Композиція, що містить аналог простацикліну та інгібітор pde4, для лікування муковісцидозу

Реферат: Винахід стосується застосування композиції, яка містить щонайменше один аналог простацикліну, вибраний з групи трепростинілу, ілопросту, цикапросту або берапросту або їх фармацевтично прийнятних солей, і щонайменше один інгібітор фосфодіестерази (PDE) 4, вибраний з групи RO 20-1724, ібудиласту, рофлуміласту і його N-оксиду, для запобігання або лікування муковісцидозу. UA 113161 C2 (12) UA 113161 C2 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід пропонує композиції, які містять простациклін або аналог простацикліну у комбінації з інгібітором фосфодієстерази 4 для застосування при запобіганні або лікуванні муковісцидозу (кістозного фіброзу), а також спеціальні композиції. Простагландін I2 (простациклін; епопростенол, PGI2) являє собою окиснений метаболіт арахідонової кислоти, утворений ферментативно шляхом послідовної діяльності ферментів циклооксигенази й PGI-синтази. Він виробляється коститутивно ендотеліальними й гладком'язовими клітинами судин і індукується за умов запалення в судинних клітинах і макрофагах. PGI2 є сильним судинорозширювальним і антитромботичним засобом, ефекти якого є результатом зв'язування з унікальним гептаспіральним рецептором, який сполучається з Gбілком і називається I простаноїдним (IP)4 рецептором. Цей рецептор з'єднаний з G s- і активує аденілатциклазу, приводячи до сильного викиду внутрішньоклітинної цАМФ. Тому що експресія CFTR (муковісцидозного трансмембранного регулятора провідності) і мутованого CFTR є цАМФ-залежною, речовини, що збільшують внутрішньоклітинні рівні цАМФ, становлять інтерес відносно розробки лікарських засобів для лікування муковісцидозу (КФ). Однак більшість із цих речовин, таких як форсколін, індукує скоріше неспецифічне підвищення цАМФ, яке також може мати дуже шкідливі наслідки, такі як запалення. Таким чином, існує незадоволена потреба в специфічних агентах, що підсилюють вироблення цАМФ в епітеліальних клітинах легенів. Трепростиніл є сильним агоністом IP рецептора, хоча його специфічність до цього рецептора не відома. Sprague R.S. et al., Microcirculation 2008 Jul;15(5):461-71 показав, що аналоги простацикліну (UT-15, ремодулін) стимулюють рецептор-опосередкований синтез цАМФ і вивільнення АТФ із еритроцитів кролика й людини. Ядерна фосфодієстераза (PDE) є ферментом, який каталізує гідроліз цАМФ і циклічного 3',5-гуанозинмонофосфату (цГМФ) до неактивних 5'-нуклеотидних продуктів. цАМФ і цГМФ демонструють безліч внутрішньоклітинних ефектів, опосередкованих в основному за рахунок їх стимулюючої дії на мультисубстратні протеїнкінази. При інгібуванні PDE рівень цАМФ і цГМФ збільшується, приводячи до розслаблення гладкої мускулатури дихальних шляхів і інгібування активації клітин запалення. PDE4, PDE7 і PDE8 є специфічними для цАМФ. Інгібітори фосфодієстерази блокують один або більше підтипів ферменту фосфодієстерази (PDE), внаслідок цього запобігаючи інактивації вторинних внутрішньоклітинних месенджерів циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ) і циклічного гуанозинмонофосфату (цГМФ) за допомогою відповідного підтипу(ів) PDE. Ізоферменти циклічного-3',5'-нуклеотиду PDE є вкрай важливим компонентом сигнального шляху цАМФ-протеїнкіназа A (PKA). Було встановлено одинадцять PDE-сімейств. Суперсімейство ізоферментів PDE складається, щонайменше, з дев'яти сімейств генів (типів), від PDE1 до PDE11. Деякі PDE-сімейства є дуже різними й складаються з декількох підтипів і численних ізоформ сплайс-варіантів. Прикладами неспецифічних PDE-інгібіторів є теофілін і родинні ксантинові сполуки, кофеїн, амінофілін і т.д. Вінпоцетин є селективним інгібітором PDE1. Відомими селективними інгібіторами PDE2 є EHNA або анагрелід, селективними інгібіторами PDE3 є еноксимон або мілринон. PDE4 є основним ферментом, який метаболізує цАМФ, виявленим у запальних і імунних клітинах. Доведений потенціал інгібіторів PDE4 у якості протизапальних лікарських засобів, зокрема, при запальних хворобах легенів, таких як астма, ХОБЛ, і ринітах. Вони пригнічують вивільнення цитокінів і інших запальних сигналів і інгібують вироблення активних видів кисню. Відомими інгібіторами PDE4 є, наприклад, мезембрін, роліпрам, ібудиласт і т. п. Інгібітори PDE5 переважно метаболізуються ферментом цитохром P450 CYP3A4. Існує потенційна можливість несприятливих взаємодій лікарського засобу з іншими лікарськими засобами, які інгібують або індукують CYP3A4, включаючи інгібітори HIV-протеази, кетоконазол, ітраконазол, та інші антигіпертензивні лікарські засоби, такі як нітроспрей. Прикладами інгібіторів PDE5 є силденафіл, тадалафіл, верденафіл або уденафіл. Муковісцидоз (КФ) являє собою генетичне захворювання, що є результатом мутацій у гені з 230 т.п.н. на хромосомі 7, який кодує поліпептид, що складається з 1480 амінокислот, відомий як муковісцидозний трансмембранний регулятор провідності (CFTR), який служить як канал для іонів хлору в епітеліальних мембранах. До теперішнього часу встановлено більше 1000 мутантних алелей. Найпоширеніша мутація, ΔΔF508, являє собою делецію залишку фенілаланіну в кодоні 508 у муковісцидозному трансмембранному регулюючому провідність (CFTR) білку. Ця мутація приводить до сильного зменшення CFTR-функції й веде до класичного фенотипу муковісцидозу, який характеризується порушенням функції ендокринних залоз, таким як підвищення хлоридів у складі поту, рецидивуючою інфекцією дихальних шляхів у комбінації із бронхоектазом (розширенням бронхів) і з раннім початком недостатності підшлункової залози. 1 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Із клінічної точки зору КФ звичайно підозрюють, коли в суб'єкта присутня одна або більше типових для КФ фенотипічних ознак. Це може бути хронічна легенева хвороба окремо або, найчастіше, пов'язана з порушеннями з боку шлунково-кишкового тракту й порушеннями, обумовленими харчуванням (наприклад, недостатність підшлункової залози та рецидивуючий панкреатит), синдром втрати солей і урогенітальні порушення у чоловіків (тобто обструктивна азооспермія). У легенях людини густі липкі виділення закупорюють периферичні дихальні шляхи й підслизисті залози, які експресують CFTR. Розширення проток цих залоз (пов'язане із блокуванням слизом) і покриття поверхонь дихальних шляхів густими, в'язкими слизистогнійними продуктами з домінуванням нейтрофілів входять до числа патологічних ознак хвороби. Запалення легенів є іншою основною причиною погіршення дихальної функції у суб'єктів з муковісцидозом і може випереджати початок хронічної інфекції. Закупорка слизом і його осадження товстим шаром у протоках підшлункової залози веде до хронічного фіброзу, жирового переродження залози або й того й іншого у великій підгрупі суб'єктів з попереднім діагнозом ідіопатичного або алкогольного панкреатиту. Муковісцидоз є найпоширенішою смертельною спадкоємною хворобою в європеоїдній (кавказькій) популяції, що вражає приблизно 4 з 10 000 дітей. У Сполучених Штатах середній вік у момент смерті збільшився від 8,4-літнього віку в 1969 році до 14,3-літнього віку в 1998 році. Середній вік у момент смерті збільшився з 14 років в 1969 році до 32,4 років в 2003 році (Фонд муковісцидозу). Передбачають, що для дітей, народжених в 1990-і роки, медіана виживаності буде становити більше 40 років. Основним фактором значного збільшення середньої тривалості життя є поліпшене лікування хронічних інфекцій дихальних шляхів і усунення слизу суб'єктів із КФ, а також поліпшене харчування й більш рання постановка діагнозу. Втрата аніонної провідності внаслідок відсутності муковісцидозного трансмембранного регулятора провідності (CFTR) з апікальних мембран епітелію дихальних шляхів руйнує регулювання рідкого шару на поверхні дихальних шляхів. Це веде до погіршеного мукоциліарного кліренсу, інфекції дихальних шляхів і запального характеру муковісцидозу (КФ). Звичайна CFTR-мутація ΔF508 присутня, щонайменше, на одному алелі в >90 % пацієнтів із КФ, причому >50 % пацієнтів є гомозиготними за ΔF508, інші є компаунд-гетерозиготними. Найважливішим питанням при муковісцидозі є нездатність цього загального CFTR-варіанту досягати нативного, складчастого стану, у якому він буде виходити з ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) і рухатися в апікальні мембрани епітеліальних клітин. Уважають, що