренсу, і може забезпечити підвищений доступ в солідні пухлини. Огляд по деяких фрагментах антитіл дивись у Hudson et al., Nat. Med., 9:129-134 (2003). Для отримання фрагментів антитіл розроблені різні методи. Традиційно дані фрагменти отримували протеолітичним розщепленням інтактних антитіл (дивись, наприклад, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992) і Brennan et al., Science, 25 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 229:81 (1985)). Однак в цей час дані фрагменти можуть безпосередньо продукуватися рекомбінантними клітинами-хазяями. Всі Fab-, Fv- і ScFv-фрагменти антитіл можуть експресуватися в і секретуватися з Е. coli, забезпечивши просте отримання даних фрагментів у великих кількостях. Фрагменти антитіл можна виділити з фагових бібліотек антитіл, які вже обговорювалися вище. Альтернативно, Fab'-SH-фрагменти можна безпосередньо виділити з Е. coli і хімічно зв'язати з утворенням F(ab')2-фрагментів (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). Згідно з іншим підходом F(ab') 2-фрагменти можна виділити безпосередньо з культури рекомбінантних клітин-хазяїв. Fab- і F(ab')2-фрагменти з підвищеним періодом напіврозпаду в умовах in vivo, що містять залишки епітопа, який зв'язується з рецептором, описані в патенті США № 5869046. Фахівцям в даній галузі відомі інші способи отримання фрагментів антитіл. У деяких варіантах здійснення антитіло представляє одноланцюжковий Fv-фрагмент (scFv). Дивись міжнародну заявку WO 93/16185; патенти США №№ 5571894 і 5587458. Fv і scFv є єдиними фрагментами з інтактними сайтами зв'язування, в яких відсутні константні області; таким чином, вони є прийнятними з точки зору зниженого неспецифічного зв'язування при застосуванні в умовах in vivo. Можна сконструювати злиті білки SсFv з отриманням злиття ефекторного білка або з аміно-, або з карбоксильним кінцем sсFv. Дивись "Antibody Engineering, ed. Borrebaeck", вище. Фрагмент антитіла також може являти собою "лінійне антитіло", наприклад, описане в патенті США № 5641870. Такі лінійні антитіла можуть бути моноспецифічними або біспецифічними. Гуманізовані антитіла Винахід включає гуманізовані антитіла. У даній галузі відомі різні методи гуманізації антитіл, відмінних від антитіл людини. Наприклад, гуманізоване антитіло може містити один або декілька амінокислотних залишків, введених в нього з джерела, відмінного від людини. Такі амінокислотні залишки від тварини, відмінної від людини, часто називають "залишками, що імпортуються", які звичайно беруть з "варіабельного домену, що імпортується". Гуманізацію антитіл можна по суті виконати, слідуючи способу Winter і співавторів (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), заміною послідовностей гіперваріабельних ділянок на відповідні послідовності антитіла людини. Отже, такі "гуманізовані" антитіла є химерними антитілами (патент США № 4816567), в яких значно менша частина, ніж інтактний людський варіабельний домен, була замінена на відповідну послідовність від виду, відмінного від людини. Як правило, на практиці гуманізовані антитіла представляють людські антитіла, в яких деякі залишки гіперваріабельної ділянки і, можливо, деякі залишки FR замінені залишками з аналогічних сайтів в антитілах гризунів. Вибір людських варіабельних доменів легкого і важкого ланцюга для використання в отриманні гуманізованих антитіл важливий для зниження антигенності. Згідно з так званим способом "найбільш оптимальної підгонки", послідовність варіабельного домену антитіла гризунів піддають скринінгу в порівнянні з цілою бібліотекою відомих послідовностей людських варіабельних доменів. Потім людську послідовність, яка найбільш близька до послідовності гризунів, беруть як людську каркасну послідовність для гуманізованого антитіла. Дивись, наприклад, Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987). У іншому способі використовується конкретна