Вакцина, направлена проти інфекції, викликаної вірусом герпесу хвороби марека

1. Вакцина, направлена проти інфекції, викликаної вірусом герпесу хвороби Марека, яка відрізняється тим, що вказана вакцина включає щонайменше рекомбінантний реплікативний мінігеном вірусу хвороби Марека і послідовність вектора штучної бактеріальної хромосоми (ВАС), причому вказаний вектор дозволяє здійснювати рекомбінацію за відсутності хазяйської клітини. 2 (19) 1 3 84667 4 анемії курчат, вірусу грипу, вірусу інфекційного 14. Застосування геному за будь-яким з пп. 11-13 захворювання синовіальної сумки або реовірусу. для приготування вакцини, направленої проти 11. Рекомбінантний вірусний геном, одержаний з хвороби, викликаної інфекцією вірусом герпесу вірусу герпесу хвороби Марека, який по суті асоціхвороби Марека. йований з клітиною, який відрізняється тим, що 15. Вакцина, що включає рекомбінантний геном за вказаний геном включає послідовність вектора п. 11. штучної бактеріальної хромосоми (ВАС), що до16. Спосіб обмеження ризику набуття або повного зволяє проводити рекомбінацію за відсутності вкавияву у індивідуума інфекції, яка викликається заної хазяйської клітини. вірусом герпесу хвороби Марека, що включає вве12. Геном за п. 11, який включає щонайменше редення вказаному індивідууму вакцини за будь плікативний міні-геном. яким з пп. 1-10 або геному за будь-яким з пп. 1113. Геном за п. 11, який відрізняється тим, що 13. вказаний геном включає копію по суті повної дов17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що жини, одержану з вказаного вірусу герпесу. вказаний індивідуум являє собою птаха. Даний винахід відноситься до області вакцинації проти так званого асоційованого з хазяйською клітиною вірусу герпесу, що бере участь у таких захворюваннях, як вірусна хвороба Марека птахів (MDV) і вірус вітряної віспи людини (VZV, що викликає вітряну віспу та оперізувальний лишай після реактивації з латентного періоду), і до вакцинації проти захворювань, викликаних вказаними вірусами, у тому числі до хвороб птахів, зокрема, до області вакцинації проти хвороби Марека. Зокрема, хвороба Марека стала проблемою у птахівництві у зв'язку з початком інтенсивного виробництва пташиного м'яса. Вона є захворюванням, що викликається вірусом герпесу, яке супроводжується великою кількістю клінічних симптомів, що починаються з імуносупресії, неврологічних розладів, анемії та невизначеної апатії і закінчуються важкими захворюваннями лімфатичних судин на більш пізніх стадіях інфекції. Спочатку при захворюванні Марека не проводилося лікування і яких-небудь профілактичних заходів. Пізніше з індичок виділили вірус (HVT) апатогенного типу (серотип 3) і використали його для первинної вакцинації. Однак, через деякий час після проведення вакцинації з використанням HVT, хвороба Марека виникла знову і стало очевидним, що віруси, які циркулюють у середовищі, змінилися, обійшовши захисний механізм, індукований штамом HVT. У цей же час був виявлений новий апатогенний вірус (штам Rispens), який загалом має той же серотип, що і вір уси, які викликають захворювання. Вказаний вакцинний штам був дуже швидко виведений на фармацевтичний ринок і привів до дуже хороших результатів при вакцинації. Однак, приблизно через десять років знову був відмічений спалах захворювання, знову віруси, які циркулюють у середовищі, змінилися, обійшовши захисний механізм, що індукується вакцинним штамом, який використовувався у даний момент. Після цього для захисту тварин використовували комбінацію обох вакцин (HVT і Rispens), однак задовільні результати спостерігалися тільки тимчасово. У наш час, незважаючи на проведення всіх таких вакцинацій, спостерігається новий спалах захворювання. Причина вказаного спалаху досі незрозуміла, але цілком очевидна потреба у впровадженні нових потужних вакцин. Проблеми, пов'язані з вакцинацією проти хвороби Марека, полягають у тому, що незалежно від того факту, що вакцини Марека виготовляють протягом тривалого часу, спосіб одержання вказаних вакцин не вдається вдосконалити. Причиною цього є, головним чином, те, що практично нерозривно зв'язаний з хазяйською клітиною вірус може бути вирощений по суті тільки у клітинах первинного хазяїна, наприклад, у випадку MD V або HVT, у первинних клітинах, таких як фібробласти, що одержують з птахів, таких як курчата, вільні від патогену, або, у випадку вірусу вітряної віспи, у клітинах (по суті первинних) людини (також, зрозуміло, вільних від зараженості патогенами), і не можуть або тільки з великими труднощами можуть бути вирощені поза межами специфічної клітини відповідного хазяїна. Дана обставина робить виготовлення вакцин, направлених проти вірусних інфекцій або хвороб, викликаних вказаними типами вірусів, складним, якщо взагалі можливим у практичному плані, і, виходячи з цього, дорогим. Так наприклад, направлена проти хвороби Марека вакцина Rispens, яка у наш час вважається єдиною досить потужною, є, як і всі віруси Марека серотипу 1, строго зв'язаною з хазяйською клітиною. Інфекційність асоційованого з клітиною вірусу (як, наприклад, у випадку серотипів 1 і 2) повністю втрачається у ході нормального процесу заморожування або ліофілізації. У зв'язку з цим, приготування вказаної вакцини включає дуже складну і дорогу стадію, на якій цілі клітини повинні бути заморожені у рідкому азоті. При цьому вакцина повинна зберігатися і транспортуватися, а надалі і зберігатися, у рідкому азоті до моменту використання, що породжує величезні витрати і проблеми у процесі транспортування. Далі на місці використання при роботі з вказаною вакциною потрібно ретельно дотримуватися умов обережності, оскільки інфіковані клітини дуже чутливі до факторів навколишнього середовища. Фактори, такі як підвищена температура, вплив 5 84667 6 світла і наявність залишкових детергентів у скляку з високим ступенем природної асоційованості ному посуді, що використовується, часто здатні агента з клітинною культурою, потребує численних пошкодити вірус так, що не вдається приготувати циклів очищення вірусних рекомбінантів [Cantello досить життєздатну партію вакцини, що веде до et al., 1991; Sakaguchi et al., 1993; Parcells et al., повної нездатності вакцини виконувати свою фун1994; Schat et al., 1998; Anderson et al., 1998]. кцію. Причому, такий невдалий результат може Але насамперед, як вже відмічалося вище, вабути розпізнаний лише у тому випадку, коли закцинація не може гарантувати захист тварин від хворювання вже починає розповсюджуватися і всієї сукупності вірусів хвороби Марека. Вказаний уражені птахи демонструють симптоми захворювірус, як всі віруси герпесу, здатний знаходити вання. шляхи для обходу імунної реакції, індукованої вкаКоротко, потрібно зазначити, що, аж до даного заними вакцинами. У зв'язку з цим, була б необмоменту, всі спроби створити інактивовані, субхідна швидка адаптація вакцин до ситуації, що одиничні або рекомбінантні вакцини для захисту складається. У наш час з цією метою проводять від хвороби Марека були невдалі, і у зв'язку з цим виділення набору ізолятів (таких як HVT або у наш час навіть не розглядаються альтернативи Rispens) і/або їх подальше ослаблення in vitro. живим асоційованим з клітинами вакцинам, що Саме по собі виділення вже породжує величезні включають віруси хвороби Марека. З хворобою проблеми у зв'язку зі складністю одержання асоціМарека продовжують боротися шляхом застосуйованого з клітиною інфекційного вірусу поза курвання препаратів з інфікованими клітинами як вакчатами та інфікованими клітинами у клітинній цини. Вказані препарати не тільки містять живі культурі. Стадії ослаблення, які повинні слідувати клітини, суспендовані у середовищі, яке містить за цим, є дуже трудомісткими і тривалими, особДМСО, і велику кількість клітинних антигенів, вони, ливо через те, що є надзвичайно складним очикрім того, повинні зберігатися у рідкому азоті. Отщення бляшок, що знов-таки пов'язане з природже, на шляху від виготовлення вакцини до спожиною асоційованістю вірусу з клітиною. вача і аж до стадії застосування вакцини повинен Результат ослаблення звичайно не визначазабезпечуватися холодовий ланцюг. Крім того, ють. Внаслідок цього факту, вже протягом тривапісля відтавання вакцина повинна бути введена лого періоду часу на фармацевтичний ринок не протягом дуже короткого періоду часу кожному з поступали вакцини, які могли б забезпечити заміну птахів, які підлягають ін'єкції. Деякі з вказаних провакцинам HVT і Rispens, що є у наш час, там, де блем є спільними для випадку одержання вакцин останні не здійснюють потрібного ефекту. Крім проти інших, безпосередньо пов'язаних з клітинатого, часто спостерігається надмірне ослаблення ми вірусів герпесу, таких як вірус вітряної віспи. при виготовленні вакцини, оскільки вірус пасируВірус хвороби Марека (MDV) відноситься до ють дуже багато разів. Остання обставина додатпідсімейства Alphaherpesvirinae з сімейства ково погіршує низьку ефективність вакцин типу Herpesviridae [Lee et al, 2000, Murphy et al., 1995]. HVT і Rispens у польових умовах. Коротко, потрібНа основі вірулентності відносно курчат і здатності но зазначити, що наступні проблеми складають індукувати Т-клітинні лімфоми, MDV поділяють в значну частину безвихідного становища з контроосновному на три серотипи (MDV-1, MDV-2 і MDVлем MDV, яке існує у наш час. Це низька репроду3). Серотип MDV-3 представлений вірусом герпесу ктивність виготовлення класичної вакцини, іноді індичок (HVT), який широко використовується для надмірне ослаблення вакцинного вірусу, що сповакцинації проти захворювань, пов'язаних з MDV. стерігається, невизначене ослаблення вакцинного Однак невдалі результати вакцинації і вдосконавірусу, висока вартість виготовлення, висока варлення так званого вірулентного і дуже вірулентнотість зберігання і транспортування, висока чутлиго MD V-1 [Witter, 1985] привели до застосування у вість вакцини до факторів навколишнього середокомпозиціях для вакцинування ослаблених MD V-2 вища і дуже повільна розробка нових вакцинних штамів і пізніше ослаблених MD V-1 штамів [наприштамів, особливо для вірусів, асоційованих з кліклад, штаму CVI 988 Rispens]. В останні роки, притиною. чому перше повідомлення з'явилося у Сполучених На вказані проблеми накладається той факт, Штатах Америки, з'явилися навіть більш вірулентні що вір уси, які циркулюють у середовищі у наш час, MD V-1, так звані дуже вірулентні плюс (w+) варіанприводять до утворення високих титрів антитіл у ти MDV-1, і викликали різкий підйом рівня захвозапасах продуктів птахівництва, так що вказані рюваності хворобою Марека і смертності, обумоввисокі титри антитіл передаються по лінії потомстленої розвитком пухлини та імуносупресією на ва через материнські антитіла в яйцях. Вплив вкаранній стадії після інфекції [Witter, 1997]. Один з заних материнських антитіл у процесі первинної vv+ штамів, 584А, пасирували більше 100 разів на інфекції за допомогою вірусних вакцин, що викоембріональних фібробластах курчати (CEF) і покаристовуються у наш час, додатково знижує ефекзали втрату його патогенності по відношенню до тивність вакцинації проти хвороби Марека. курчат [Witter, 1997]. Однак, молекулярну основу Даний винахід пропонує вакцину, направлену вказаного зростання патогенності vv+ MD V-1 і, проти інфекції, викликаної вірусом герпесу, який по відповідно, втрати вірулентності дуже важко зросуті асоційований з хазяйською клітиною, причому зуміти, оскільки молекулярний аналіз MDV-1 склавказана вакцина включає рекомбінантний вірусний дний для проведення. З одного боку, потомство геном, одержаний з вказаного вірусу герпесу, при вірусу у клітинах, що культивуються, не вивільняцьому вказаний геном дозволяє здійснювати релося зовсім або вивільнялося тільки у невеликих комбінацію практично без наявності вказаної хакількостях, з іншого боку, утворення рекомбінантів зяйської клітини. У зв'язку з цим, даний винахід MD V-1 являє собою трудомісткий процес і, у зв'язвідноситься до рекомбінантного вірусного геному, 7 84667 8 одержаного з вірусу герпесу, який розглядається компетентного для реплікації міні-геному даний як по суті асоційований з хазяйською клітиною, винахід також пропонує можливість видалення причому вказаний геном переважно здатний, щоповного або основної частини US-регіону, за донайменше у деякій мірі, до реплікації у вказаній помогою чого міні-вірус, що одержують, реплікухазяйській клітині і у той же час дозволяє здійснюється також у хазяйських клітинах. вати рекомбінацію по суті за відсутності або незаВ іншому варіанті даний винахід пропонує талежно від вказаної хазяйської клітини, 1 тобто гокий геном, який включає по суті копію повної довмологічна рекомбінація в еукаріотичних клітинах жини, одержану з вказаного вірусу герпесу, при вже не є необхідною. У приведеному нижче доцьому термін «по суті повної довжини» вказує на кладному описі пропонується такий геном для вите, що велика частина генів вказаного вірусного падку вірусу, подібного вірусу, що викликає хворогеному присутня, за винятком деяких з них, які бу Марека. переважно (принаймні функціонально) відсутні, У зв'язку з зазначеним вище, як приклад генотаких як ген, необхідний для реплікації або пошиму вірусу хвороби Марека серотипу 1 (MDV-1), рення вірусу у хазяйській клітині або у культурі штам 584Ар80С був клонований в Escherichia coli, хазяйських клітин, що більш детально буде розяку використовують як штучну бактеріальну хроглянуто далі у даному описі. У зв'язку з цим, намосому (ВАС). Векторні послідовності ВАС вводиприклад, в одному з відновлених геномів відповідли у локус Us2 геному MDV-1 за допомогою гомоно до даного винаходу послідовності ВАС20, що логічної рекомбінації після спільної трансфекції кодують глікопротеїн В (gB), були піддані видаленембріональних фібробластів курчати (CEF) вірусню за допомогою одностадійного гесЕною ДНК і рекомбінантною плазмідою pDS-pHA1, опосередкованого мутагенезу з використанням яка включає ВАС-послідовності і ген Eco-gpt зафрагменту лінійної ДНК. Негативні по глікопротеїмість Us2-гeнa MDV-1 і послідовності, що фланкуну В MDV-1, відновлені після трансфекції gBють. Трансфіковане потомство пасирують на клінегативної ВАС20 ДНК (20DgB), були здатні рости тинах CEF у присутності мікофенолової кислоти і тільки на клітинах, що забезпечують gB in trans (у суміші ксантин/гіпоксантин. Після чотирьох циклів процесі трансфекції), вказуючи на те, що gB необвідбору одержують вірусну ДНК і використовують її хідний для росту MD V-1 у культурі хазяйських клідля трансформації Escherichia coli штам DH10B. тин. Інші гени, необхідні для росту, і для яких моІдентифікують декілька колоній, які несуть повний жуть бути передбачені клітини, які продукують геном MDV-1. Вказані ВАС, які несуть MDV-1, генний продукт in trans, являють собою gH, ІСР4, трансфікують у клітини CEF і, починаючи з третьоUL15, UL28 і UL9 або інші гени, що вважаються го дня після трансфекції інфекційність MDV-1 віднезамінними для росту, такі, як перераховані нижновлюється. Ріст MDV-1, відновлений за допомоче. гою різних ВАС, не відрізняється від росту Крім того, даний винахід відноситься до викобатьківського вірусу, на що вказують результати ристання геному відповідно до даного винаходу аналізу утворення бляшок та визначення кривих при одержанні вакцини, причому в одному з варіаросту. нтів втілення така вакцина направлена проти заТаким чином, даний винахід пропонує спосіб хворювання, викликаного інфікуванням вірусу гервиготовлення або одержання рекомбінантного песу, асоційованого по суті з хазяйською клітиною, геному вірусу герпесу, асоційованого по суті з хаоднак в іншому варіанті втілення винаходу така зяйською клітиною, що включає похідне (в залежвакцина може бути використана як векторна вакності від потреби майже повне або повне) нуклеїцина і може включати інші або додаткові патогени нової кислоти, одержаної з ізоляту MD V і/або VZV. або тяжі нуклеїнової кислоти, що кодують їх. У І оскільки по суті повний геном одержаний без випадку MDV нуклеїнова кислота переважного присутності хазяйських клітин, хоч спочатку ввадодаткового патогену включає нуклеїнову кислоту, жалося, що вони тісно асоційовані, то даний винаодержану, наприклад, з вірусу хвороби Ньюкастла, хід також пропонує геном відповідно до даного Eimeria spp., Salmonella spp, вірусу ін фекційної винаходу, який дозволяє здійснювати у повній мірі анемії курчат, вірусу грипу, вірусу інфекційного застосування всіх рекомбінантних методик, достузахворювання синовіальної сумки, реовірусу або пних фахівцеві у даній області молекулярної біоінших патогенів, що звичайно зустрічаються у пталогії, наприклад, пропонує також вакцину відповідхівництві. но до даного винаходу, яка принаймні включає Таким чином, даний винахід також відноситься (реплікативний) міні-геном. до вакцини, причому вказаний геном містить фунТак, наприклад, даний винахід пропонує мінікціональну делецію у гені, необхідному для реплігеном, який забезпечує тільки експресію тільки кації і/або для поширення вказаного вірусу герпесу зчеплених глікопротеїнів (таких як gB, gC, gD або у хазяйській клітині, або вказаний геном вірусу їх сполучень), і, наприклад, ІСР4 або інший генний включає по суті нуклеїнову кислоту, що кодує анпродукт, який, як було показано, індукує клітинний тигенну речовину, здатну до надання (переважно імунітет на вірус герпесу. Такий міні-геном, наприпо суті захисної) імунної відповіді проти інфекції клад, служить цілям ідентифікації генів, важливим індивідуума вказаним вірусом герпесу. Типовий для захисту, якщо вважати, що реплікація геному в необхідний ген або його фрагмент, який повинен (еукаріотичних) хазяйських клітинах більше не бути видалений, може являти собою, наприклад, у відбувається. Додавання, наприклад, промотору MD V гомолог UL-1 = глікопротеїн L; UL5; UL8; UL9; HCMV або SV40 перед кожним геном або генною UL15; UL18; UL19; UL22 = глікопротеїн Η; UL26; конструкцією могло б