якщо придбання природної конформації вповільнюється, CFTR зберігає надлишкові або тривалі взаємодії з молекулярними шаперонами, які потім націлюються на білок з метою розкладання за допомогою механізмів, які контролюють ЕР у відношенні неправильно згорнутих або не повністю утворених білків. Деградація, пов'язана з ендоплазматичним ретикулумом (ERAD), включає убіквітинірування аберантних (порушених) білків і їх доставку в протеасому для розщеплення. Коли ERAD відстає від швидкості синтезу білка або під час обробки протеасомними інгібіторами агрегати мутантного білка накопичуються. CFTR був першим інтегральним мембранним білком ссавців, який був установлений як субстрат для убіквітин-опосередкованої протеасомної деградації, при цьому він служить моделлю для зростаючого списку хвороб, пов'язаних з конформацією білків, яка служить причиною різноманітного набору патологічних етіологій. У принципі всі ΔF508 CFTR, які виробляються клітиною, руйнуються ERAD. Крім того, внаслідок його складного укладання, 60-70 % білка дикого типу (дт) може бути деградовано подібним чином, хоча це може варіювати між типами клітин. Схеми протеолітичного розщеплення незрілих форм дикого типу й ΔF508 CFTR схожі, тоді як схема розщеплення зрілого дикого типу CFTR відрізняється. Це виявлення підтримує ідею, що, щонайменше, частина ЕР-утриманого мутантного CFTR присутня у проміжній конформації, яка утворюється паралельно з нормальним шляхом CFTR-згортання, на противагу утворенню іншої структури білка. Із приводу ΔF508 CFTR, ця проміжна конформація не може йти далі після критичної стадії в процесі згортання, а це означає, що можна позбутися ΔF508 CFTR, якщо можливо посприяти цій стадії. Цілий ряд експериментальних умов, таких як знижена температура, інкубація з хімічними шаперонами, або фармакологічними коректорами, може сприяти виходу ΔF508 CFTR з ЕР, даючи функціональний аніонний канал на клітинній поверхні. На додаток до цього, дослідники повідомили про відновлення функції ΔF508 CFTR за допомогою коекспресії різних окремих CFTR-конструктів або субдоменів з дикого типу CFTR. Однак консенсус, при якому CFTRсубдомени є ефективними у порятунку мутантного білка, не є очевидним, і механізм цього ефекту залишається неясним. На додаток до цього, індукований фрагментом CFTR "порятунок" 2 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спостерігався спочатку в клітинах екзогенно надекспресуючих і фрагмент CFTR і ΔF508 CFTR повної довжини. WO 08/098196 описує лікування муковісцидозу з використанням трепростинілу. Муковісцидоз, однак, є інтерстиціальним захворюванням легенів, яке викликається нагромадженням колагенових волокон у легенях; це обмежує здатність легенів затягувати повітря, тому що легені втрачають свою еластичність, і збільшується опір дихальних шляхів (еластичність = 1/опір). У силу того, що хвороба прогресує, також спостерігається збільшення опору судин. Місцем дії трепростинілу при муковісцидозі є судинна мережа й позаклітинний простір в альвеолі. Tissieres et al. описує дослідження, що використовують ілопрост для лікування пацієнта з муковісцидозом і вторинною легеневою гіпертензією. Розкривається, що ілопрост у вигляді аерозолю був ефективний при зниженні тиску в легеневій артерії (The annals of thoracic surgery, vol, 78, no.3, E48-E50). US 2001/006979 A1 описує застосування похідних простацикліну, таких як ілопрост або цикапрост, для лікування фіброзних хвороб. Муковісцидоз не пов'язаний з фіброзом легенів, оскільки ця хвороба виникає в бронхіальному епітелії. Через відсутність CFTR, у слизі, який покриває бронхіальний епітелій, є занадто мало води; відповідно, війки не можуть рухати густий слиз, і мукоциліарний кліренс порушується (мукоциліарний кліренс працює подібно стрічці конвеєра, де війки ритмічно рухаються, щоб просувати слиз назад у трахею й глотку, звідки він може бути вилучений проковтуванням або відкашлюванням і т.п.). Якщо мукоциліарний кліренс порушується, бактерії не видаляються із бронхів, бронхи заселяються бактеріями, і мають місце повторні приступи легеневих інфекцій, які руйнують легені. Ця ситуація може бути виправлена відновленням потоків Cl- у бронхіальний епітелій. Таким чином, при муковісцидозі місцем дії є епітелій бронхів. Місце дії є анатомічно різним (інтерстиціальна тканина легенів у порівнянні із бронхіальними дихальними шляхами), стосується різних типів клітин (фібробласти, гладком'язові клітини судин, епітелій у порівнянні з абсорбуючими й секретуючими бронхіальними епітеліальними клітинами) і, очевидно, також стосується різних рецепторів (рецептор простацикліну на противагу, імовірно, EP2- рецептору). DE 102005016345 A1 і US 2005101608 A1 описують використання інгібіторів PDE5 для лікування легеневої гіпертензії. US 2009325976 A1 описує нові похідні простацикліну, які можуть використовуватися також у комбінації з PDE інгібітором 5 для застосування при лікуванні легеневої артеріальної гіпертензії. Використовувані в клініці інгібітори PDE були перевірені відносно активації секреції хлоридів в умовах низьких рівнів цАМФ, як описано Cobb B.R. et al., (Am J Respir Cell Moi Biol. 2003 Sep; 29 (3 Pt 1): 410-418). Інгібітори PDE5, силденафіл і варденафіл, і їхня роль у транспорті хлоридів при муковісцидозі описані Lubamba B. et al. (Am J Respir Crit Care Med. 2008 Mar 1; 177(5): 506-515). Інгібітори PDE5 і їх роль у функції каналів ΔF508 CFTR описуються Clarke Lane L. (J Respir Crit Care Med. 2008 Mar 1; 177(5): 469-70). В WO 2010106494 A1 розкривається застосування мезембрину HCI, відомого слабкого інгібітора PDE4, для лікування деяких захворювань. US 20070249668 описує композицію, що містить інгібітор PDE і аналог простацикліну, длязбільшення вмісту АТФ в еритроцитах. У цей час, відсутні доступні методи лікування муковісцидозу, які значно поліпшують якість життя пацієнтів протягом тривалого періоду. Тому ціль даного винаходу - забезпечити композиції для лікування, які можуть збільшити експресію ΔF508 CFTR і/або функцію каналів для перенесення іонів хлору в епітеліальних клітинах легенів. Розкриття винаходу Ціль винаходу досягається наданням композиції, що містить, щонайменше, один простациклін або аналог, похідне або його фармацевтично прийнятну сіль у комбінації, щонайменше, з одним інгібітором PDE4 для застосування при запобіганні або лікуванні муковісцидозу. У якості альтернативного варіанта здійснення зазначена композиція може додатково містити, щонайменше, один PDE5 і/або PD7, і/або PDE8 інгібітор. Зокрема, аналог простацикліну вибирають із групи трепростинілу, ілопросту, цикапросту або берапросту або їх похідних або фармацевтично прийнятних солей. В одному варіанті здійснення даного винаходу похідне трепростинілу є кислотним похідним, проліками, поліморфом або ізомером трепростинілу. Зокрема, згідно з винаходом інгібітор PDE4 може бути обраний із групи RO 20-1724, ібудиласту, рофлуміласту і його N-оксиду, циломіласту, BAY 19-8004, CC3, AWD 12-281, SCH 3 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 351591, цикламіласту, пікламіласту, CGH2466, мезембрину, роліпраму, лютеоліну й дротаверину. Згідно з винаходом інгібітор PDE5 можна вибрати з аванафілу, лоденафілу, міроденафілу, силденафілу цитрату, тадалафілу, варденафілу й уденафілу; PDE7 і PDE8 інгібітори можуть бути обрані з дипіридамолу, BRL-50481 і PF-04957325. Зокрема, згідно з окремим варіантом здійснення винаходу композиція складається з одного типу аналога простацикліну й одного типу PDE4 інгібітора. У якості спеціального варіанта здійснення композиція містить трепростиніл і PDE4 інгібітор, обраний із групи RO 20-1724, рофлуміласту й ібудиласту. У додатковому варіанті здійснення винаходу композиція містить додаткові PDE інгібітори, обрані з PDE5, PDE7 або PDE8 інгібіторів. В іншому варіанті здійснення винахід надає композицію, що не містить інтерферон. Конкретніше, композиція за винаходом готується у вигляді фармацевтичної композиції. Для введення комбінації за винаходом можуть бути використані будь-які відомі способи введення, наприклад, це може бути внутрішньовенне або підшкірне введення або введення за допомогою інгаляції, або введення в перорально доступній формі, обраній із групи форм із тривалим вивільненням, таблеток або капсул. Відповідно до конкретного варіанта здійснення ефективна кількість трепростинілу або його фармацевтично