Спосіб ідентифікації особи

Спосіб ідентифікації особи, що полягає у геномній дактилоскопії з використанням методом лолімеразної ланцюгової реакції, шляхом виділення ДНК із кісткової тканини трупа з застосуванням лізуючого буфера, який відрізняється тим, що досліджувану кісткову тканину спочатку механічно руйнують абразивом, а виділення ДНК виконують з використанням лізуючого буфера, в якому при додаванні ацетата калію до кінцевої концентрації' 1,5М одержують приципітацію білків і полісахаридів додецілацетатом калію, додають протеїназу К у кількості 50мкл (концентрація 20мг/мл) і антиоксидант дитіотрейтол (ДТТ) у кінцевій концентрації 20мМ, після чого ДНК осаджують ізопропанолом в об'ємі, що дорівнює об'єму розчину ДНК, та додаванням 2М хлориду магнію у кількості 5-8мкл і глікогену 13-15мкл (концентрація 50мг/мл). Корисна модель відноситься до області судової' медицини і може бути використана при ідентифікації особи. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є спосіб виділення ДНК із кісткової тканини з використанням лізуючого буфера, який складається з 0,5М ЕДТА рН8,0; 1% лаурілсаркозила Na; 0,5мг/мл протеїнази К. До наважки декальціфікованої кісткової стружки масою 300,0мг додавали 800,0мкл лізуючого буфера, інкубували за температурою 65°С на протязі 1 години, потім за 37°С на протязі двох діб. Проводили стандартну хлороформну депротеїнізацію, осаджували ДНК рівним об'ємом ізопропанопа з додаванням ацетату амонію, промивали 70% етиловим спиртом, цетрифугували при 14000об/хв на протязі 25хв, далі одержаний осад висушували. Розчинювали в 100,0мкл ТЕ-буфера, проводили додаткову очистку Chelex-100 ("Bio-Rad", США) [1]. Проби ДНК зберігали при температурі 4°С. пом геномної дактилоскопії методом ПЛР, який дозволить підвищити ефективність та точність ідентифікації' особи. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно корисної моделі, досліджувану кісткову тканину спочатку механічно руйнують абразивом, а виділення ДНК виконують з використанням лізуючого буфера, в якому при додаванні ацетату калію до кінцевої' концентрації 1,5М одержують приципітацію білків і полісахаридів додецілацетатом калію, додають протеїназу К у кількості 50мкл (концентрація 20мг/мл) і антиоксидант дітіотрейтол {ДТТ) у кінцевій концентрації' 20мМ, після чого ДНК осаджують ізопропанопом в об'ємі, що дорівнює об'єму розчину ДНК, та додаванням 2М хлориду магнію у кількості 5-8мкл і глікогену 13-15мкл (концентрація 50мг/мл). Спосіб здійснюється наступним чином. Із фрагмента трубчастої кістки, попередньо обробленої' УФ-промінням і 96%-етіловим спиртом, за допомогою мілкого терпуга одержують кістковий порошок. Наважку масою ЮОмг переносять у ступку, додають ЗООмкл лізуючого буферу і невелику кількість будь-якого абразивного матеріалу, наприклад, порошок скла, розтирають до утворювання гомогенату. Одержану масу переносять у пластикову м ікро центри фужну пробірку типу "Еппендорф" об'ємом 1,5мл і додають ще ЗООмкл свіжев и готовленого лізуючого буфера, а також 50,0мкл протеїнази К (концентрація 20мг/мл), пе Однак, застосування вказаного вище способу виділення ДНК із кісткової тканини має декілька недоліків: процедура виділення ДНК триває не менше 3 діб, вказаний спосіб потребує застосування таких токсичних хімічних реагентів, як хлороформ; а також потребує додаткової очистки розчину ДНК Chelex - 100 ("Bio-Rad", США) [2]. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалення способу ідентифікації особи шляхом виділення ДНК із кісткової тканини, що є ета ю 10445 ремішують, інкубують за температурою 60°С на локусам генома людини: локус Amel (статева хропротязі 2,5-3 годин при постійному похитуванні. мосома); локус HUMvWA (хромосома 12р 12-pter); Склад лізуючого буфера при цьому: локус HUMLPL (хромосома 8р 22). Ампліфікацію ДНК проводять згідно Protocol II 100mMTns-HCI, pH8,0 PCR Methods and Applications, 1991, v.1, №2 на 500mM NaCI термоциклері "Терцик" ("ДНК-технология", Росія) І 50тМ №2ЕДТА, pH8,0 термоциклері РТС-200 ("MJ Research", США). Для 1,5% SDS ампліфікації використовували набори "Promega" 20тМ дітіотрейтола (ДТТ). (США) і "Тапотили" (Росія). Ампліфіковані фрагмеДалі пробірку із зразком охолоджують до кімнти ДНК розподіляли в 4% агарозних і 10% поліакнатної температури на протязі 15-20 хв., додають риламідних гелях, фарбували етідієм бромідом і 200-250мкл 5М ацетату калію, ретельно перемісріблом - відповідно. Документували ампліфіковані шують і інкубують у морозильній камері за темпефрагменти, використовуючи систему для відеодоратурою -10°С на протязі 1,5-2 годин. Після чого кументації "Image Master VDS" ("Amersham м'яко перемішують, центрифугують зразок при pharmacia biotech", США). 14000об/хв на протязі 10 хвилин. Обережно відбирають та переносять в чисту пробірку супернатант Таким чином, за рахунок використання механіз ДНК, залишаючи осад на дні пробірки. У випадку, чного впливу на кісткову тканину збільшується коли із супернатантом у пробірку попадав осад поверхня взаємодії часток тканини і лізуючих агенбілку, зразок додатково центрифугують при мактів, в результаті чого відбувається повний лізис симальній швидкості на протязі 3 хвилин, обережклітин. Застосування в лізуючому буфері додатконо відбирають та переносять у чисту пробірку суво депротеїнизуючого агента протеїнази К, а також пернатант. Додають до супернатанту розчин ацетата калію у високих концентраціях дає можацетату натрію (AcONa) до кінцевої концентрації ливість ефективно відділити ДНК від білків і полі0,3M, 2M хлорид магнію (МдСІг) У кількості 5-8мкл і сахаридів. Для припинення процесу деградації глікоген - 13-15мкл (концентрація 50мг/мл) та рівДНК додатково використовують антиоксидант ний з розчином ДНК об'єм холодного Ізопропанодітіотрейтол (ДТТ), ефективному осадженню ДНК ла. Обережно перемішують та інкубують у моросприяє застосування хлориду магнію та глікогену. зильній камері за температурою -20°С на протязі В порівнянні з найближчим аналогом, запро20-25ХВ. для формування осаду. Зразок м'яко пепонований спосіб виділення ДНК із кісткової ткаремішують на еортексі і центрифугують при нини дозволяє скоротити термін (до 7 годин) оде14000об/хв на протязі 15-20 хвилин. Обережно ржання достатньої кількості пригодної ДНК для її відбирають супернатант, залишаючи осад на дні типування методом ПЛР. пробірки. Осад промивають 500мкл холодним 70% Література: розчином етилового спирту на протязі 5-1 Охв; 1. UA Деклараційний патент №53565 А ; центрифугують при 14000об7хв на протязі 5-7хв., опубл. 15.01.03. Бюл. №1 МПК 7: А61В5/117. Заявобережно відбирають супернатант, залишаючи ка №2002076389 від 31.07.02, ОДМУ, Кривда Г.Ф, осад на дні пробірки. Осад висушують на фільтруСиволап Ю.М., Кривда Р.Г. та інші, Спосіб ідентивальній бумазі за кімнатною температурою та розфікації особи. чиняють у 75мкл ТЕ-буферу. Зразок зберігають 2. Кривда Р.Г, Кривда Г.Ф., Сиволап Ю.М. Випри температурі - 20°С. ділення ДНК із кістково") тканини різного терміну зберігання //Одеський медичний журнал. -2002.Якість виділеної ДНК визначали за результа№5. -С.20-23. тами ампліфікації з використанням метода ПЛР з трьома парами праймерів, котрі гомологічні таким Комп'ютерна верстка Л Литвиненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601