каркасна послідовність, отримана з консенсусної послідовності всіх людських антитіл певної підгрупи легкого і важкого ланцюгів. Одну і ту ж каркасну послідовність можна використовувати для декількох різних гуманізованих антитіл. Дивись, наприклад, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993). Також як правило, бажано, щоб антитіла були гуманізовані із збереженням високої афінності для антигену і інших сприятливих біологічних властивостей. Для досягнення даної мети, згідно з одним способом, гуманізовані антитіла отримують, проводячи аналіз вихідних послідовностей і різних концептуальних гуманізованих продуктів з використанням тривимірних моделей вихідних і гуманізованих послідовностей. Тривимірні моделі імуноглобулінів загальнодоступні і знайомі фахівцям в даній галузі. Доступні комп'ютерні програми, які ілюструють і представляють тривимірні конформаційні структури вибраних імуноглобулінових послідовностей-кандидатів. Дослідження даних зображень дозволяє оцінити вірогідну роль залишків в функціонуванні імуноглобулінової послідовності-кандидата, тобто аналізувати залишки, що впливають на здатність імуноглобуліну-кандидата зв'язуватися зі своїм антигеном. Таким чином, можна вибрати і об'єднати залишки FR з реципієнтних послідовностей і послідовностей, що імпортуються, щоб досягнути необхідної характеристики антитіла, такої як підвищена афінність для антигену(ів)-мішені. Загалом, залишки гіперваріабельної ділянки впливають безпосередньо і найбільш суттєво на зв'язування антигену. 26 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Людські антитіла Людські антитіла за винаходом можна отримати об'єднанням послідовності(їй) варіабельних доменів Fv-клонів, вибраних з бібліотек людського походження в фаговому представленні, з відомими людськими константними областями послідовностями, як описано вище. Альтернативно, людські моноклональні антитіла за винаходом можна отримати гібридомною технологією. Описані людські мієломні і гетеромієломні клітинні лінії миші-людини для отримання людських моноклональних антитіл, наприклад, Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); і Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991). У даний час, можливо, отримувати трансгенних тварин (наприклад, мишей), які здатні при імунізації продукувати повний репертуар антитіл людини за відсутності продукції ендогенних імуноглобулінів. Наприклад, описано, що гомозиготна делеція гена з'єднувальної області (JH) важкого ланцюга антитіла у химерних і мутантних мишей по зародковій лінії приводить до повного придушення продукції ендогенних антитіл. Перенесення ряду генів імуноглобулінів зародкової лінії людини таким мутантним мишам по зародковій лінії, приводить до продукції людських антитіл при стимуляції антигеном. Дивись, наприклад, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993). Також можна використовувати перестановку генів для отримання людських антитіл з антитіл, відмінних від людських, наприклад, антитіл гризунів, де людське антитіло має афінність і специфічність, аналогічні для вихідних "нелюдських" антитіл. Згідно з даним способом, який також називають, "імпринтингом епітопів", варіабельну ділянку важкого або легкого ланцюга фрагмента антитіла, відмінного від антитіла людини, отриманого фаговим представленням, описаними в даному документі, замінюють репертуаром людських генів V-домену з отриманням популяції химерних scFv- або Fab-конструкцій "нелюдський" ланцюг/людський ланцюг. Відбір з антигеном дозволяє виділити химерні scFv- або Fab-конструкції "нелюдський" ланцюг/людський ланцюг, в яких людський ланцюг відновлює антигензв'язувальний сайт, зруйнований при видаленні відповідного "нелюдського" ланцюга в первинному клоні фагового представлення, тобто епітопи (імпринти) направляють вибір партнера людського ланцюга. У тому випадку, коли спосіб повторюють для заміни "нелюдського" ланцюга, що