забезпечити остаточну іденUL26,5; UL27 = глікопротеїн В; UL28; UL29; UL30; тифікацію мінімальної захисної одиниці. У випадку 9 84667 10 UL52; UL53; ІСР4 або гени або їх фрагменти, вибВикористання реплікативних вірусних геномів рані з US-регіону вказаного геному (Фіг.1). у контексті даного опису, що містять частини цілоУ переважному варіанті втілення даний винаго та інфекційного геномів вірусу хвороби Марека хід відноситься до вакцини, що включає функціо(MD V-1), відкриває велику кількість нових можлинальну делецію у гені, необхідну для вияву маркевостей для одержання більш ефективних, біологірної імунної відповіді, специфічної для вказаного чно безпечних і стабільних вакцин MDV-1. У зв'язвірусу герпесу, яка дозволяє проводити імунологіку з тим фактом, що рекомбінантні MDV-1 чне розділення між результатом вакцинації індивівідновлюють з клонованої ДНК, вірусне потомство, дуума вказаною вакциною і результатом, що спояке одержують після трансфекції ДНК, може бути стерігається у індивідуума, інфікованого вказаним краще охарактеризовано і у зв'язку з цим може вірусом герпесу, асоційованим по суті з клітиною. бути реально позбавлене наслідків «надмірного Реакції переважного маркера направлені, наприослаблення» вакцинних вірусів. Наприклад, кільклад, на gC, gM, gD або gE, при цьому приведений кість повторів 132-bр, яка, очевидно, здається понижче докладний опис містить пояснення (у данов'язаною з ослабленням [Maotani et al., 1986], мому варіанті для випадку gM) відносно делеції у же бути точно визначена і, якщо необхідно, бути гені, необхідної для вияву маркерної імунної відзнижена або збільшена відповідно до потреби, що повіді. диктується вимогами виготовлення вакцини або Крім того, даний винахід відноситься до вакситуацією у польових умовах (див. нижче). Ствоцини, що розглядається у ньому, причому вказарення мутанту MD V-1 значно спрощується. Потріний вірусний геном включає щонайменше нуклеїбно нагадати, що мутанти MDV-1 одержують за нову кислоту, яка кодує протеїноподібну речовину, допомогою трудомісткого і тривалого процесу гоздатну до модуляції транскрипції і/або трансляції мологічної рекомбінації і процедур селекції в еукануклеїнової кислоти, що кодує антигенну речовину, ріотичних клітинах. Вказані процедури відбору, як здатну до вияву імунної відповіді проти інфекції відмічається для інших вір усів герпесу, часто приіндивідуума вказаним вірусом герпесу. водять до мутацій геному в інши х, відмінних від Переважно вказана вакцина включає копію по бажаних, сайтах, особливо оскільки у випадку суті повної довжини, одержану з вказаного вірусу MD V-1 не може бути одержаний безклітинний вагерпесу з метою підтримки такої кількості функцій, ріант вірусу, що робить процедури відбору, віднояка потрібна для ефективної модуляції транскрипвлення і розмноження мутантів ще більш ускладції і/або трансляції геному вакцини у хазяйській неними. І навпаки, даний винахід забезпечує клітині, яку вакцинують, однак винахід також відспосіб маніпуляцій з вірусним геномом на основі носиться до вакцинації з використанням мінімутагенезу з використанням гесЕ-, гесТ- і гecB/Cгеному. Безсумнівно, переважно здійснювати ефесупресування гена l gam, присутнього на плазміді ктивну модуляцію транскрипції і/або трансляції pGETrec (Narayanan et al., 1999). Перевагами вкануклеїнової кислоти, що кодує чужорідний патоген заної системи є: (і) те, що тільки гомологічні ділянабо одержану з нього антигенну речовину, коли ки довжиною від 30 до 50 bр потрібні для досягекспресується додатковий патоген або антигенна нення специфічної послідовності, яка підлягає речовина, одержана на його основі з вказаного видаленню, тобто видалення будь-якої відкритої геному, і можна також вважати, що чужорідні рерамки зчитування може бути досягнуте без необчовини (тобто, регуляторні елементи не з вірусу хідності клонувати рекомбінаційні касети, (іі) спосіб герпесу) забезпечені вказаним геномом, коли продуже швидкий і (ііі) те, що вектор pGETrec, який понується вакцина відповідно до даного винаходу, визначає здатність системи до мутагенезу і ексзабезпечена нуклеїновою кислотою, що кодує допресує стійкість до ампіциліну, швидко зникає з датковий патоген. бактеріальних клітин за відсутності ампіциліну. Зокрема, даний винахід надає вакцину відпоПри застосуванні потужних технологій, що вивідно до даного винаходу, в якій вказаний вірус користовують так звані процедури Е/Т клонування, герпесу включає вірус, подібний збуднику хвороби можливо здійснення одностадійної мутації та відМарека. Зокрема, переважно забезпечити наявбору в Escherichia coli [Mu yrers et al., 1999; ність вакцини, в якій вказаний вірус, подібний збуNarayanan et al., 1999; Zhang et al., 1998]. Така днику хвороби Марека, включає серотип 1. І крім методика дозволяє також проводити видалення того, оскільки методи маніпуляцій з геномом мообов'язкових генів MDV-1 без необхідності викорижуть здійснюватися поза хазяйською клітиною, з стання клітинних ліній, що доповнюють, оскільки якою геном спочатку був зв'язаний, то вакцину, що реплікація геномів MDV-1, які мутували, відповідно пропонується, замість того, щоб одержувати її з до даного винаходу не вимагає транснормально ослаблених або авірулентних ізолятів комплементарності у випадку видалення необхідвірусу, подібного збуднику хвороби Марека, одерного гена. Крім того, стають необов'язковими прожують з вірулентного, дуже вірулентного або дуже цедури клонування. вірулентного плюс польового вірусу, оскільки швиВ іншому варіанті даний винахід відноситься дке виділення інфекційних клонів з польових ізодо способу одержання MDV-1 або інших (по суті лятів тепер вже стало можливим, що дозволяє асоційованих з клітинами вірусів герпесу) вірусних одержати вакцинні ДНК для профілактики хвороби ВАС, що включає трансформацію, наприклад, кліМарека у курчат та індичок, коли мутації у геномі тин Escherichia coli DH10B плазмідою pΒΑDabg, можуть бути швидко застосовані для використанpGETrec або будь-якою іншою плазмідою, яка іння. Схожа система може також використовуватися дуцибельно або стабільно експресує ген rесЕ, rесТ для інших по суті асоційованих з клітиною вірусів і l gam, з подальшим одержанням кільцевої вірусгерпесу, таких як вірус вітряної віспи. ної ДНК з літично або латентно інфікованих клітин, 11 84667 12 взятих, наприклад, ех vivo, або з клітинних кульможе бути введена декількома способами (внуттур. Як паралельна або окрема процедура також рішньом'язово, внутрішньошкірно, всередину яйпропонуються лінійна ДНК, що несе послідовності цеклітини, перорально, респіраторним шляхом і ВАС-вектора і послідовності, які дозволяють здійст.п.) та у вигляді різних композицій (при наявності нювати гомологічну рекомбінацію послідовностей носія і без нього і т.д.). Крім того, наявність матеВАС-вектора з вірусною ДНК. Вказана лінійна ДНК ринських антитіл не перешкоджає первинній ін'єкможе бути, наприклад, одержана за допомогою ції імуногену. ПЛР або за допомогою лінеаризації плазмідної По суті, геноми MDV-1 відповідно до даного ДНК. Потім здійснюють експресію гена rесЕ, rесТ і опису вперше дають можливість виготовляти і конструювати високо ефективні і біологічно безпеl gam в Escherichia coli та одержують електрокомчні вакцини проти захворювань, які викликають петентні клітини [див., наприклад, Sambrook et al, пухлини, і є економічно значущими. Таким чином, 1989]. Вірусну ДНК потім піддають електропорації разом з лінійною ДНК, що несе послідовності ВАСданий винахід пропонує спосіб зниження ризику індивідуума відносно набуття або повного вияву вектора, у компетентні клітини Escherichia coli. захворювання, що викликається інфекцією вірусом Потім для одержання колонії або колоній їх помігерпесу, по суті асоційованого з хазяйською клітищають на агарові пластинки, які містять відповідні ною, який включає введення вказаному індивідууантибіотики, і ВАС-ДНК може бути одержана як описано, наприклад, у процедурі, приведеній у му вакцини відповідно до даного винаходу або геному відповідно до даного винаходу. розділі докладного опису даного винаходу. ІнфекДокладний опис: ційність клонованої вірусної ВАС-ДНК контролюВірус хвороби Марека (MDV) є представником ють за допомогою трансфекції чутливих клітин. підсімейства Alphaherpesvirinae сімейства Даний винахід, таким чином, пропонує спосіб генетичної рекомбінації геному вірусу герпесу, асоціHerpesviridae (van Regenmortel et al, 1999). На основі вірулентності відносно курчат, здатності індуйованого по суті з хазяйською клітиною, який одекувати Т-клітинні лімфоми та антигенних властиржують з хазяйської клітини або тканини без востей, MD V поділяються на три серотипи (MDV-1, необхідності проводити (гомологічну) рекомбінаMD V-2 і MDV-3) (Payne, 1985). Серотип MDV-3 цію в еукаріотичних клітинах, що дозволяє одержувати (при необхідності повний або майже попредставлений вірусом герпесу, що уражує індичок (HVT), який широко використовувався для ваквний) інфекційний