прийнятної солі переважно становить близько 1,0 нг/кг ваги тіла, кількість ібудиласту переважно становить до 5x30 мг, переважно до 2x30 мг, ефективна кількість PDE4 інгібітору становить приблизно 0,5 мг. Крім того, один або більше інгібіторів із групи PDE5 і PDE7 інгібіторів можуть перебувати в ефективній кількості близько 0,5 мг кожного з інгібіторів. Даний винахід також надає спосіб in vitro збільшення рівня цАМФ у клітині, при цьому зазначена клітина контактує, щонайменше, з одним простацикліном або аналогом простацикліну і, щонайменше, одним PDE4 інгібітором або його фармацевтично прийнятною сіллю. Крім того, PDE5, PDE7 і/або PDE8 інгібітор може додатково використовуватися згідно із зазначеним способом. Зокрема, клітина є епітеліальною клітиною, конкретніше, вона може бути бронхоепітеліальною клітиною. Також надається терапевтична композиція, що містить, щонайменше, один простациклін або аналог простацикліну й, щонайменше, один PDE4 інгібітор або його фармацевтично прийнятну сіль, у якій аналог простацикліну й PDE4 інгібітор надаються у кількостях, які разом є достатніми для лікування та/або запобігання, щонайменше, одного симптома, пов'язаного з муковісцидозом. Зокрема, аналог простацикліну й PDE4 інгібітор входять до складу, призначеного для введення за допомогою інгаляції. Зазначена терапевтична композиція може, згідно з варіантом здійснення, містити, щонайменше, один додатковий інгібітор, обраний із групи PDE5, PDE7 і PDE8 інгібіторів. Фігури Фіг. 1 - нагромадження цАМФ у клітинах 1B3-1 після інкубації із трепростинілом окремо або в комбінації з PDE4 інгібіторами ібудиластом (100 мкM) і цилостазолом (100 мкM). Фіг. 2 - нагромадження цАМФ у клітинах 1B3-1 після інкубації із трепростинілом у комбінації з PDE4 інгібіторами RO-20-1724 (100 мкM) і рофлуміластом (10 мкM). Фіг. 3 - активація потоку іонів Cl- трепростинілом у лінії епітеліальних клітин бронхів людини IB3-1, транзиентно експресуючих CFTR дикого типу (дт). Фіг. 4 - нагромадження цАМФ у клітинах IB3-1, стимульоване 10 мкM трепростинілу під час відсутності або в присутності зазначених концентрацій дипіридамолу, ібудиласту, RO20-1724 3 або рофлуміласту. Клітини попередньо метаболічним шляхом мітили [ H]аденіном протягом 4 3 годин і потім інкубували із зазначеними сполуками протягом 30 хвилин. Утворення [ H]цАМФ визначали, як зазначено у розділі "Матеріали й методи". Дані являють собою середні значення ± стандартна помилка середнього (n=3). Фіг. 5 - крива концентрація-ефект для викликаного трепростинілом нагромадження цАМФ у клітинах IB3-1. Клітини інкубували зі зростаючими концентраціями трепростинілу під час відсутності й у присутності зазначених концентрацій ібудиласту, RO20-1724 або рофлуміласту. 3 Клітини попередньо метаболічним шляхом мітили [ H]аденіном протягом 4 годин, а потім 3 інкубували із зазначеними сполуками протягом 30 хвилин. Утворення [ H]цАМФ визначали, як зазначено в Матеріалах і Методах. Дані являють собою середні значення ± стандартна помилка середнього (n=3). Фіг. 6 - дія обраних інгібіторів фосфодієстерази на основне нагромадження цАМФ у клітинах 3 IB3-1. Клітини попередньо метаболічним шляхом мітили [ H]аденіном протягом 4 годин і потім інкубували під час відсутності (основне нагромадження) і в присутності зазначених концентрацій 4 UA 113161 C2 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дипіридамолу, RO-20-1724 або рофлуміласту протягом 30 хвилин. Рівні [ H]цАМФ визначали, як зазначено в Матеріалах і Методах. Дані являють собою середні значення ± стандартна помилка середнього (n=3). Докладний опис винаходу Винахідники зненацька виявили, що простациклін або його аналоги або фармацевтично прийнятна сіль у комбінації з PDE4 інгібітором може використовуватися для лікування муковісцидозу. Було показано, що комбінація простацикліну або аналогів простацикліну й PDE4 інгібіторів виявляє синергічну дію на збільшення цАМФ, зокрема, в уражених епітеліальних клітинах дихальних шляхів людини, у порівнянні із застосуванням окремих засобів. Зазначений ефект може додатково збільшуватися за рахунок присутності додаткових PDE-інгібіторів, обраних з PDE5, PDE7 і PDE8 інгібіторів. Синтетичні аналоги простацикліну можуть являти собою, але не обмежуються цим, трепростиніл, ілопрост, цикапрост або берапрост. Трепростиніл комерційно доступний як Ремодулін™. Трепростиніл являє собою мононатрієву сіль (1R,2R,3aS,9aS)-[[2,3,3a,4,9,9а-гексагідро-2-гідрокси-1-[(3S)-3-гідроксиоктил]1H-бенз[f]інден-5-іл]окси] оцтової кислоти. Ілопрост комерційно доступний як "Іломедин" і являє собою 5-{(E)-(1S,5S,6R,7R)-7-гідрокси6[(E)-(3S,4RS)-3-гідрокси-4-метил-1-октен-6-иніл]-бі-цикло[3.3.0]oктан-3-іліден}-валеріанову кислоту. Берапрост являє собою 2,3,3a,8b-тетрагідро-2-гідрокси-1-(3-гідрокси-4-метил-1-октен-6иніл)-1H-циклопента(b) бензофуран-5-бутанову кислоту. Цикапрост являє собою 2-[(2E)-2-[(3aS,4S,5R,6aS)-5-гідрокси-4-[(3S,4S)-3-гідрокси-4метилнона-1,6-диініл]-3,3a,4,5,6,6a-гексагідро-1H-пентален-2-іліден]етокси]-оцтову кислоту. У відношенні простацикліну, PDE4 і PDE5, PDE7 або PDE8 інгібіторів, відповідно до винаходу термін "аналоги простацикліну", "аналоги інгібітора" або "аналоги PDE4, PDE5, PDE7 або PDE8 інгібітора" має на увазі похідні або аналоги зазначених речовин. Терміни "aналог" або "похідне" відносяться до хімічної молекули, яка подібна з іншою хімічною речовиною за структурою й функцією, часто окремим елементом, що структурно відрізняється, або групою, яка може відрізнятися внаслідок модифікації більше, ніж однієї групи (наприклад, 2, 3 або 4 груп), якщо вона зберігає ту ж саму функцію як вихідна хімічна речовина. Такі модифікації є звичайними для фахівців і включають, наприклад, додаткові або заміщені хімічні фрагменти, такі як складні ефіри або аміди кислоти, захисні групи, такі як бензильна група для спирту або тіолу, і тре-бутоксилкарбонільні групи для аміну. Також включаються модифікації алкільних бічних ланцюгів, такі як алкільні заміщення (наприклад, метил, диметил, етил і т. д.), модифікації рівня насиченості й ненасиченості бічних ланцюгів і введення модифікованих груп, таких як заміщений феніл і феноксигрупа. Похідні також можуть включати кон'югати, такі як молекули біотину або авідину, ферменти, такі як пероксидаза хріну й таке інше, і радіоізотопномічені, біолюмінесцентні, хемолюмінесцентні або флуоресцентні фрагменти. Крім того, фрагменти можуть бути додані до описаних тут речовин для зміни їх фармакокінетичних властивостей, наприклад, для збільшення часу напівжиття in vivo або ex vivo, або збільшення їх здатності проникати в клітину, у числі інших бажаних властивостей. Також включаються проліки, відомі як посилюючі численні бажані властивості фармацевтичних препаратів (наприклад, розчинність, біологічну доступність, властивості, необхідні при виробництві, і т. д.). Термін "похідне" також включає зміни вихідної послідовності, включаючи додавання, видалення й/або заміщення, які надають функціонально еквівалентні або функціонально поліпшені молекули. Придатні похідні простацикліну або аналогів простацикліну включають, але не обмежуються цим, кислотні похідні, проліки, форми із тривалим вивільненням, інгаляційні форми й пероральні форми трепростинілу, ілопросту, цикапросту або берапросту. Згідно з окремим варіантом здійснення винаходу похідне трепростинілу вибирають із групи кислотних похідних, проліків, поліморфів і ізомерів трепростинілу. Аналогічно, похідні ілопросту, цикапросту або берапросту можуть бути кислотними похідними, проліками, поліморфами або ізомерами. Термін похідне простацикліну також включає його фармацевтично прийнятні солі. Фармацевтично прийнятна сіль простацикліну або аналогу простацикліну цього винаходу може бути утворена між кислотною й основною групою сполуки, такою як амінна функціональна група, або основою й кислотною групою сполуки, такої як карбоксильна функціональна група. Зокрема, фізіологічно прийнятні солі аналогів простацикліну включають солі, отримані з основ. Основні солі включають солі амонію (такі як четвертинні амонієві солі), солі лужних металів, такі як солі натрію й калію, солі лужноземельних металів, такі як солі кальцію й магнію, 5 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 солі, утворені з органічними основами, такими як дициклогексиламін та N-метил-D-глюкамін, і солі, утворені з амінокислотами, такими