залишився, то отримують антитіло людини (дивись публікацію міжнародної заявки PCT WO 93/06213, опубліковану 1 квітня 1993 року). На відміну від традиційного способу гуманізації "нелюдських" антитіл пересадкою HVR, даний спосіб забезпечує отримання повністю людських антитіл, в яких відсутні залишки FR або HVR "нелюдського" походження. Біспецифічні антитіла Біспецифічні антитіла є моноклональними антитілами, які мають специфічність зв'язування щонайменше до двох різних антигенів. У деяких варіантах здійснення біспецифічні антитіла є людськими або гуманізованими антитілами. У деяких варіантах здійснення одна специфічність зв'язування є специфічністю для EGFL7, і інша - для будь-якого іншого антигену. У деяких варіантах здійснення інший антиген представляє фактор росту ендотелію судин (VEGF), наприклад, епітоп зв'язується антитілами бевацизумабом і ранібізумабом. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло має перше плече, що містить послідовності HVR антитіла за винаходом, і друге плече, що містить послідовності HVR бевацизумабу і ранібізумабу. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло містить послідовності VH і VL бевацизумабу і ранібізумабу. У деяких варіантах здійснення біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися з двома різними епітопами EGFL7. Також біспецифічні антитіла можна використовувати для доставки цитотоксичних агентів до клітин, які експресують EGFL7. Дані антитіла мають EGFL7зв'язувальне плече і плече, яке пов'язане з цитотоксичним засобом, таким як сапорин, антиінтерферон-α, алкалоїд барвінку, А-ланцюг рицину, метотрексат або мічений радіоактивним ізотопом гаптен. Біспецифічні антитіла можна отримати у вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів антитіл (наприклад, F(ab')2 біспецифічні антитіла). У даній галузі відомі способи отримання біспецифічних антитіл. Традиційно рекомбінантна продукція біспецифічних антитіл основана на коекспресії двох пар важкий ланцюг-легкий ланцюг імуноглобуліну, при цьому дві важкі ланцюги мають різну специфічність (Milstein and Cuello, Nature, 305:537 (1983)). Внаслідок випадкового вибору важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну дані гібридоми (квадроми) продукують можливу суміш 10 різних молекул антитіл, з яких тільки одна має правильну біспецифічну структуру. Виділення правильної молекули, яке звичайно проводять з використанням стадій афінної хроматографії, є досить громіздким, а вихід продукту - низьким. Аналогічні способи описані в міжнародній заявці WO 93/08829, опублікованій 13 травня 1993 року, і Traunecker et al., EMBO J., 10:3655 (1991). 27 UA 105386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Згідно з іншим підходом варіабельні домени антитіла з необхідною специфічністю зв'язування (сайти зв'язування антитіла-антигену) зливають з послідовностями константних доменів імуноглобуліну. Злиття здійснюють, наприклад, з константним доменом важкого ланцюга імуноглобуліну, що містить щонайменше частину шарнірної області, області СН2 і СН3. У деяких варіантах здійснення перша константна область важкого ланцюга (СН1), яка містить сайт, необхідний для зв'язування легкого ланцюга, знаходиться щонайменше в одній злитій конструкції. ДНК, що кодують важкий ланцюг імуноглобулінових злитих конструкцій і, якщо бажано, легкий ланцюг імуноглобуліну, вбудовують в окремі експресуючі вектори і котрансфікують у прийнятний організм-хазяїн. Такий підхід забезпечує високу гнучкість при коректуванні взаємних співвідношень трьох поліпептидних фрагментів в тих варіантах здійснення, в яких використовують різні відносні кількості трьох поліпептидних ланцюгів при конструюванні, що забезпечує високий вихід. Однак можливо вбудувати кодуючі послідовності двох або всіх трьох поліпептидних ланцюгів в один експресуючий вектор, коли експресія щонайменше двох поліпептидних ланцюгів в рівних відносних