геном або нуклеїнову кислоту цинації проти захворювань, пов'язаних з MDV. вірусу герпесу з польових ізолятів або аналогічних Відповідно до сучасної номенклатури, MD V-1 клаослаблених ізолятів. сифікують як вірус герпесу 2 gallid (GHV-2), MD V-2 Спосіб відповідно до даного винаходу дозволяє також додатково ослаблювати передбачувану як GHV-3 і HVT як вірус герпесу meleagrid. Всі три віруси належать до нового роду вірусів, подібних для використання вакцину MDV-1 або одержувати вірусу хвороби Марека, всередині підсімейства мутанти MDV-1, що несуть гени інших важливих Alphaherpesvirinae. для курчат патогенів. Крім того, ізоляти MDV-1, які Контроль над інфекцією, пов'язаною з MDV-1, виникають у польових умовах, і несуть, можливо, інші та змінені антигенні властивості, можуть бути досягається вакцинацією переважно HVT, однак після невдач з вакцинацією і опису так званогозупинені за допомогою вакцини, побудованої на «дуже вірулентного» MDV-1 (Witter, 1989) у компооснові обміну відповідних генів, які мутували, між зиціях для вакцинації стали застосовувати штами клонованими MDV-1 та ізолятом(ами), що виMD V-2 і, пізніше, ослаблені штами MDV-1 (наприник(ли) у польових умовах. Такі заміни, як вказано вище, можуть бути проведені за допомогою подібклад, штам CVI 988 Rispens) (Witter, 1985). В останні роки, причому перше повідомлення ної методики Е/Т клонування, і як такі вони забезпро це з'явилося у Сполучених Штатах Америки, печують можливість дуже швидко реагувати на з'явився ще більш вірулентний MDV-1, так званий зміни MDV-1 у польових умовах. Привабливою «дуже вірулентний плюс» (vv+) варіант MDV-1, і особливістю відновлення інфекційних MDV-1 відповідно до даного опису є, однак, використання викликав різкий підйом смертності навіть серед вакцинованих груп пта хів (Witter, 1997). Один з геному, що розглядається у ньому, як ДНК вакцивказаних vv+ штамів, 584А, був серійно пасировани. Аж до цього часу боротьба з хворобою Марека ний на ембріональних фібробластах к урчати проводилася шляхом застосування препаратів з (CEF), після чого він втрачав патогенність по відінфікованими клітинами. Такі препарати не тільки містять живі клітини, ношенню до курчат (Witter, 1997). Молекулярна основа вказаної збільшеної патогенності vv+ MDVсуспендовані у середовищі, що містить ДМСО, і 1 і, відповідно, втрати вірулентності дуже важко великий набір клітинних антигенів, вони також позрозуміти, оскільки молекулярний аналіз MDV-1 винні зберігатися у рідкому азоті. Отже, на всьому дуже складений для проведення. шляху від стадії вигото влення вакцини до надходження її до користувача і аж до введення повиЗ одного боку, ніякого потомства вірусу не вивільнялося у клітинах, що культивуються, з іншого нен постійно підтримуватися холодовий ланцюг. боку, одержання рекомбінантів MDV-1 являє соКрім того, після відтавання вакцина повинна бути бою трудомісткий процес і, у зв'язку з високим стувведена протягом дуже короткого періоду часу, пенем природної асоційованості агента з клітинпричому ін'єкована кожному птаху. У випадку ДНК геному MDV-1 відповідно до даного опису, очиною культурою in vitro, існує необхідність у численних циклах очищення вірусних рекомбінанщення «вакцини» (ДНК) легко досяжне і відтворютів [Cantello et al., 1991; Sakaguchi et al., 1993; ване. ДНК надзвичайно стабільна, підтримка хоParcells et al., 1994, 1995; Schat et al., 1998; лодового ланцюга не потрібна і інфекційна ДНК 13 84667 14 Anderson et al., 1998]. Крім того, для росту MD V-1 раннього промотору людського цитомегаловірусу. необхідно використовувати первинні клітини Клітини QM7, які містять pcMgB, виділяють у при(Payne), а це приводить до того, що аналіз основсутності 1мг/мл G418, і клони, що експресують gB, них генів MDV-1 практично неможливий, оскільки ідентифікують з використанням анти-gB моноклоне можуть бути одержані транс-комплементарні нальних антитіл (mab) 2K11 (люб'язно наданих клітинні лінії. лікарем Jean-Francois Vautherot, INRA, Tours, З використанням вказаної методики були клоФранція). Одержана при цьому клітинна лінія, що новані у вигляді інфекційних ВАС геноми мишачих експресує gB MD V-1, була позначена як MgB1. і людських цитомегаловірусів [MC MV і HCMV; Конструювання MDV-1 ВАС. ДНК MD V-1 очиMesserle et al., 1997; Borst et al., 1999], віруси прощають з інфікованих клітин за допомогою екстракстого герпесу типу 1 [HSV-1; Suter et al., 1998], ції сумішшю додецилсульфат натрію-протеїназа К, вірус помилкового сказу [PrV; Smith et al., 1999, як було описано раніше (Morgan et al., 1990). Пла2000], і вірус Епштейна-Барра [EBV; Delecluse et зміду pDS-pHAl конструюють наступним чином. al., 1998]. Фрагменти розміром 2,1 і 3,1тис. п.н. на будь-якій Мета даного дослідження полягала у створенстороні US2-гена MDV-1 (Фіг.1) ампліфікують у ні основи для швидкого і ефективного одержання ході полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) з викорекомбінантів MDV-1 за допомогою клонування ристанням стандартних праймерів, що містять повного геному розміром 180тис. п.н. в Escherichia відповідні сайти для ферментів рестрикції (таблиcoli. Інфекційний MDV-1 легко відновлювали після ця 1), і обидва фрагменти клонують в pTZ18R трансфекції клонованої ДНК MDV-1 ВАС з викори(Pharmacia-Amersham). ВАС-вектор, що містить станням клітин CEF, при цьому MDV-1 ВАС залиген Eco-gpt під контролем раннього промотору шалися стабільними після декількох циклів росту HCMV, вивільняють з плазміди рНА1 [люб'язно бактерій або серії розмножень у клітинах CEF. наданої лікарем M.Messerle, LMU Munich, НімечІ, нарешті, у зв'язку з тим, що одностадійна чина; Messerle et al., 1997] і вставляють у сайти делеція необхідного гена в Escherichia coli стала РасІ, представлені у двох фрагментах розміром можливою,вказана система володіє великим по2,1 і 3,1 тис. п.н., які присутні у плазміді pDS тенціалом з точки зору полегшення подальшого (Фіг.1). аналізу обов'язкових і необов'язкових генів MD V-1 Первинні клітини CEF піддають спільній і може служити як інструмент для одержання мотрансфекції 2мкг ДНК 584Ар80С і 10мкг pDS-pHA1. дифікованих біологічно безпечних вакцин на осноНа 5 день після трансфекції клітини нашаровують ві живих вірусів і/або ДНК. на первинні клітини CEF у присутності 250мкг/мл Матеріали і методи: мікофенолової кислоти (МФК), 50мкг/мл ксантину і Віруси і клітини. Первинні або вторинні ембрі100мкг/мл гіпоксантину. Відбір з використанням ональні фібробласти курчати (CEF) або м'язові суміші МФА/ксантин/гіпоксантин повторюють загаклітини перепелиці (QM7) підтримували на модилом чотири рази. Після розвитку повного цитопафікованому за Дульбекко основному середовищі тичного ефекту (цпе) внаслідок чотирьох циклів (DMEM), збагаченому 5-10% фетальною сироватселекції, з інфікованих клітин одержують вірусну кою теляти (FCS). Штам MDV-1 584Ар80С був люДНК і 1мкг клітини ДНК, що інфікує, вводять метоб'язно наданий лікарем Ріхардом Віттером [Dr. дом електропорації у клітини Escherichia coli Richard Witter, ADOL, East Lansing, Michigan, СШАї. DH10B. Колонії реєструють через 16 годин після Штам 584Ap80C являє собою пасированого на трансфекції на чашках з агаром, що містять культурі клітин авірулентного потомка vv+ штаму 5 30мкг/мл хлорамфеніколу (Sarabrook et al., 1989). 84A (Witter, 1997) і вирощується на первинних і Окремі колонії відбирають і потім виділяють ВАСвторинних клітинах CEF, як було описано раніше ДНК з Escherichia coli з використанням стандартної (Osterrieder, 1999). Клітини QM7 тестували на відпроцедури лужного лізису (Sainbrook et al., 1989). сутність послідовностей MDV-1 за допомогою меОдержання ВАС-ДНК у великих масштабах провотоду ПЛР і Саузерн-блот гібридизацією, направледять методом афінної хроматографії на основі ною на різні ділянки геному перед використанням силікагелю з використанням комерційно доступних їх для розмноження MDV-1 (Zelnik and Osterrieder, наборів (Qiagen, Macherey & Nagel). Для подальнеопубліковані дані). Криві росту вірусу були побушого аналізу були відібрані три ВАС-клони довані за описаною раніше методикою з невели584Ар80С MDV-1 (ВАС 19, ВАС20, ВАС24). кими модифікаціями (Parcells et al., 1994). В осноМутагенез ВАС MD V-1. Для мутагенезу клоновних рисах процедура полягає у тому, що 100 ваної ДНК MDV-1 в Escherichia coli проводять реаодиниць, що утворюють бляшки, (ОУБ) використокції, що каталізуються rесЕ, які прискорюють гомовують для інфікування 2x106 свіжопосіяних клітин логічну рекомбінацію між лінійними фрагментами CEF. У різні моменти часу після інфікування (0, 12, ДНК, що одержали назву Е/Т-клонування [Zhang et 24, 48, 72, 96, 120 годин) інфіковані клітини обробal., 1998; Narayanan et al., 1999]. Плазміду pGETrec ляють трипсином і титрують на свіжих клітинах (люб'язно надану лікарем Panos Ioannou, Murdoch CEF. Визначають кількість бляшок і результати Institute, Melbourne, Австралія), яка несе recE, recT виражають у вигляді середнього значення з двох і gam-ген бактеріофагу 1, трансформують у клітинезалежних експериментів. ни DH10B, що містять ВАС20 (Narayanan et al., Клітинна лінія QM7, яка стійко експресує gB 1999). Після індукції recE, recT і gam за допомогою MD V-1, була одержана шляхом трансфекції 1x106 додавання 0,2% арабінози одержують електрококлітин QM7 з використанням 10мкг pcMgB (Фіг.1), мпетентні клітини, по суті так, як було описано що базується на рсДНК3 (Invitrogen) і містить gBNarayanan. Для видалення gB-гена у ВАС20 за ген MDV-1 з штаму Rispens CV1988, під контролем допомогою методу ПЛР ампліфікують ген стійкості 15 84667 16 до канаміцину (kanR) у плазміді pEGFP-Nl клітин Escherichia coli DH10B. Трансформовані (Clontech). Підготовані праймери містять гомологібактерії поміщають на чашки з агаром, що містять чні плечі по 50 нуклеотидів, що обмежують бажану 30мкг/мл хлорамфеніколу і відбирають одиничні делецію всередині gB і 20 нуклеотидів для ампліколонії. ДНК з бактеріальних колоній екстрагують з фікації kanR (таблиця 1). Одержаний фрагмент використанням стандартних процедур одержання розміром 1,6тис. п.