як аргінін і лізин. Зокрема, згідно з винаходом кращим є застосування трепростинілу. Трепростиніл може успішно збільшувати експресію ΔF508 CFTR і/або функцію хлорних каналів в епітеліальних клітинах легенів у пацієнтів з муковісцидозом. Зненацька було показано, що аналог простацикліну в комбінації з PDE4 інгібітором і необов'язково в комбінації з PDE5 і/або PDE7 і/або PDE8 інгібітором приводить до синергічного стимулювання вироблення цАМФ і/або збільшення вмісту цАМФ у бронхоепітеліальних клітинах. Цікаво, що PDE3 інгібітори, подібні анагреліду й цилостазолу, взагалі не викликають накопичення цАМФ в експериментах. З урахуванням цієї здатності стимулювати вироблення цАМФ через IP рецептор і обмежена присутність IP рецепторів на невеликій кількості типів клітин (такому як епітеліальні клітини легенів), простациклін або його аналог, наприклад, трепростиніл, може викликати експресію й "відмикання" (відкриття) CFTR і mutCFTR специфічним способом, що може бути використано для лікування КФ, зокрема, при комбінуванні зазначених PDE4 інгібіторів, щоб викликати тривале збільшення рівнів цАМФ в епітелії дихальних шляхів. Згідно з додатковим варіантом здійснення зазначене збільшення цАМФ може бути додатково викликане комбінацією PDE4 інгібітора з додатково обраними PDE інгібіторами із групи PDE5, PDE7 і/або PDE8 інгібіторів. PDE4 інгібітори схвалені для лікування ХОХЛ і астми; головна мета при ХОХЛ і астмі зменшити гіперреактивність гладком'язових клітин, що вистилають дихальні шляхи. Уже давно відомо, що підвищені рівні цАМФ у гладком'язових клітинах викликають розслаблення гладких м'язів через вплив на кіназу легенів ланцюгів міозину. На додаток до цього, вважають, що PDE4 інгібітори зменшують імунну відповідь, яка стимулює алергійну астму шляхом націлювання моноцитів, еозинофілів і базофільних гранулоцитів, В- і T-клітин, наприклад, клітин запалення. Жоден із цих двох механізмів не має відношення до механізму дії при муковісцидозі. При муковісцидозі рівні цАМФ повинні бути підвищені в дуже незвичайному клітинному компартменті, тобто епітелії дихальних шляхів. Насправді, наскільки нам відомо, не існує наукових повідомлень, що показують, що PDE4 є релевантною ізоформою, яка збільшує опосередковане рецептором нагромадження цАМФ в епітелії дихальних шляхів. Відповідно до винаходу може використовуватися будь-який PDE4 інгібітор або його аналог, що володіє інгібуючою активністю відносно ферменту PDE4. Таким чином, не виключається, що PDE4 інгібітор може так само додатково інгібувати інші PDE ферменти. Зокрема, PDE4 інгібітор може бути специфічним PDE4 інгібітором. PDE4 інгібітор винаходу може бути обраний з, але не обмежується цим, RO 20-1724, ібудиласт, рофлуміласт (3-(циклопропілметокси)-N-(3,5-дихлорпіридин-4-іл)-4(дифторметокси)бензамід) і його N-оксид, циломіласт, BAY 19-8004, CC3, AWD 12-281 (N-(3,5дихлор-4-піридиніл)-2-[144-фторбензил)-5-гідрокси-1H-індол-3-іл]-2-оксоацетамід), SCH351591 (N-(3,5-дихлор-1-оксидо-4-піридиніл)-8-метокси-2-(трифторметил)-5-хінолін карбоксамід), цикламіласт, пікламіласт, CGH2466, мезембрин, роліпрам, лютеолін і дротаверин або їх функціональні аналоги. Конкретніше, композиція для застосування при запобіганні або лікуванні КФ, зокрема, шляхом збільшення рівнів цАМФ у бронхоепітеліальних клітинах індивідуумів, що страждають від КФ, може містити трепростиніл і рофлуміласт або трепростиніл і ібудиласт або трепростиніл і RO-20-1724. Показано, що PDE5-інгібітори збільшують рівні вторинного месенджеру циклічного нуклеотида в гладком'язових клітинах. Відповідно до винаходу може використовуватися будь-який інгібітор PDE5 або його аналог, що володіє інгібуючою активністю відносно ферменту PDE5. Таким чином, не виключається, що PDE5-інгібітор може так само додатково інгібувати інші PDE ферменти. Зокрема, відповідно до винаходу інгібітор PDE5 може бути обраний з аванафілу (4-[(3-хлор4-метоксибензил)аміно]-2-[2-(гідроксиметил)-1-піролідиніл]-N(2-піримідинілметил)-5піримідинкарбоксамід), лоденафілу (біс-(2-{4-[4-етокси-3-(1-метил-7-оксо-3-пропіл-6,7-дигідро1H-піразоло[4,3-d] піримідин-5-іл)-бензолсульфоніл]піперазин-1-іл}-етил) карбонат), мироденафілу (5-етил-3,5-дигідро-2-[5-([4-{2-гідроксиетил)-1-піперазиніл]сульфоніл)-2пропоксифеніл]-7-пропіл-4H-піроло[3,2-d]піримідин-4-он), силденафілу цитрату (1-[4-етокси-3(6,7-дигідро-1-метил-7-оксо-3-пропіл-1H-піразоло[4,3-d]піримідин-5-іл)фенілсульфоніл]-4метилпіперазин), тадалафілу (6R-транс)-6-(1,3-бензодіоксол-5-іл)-2,3,6,7,12,12а-гексагідро-2метил-піразино[1',2':1,6] піридо[3,4-b]індол-1,4-діон), варденафілу (4-[2-етокси-5-(4етилпіперазин-1-іл)сульфоніл-феніл]-9-метил-7-пропіл-3,5,6,8-тетразабіцикло[4.3.0]нона-3,7,9 6 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 трієн-2-он) або уденафілу (3-(1-метил-7-оксо-3-пропіл-4,7-дигідро-1H-піразоло[4,3-d] піримідин5-іл)-N-[2-(1-метилпіролідин-2-іл)етил]]-4-проапокси бензолсульфонамід) або їх будь-якого функціонального аналога. У конкретному варіанті здійснення винаходу композиція може містити трепростиніл, рофлуміласт і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8-інгібітор або трепростиніл, ібудиласт і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8-інгібітор або трепростиніл, RO-20-1724 і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8-інгібітор. У додатковому варіанті здійснення винаходу композиція може містити берапрост, рофлуміласт і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8-інгібітор або берапрост, ібудиласт і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8 інгібітор або берапрост, RO-20-1724 і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8-інгібітор. У додатковому варіанті здійснення винаходу композиція може містити ілопрост, рофлуміласт і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8-інгібітор або ілопрост, ібудиласт і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8 інгібітор або ілопрост, RO-20-1724 і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8-інгібітор. У наступному варіанті здійснення винаходу композиція може містити цикапрост, рофлуміласт і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8-інгібітор або цикапрост, ібудиласт і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8 інгібітор або цикапрост, RO-20-1724 і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8-інгібітор. Відповідно до винаходу може використовуватися будь-який PDE7 або PDE8-інгібітор або його аналог, що володіє інгібуючою активністю відносно ферменту PDE7 або PDE8. Таким чином, не виключається, що PDE7 або PDE8-інгібітор може так само додатково інгібувати інші PDE ферменти. Зокрема, згідно з винаходом PDE7-інгібітор може бути обраний з дипіридамолу та BRL 50481. Зокрема, згідно з винаходом PDE8-інгібітор може бути обраний з 1,5-заміщених ніпекотинових амідів і PF-4957325. В альтернативному варіанті здійснення винаходу композиція може містити, зокрема, трепростиніл, рофлуміласт і дипіридамол або трепростиніл, ібудиласт і дипіридамол або трепростиніл, RO-20-1724 і дипіридамол. У додатковому альтернативному варіанті здійснення винаходу композиція може, зокрема, містити берапрост, рофлуміласт і дипіридамол або берапрост, ібудиласт і дипіридамол або берапрост, RO-20-1724 і дипіридамол. У наступному додатковому альтернативному варіанті здійснення винаходу композиція може, зокрема, містити ілопрост, рофлуміласт і дипіридамол або ілопрост, ібудиласт і дипіридамол або ілопрост, RO-20-1724 і дипіридамол. У додатковому варіанті здійснення винаходу композиція може, зокрема, містити цикапрост, рофлуміласт і дипіридамол або цикапрост, ібудиласт і дипіридамол або цикапрост, RO-20-1724 і дипіридамол. Альтернативно, композиція може містити трепростиніл, рофлуміласт і BRL 50481 або трепростиніл, ібудиласт і BRL 50481 або трепростиніл, RO-20-1724 і BRL 50481. Альтернативно, композиція може містити, зокрема, трепростиніл, рофлуміласт і PF-4957325 або трепростиніл, ібудиласт і PF-4957325 або трепростиніл, RO-20-1724 і PF-4957325. Відповідно до винаходу термін "щонайменше, один" або "деякий" означає, що один тип простацикліну або аналога простацикліну й один тип PDE4-інгібітора й необов'язково один або більше PDE5, PDE7 або PDE8-інгібіторів, є в наявності для застосування при лікуванні або запобіганні муковісцидозу, зокрема, для застосування з метою збільшення рівня цАМФ у