кількостях забезпечує високий вихід, або коли відносні кількості не мають особливого значення. У одному варіанті здійснення такого підходу біспецифічні антитіла складаються з гібридного важкого ланцюга імуноглобуліну з першою специфічністю зв'язування в одному плечі і гібридної пари важкий ланцюг-легкий ланцюг імуноглобуліну (що забезпечує другу специфічність зв'язування) в іншому плечі. Було встановлено, що дана асиметрична структура полегшує відділення необхідного біспецифічного з'єднання від небажаних комбінацій ланцюгів імуноглобуліну, оскільки присутність легкого ланцюга імуноглобуліну тільки в половині біспецифічних молекул забезпечує простий шлях їх розділення. Даний спосіб розкритий в міжнародній заявці WO 94/04690. Більш докладний опис отримання біспецифічних антитіл дивись, наприклад, у Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). Згідно з ще одним підходом можна сконструювати область контакту між парою молекул антитіла для отримання максимальної відносної кількості гетеродимерів, які виділяють з рекомбінантної культури клітин. Область контакту містить щонайменше частину домену СН3 константної області антитіла. У даному способі один або декілька невеликих бічних ланцюгів амінокислот з області контакту першої молекули антитіла замінюють більш великими бічними ланцюгами (наприклад, тирозином або триптофаном). Створюють компенсуючі "порожнини" з розміром, аналогічним або близьким до розміру великого бічного ланцюга(ів) в області контакту другого антитіла, замінюючи великі бічні ланцюги амінокислот на менші бічні ланцюги (наприклад, аланін або треонін). Такий прийом збільшує вихід гетеродимера в порівнянні з іншими небажаними кінцевими продуктами, такими як гомодимери. Біспецифічні антитіла включають поперечно зшиті або "гетерокон'юговані" антитіла. Наприклад, одне з антитіл в гетерокон'югаті може бути зв'язане з авідином, інше - з біотином. Подібні антитіла, наприклад, були запропоновані для цілеспрямованого впливу на клітини імунної системи в порівнянні з іншими "непотрібними" клітинами (патент США № 4676980) і для лікування ВІЛ-інфекції (міжнародні заявки WO 91/00360, WO 92/00373 і ЕР 03089). Гетерокон'югатні антитіла можна отримати з використанням відповідного методу поперечного зшивання. Прийнятні агенти для зшивання добре відомі в даній галузі, і вони розкриті в патенті США № 4676980, нарівні з рядом інших методів поперечного зшивання. У літературі також описані різні способи отримання біспецифічних антитіл з фрагментів антитіл. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть бути отримані з використанням хімічного зв'язування. У публікації Brennan et al., Science, 229:81 (1985) описаний спосіб, в якому інтактні антитіла протеолітично розщеплюють з отриманням F(ab') 2-фрагментів. Отримані фрагменти відновлюють в присутності агента, утворюючого комплекси дитіолу, арсеніту натрію, щоб стабілізувати сусідні дитіоли і відвернути утворення міжмолекулярного дисульфіду. Потім отримані Fab'-фрагменти перетворюють в похідні тіонітробензоату (TNB). Одне з Fab'-TNBпохідних потім знов перетворюють в Fab'-тіол відновленням з використанням меркаптоетиламіну і змішують з еквімолярною кількістю іншого Fab'-TNB-похідного з утворенням біспецифічного антитіла. Отримані біспецифічні антитіла можна використовувати як агенти для вибіркової іммобілізації ферментів. Нещодавні досягнення полегшили пряме виділення Fab'-SH-фрагментів з E.coli, які можуть бути хімічно пов'язані з утворенням біспецифічних антитіл. У публікації Shalaby et al., J. Exp.Med., 175: 217-225 (1992) описане отримання повністю гуманізованої молекули біспецифічного антитіла F(ab')2. Кожний Fab'-фрагмент окремо секретувався з клітин E.coli, і його піддавали хімічному зв'язуванню в умовах in vitro з утворенням біспецифічного антитіла. Отримане біспецифічне антитіло здатне зв'язуватися з клітинами, надекспресуючими рецептор 28