н. очищають на агарозному гелі плазмід [Sambrook et al., 1989] і розганяють в 0,8% (Qiagen) і вводять методом електропорації у клітиагарозних гелях. ни з ВАС20, що містить pGETrec. Колонії, які неБуло встановлено, що декілька бактеріальних суть гени cam R і kanR, ідентифікують на чашках, колоній містять високомолекулярну позахромосощо містять обидва антибіотики [Narayanan et al., мну ДНК, і три з вказаних клонів (ВАС 19, ВАС20 і 1999]. ВАС24) були відібрані для подальшого аналізу Аналіз ДНК. ДНК ВАС або вірусн у ДНК (Фіг.2). Для подальшої характеристики виділених 584Ар80С розщеплюють за допомогою EcoRI, ВАС-клонів проводять Саузерн-блот аналізи ДНК BamHI, Bg1H або StuI і розділяють у 0,8% агароз584Ар80С і ВАС після розщеплення за допомогою них гелях. Фрагменти ДНК переносять на позитивВаmНІ або EcoRI, використовуючи як зонд мічену но заряджені нейлонові мембрани (PharmaciaВАС 19 ДНК. Можна було показати, що ДНК з ι Amersham) і проводять Саузерн-блот гібридизацію ВАС 19, ВАС20 і ВАС24 утворюють практично ідез використанням міченої дигоксигеніном ВАС 19 нтичні фрагменти при розщепленні рестриктазами ДНК або індивідуальних BamHI фрагментів MD V-1 у порівнянні з такими, що утворюються при розщештаму GA [Fukuchi et al., 1991; Osterrieder, 1999]. пленні батьківської 584Ар80С (Фіг.3А і В). Однак, Додатково готують gB-специфічний зонд з виразно відмічають два істотних виключення. Фраплазміди pcgB і зонд, який несе ген kanR, для анагмент ВаmНІ-А розміром 20тис. п.н., що присутній лізу gB-негативної ВАС MD V-1. Хемілюмінісцентне у ДНК 584Ар80С, відсутній у всі х проаналізованих виявлення гібридів ДНК з використанням СSPD™ ВАС-клонах. Замість цього, у ДНК ВАС 19, ВАС20 і проводять відповідно до інструкції виробника ВАС24 виявлені фрагменти розміром 16 і 10тис. (Roche Biochemicals). п.н. (Фіг.3В). Вказані дві смуги відповідають збільНепряма імунофлуоресценція. Для проведеншеному фрагменту ВаmНІ-А, в який за допомогою ня аналізів методом непрямої імунофлуоресценції вставки плазміди F і делеції послідовностей Us2 (НІФ) клітини вирощують на 6- або 24-ямкових був введений додатковий сайт BamHI (Фіг.1). планшетах (Greiner) або на накривних скельцях і У ВАС ДНК, розщепленій EcoRI, виявляється потім інфікують у потрібних варіантах. Клітини фікодна додаткова смуга розміром 5,8тис. п.н. (ВАС сують 90% ацетоном у різні моменти часу після послідовності) та невеликі зміни у розмірах фрагінфікування або трансфекції і проводять аналіз ментів, викликані делецією гена US2 (Фіг.1 і 3В). методом НІФ точно відповідно до описаної метоПравильність вставки ВАС послідовностей у різні дики [Meindl and Osterrieder, 1999]. Зразки аналіклони далі перевірялася у ході аналізу методом зують за допомогою флуоресцентної мікроскопії Саузерн-блот гібридизації з використанням мічеабо конфокальної лазерної мікроскопії, що сканує них вставок плазміди pDS або рНА1 як зонду, при (CLSM). цьому спостерігалася очікувана картина реакції Антитіла, що використовуються, являють совідносно ДНК, розщепленої за допомогою ВаmНІ бою анти-gB моноклональні антитіла 2K11, антиабо EcoRI. У ВАС ДНК фрагменти, одержані після рр38 моноклональні антитіла Н19 (люб'язно надані розщеплених ВаmНІ, розміром 16 і 10тис. п.н. спелікарем Lucy Lee, ADOL, East Lansing, MI) або концифічно реагують з pDS зондом, тоді як тільки валесцентну сироватку з курчат, інфікованих MDVодин фрагмент розміром 10тис. п.н. реагує із зон1 (MDSI). дом, одержаним з плазміди рНА1 (Фіг.1; Фіг.3С і Результати: D). Конструювання і аналіз ВАС, що містять повні У ДНК з ВАС 19, ВАС20 або ВАС24, розщепгеноми MDV-1. Один мільйон первинних клітин лених за допомогою EcoRI, фрагменти розміром CEF інфікують з використанням 1x104 ОУБ штаму 4,3, 2,8 і 1,7тис. п.н. специфічно реагують з pDS MD V-1, тобто інфіковані клітини змішують з неінфізондом, тоді як фрагменти розміром 5,8 і 1,7тис. кованими клітинами. Після досягнення повного п.н., специфічно гібридизуються з рНАІ зондом цитопатичного ефекту виділяють ДНК з інфікова(Фіг.1, Фіг.3С і D). Вказані фрагменти точно відпоних клітин і 2мкг вірусної ДНК трансфікують в відають тим структурам, які прогнозувалися як 1x106 первинних клітин CEF разом з 10мкг pDSрезультат вставки послідовностей рНА1 (Фіг.1), на рНА1 плазмідою ДНК. Через п'ять днів після основі чого був зроблений висновок про те, що трансфекції клітини висівають разом зі свіжими послідовності плазміди F були правильно вставCEF і нашаровують зверху селективне поживне лені замість ОРС Us2 у всі проаналізовані ВАС середовище. MD V-1. Крім того, деякі варіації у характері розтаВказану процедуру повторюють загалом чотишування смуг у зразках ВАС 19, ВАС20 і ВАС24 ри рази. У результаті, виділяють ДНК з рекомбінабули відмічені у ДНК, розщепленій як ВаmНІ, так і нтних MDV-1, які здатні рости у присутності суміші EcoRI, наприклад, відмічається додаткова смуга МФА/ксантин/гіпоксантин, і піддають її Саузернрозміром приблизно 6,2тис. п.н. у ВАС 19 ДНК, блот аналізу з використанням міченої рНА.1 як розщепленій ВаmНІ, або додаткові смуги у ДНК з зонду. Можна показати, що частина вір усної ДНК ВАС20 і ВАС24, розщеплених EcoRI (Фіг.2, 3А і В). містить вставлені у неї послідовності плазміди F Що стосується питання про варіації, які спостері(дані не приведені). Використовують один мікрогалися, у розмірах індивідуальних фрагментів, грам вказаної вірусної ДНК для трансформації одержаних під дією рестриктаз, то гібридизація з 17 84667 18 міченим фрагментом BamHI-D мала місце, оскільпісля трансфекції ВАС19 і ВАС20, пасирують чоки варіації у розмірі кінцевих і внутрішніх повторів тири рази і виділяють вірусну ДНК. Далі вір усну унікального довгого регіону (TRL і IRL) були спільДНК розщеплюють за допомогою ВаmНІ або ними. EcoRI, розділяють електрофорезом у 0,8% агарозМетодом Саузерн-блотингу було показано, що ному гелі та переносять на нейлонові мембрани. додаткові фрагменти, які спостерігаються у розДалі проводять гібридизацію з використанням pDS щеплених як ВаmНІ, так і EcoRI ДНК з ВАС 19, або рНА1 зонду. Спостерігали фрагменти ДНК, ВАС20 або ВАС24, дійсно були результатом варіаналогічні описаним раніше, і характер розподілу ацій у TRL і IRL. В той час, як у вірусній ДНК смуг, що аналізується з використанням двох проб, 584Ар80С, розщепленій за допомогою ВаmНІ, вине змінювався при серійних пасажах трансфіковаявлялися дві широкі смуги зонду BamHI-D, розміри ного потомства (Фіг.6). На основі вказаних резульяких варіювали у межах приблизно від 9 до 15тис, татів автори зробили висновок про те, що послідоп.н. і від 4 до 8тис. п.н. (що відповідає BamHI-D і -Н вності, одержані з плазміди F, залишаються фрагментам вірулентного MDV-1, відповідно; стабільно вставленими у геноми 584Ар80С, відноФіг.1), виразні, але відмінні смуги спостерігалися у влені з індивідуальних ВАС-клонів MDV-1, навіть всіх проаналізованих ВАС-клонах (Фіг.4). Усі інші після серійного пасирування у клітинах CEF. фрагменти різних ВАС-клонів, одержані під дією Однак, як показали гібридизація з фрагментом рестриктаз, були, скоріш за все, ідентичними таBamHI-D і ПЛР аналіз, варіабельність послідовноким з вірусної ДНК 584Ар80С. Вказаний факт був стей, що повторюються, розміром 132п.н. зберігапідтверджений з використанням декількох інших ється і дифузний мазок реактивних смуг спостерімічених фрагментів ВаmНІ як зондів, включаючи гається у розщеплених ВаmНІ або EcoRI ДНК ВаmНІ-А, -В, -С -І 2 фрагменти (дані для зонду трансфікованого потомства вже після першого ВаmНІ-С як приклад приведені на Фіг.4). пасирування вірусу (дані не приведені). Відновлення інфекційних MDV-1 з клонованої Мутагенез ВАС20 і делеція послідовностей, ДНК. ДНК з ВАС 19, ВАС20 або ВАС24 трансфікущо кодують gB. У наступних експериментах був ють у первинні CEF. На 3-7 день після трансфекції використаний розроблений останнім часом метод з'являються специфічні вірусні бляшки MDV-1, як мутагенезу для видалення ділянки розміром показав аналіз методом НІФ з використанням ан2,3тис. п.