бронхоепітеліальних клітинах. Однак альтернативно, композиція також може містити більш ніж один тип простацикліну або аналога простациклініна й більш ніж один тип PDE4-інгібітора й необов'язково один або більше із PDE5, PDE7 або PDE8-інгібіторів, зокрема, два, три, чотири типи або будь-яку комбінацію простациклінів, або аналогів простацикліну й PDE4, і необов'язково PDE5, PDE7, і/або PDE8-інгібіторів. Винахід додатково надає спеціальну композицію, що містить трепростиніл і один або більше PDE4-інгібіторів, обраних із групи RO 20-1724, рофлуміласту й ібудиласту. Композиція за винаходом може бути виготовлена у вигляді фармацевтичної композиції. Композиція винаходу може перебувати в будь-якій формі, яка може використовуватися для введення. Точна доза сполуки, що вводиться, згідно із цим винаходом, призначена для одержання терапевтичного або профілактичного ефектів, буде визначатися конкретними обставинами, 7 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пов'язаними з даним випадком, включаючи, наприклад, спосіб уведення, вік, вагу й відповідь окремого пацієнта, стан, який необхідно лікувати, і тяжкість симптомів у пацієнта. Загалом, сполуки винаходу бажано вводити у концентрації, яка буде в більшості випадків забезпечувати ефективні результати, не викликаючи яких-небудь серйозних побічних явищ, при цьому сполуки можуть уводитися або у вигляді одиничної стандартної дози, або, за необхідності, дозування можна поділити на відповідні субодиниці, які вводяться в відповідний час протягом дня. Композиція може бути надана у вигляді цілого ряду складів для системного або місцевого застосування. Композиції винаходу для системного або місцевого застосування вибирають із групи композицій, призначених для перорального, внутрішньоротового, внутрішньолегеневого, ректального, внутрішньоматкового, внутрішньошкірного, місцевого, дермального, парентерального, внутрішньопухлинного, внутрічерепного, щічного, під'язичного, назального, підшкірного, внутрішньосудинного, внутрішньооболочного введення, уведення за допомогою інгаляції й вдихання, внутрішньосуглобного, внутрішньопорожнинного, уведення за допомогою імплантації, трансдермального, іонтофоретичного, внутрішньоочного, офтальмологічного, вагінального, очного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, внутрішньозалозистого, внутрішньоорганного, внутрішньолімфатичного введення, а також уведення за допомогою композицій з уповільненим вивільненням і ентеросолюбільним покриттям. Принципи готування й складання подібних композицій відомі в даній області техніки й не мають потреби в докладному описі в даному документі. Композиція може бути введена один раз або кілька разів на день. Композиції, що підходять для респіраторного, назального, внутрішньолегеневого й інгаляційного введення, є кращими, так само як місцеві, пероральні й парентеральні композиції. Загалом, композиції одержують шляхом рівномірного й ретельного з'єднання активної речовини з рідким носієм, дрібно подрібненим твердим носієм, або й тим і іншим, і потім, якщо необхідно, формуванням продукту в бажані композиції. Композиції, що придатні для перорального введення, можуть бути представлені у вигляді окремих одиниць, таких як капсули, облатки, пастилки або таблетки, кожна з яких містить композицію у вигляді порошку або гранул; у вигляді розчинів або суспензій у водній або безводній рідині; або у вигляді емульсії олія-у-воді або вода-в-олії. Композиції, що придатні для парентерального введення, включають стерильні водні й неводні ін'єкційні розчини активної сполуки, причому ці препарати переважно є ізотонічними із кров'ю реципієнта. Ці препарати можуть містити антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні речовини й розчинені компоненти, які приводять композиції в ізотонічний стан із кров'ю реципієнта. Водні й неводні стерильні суспензії можуть включати суспендуючі речовини й загусники. Композиції можуть бути представлені в однодозних або багатодозних контейнерах, наприклад, запаяних ампулах або флаконах, і можуть зберігатися у висушеному сублімацією або ліофілізацією стані, який вимагає тільки додавання стерильного рідкого носія, наприклад, фізіологічного розчину або води для ін'єкції, безпосередньо перед застосуванням. Назальні композиції й композиції для закапування містять очищені водяні розчини активної сполуки в комбінації з консервуючими речовинами та ізотонічними речовинами. Переважно, подібні композиції доводять до значення pH і ізотонічного стану, сумісного з назальними слизовими оболонками. Композиція, розкрита відповідно до винаходу, може вводитися в дихальну систему суб'єкта або шляхом інгаляції, вдихання, назального введення, або шляхом внутрішньолегеневої інстиляції (у легені) за допомогою будь-яких придатних засобів, і переважно вводиться за допомогою аерозолю або спрею, що складається з порошкоподібних або рідких часток для назального, внутрішньолегеневого введення, а також уведення за допомогою інгаляції й вдихання. Частки для вдихання або інгаляції, що містять активну сполуку, вдихаються суб'єктом, наприклад, при інгаляції або при назальному введенні, або при інстиляції в дихальні шляхи або власне в легені. Композиція може містити призначені для вдихання або введення за допомогою інгаляції рідкі або тверді частки активної сполуки, які відповідно до даного винаходу включають частки для інгаляції або вдихання достатнього малого розміру, щоб проходити через рот і дихальне горло після інгаляції й далі в бронхи й альвеоли легенів. Загалом, частки мають близько 0,05, близько 0,1, близько 0,5, близько 1, приблизно від 2 до 4, близько 6, близько 8, близько 10 мікронів у діаметрі. Конкретніше, частки приблизно від 0,5 до 5 мкм у діаметрі являють собою частки для інгаляції або вдихання. Частки, непридатного для вдихання розміру, включені в аерозоль або спрей, мають тенденцію осаджуватися в горлі й проковтуються. Тому кількість часток, непридатного для вдихання розміру, в аерозолі переважно зводиться до мінімуму. Для назального введення або внутрішньолегеневої інстиляції розмір часток у межах 8 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 близько 8, близько 10, близько 20, приблизно від 25 до 35, близько 50, близько 100, близько 150, близько 250, близько 500 мкм у діаметрі є кращим, щоб забезпечити утримання в носовій порожнині або для інстиляції й безпосереднього осадження в легенях. Рідкі композиції можуть впорскуватися в дихальні шляхи або ніс і легені, зокрема, при введенні немовлятам і дітям. Аерозолі з рідких часток, що містять активну сполуку, можна одержати за допомогою будьяких придатних засобів, таких як розпилювач (аерозольний інгалятор). Розпилювачі є комерційно доступними обладнаннями, що перетворять розчини або суспензії активного інгредієнта в лікувальний аерозольний пил шляхом прискорення стисненого газу, як правило, повітря або кисню. Придатні композиції для застосування в розпилювачі складаються з активного інгредієнта в рідкому носії, при цьому активний інгредієнт становить до 40 % об./об. композиції, але переважно менше ніж 20 % об./об., носій є в більшості випадків водою або розведеним водяним розчином спирту, переважно його роблять ізотонічним з рідинами організму шляхом додавання, наприклад, хлориду натрію. Необов'язкові добавки включають консервуючі речовини, у тому випадку, якщо композиція готується як нестерильна, наприклад, метилгідроксибензоат, антиоксиданти, смакові речовини, ефірні олії, буферні засоби й поверхнево-активні речовини. Аерозолі із твердих часток, що містять активну сполуку, також можна одержати за допомогою будь-якого наявного в продажу аерозольного генератора, призначеного для медикаменту, що складається із часток. Аерозольні генератори для введення медикаменту, що містить тверді частки, роблять частки, придатні для вдихання, як пояснено вище, і створюють обсяг аерозолю, що містить заздалегідь визначену відміряну дозу медикаменту, при швидкості, що придатна для введення людині. Приклади таких аерозольних генераторів включають дозуючі інгалятори й інсуфлятори (порошковдувачі). В одному варіанті здійснення обладнання, що подає (засіб доставки) включає порошковий інгалятор (DPI), що доставляє одну або множину доз композиції. Однодозовий інгалятор може бути наданий у вигляді набору для одноразового використання, у який попередньо стерильно завантажується кількість