н. з gB-гена ВАС20 розміром 2,8тис. п.н. ти-MD V-l-gB моноклональних антитіл. MD V-1, що (Фіг.7). Після трансформації плазміди pGETrec залишився після трансфекції різними ВАС, був (Narayanan) у ВАС20, що містить DH10B, rен kanR потім висіяний разом зі свіжими клітинами CEF і ампліфікують з використанням праймерів, які дорозміри бляшок були порівняні з розмірами таких, зволяли здійснити гомологічну рекомбінацію з gBіндукованих батьківським варіантом 584Ар80С. Як послідовностями MDV-1 (таблиця 1; Фіг.8), і ввоприклад показані бляшки, забарвлені на 2 день дять електропорацією у клітини BAC20-pGETrec. після інфікування (п.і.), при цьому ніяких помітних Бактерії поміщають на чашки з LB-агаром, що місвідмінностей у розмірах бляшок між рекомбінанттить хлорамфенікол і канаміцин; та відбирають ним і батьківським вірусом не виявляється колонії з подвійною стійкістю. Після виділення ДНК (Фіг.5А). з окремих колоній проводять Саузерн-блот аналіз Для подальшої характеристики біологічних рекомбінантної ВАС20, що несе делецію у gB-гені властивостей MD V-1, відновлених після трансфе(20DgB). Зонди, специфічні відносно kanR і gB, кції ВАС, порівнюють кінетику росту вказаних вірувиявляють фрагменти 20DgB після її розщеплення сів з батьківським варіантом 584Ар80С. У випадку з використанням BamHI, EcoRI, BgHI або StuI, що ВАС, вір ус, відновлений на 5 день після трансфекповністю відповідає результатам, розрахованим ції, використовують для інфікування свіжих клітин на випадок включення гена стійкості до канаміцину CEF, висіяних на 6-ямкові планшети (використо(kanR) у послідовності, що кодують gB (Фіг.9). Було вують 50 ОУБ вірусу для інфікування однієї комірвідмічено, як повідомлялося раніше, що pGETrec, ки, що містить 1x106 клітин). Аналогічно, 50 ОУБ яка додає стійкості до ампіциліну, легко втрача584Ар80С використовують для інфікування свіжих ється клітинами Escherichia coli, що ростуть за клітин CEF тим же способом. У різні часові точки відсутності антибіотика (Фіг.9). Виходячи з вказапісля інфікування вірус збирають і титрують за них результатів, автори зробили висновок про те, допомогою спільного посіву 10-кратних розведень що відкрита рамка для зчитування gB була праквірусу зі свіжими клітинами CEF. Результати вкатично повністю видалена з 20DgB. заних експериментів узагальнені на Фіг.5В. Аналіз gB-негативних MDV-1, відновлених з Можна показати, що усі протестовані ВАС 20DgB. Оскільки gB обов'язковий для росту всіх MD V-1 демонструють ростові характеристики, вірусів герпесу, проаналізованих до цього часу практично ідентичні таким для батьківського варі(розглянуті в огляді Регеіга), була створена клітинанту 584Ар80С (Фіг.5В). Максимальні титри досяна лінія QM7, яка експресувала gB MD V-1 під конгалися до 72 годин після інфікування і залишалися тролем дуже раннього промотору HCMV. Непряфактично постійними до закінчення періоду спомий імунофлуоресцентний аналіз показав, що стереження, через 120 годин після інфікування. На фактично кожна клітина клітинної лінії MgBl коноснові даних по розмірах бляшок і ростових харакститутивно експресує gB MDV-1, що було також теристиках, автори зробили висновок про те, що продемонстровано з використанням моноклональбіологічні властивості MD V-1 in vitro практично не них антитіл 2K11 або конвалесцентної сироватки відрізняються від таких батьківського штаму. курчати (MDSI) (Фіг.10). Для аналізу нарощування Для того, щоб підтвердити стабільність вірусів, ВАС20 і 20DgB у різних клітинних лініях одержуодержаних на основі ВАС, потомство, одержане ють ДНК і потім використовують її для трансфекції 19 84667 20 клітин CEF, QM7 або MgBl. На 3-5 день після них пасажів на клітинах, що культивують (Maotani, трансфекції вірусні бляшки відмічалися у всіх кліSilva, Fukuchi). Крім того, число тандемних повтотинах, трансфікованих ВАС20 (Фіг.10). рів ділянки 132 п.н. асоціюється з втратою онкоОднак, після трансфекції 20DgB ДНК бляшки генності, оскільки у вірулентних штамах відмічаспостерігаються тільки у клітинах MgBl, що ексється постійне число вказаних одиниць [Fukuchi et пресують gB (Фіг.11). У клітинах CEF і QM7, al., 1985; Bradley et al., 1989], хоча нещодавне дотрансфікованих 20DgB, лише одиничні клітини слідження на широко використовуваному вакцинекспресують ранній ген рр38, як було показано на ному штамі Rispens CVI 988 вказує на те, що може основі їх здатності реагувати з моноклональними існувати непряма кореляція невеликого числа поантитілами НІ 9 (Lee et al.), але формування блявторів ділянки 132 п.н. і вірулентності. У випадку шок інгібується (Фіг.11). Вказані результати відноMD V-1 штам 584Ар80С гібридизація вірусної ДНК сно необхідності gB для поширення MDV-1 з клітипісля її обробки рестриктазою з фрагментом ни у клітину in vitro підтверджуються при спільному BamHI-D приводить до появи картини з дифузним посіві клітин MDV-1, інфікованих 20DgB, і клітин розподілом смуг, яка вказує на наявність числа CEF, QM7 або свіжих клітин MgBl. Було показано, повторів, що варіює, у популяції вірусу. І, навпаки, що після первинної трансфекції утворення бляшок тільки прості дуже реакційноздатні смуги були ідеспостерігається тільки після спільного посіву з клінтифіковані у кожному з ВАС-клонів з тим же зонтинами, що експресують gB (таблиця 2). Виходячи дом. Однак розміри реакційноздатних смуг після з вказаних результатів, автори зробили висновок розщеплення за допомогою ВаmНІ або EcoRI вапро те, що gB MDV-1 обов'язково потрібен для ріюють серед ВАС19, ВАС20 і ВАС24, вказуючи на поширення MDV-1 з клітини у клітину в клітинах, те, що були клоновані геноми, які містять різне що культивуються. число повторів ділянки 132 п.н. Вказане пояснення Незважаючи на те, що вірус хвороби Марека було підтверджене результатами аналізу методом являє собою важливий патоген курчат, що виклиПЛР, націленого на повтори ділянки 132 п.н. Тоді кає Т-клітинні пухлини і високу смертність інфікояк при використанні ДНК 584Ар80С спостерігалася ваних тварин, мало відомо про функцію окремих типова, подібна східцям сходів картина розподілу генів і генних продуктів у літичній, латентній або продуктів ПЛР (Becker et al., 1993), у випадку пухлинній фазі інфекції. Аналіз генів і генних проВАС19, ВАС20 або ВАС24 з клонованої вірусної дуктів MD V-1 надто ускладнений з двох основних ДНК були ампліфіковані чіткі смуги. причин. По-перше, клітини, що культивуються, У зв'язку з зазначеним вище був зроблений інфіковані MDV-1, не продукують вільний вірус, що висновок про те, що зміни у картині, яку одержуінфікує, а по-друге, е фективний ріст MDV-1 у кліють після обробки рестриктазами різних ВАСтинах, що культивуються, обмежується первинниклонів, є результатом різної кількості тандемних ми або вторинними ембріональними фібробласповторів ділянки 132 п.н. в окремих клонах, які не тами курчати. впливають на інфекційність клонованої ДНК, оскіУ зв'язку з цим, мутагенез з використанням льки інфекційний вірус відновлюється після традиційної гомологічної рекомбінації, що застосотрансфекції ДНК, виділеної з кожного з різних вується для мутагенезу інших Alphaherpesvirinae, є ВАС-клонів. трудомістким, витратним за часом і вимагає поПісля клонування повного геному MD V-1 і достійного надходження первинних клітин. У той час казу інфекційності клонованої ДНК MDV-1, для як мутагенез HSV і PrV явно полегшується за равидалення послідовностей, що кодують gB, з хунок використання технології ВАС, традиційний ВАС20 була використана нещодавно розроблена мутагенез, що базується на гомологічній рекомбісистема мутагенезу, в якій лінійний фрагмент ДНК нації в еукаріотичних клітинах, являє собою станможе бути рекомбінований у хазяйській бактеріадартну методику для вказаних дво х вірусів, і була льній ДНК, причому вказаний процес каталізується одержана велика кількість мутантних вірусів. І наrecE (Narayanan, Muyrers). Вказаний мутагенез впаки, для мутагенезу MDV-1 ВАС-клонування і базується на присутності у плазміді pGETrec гена мутагенез є найбільш прийнятними. Оскільки геl gam, що супресує rесЕ, rесТ і recB/C (Narayanan ном MDV-1 клонують у вигляді ВАС і він може стаet al., 1999). більно підтримуватися в Escherichia coli, генеруВеликими перевагами вказаної системи, яка вання мутантів і аналіз основних генів повинен була вперше використана для маніпуляцій з вірусбути відносно простим. Фактично, можливо клонуним геномом, є: (і) те, що тільки гомологічні плечі вати повний геном штаму 584Ар80С у вигляді тарозміром 30-50 п.