композиції, достатня для однократного застосування. Інгалятор може бути наданий у вигляді інгалятора під тиском (аерозольного інгалятора), а композиція - в капсулі, що пробивається або відкривається, або картриджі. Крім того, набір необов'язково може містити в окремому контейнері деякий засіб, наприклад, інші терапевтичні сполуки, ексципієнти (допоміжні речовини), поверхнево-активні речовини (передбачувані як терапевтичні засоби, а також інгредієнти композиції), антиоксиданти, смакові й забарвлюючі речовини, наповнювачі, ефірні олії, буферні речовини, диспергуючі речовини, ароматизуючі речовини, об'ємоутворюючі агенти, речовини, що консервують та розпорошують, у числі інших добавок, що придатні для різних композицій. Завдяки високій метаболічній стабільності деяких аналогів простацикліну, подібних трепростинілу, або у випадку надання простациклінів або аналогів простацикліну у формі на основі ліпіду або пегільованій формі, речовини також можуть бути введені як депо-медикаменти (препарати вповільненої дії). PDE4, PDE5, PDE7 і PDE8-інгібітори також є метаболічно стабільними, тому комбінація простацикліну або аналога простацикліну й PDE4-інгібітора, необов'язково разом з одним або більше з PDE5, PDE7 або PDE8-інгібіторів, також може бути створена у вигляді депомедикаментів. Аерозольна доставка композиції може давати в результаті більш рівномірний розподіл засобу в легені, так що виходить доставка глибоко в легені. Таким чином, дозування може бути знижене, завдяки тривалій присутності засобу в місці дії в легені. Наприклад, композиція може подаватися за допомогою розпилювача. Перевага способу доставки за допомогою розпилювача полягає в тому, що менша кількість препарату досягає загального кровообігу. Композиція може подаватися кілька разів на день, наприклад, від п'яти до 10 разів на день, однак, внаслідок синергічного ефекту простацикліну або аналога простацикліну й PDE4, необов'язково в комбінації з одним або більше з PDE5, PDE7 і/або PDE8інгібіторів, у більшості випадків частота дозування може бути зменшена. Композиція може бути введена разом з будь-якими фармацевтично прийнятними речовинами або носіями, або ексципієнтами, відомими в даній області техніки. Вони можуть бути, наприклад, але не обмежуються цим, водою, нейтралізуючими засобами, подібними до NaOH, KOH, стабілізуючими речовинами, DMSO, фізрозчином, бетаіном, таурином і т.д. Термін "фармацевтично прийнятний" означає схвалений контрольним органом федерального уряду або уряду штату або зареєстрований у США. Термін "носій" відноситься до розріджувача, ад'юванта (допоміжного засоба), ексципієнта або розчинника, разом з яким уводиться фармацевтична композиція. Сольові розчини й водяні розчини декстрози й гліцерину також можуть використовуватися в якості рідких носіїв, зокрема, 9 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для ін'єктуємих розчинів. Придатні ексципієнти включають крохмаль, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, борошно, крейду, силікагель, стеарат натрію, гліцеринмоностеарат, тальк, хлорид натрію, сухе знежирене молоко, гліцерин, пропіленгліколь, воду, етанол і т.п. Приклади придатних фармацевтичних носіїв описані в "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin. Склад слід вибирати у відповідності зі способом уведення. Кількість композиції за винаходом може бути підібрана кваліфікованим фахівцем, зокрема, кількість простацикліну або аналогів простацикліну або їх фармацевтично прийнятних солей, зокрема, кількість трепростинілу становить, щонайменше, 1,0 нг/кг ваги тіла. Кількість PDE4 або PDE5-інгібітора також може бути легко підібрана кваліфікованим фахівцем. Зокрема, кількість PDE4 або PDE5 або PDE7 або PDE8-інгібітора становить приблизно 0,5 мг для рофлуміласту або близько 30 мг для ібудиласту, щонайменше, один раз на день, зокрема, щонайменше, два рази на день. Даний винахід додатково надає спосіб збільшення рівня цАМФ у клітині, при цьому зазначена клітина контактує, щонайменше, з одним простацикліном або аналогом простацикліну й, щонайменше, з одним PDE4 і необов'язково, щонайменше, з одним з PDE5, PD7 або PDE8-інгібіторів. Збільшення цАМФ у зазначених клітинах може становити, щонайменше, 10 %, переважно, щонайменше, 25 %, переважно, щонайменше, 50 %, більш переважно, щонайменше, 100 % у порівнянні з лікуванням одним простацикліном або PDE4 і/або PDE5 або PDE7 або PDE8-інгібітором. Також надається терапевтична комбінація, яка містить, щонайменше, один аналог простацикліну й, щонайменше, один PDE4, і необов'язково, щонайменше, один PDE5 і/або PDE7 інгібітор і/або PDE8 інгібітор, у якій аналог простацикліну й PDE4, і/або PDE5 інгібітор, і/або PDE7-інгібітор, і/або PDE8-інгібітор надаються у кількостях, які разом є достатніми для лікування й/або запобігання, щонайменше, одного симптома, пов'язаного з муковісцидозом. Зокрема, збільшення рівня цАМФ в епітеліальних клітинах легенів пацієнтів із КФ може досягатися шляхом уведення розробленого терапевтичного комбінованого препарату. Зокрема, щонайменше, один з аналогів простацикліну й PDE4 і необов'язково один або більше із PDE5, PDE7 або PDE8-інгібіторів включаються до складу для введення за допомогою інгаляції. У певному варіанті здійснення даного винаходу розкривається комбінована терапія для лікування муковісцидозу. Згідно з окремим варіантом здійснення симптоми, пов'язані зі зниженими рівнями цАМФ у бронхоепітеліальних клітинах пацієнтів із КФ, можна лікувати або запобігти за допомогою розробленої комбінованої терапії. Також можливе введення одного або більше додаткових засобів. Простациклін або аналог простацикліну й PDE4 і необов'язково PDE5, PDE7 або PDE8інгібітор можуть уводитися разом, наприклад, в одній таблетці або капсулі або складі для інгаляції, або PDE4 і необов'язково інші PDE-інгібітори винаходу, а також необов'язкові додаткові засоби можуть уводитися окремо від простацикліну або аналога простацикліну. Винахід додатково надає набір і його застосування для лікування або запобігання стану, пов'язаного з муковісцидозом у суб'єкта, що містить (i) ефективну кількість простацикліну або аналога простацикліну, (ii) PDE4-інгібітор, зокрема, рофлуміласт, RO-20-1724 або ібудиласт, і необов'язково одну або більше сполук, обраних із групи PDE5, PDE7 і PDE8-інгібіторів, (iii) один або більше фармацевтично прийнятних носіїв і/або допоміжних речовин і (iv) інструкції, що стосуються застосування при лікуванні або запобіганні муковісцидозу в суб'єкта, переважно, у людини. Зазначені компоненти (i) і (ii) і (iii) можуть перебувати у формі, що придатна для внутрішньовенного введення, інгаляції або перорального введення. Описані тут приклади є характерними для даного винаходу й не призначаються для його обмеження. Описані різні варіанти здійснення даного винаходу відповідно до даного винаходу. У відношенні описаних і проілюстрованих тут методів може бути зроблено багато модифікацій і варіантів без відступу від обсягу й сутності винаходу. Таким чином, слід розуміти, що приклади є тільки ілюстративними й не є обмежуючими рамки винаходу. Приклади Приклад 1 Клітини IB3-1 висівали в 6-ямкові планшети (0,2*106 клітин/лунку на Фіг. 1; 0,4* 106 клітин на Фіг. 2) у повне ростове середовище (LHC-8 + 5 % FCS). Наступного дня пул аденінових 3 нуклеотидів метаболічно позначили інкубацією з [ H]аденіном (1мкCi/лунку) у середовищі Ігла, модифікованому за способом Дульбекко (DMEM), що містить аденозиндезаміназу (1 од/мл) протягом 4 годин. Після цього середовище замінили чистим середовищем; клітини стимулювали додаванням одного трепростинілу (у розташованих логарифмічно концентраціях у 10 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 межах від 0,1 до 30 мкM) або трепростинілу в комбінації із зазначеними концентраціями PDEінгібіторів. Після інкубації протягом 30 хвилин клітини лізували додаванням хлорної кислоти. 