н. необхідні для одержання спекого, що інфікує ВАС. Штам 584Ар80С являє социфічної послідовності, яка підлягає видаленню, бою ослаблений варіант дуже вірулентного плюс тобто видалення будь-якої відкритої для зчитуван(vv+) MD V-1 штам 584А, одержаний після 80 сеня рамки може бути здійснене без необхідності рійних пасажів на клітинах CEF (Witter, 1997). Анаклонувати касети рекомбінації, (іі) те, що метод ліз клонованих геномів MD V-1, присутні х у ВАС19, дуже швидкий, і (ііі) те, що вектор pGETrec, який ВАС20 і ВАС24, показує очевидну наявність варіанесе систему мутагенезу і експресує стійкість до цій у зразках, що одержують внаслідок обробки ампіциліну, швидко втрачається клітинами бактерестриктазами. рій за відсутності ампіциліну. Після електропорації Вказана гетерогенність може бути пояснена продукту ПЛР з вибитим gB у клітини ВАС20, що варіаціями у фрагментах ВаmНІ-D і Н. Відомо, що містять pGETrec, було виявлено від 10 до 30 колоу різних штамах MD V-1 присутня кількість тандемній з подвійною стійкістю до cam R і kanR. Одна з них повторів розміром 132 п.н., що варіює, і що колоній була позначена як 20DgB-l і відібрана для число вказаних повторів підвищується після серійподальшого аналізу, оскільки вона втрачає 21 84667 22 pGETrec відразу ж після поміщення на чашку з identification of essential and nonessential агаром, що містить хлорамфенікол і канаміцин. herpesvirus genes by direct transposon mutagenesis. Саузерн-блот аналіз продемонстрував успішн у Nat. Biotechnol. 17:360-364. делецію гена gB і вставку гена kanR у 20DgB-l. 7. Brunovskis P., and L.F. Velicer. 1995. The MD V-1, відновлений після трансфекції клітин CEF Marek's disease virus (MDV) unique short region: за допомогою 20DgB-l, був нездатний передаватиalphaherpesvirus-homologous, fowlpox virusся від інфікованих клітин оточуючим клітинам, і це homologous, and MDV-specific genes. Virology 206: вказує на те, що gB MD V-1, подібно до його дублі324-38. катів в інших вір усах герпесу, необхідний для пе8. Cantello J.L., A.S. Anderson, A. Francesconi, редачі інфекційного початку від клітини до клітини. and R.W. Morgan. 1991. Isolation of a Marek's Оскільки MDV-1 характеризується високою асоціdisease virus (MDV) recombinant containing the lacZ йованістю з клітиною у клітинах, які культивують, і gene of Escherichia coli stably inserted within the не вивільняє вірус, що інфікує, у культуральне MD V US2 gene. J. Virol, 65:1584-1588. середовище, автори не змогли дослідити можливу 9. Cui Z.Z., D. Yan, and L.F. Lee. 1990. Marek's роль gB MDV-1 у процесі проникнення вірусу. disease virus gene clones encoding virus-specific Одержаний gB мутант являє собою перший приphosphorylated polypeptides and serological клад MDV-1 з делецією основного гена і демонcharacterization of fusion proteins. Virus Genes струє серйозні можливості ВАС-клонування і сис3:309-322. теми мутагенезу, які особливо корисні у випадку 10. Delecluse H.J., T. Hilsendegen, D. Pich, R. MD V-1. Використання ВАС MDV-1 і постійної кліZeidler, and W. Hammerschmidt. 1998. Propagation тинної лінії QM7, яка дозволяє здійснювати розand recovery of intact, infectious Epstein-Barr virus множення MDV-1 і яка, на відміну від клітинної лінії from prokaryotic to human cells. Proc. Natl. Acad. фібробластів перепелиці QT35, не несе послідовSei. U.S.A. 95: 8245-8250. ностей MDV-1 [Zelnik et al., неопубліковані дані], 11. Fuckuchi K., M. Sudo, Y.S. Lee, A. Tanaka; являє собою чудовий приклад комбінації з ретельand M. Nonoyama. 1984. Structure of Marek s но проаналізованими основними генами MDV-1. disease virus DNA: detailed restriction enzyme map. Крім того, порівняльні аналізи функцій генів у різJ. Virol. 51: 102-109. них Alphaherpesvirinae можуть тепер включати 12. Lee L.F., P. Wu, D. Sui, D. Ren. J. Kamil, H.J. MD V-1 і дозволяють проводити дослідження дуже Kung, and R. L. Witter. 2000. The complete unique далеко віддалених представників, таких як VZV long sequence and the overall genomic organization або BHV-4, одного сімейства вірусів. of the GA strain of Marek's disease virus. Proc. Natl. Для клонування геномів, що пропонуються у Acad. Sei. U.S.A. 97:6091-6096. даному описі, приводиться нижче докладна пода13. Maotani K, K. Kanamori, K. Ikuta, S. Ueda, S. льша оцінка літичних, латентних генів та генів, що Kato, and K. Hirai. 1986. Amplification of a tandem індукують пухлину, у вір усу, відносно якого викоrepeat within inverted repeats of Marek s disease ристання генетичних маніпуляцій було б дуже обvirus DNA during serial in vitro passage. J. Virol. 58: межене. 657-659. References: 14. Meindl A. and N. Osterrieder. 1999. The 1. Anderson A.S., Parcells M.S., and R.W. equine herpesvirus type 1 Us2 homolog encodes a Morgan. 1998. The glycoprotein D (US6) homolog is nonessential membrane-associated virion not essential for oncogenicity or horizontal component. J. Virol. 73, 3430-3437. transmission of Marek's disease virus. J. Virol. 72: 15. Messerle Μ., I. Crnkovic, W. Hammerschmidt, 2548-2553. Η. Ziegler, and U.H. Koszinowski. 1997. Cloning and 2. Backer Y., E. Tabor, Y. Asher, I. Davidson, M. mutagenesis of a herpesvirus genome as an Malkinson, and R.L. Witter. 1993. PCR detection of infectious bacterial artificial chromosome. Proc. Natl. amplified 132 bp repeats in Marek's disease virus Acad. Sei. U.S.A. 94:14759-14763. type 1 (MD V-1) DNA can serve as an indicator for 16. Morgan R.W., J.L. Cantello, and C.H. critical genomic rearrangement leading, to the McDermott. 1990. Transfection of chicken embryo attenuation of virus virulence. Virus Genes 7:277-287. fibroblasts with Marek's disease virus DNA. Avian Dis. 3. Borst E.M., G. Hahn, U.H. Koszinowski, and M. 34:345-351. Messerle. 1999. Cloning of the human cytomegalo 17. Muyrers J.P., IT. Zhang, G. Testa, and A.P. virus (HCMV) genome as an infectious bacterial Stewart. 1999. Rapid modification of bacterial artificial artificial chromosome in Escherichia coli: a new chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids approach for construction of HCMV mutants. J.Virol. Res. 27: 1555-1557. 73: 8320-8329. 18. Narayanan K., R. Williamson, Y. Zhang, A.F. 4. Bradley G., M. Hayashi, G. Lancz, A. Tanaka, Stewart, and P.A. Ioannou. 1999. Efficient and and M. Nonoyama. 1989. Structure of the Marek's precise engineering of a 200 kb beta-globin Disease virus BamHI-H gene family: Genes of human/bacterial artificial chromosome in E. coli putative importance for tumor induction, J. Virol. 63: DH10B using an inducible homologous recombination 2534-2542. system. Gene Ther. 6: 442-447. 5. Bradley G., G. Lancz, A. Tanaka, and M. 19. Osterrieder N. 1999. Sequence and initial Nonoyama. 1989. Loss of Marek's disease virus characterization of the UL10 (glycoprotein M) and tumorigenicity is associated with truncation of RNAs UL11 homologous genes of serotype 1 Marek's transcribed within BamHI-H. J. Virol. 63: 4129-4235. Disease Virus. Arch. Virol. 144,1853-63. 6. Brune W., C. Menard, U. Hobom, S. Odenbreit, 20. Osterrieder N., A. Neubauer, С. Brandmtiller, M. Messerle, and U.H. Koszinowski. 1999. Rapid В. Braun, O.-R. Kaaden, and J.D. Baines. 1996. The 23 84667 24 equine herpesvirus type 1 glycoprotein gp21/22a, the associated with serial in vitro passage. J. Virol. 54: herpes simplex virus type 1 gM-homolog, is involved 690-696. in virus penetration and cell-to-cell spread of virions. 32. Smith G.A., and L.W. Enquist. 1999. J. Virol 70: 4110-4115. Construction and transposon mutagenesis in 21. Parcells M.S., A.S. Anderson, J.L. Cantello, Escherichia coli of a full-length infectious clone of and R.W. Morgan. 1994. Characterization of Marek's pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J. Virol. 73: disease virus insertion and deletion mutants that lack 6405-6414. US 1 (ICP22 homolog), US 10, and/or US2 and 33. Smith G.A., and L.W. Enquist. 2000. A selfneighboring short-component open reading frames. J. recombining bacterial artificial chromosome and its Virol. 68: 8239-8253. application for analysis of herpesvirus pathogenesis. 22. Parcells M.S., A.S. Anderson, and R.W. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 97: 4873-4878. Morgan. 1994. Retention of oncogenicity by a Marek's 34. Suter M., A.M. Lew, P. Grob, G.J. Adema, M. disease virus mutant lacking six unique short region Ackermann, К. Shortman, and C. Fraefel. 1999. BACgenes. J. Virol. 69: 7888-7898. VAC, a novel generation of (DNA) vaccines: A 23. Parcells M.S., A.S. Anderson, and R.W. bacterial artificial chromosome (ВАС) containing a Morgan. 1994. Characterization of a Marek's disease replication-competent, packaging-defective virus virus mutant containing a lacZ insertion in the US6 genome induces protective immunity against herpes (gD) homologue gene. Virus Genes 9:5-13. simplex virus 1. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 96: 24. Payne L.N. 1985. Pathology. In: LN 12697-12702. Payne(ed) Marek's Disease. Kluwer Academic 35. van Iddekinge B.J., L. Stenzler, K.A. Schat, Publishers, Hinghain, MA, U.S.A., pp. 43-76. H. Boerrigter, and G. Koch. 1999. Genome analysis 25. Pereira L. 1994. Function of glycoprotein В of Marek's disease virus strain CVI-988: effect of cell homologues of the family herpesviridae. Infect. culture passage on the inverted repeat regions. Avian Agents Dis. 3: 9-28. Dis. 43:182-188. 