3 Утворення [ H]цАМФ визначали за допомогою послідовної хроматографії на колонках Dowex 50WX-4 і колонках з нейтральним окисом алюмінію з наступним підрахунком елюату на рідинному лічильнику. Дослідження проводили в трьох повторах. Результати показано на Фігурах 1 і 2. Відмінність між максимальною відповіддю на Фіг. 1 і Фіг. 2 пов'язана головним чином з тим фактом, що кількість клітин і/або лунок на Фіг. 2 у два рази більше, ніж кількість клітин, використана на Фіг. 1. Приклад 2 Клітини IB3-1 ендогенно експресують тільки мутований CFTR-ΔF508, який утримується в клітинах. Використовуючи відповідні маніпуляції (наприклад, інкубацію з фармако-шаперонами або низькотемпературну інкубацію), можна перемістити мутант CFTR-ΔF508 з ендоплазматичного ретикулуму в ЕР; при включенні на клітинній поверхні Cl-провідність може бути стимульована підвищенням цАМФ. Однак, у результаті була отримана маленька Clпровідність. Для того, щоб виразно довести, що нагромадження цАМФ, викликане трепростинілом, обумовлює активацію CFTR, ми транзиентно експресували GFP-мічений варіант CFTR дикого типу (GFP-мітка давала можливість ідентифікувати клітини, які експресують білок на клітинній поверхні). Як видно на Фіг. 3, трепростиніл викликав сильну активацію потоку, викликаного деполяризацією від -40 мВ вихідного потенціалу до +60 мВ. Максимальний ефект затримувався, тобто він спостерігався тільки через кілька секунд після внесення сполуки. Також спостерігалося запізнювання в реакції на вимикання; потік знижувався до вихідного тільки через ~100 сек після промивання. Ці відстрочені реакції відображають (i) проміжний сигнальний каскад (тобто, рецептор-залежну активацію GS, Gas-залежну активацію утворення цАМФ і наступне протеїнкіназа A-залежне фосфорилювання CFTR) і (ii) уповільнену деактивацію підвищеного цАМФ за допомогою фосфодієстераз. Подібні затримки також спостерігалися, якщо клітини стимулювали форсколіном, прямим активатором аденілатциклази, який використовували як позитивний контроль. Ці спостереження довели, що трепростиніл може активувати CFTR у бронхіальних епітеліальних клітинах. Методи Електрофізіологія Для реєстрації потоку використовували петч-кламп метод на цілій клітині, який проводили при 22±1,5 °C за допомогою петч-кламп-підсилювача Axociamp 200B (Axon Instruments). Піпетки мали опір між 1 і 2 МΩ при заповненні реєструючим розчином для піпеток (склад: 110 мM CsCI, 5 мM EGTA, 2 мM MgCI2, 1 мM K2.ATP, 10 мM Hepes, pH регулювали до значення 7,2 за допомогою CsOH). Протоколи напруга-вологість і реєстрацію даних здійснювали за допомогою програмного забезпечення pclamp 6.0 (Axon Instruments). Дані пропускали через фільтр нижніх частот при 2 кГц (-3 dB) і переводили в цифрову форму при 10-20 кГц. Клітини постійно обливали зовнішнім розчином (склад: 145 мM NaCl, 4.5 мM KCI, 2 мM CaCl2, 1 мM MgCI2, 5 мM глюкоза, 10 мM Hepes, pH регулювали до значення 7,4 за допомогою NaOH). Коли вказано, зовнішній розчин містив трепростиніл (10 мкM) або форсколін (5 мкM), перемикання між розчинами досягалося за допомогою клапана тиску з електронним керуванням. Виходячи з результатів прикладу 1, очікується тривала відповідь, якщо трепростиніл комбінується з інгібіторами PDE4 або 5, наприклад, 10 мкM рофлуміласту або 100 мкM ібудиласту або 10-100 мкM тадалафілу або силденафілу або варденафілу. Культура клітин Клітини IB3-1 вирощували в чашках (Nunc; діаметр 3,5 см), покритих фібронектином (10 мкг/мл), щурячим колагеном I (30 мкг/мл) і BSA 10 мкг/мл у середовищі LHC-8 (Gibco), що містить 5 % ембріональної телячої сироватки (FCS). Клітини транзиентно трансфікували плазмідою, що стимулює експресію людського GFP-міченого CFTR дикого типу з використанням Lipofectamine plus® (Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника. Характерні амплітуди потоку реєстрували методом петч-кламп на цілій клітині при +60 мВ. Транзиентно трансфіковані клітини IB3-1, експресуючі GFP-мічений CFTR дикого типу, були відібрані під флуоресцентним світлом і встановлені до вихідного потенціалу при -40 мВ. Деполяризацію викликали стрибком напруги до +60 мВ протягом 50 мсек і реєстрували амплітуду потоку. Внесення трепростинілу (10 мкM остаточна концентрація, TP) починалося на момент часу 50 сек і завершувалося на 125 сек. Форсколін вносили в момент часу 275 сек і видаляли на 375 сек. Результати показано на Фіг. 3. Приклад 3 Уведення 11 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Попередні спостереження показали, що в епітеліальних клітинах дихальних шляхів людини викликане трепростинілом нагромадження цАМФ специфічно збільшувалося інгібіторами ізоформ фосфодієстерази-4 (PDE4). Матеріали й методи Клітинні лінії й культура клітин: Наступні лінії епітеліальних клітин дихальних шляхів людини були отримані від ATCC: BEAS-2B (ATCC CRL-9609), NuLi-1 (ATCC CRL-4011), IB3-1 (ATCC CRL-2777), CuFi-1 (ATCC CRL-4013). Клітини розмножували, використовуючи умови культивування, викладені в рекомендаціях ATCC, наприклад, клітини IB3-1 підтримували на чашках, покритих фібронектином (10 мкг/мл), щурячим колагеном I (30 мкг/мл) і BSA (10 мкг/мл) у середовищі LHC-8 (Gibco), що містить 5 % ембріональної телячої сироватки (FCS) при 37 °C у вологій атмосфері 5 % CO2. Клітини BEAS-2B підтримували при 37 °C у вологій атмосфері 5 % CO2 у чашках, попередньо покритих колагеном IV (60 мкг/мл в 0,25 % оцтовій кислоті) у середовищі BEGM (Lonza); GA-1000 (суміш гентаміцин-амфотерицин В), надану з набором BEGM, у середовище не додавали. Рівень ендогенної експресії CFTR був занадто низький, щоб одержати надійний сигнал. Тому клітини BEAS-2B транзиентно трансфікували плазмідою, що стимулює експресію людського GFP-міченого CFTR дикого типу з використанням Lipofectamine plus® (Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника. Клітини, експресуючі цей GFP-мічений CFTR, визначали за допомогою флуоресцентної мікроскопії й проводили реєстрацію петчкламп, як описано нижче. Дослідження нагромадження цАМФ Клітини IB3-1 висівали в PDL-покриті лунки 6-ямкових планшетів (від 2 до 2.5*105 клітин/лунку) у повне поживне середовище (LHC-8 + 5 % FCS). Наступного дня пул аденінових 3 нуклеотидів метаболічно позначили інкубацією з [ H]аденіном (1 (1мкCi/лунку) у середовищі Ігла, модифікованому за способом Дульбекко (DMEM), у присутності аденозиндезамінази (5 мкг/мл) протягом 4 годин. Потім середовище замінили свіжим DMEM і стимулювали утворення цАМФ додаванням 5 мкM форсколіну, прямого активатора аденілатциклази, або 10 мкM трепростинілу при відсутності або в присутності різних концентрацій наступних інгібіторів фосфодієстерази (PDE): ібудиласту (0,3 -1000 мкM), RO-20-1724 (0,03 - 300 мкM), рофлуміласту (1 нM -10 мкM), дипіридамолу (0,01 - 100 мкM), амринону (1, 10, 100 мкM), анагреліду (1, 10, 100 мкM), еноксимону (1, 10, 100 мкM), мілринону (1, 10, 100 мкM) і цилостазолу (від 0,1 до 100 мкM) протягом 20 хвилин при 37 °C. У деяких випадках дія цих інгібіторів на основне нагромадження цАМФ було перевірена шляхом інкубування клітин під час відсутності якого-небудь додаткового стимулу зі зростаючими концентраціями PDE-інгібіторів (тобто дипіридамолу, ібудиласту й RO20-1724 при 1, 10 і 100 мкМ; рофлуміласту при 0,1, 1 і 10 мкM рофлуміласту). Криві концентрація-відповідь для трепростинілу були отримані шляхом додавання трепростинілу (від 0,1 до 30 мкM) окремо або в комбінації з 100 мкМ RO-20-1724, 100 мкM ібудиласту або 5 мкM рофлуміласту. Реакцію повторювали три рази й зупиняли додаванням 2,5 % хлорної кислоти в 3 комбінації з 0,1 мM (неміченим) цАМФ. [ H]цАМФ виділяли за допомогою послідовної хроматографії на Dowex 50W-X4 і колонках з нейтральним окисом алюмінію. Утворення 3 [ H]цАМФ кількісно визначали за допомогою рідинного лічильника. Електрофізіологія - петч-кламп-реєстрація: Для реєстрації потоку використовували петч-кламп метод на цілій клітині, який проводили при 22±1,5 °C за допомогою петч-кламп-підсилювача Axociamp 200B (Axon Instruments). Піпетки мали опір між 1 і 2 МΩ при заповненні реєструючим розчином для піпеток (склад: 110 мM CsCI, 5 мM EGTA, 2 мM MgCI2, 1 мM K2.ATP, 10 мM Hepes, pH регулювали до значення 7,2 за допомогою CsOH). Протоколи напруга-вологість і реєстрацію даних здійснювали за допомогою програмного забезпечення pclamp 6.0 (Axon Instruments). Дані пропускали через фільтр нижніх частот при 2 кГц (-3 dB) і переводили в цифрову форму при 10-20 кГц. Клітини постійно обливали зовнішнім розчином (склад: 145 мM NaCl, 4.5 мM KCI, 2 мM CaCl2, 1 мM MgCI2, 5 мM глюкоза, 10 мM Hepes, pH регулювали до значення 7,4 за допомогою NaOH). Коли вказано, зовнішній розчин містив трепростиніл (10 мкM) або форсколін (5 мкM), перемикання між розчинами досягалося за допомогою клапана тиску з електронним керуванням. Нагромадження цАМФ у клітинах лінії IB3-1 при відсутності або в присутності інгібіторів