26. Ross N.L.J., Binns M.M., and J. Pastorek. 36. van Regenmortel M.H.V., C M. Fauquet, 1991. DNA sequence and organization of genes in a D.H.L. Bishop, E. Carstens, M.K. Estes, S. Lemon, J. 5.5 kbp EcoRI fragment mapping in the short unique Maniloff, M.A. Mayo, D. McGeoch, C.R. Pringle, and segment of Marek's disease virus (strain RB1B). J. R.B. Wickner (eds). 1999. Virus Taxonomy. Seventh Gen. Virol. 72: 949-954. Report of the International Committee on Taxonomy 27. Sakaguchi M., T. Urakawa, Y. Hirayama, N. of Viruses. Academic Press, New York, San Diego. Miki, M. Yamamoto, G.S. Zhu, and K. Hirai. 1993. 37. Wagner M., S. Jonjic, U.H. Koszinowski, and Marek's disease virus protein kinase gene identified M. Messerle. 1999. Systematic excision of vector within the short unique region of the viral genome is sequences from the BAC-cloned herpesvirus genome not essential for viral replication in cell culture and during virus reconstitution. J. Virol. 73:7056-7060. vaccine-induced immunity in chickens. Virology 195: 38. Witter R.L. 1985. Principles of vaccination. In: 140-1488. L.N. Payne(ed): Marek's Disease. Kluwer Academic 28. Sambrook J., D.F. Fritsch, and T. Maniatis. Publishers, Hingham, MA, U.S.A., pp. 203-250. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold 39. Witter R.L. 1997. Increased virulence of Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring. Harbor. Marek's disease virus field isolates. Avion Dis. 29. Senat K.A. 1985. Characteristics of the virus. 41:149-163, In: LN Payne(ed) Marek's Disease. Kluwer Academic 40. Witter R.L., J.M. Sharma, and A.M. Fadly. Publishers, Hingham, MA, U.S.A., pp. 77-112. 1980. Pathogenicity of variant Marek's disease virus 30. Schat K.A., B.J. van Iddekinge, H. Boerrigter, isolants in vaccinated and unvaccinated chickens. P.H. O'connell, and G. Koch. 1998. Open reading Avian Dis. 24: 210-232. frame LI of Marek's disease herpesvirus is not 41. Zhang X., F. Buchholz, J.P. Mu yrers, and essential for in vitro and in vivo virus replication and A.F. Stewart. 1998. A new log for DNA engineering establishment of latency. J. Gen. Virol. 79: 841-849. using recombination in Escherichia coli. Nature 31. Silva R.F., and R.L. Witter. 1985. Genomic Genet. 20:123-128. expansion of Marek's disease virus DNA is 25 Опис схем і креслень На Фіг.1 приведена схематична ілюстрація процедури клонування з метою одержання ВАС, що несуть повні геноми MDV-1. Показана організація геному MDV-1 розміром приблизно 180тис. п.н. (А) і карта рестрикції ВаmНІ (В) відповідно до даних Fukuchi et al. (11). Показані також унікальна коротка послідовність (Us) і ОРС, що розміщені в Us (С і D). Фрагменти розміром 2,1 і 3,1тис. п.н., що межують з геном Us2 (сірі прямокутники) ампліфіковані за допомогою ПЛР і клоновані у плазміді pTZ18R з одержанням рекомбінантної плазміди pDS. Вас-вектор розміром 7,2 тис. п.н., що вивільняється з рекомбінантної плазміди рНА1 (15), вставляють у pDS з одержанням плазміди pDS-pHAl (Ε). Сайти рестриктази відповідно до (2) мають наступні скорочені позначення: В = ВаmНІ, Ε = EcoRI, Ρ = PstI, Pa = Pacl, S - SaIl. На Фіг.2 приведена оцифрована картина сканування 0,8% агарозного гелю, забарвленого етидій-бромідом. ДНК, виділену з клонів ВАС 19, ВАС20 і ВАС24 Escherichia coli DH10B, розщеплюють з використанням ВаmНІ та EcoRI і розділяють. Продукти розщеплення рестриктазами фланкують приставкою розміром 1тис. п.н. (Gibco-BRL). Зірочки вказують додаткові смуги або варіації у розмірах окремих фрагментів, що є між трьома ВАС-клонами. На Фіг.3 приведена оцифрована картина сканування ДНК з 584Ар80С (V), ВАС 19, ВАС20 і ВАС24, розщеплених з використанням ВаmНІ або EcoRI з подальшим розділенням електрофорезом на 0,8% агарозному гелі та забарвлюванням етидій-бромідом (ліва панель). Після Саузернперенесення фрагментів ДНК на нейлонові мембрани проводять гібридизацію з дигоксигенінміченими фрагментами, виділеними з плазміди pDS або рНАІ. Приведені розміри маркерів (приставка розміром 1тис. п.н., Gibco-BRL) і розміри реакційноздатних смуг. На Фіг.4 приведені оцифровані картини сканування Саузерн-блотів при аналізі варіацій розмірів ДНК ВАС19, ВАС20 і ВАС24. Вірусн у ДНК з 84667 26 штаму 584Ар80С (V) і окремі ВАС розщеплюють з використанням ВаmНІ та EcoRI і переносять на нейлонові мембрани. Смуги інкубують з дигоксигенін-міченою ДНК ВАС 19 або з міченими фрагментами ВаmНІ-С або BamHI-D. Приведені розміри маркерів (приставка розміром 1тис. п.н., Gibco-BRL). Поява смуг у вигляді мазка у випадку ДНК 584Ар80С при гібридизації з послідовностями BamHI-D виділені за допомогою дужок. Фіг.5 (А): НІФ аналіз бляшок MDV-1 після трансфекції ДНК ВАС 19, ВАС20 або ВАС24. На 5 день після трансфекції інфіковані клітини фіксують і піддають непрямому імунофлуоресцентному аналізу з використанням анти-gB моноклональних антитіл 2К11. Виявлення зв'язаних антитіл проводять з використанням антимишачих Аіеха™ 488 (молекулярні зонди) і ядра контрастно забарвлюють пропідій-йодидом. Збільшення = 400х. (В): Криві росту MDV-1 штам 584 та різних ВАС. Після інфікування клітин CEF з використанням 100 ОУБ 584Ар80С або трансфікованим потомством ВАС19, ВАС20 або ВАС24 визначають титри вірусу у вказані моменти часу після інфікування за допомогою спільного посіву зі свіжими клітинами CEF. Бляшки підраховують після імунофлуоресцентного забарвлювання з використанням моноклональних антитіл 2К11. На Фіг.6 приведені оцифровані картини Саузерн-блотів при аналізі стабільності послідовностей ВАС-векторів у віруса х, відновлених після трансфекції ВАС 19 і ВАС20. Трансфіковане потомство пасирують протягом чотирьох разів і після кожного пасирування виділяють вірусну ДНК. Вірусну ДНК розщеплюють з використанням ВаmНІ або EcoRI, розділяють електрофорезом у 0,8% агарозному гелі та переносять на нейлонові мембрани. Проводять Саузерн-блот гібридизацію з використанням дигоксигенін-мічених фрагментів плазмід pDS або рНА1. Скорочення: V=584Ар80С, 19=ВАС19, 20=ВАС20. Пасажі з 1 по 4 після трансфекції ДНК ВАС 19 вказані номерами від 1 до 4. Пасаж 4 після трансфекції ДНК ВАС20 поміщений в останню лінію, відповідно, і 27 84667 28 позначений номером 4а. Приведені розміри реакбрани та гібридизують з дигоксигенін-міченими тивних фрагментів. Зірочки відмічають реактивну kanR- або gB-специфічними зондами. Вказані лінію маркера розміром 1,6тис. п.н. (приставка розміри реакційноздатних фрагментів ДНК. Скорозміром 1тис. п.н., Gibco-BRL). рочення: В=ВаmНІ, Ε=EcoRI, Bg=Bgll, S=StuI. Фіг.7 (А): Дана схематична ілюстрація мутаНа Фіг.9 показаний аналіз методом конфокагенезу ВАС20 з метою видалення послідовносльного лазерного сканування MgBl клітин, які тей, що кодують gB. Рекомбінантну плазміду конститутивно експресрують gB MD V-1. Клітини pGETrec, що кодує rесЕ, rесТ і gam ген, які індуMgB1 або QM7 висівають на накривні скельця та куються L-арабінозою, трансформують у клітини інкубують у присутності анти-gB моноклональних DH10B, що містять ВАС20. Після проведення антитіл 2K11 або конвалесцентної сироватки курампліфікації методом ПЛР гена kanR з плазміди чати MDSI. Вторинними антитілами служили pEGFP-Nl (Clontech) за допомогою праймерів, які кон'югати антимишачих або антикурячих IgG також містять гомологічні плечі розміром 50 п.н., Alexa™ 488 (молекулярні зонди). Ядра контрастщо межують з делецією gB, ПЛР амплікон розміно забарвлюють пропідіум-йодидом. Смуга ознаром 1,6тис. п.н. вводять електропорацією у клітичає 10мкм. ни DH10B, що несуть ВАС20 і pGETrec. БактеріаНа Фіг.10 приведені результати аналізу мельні суспензії нашаровують на агар, який містить тодом НІФ клітин MgBl, QM7 або CEF після їх 30 мкг/мл канаміцину і 30мкг/мл хлорамфеніколу. трансфекції ВАС20 (верхні панелі) або 20DgB Відбирають колонії з подвійною стійкістю і підда(нижні панелі). На 5 день після трансфекції клітиють подальшому аналізу. ни фіксують ацетоном та інкубують з анти-рр38 (В): Схематична ілюстрація розташування гемоноклональними антитілами Η19. Вторинними на gB у MD V-1 та делеції, яка присутня у ВАС антитілами служили антимишачі IgG Alexa™ 488 20DgB. (молекулярні зонди). У той час, як після трансфеФіг.8: Картина сканування забарвленого етикції ВАС20 ДНК бляшки MDV-1 спостерігаються діум-бромідом 0,8% агарозного гелю, що містить на всіх клітинних лініях, після трансфекції з викоДНК ВАС20 і 20DgB, розщеплені з використанням ристанням 20DgB вірусні бляшки відмічаються ВаmНІ, EcoRI, Bgll або StuI і розділенні електротільки на клітинах MgBl. Тільки окремі варіанти форезом у 0,8% агарозному гелі (ліва панель). інфікованих клітин спостерігаються на клітинах Фрагменти ДНК переносять на нейлонові мемQM7 і CEF (стрілки). Збільшення = 400 х. 29 84667 30 31 84667 32 33 84667 34 35 84667 36 37 Комп’ютерна в ерстка В. Мацело 84667 Підписне 38 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601