фосфодієстерази: Вивчення PDE-ізоформ передбачає, що PDE-інгібітори повинні мати виражений ефект на нагромадження цАМФ у бронхіальних епітеліальних клітинах людини. Крім того, цей аналіз надав докази наявності додаткових ізоформ фосфодієстераз. Тому були протестовані PDE4 селективні інгібітори рофлуміласт і ібудиласт, і їхній ефект порівняли з деякими додатковими PDE-інгібіторами: RO 20-1724, неселективний PDE-інгібітор з PDE4-перевагою; дипіридамол, 12 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 який блокує рівноважно нуклеозидний транспортер-1 і -2 (ENT 1-і dENT2) і, крім того, інгібує PDE5, PDE7A, PDE8A, PDE10A і PDE11 (Soderling et al., 1998; Hetman et al., 2000a&b; Omori & Kotera, 2007). Амринон, мілринон і цилостазол, що є селективними інгібіторами PDE3-ізоформ; анагрелід, інгібуючий PDE2 і PDE3. Ібудиласт є менш селективним, ніж рофлуміласт, і також інгібує PDE10- і PDE11-ізоформи. Даний підхід фокусувався на регулюванні рівнів цАМФ; тому цГМФ-специфічні ферменти PDE5, PDE6 і PDE9 далі не розглядалися (Bender & Beavo, 2006; Omori & Kotera, 2007). Як правило, клітини експресують багато ізоформ аденілатциклази. У багатьох випадках рецептори, пов'язані з Gs, не мають доступу до всіх клітинних пулів аденілатциклази. На противагу цьому форсколін стимулює всі ізоформи аденілатциклази. При відсутності фосфодієстеразного інгібування цАМФ швидко зазнає гідролізу, так що він накопичується тільки до низьких рівнів при рівноважному стані. Інгібування фосфодієстерази приводить до нагромадження цАМФ. Рофлуміласт, ібудиласт, дипіридамол і RO20-1724 суттєво збільшують нагромадження цАМФ, ініційоване 5 мкM форсколіном. Рофлуміласт був найдужчим інгібітором, а дипіридамол був найслабшим інгібітором. Ібудиласт і RO20-1724 були більш ефективними, ніж рофлуміласт. Узяті в сукупності, ці дані наводять на думку, що PDE4-ізоформи у великому ступені сприяють гідролізу цАМФ. Якщо нагромадження цАМФ було ініційовано трепростинілом, концентраційні криві для всіх інгібіторів були зміщені вліво. Це зміщення ліворуч показує, що цАМФ, генерований через стимулювання рецептора є більш легко доступним для деградації фосфодієстеразами. Одним можливим поясненням є прикріплення (заякорювання) фосфодієстераз поблизу від рецепторів (Francis et al., 2011). Більш висока ефективність дипіридамолу також припускає можливе сприяння PDE8 або PDE10. Основна дія інгібіторів фосфодієстерази полягає в збільшенні нагромадження цАМФ: при Emax (тобто максимальний ефект збільшується) гадана спорідненість агоніста (тобто його EC50) не змінюється. При відсутності екзогенно доданого агоніста (або форсколіну) PDE-інгібітори як такі не викликають якого-небудь помітного збільшення нагромадження цАМФ. Цього можна було очікувати; вихідна активність аденілатциклази є дуже низькою, і потрібен вхід через рецепторзалежну активацію Gs, щоб каталізувати утворення цАМФ. Однак, при умовах культивування клітин - тобто в певному середовищі - будь-який агоніст не присутній. PDE-інгібування збільшує викликані трепростинілом Cl- потоки через CFTR: Тому що інгібування PDE4-ізоформ збільшує викликане трепростинілом нагромадження цАМФ, було передбачено, що цей вплив збільшить ефект трепростинілу на хлорні потоки через муковісцидозний трансмембранний регулятор провідності/Cl- канал (CFTR). У цьому випадку репростиніл викликав тривалу активацію CFTR; результуючий вихідний потік можна було виявити стрибком напруги від -20 до -80 мВ. Додавання рофлуміласту (і інших PDE4 інгібіторів, таких як ібудиласт і RO20-1724) викликало додаткове збільшення потоку. Потік проводився CFTR, тому що він зворотньо блокувався специфічним інгібітором. Висновок 1) Епітеліальні клітини дихальних шляхів людини експресують кілька рецепторів, на які можна впливати за допомогою трепростинілу, щоб підвищити цАМФ і в такий спосіб активувати CFTR в епітеліальних клітинах дихальних шляхів людини. 2) В епітеліальних клітинах дихальних шляхів людини присутні PDE4-ізоформи, при цьому PDE4-інгібітори ефективно збільшують відповідь на трепростиніл. Джерела інформації: Aronoff DM, Peres CM, Serezani CH, Ballinger WIN, Carstens JK, Colernan N, Moore. BB, Peebles RS, Faccioli LH, Peters-Golden M (2007) Synthetic prostacyclin analogs differentially regulate macrophage function via distinct analog-receptor binding specificities. J Immunol 178:16281634. Bender AT, Beavo JA (2006) Cyclic nucleotide phosphodiesterases: molecular regulation to clinical use. Pharmacol Rev 58:488 520. Francis SH, Blount MA, Corbin JD (2011) Mammalian cyclic nucieotide phosphodiesterases: molecular mechanisms and physiological functions. Physiol Rev 91:651-690. Hetman JM, Soderling SH, Glavas NA, Beavo JA. (2000a) Cloning and characterization of PDE7B, a camf-specific phosphodiesterase. Proc Natl Acad Sci USA 97: 472-476. Hetman JM, Robas N, Baxendale R, Fidock M, Phillips SC, Soderling SH, Beavo JA (2000b) Cloning and characterization of two splice variants of human phosphodiesterase 11A. Proc Natl Acad Sci USA97: 12891-12895. Houslay MD, Schafer P, Zhang KY (2005) Keynote review: phosphodiesterase-4 as a therapeutic target. Drug Discov Today 10:1503-1519 Omori K, Kotera J (2007) Overview of Pdes and their regulation. Circ. Res. 100:309-327. 13 UA 113161 C2 5 10 15 20 25 30 35 Nikam VS, Wecker G, Schermuly R, Rapp U, Szeiepusa K, Seegerw, Voswinckel R (2011) Treprostinil inhibits adhesion and differentiation of fibrocytes via camf and Rap dependent ERK inactivation. Am J Respir Ceil Mol Biol 45: 692-703. Soderling SH, Bayuga SJ, Beavo JA (1998) Cloning and characterization of a camp-specific cyclic nucleotide phosphodiesterase. Proc Natl Acad Sci U S A 95:8991-8996. Wright JM, Zeitlin PL, Cebotaru L, Guggino SE, Guggino WB (2004) Gene expression profile analysis of 4-phenyibutyrate treatment of IB3-1 bronchial epithelial cell line demonstrates a major influence on heat-shock proteins. Physiol Genomics16:204-211. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Застосування композиції, яка містить щонайменше один аналог простацикліну, вибраний з групи трепростинілу, ілопросту, цикапросту або берапросту або їх фармацевтично прийнятних солей, і щонайменше один інгібітор фосфодіестерази (PDE) 4, вибраний з групи RO 20-1724, ібудиласту, рофлуміласту і його N-оксиду, для запобігання або лікування муковісцидозу. 2. Застосування за п. 1, де зазначений аналог простацикліну вибирають із ізомерів трепростинілу. 3. Застосування за будь-яким із пп. 1-2, де композиція є фармацевтичною композицією. 4. Застосування за будь-яким із пп. 1-3, де композиція призначена для інгаляції. 5. Застосування за будь-яким із пп. 1-4, де композиція призначена для внутрішньовенного або підшкірного введення або у формі, доступній для перорального приймання, вибраної із групи форм із тривалим вивільненням, таблеток або капсул. 6. Застосування за будь-яким із пп. 1-5, де ефективна кількість трепростинілу або його фармацевтично прийнятної солі становить щонайменше 1,0 нг/кг ваги тіла. 7. Спосіб лікування муковісцидозу шляхом збільшення рівня цАМФ в клітинах епітелію дихальних шляхів людини, що включає контактування вказаних клітин щонайменше з одним аналогом простацикліну, вибраним з групи трепростинілу, ілопросту, цикапросту або берапросту або їх фармацевтично прийнятних солей, і щонайменше одним інгібітором фосфодіестерази (PDE) 4, вибраним з групи RO 20-1724, ібудиласту, рофлуміласту і його Nоксиду. 8. Застосування терапевтичної комбінації, яка містить щонайменше один аналог простацикліну, вибраний з групи трепростинілу, ілопросту, цикапросту або берапросту або їх фармацевтично прийнятних солей, й щонайменше один PDE4-інгібітор, вибраний з групи RO 20-1724, ібудиласту, рофлуміласту і його N-оксиду, і де вказаний аналог простацикліну й PDE4-інгібітор містяться в ефективних кількостях, для лікування муковісцидозу. 9. Застосування терапевтичної комбінації за п. 8, де аналог простацикліну, вибраний з групи трепростинілу, ілопросту, цикапросту або берапросту або їх фармацевтично прийнятних солей, й PDE4-інгібітор, вибраний з групи RO 20-1724, ібудиласту, рофлуміласту і його N-оксиду, уведені до складу, призначеного для введення за допомогою інгаляції. 14 UA 113161 C2 15 UA 113161 C2 16 UA 113161 C2 Комп’ютерна верстка Т. Вахричева Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 17