Спосіб виділення l-форм мікобактерій з об’єктів зовнішнього середовища та продуктів тваринництва

Спосіб виділення L-форм мікобактерій з проб об'єктів зовнішнього середовища та продуктів тва ринництва, що включає оброблення проб 3% розчином сірчаної кислоти, центрифугування, відмивання стерильним фізіологічним розчином, висів на щільне середовище та напівсинтетичне середовище Школьникової, який відрізняється тим, що збільшують об'єм проби до 100 см 3 , пропускають одержану суміш при третьому відмиванні стерильним фізіологічним розчином через фільтрувальні стерилізувальні пластини фільтра Зейтца та центрифугують отриманий фільтрат. Корисна модель відноситься до ветеринарної мікробіології і може бути використана для виділення L-форм мікобактерій з об'єктів зовнішнього середовища та продуктів тваринництва також застосування в ветеринарній медицині як спосіб виділення L-форм мікобактерій при дослідженнях на туберкульоз. Є відомий спосіб виділення L-форм мікобактерій, суть якого полягає в слідуючому: проби молока обробляють 6% розчином сірчаної кислоти з загальною експозицією 20 хвилин, центрифугують при 2500-3000 об/хв протягом 20 хвилин, Із осаду роблять мазки для фазово-контрастної мікроскопії та висівають на яєчні середовища і модифіковане середовище Школьникової [Гертман М.Й., Гапатова Л.В., Петров А.А. Выделение L-форм микобактерий из молока коров // Ветеринария. - 1990. №6 - с. 30-31 ] Існує також спосіб, який передбачає оброблення проб 3% розчином луги, концентрування мікобактерій у матеріалі способом центрифугування при 2500-3000 об/хв протягом 20 хвилин, із отриманого осаду готують мазки для фазовоконтрастної мікроскопії та висів досліджуваних проб на середовища Школьникової, Петраньяні, Гельберга [Гизатуллин Х.Г , Сафин М А , Харитонов М В Выделение L-форм микобактерий // Науч. тр. Казанского вет. ин-та. - 1989. - том 139 - с 7780] Недоліком обох способів є пагубна дія кислоти та лугу, які використовуються без подальшого відмивання фізіологічним розчином, високий ріст сторонньої мікрофлори та паралельне виділення як L-форм, так і не змінених мікобактерій, що утруднює ідентифікацію культур, та зменшує чутливість запропонованих способів Існує живильне середовище для виділення та культивування L-форм мікобактерій, що містить сахарозу, нативну сироватку крові великої рогатої худоби або коней, агар-агар, сольову основу та ізоніазід [Патент Росії № 2002122009 кл C12N от 08.12.2002]. Але це середовище не може бути використано для виділення L-форм мікобактерій з зовнішнього середовища та продуктів тваринництва при дослідженнях на туберкульоз, тому що наявність ізоніазиду у середовищі затримує ріст колоній та може сприяти утворенню L-форм мікобактерій із звичайних бактеріальних культур. Найбільш близькою за технічною суттю до заявляемого об'єкту є спосіб виділення L-форм мікобактерій, для чого передпосівне оброблення дослідного матеріалу обробляють 3% розчином сірчаної кислоти з експозицією 20 хвилин, після цього його центрифугують при 1000 об/хв протягом 10 хвилин. Одержаний осад трьохразово відмивають стерильним фізіологічним розчином та висівають досліджувану пробу по 0,2см на щільне живильне середовище Левенштейна-Иенсена та напівсинтетичне середовище Школьникової. [Савченко П.Е Лабораторная диагностика туб-за жиных - Чернигов, 1998 г. - 64с] Недоліком цього способу є високий відсоток росту сторонньої мікрофлори та паралельний ріст на середовищі 10499 4 розчином сірчаної" кислоти і центрифугують при Школьникової як L-форм, так і бактеріальних форм режимі 1000 об/хв протягом 10 хвилин. Отриманий мікобактерій, що ускладнює їх ідентифікацію. осад відмивають стерильним фізіологічним розчиВ основу корисної моделі поставлено задачу: ном центрифугуванням при тому ж режимі. розробити спосіб виділення L-форм мікобактерій з Відмитий осад ресуспендують в стерильному проб об'єктів зовнішнього середовища та продукфізіологічному розчині та пропускають через тів тваринництва, що включає оброблення проб фільтруючо-стерилізувальніуючі пластини фільтра 3% розчином сірчаної кислоти, центрифугування, Зейтца. Отриманий фільтрат центрифугують при відмивання стерильним фізіологічним розчином, режимі 1500 об/хв. протягом 20 хвилин. Осад ревисів на щільне середовище та напівсинтетичне суспендують в стерильному фізіологічному розчині середовище Школьникової шляхом збільшення 3 та висівають на середовище Школьникової та на об'єму проби до 100см , пропускання одержаної щільне середовище для культивування суміші при третьому відмиванні стерильним фізіомікобактерій (по 10 пробірок на пробу) і культивулогічним розчином через фільтрувальні стерилізують в термостаті при температурі 37°С протягом вальні пластини фільтра Зейтца, центрифугування трьох місяців. Облік росту проводять кожні 5-7 діб. отриманого фільтрату, щоб забезпечити спосіб виділення мікобактерій з об'єктів зовнішнього сеПриклад №1. редовища та продуктів тваринництва. Оброблення проб об'єктів зовнішнього середовища (фунт, вода) та продуктів тваринництва Поставлене завдання вирішується збільшен(молоко, кефір, сметана), проводили за описаною ням об'єму проб до 100см3, пропусканням отримаметодикою з застосуванням 3% розчину сірчаної ної суміші при останньому відмиванні стерильним кислоти та експозицією 10 хвилин. фізіологічним розчином через фільтруючістерилізувальні пластини фільтра Зейтца, Приклад №2. центрифугуванням фільтрату. Теж, що і в прикладі 1 при застосуванні 5% розчину сірчаної кислоти та експозиції також 10 Порівняльний аналіз способу, що заявляється, хвилин. і найближчого аналалога показує, що заявляємий спосіб виділення L-форм мікобактерій з проб об'Приклад №3. єктів зовнішнього середовища та продуктів тваТеж, що і в прикладі 1, 2 при застосуванні 10% ринництва відрізняється від відомого тим, що дорозчину сірчаної кислоти та експозиції також 10 датково проводиться одночасно стерилізувальна хвилин. Результати проведених досліджень навефільтрація досліджуваних проб. дені в таблиці. Із матеріалів таблиці видно, що при застосуСпосіб виділення L-форм мікобактерій з проб ванні 3% розчинів сірчаної кислоти та експозиції зовнішнього середовища та продуктів тваринницт10 хвилин виділяємість культур L-форм мікобактева дає можливість зменшити відсоток росту на рій складає 66,2%, тоді як ріст сторонньої мікроживильних середовищах секундарної мікрофлори, флори не перевищує 3%. При застосуванні 5% підвищити виділення L-форм мікобактерій. розчину сірчаної кислоти при експозиції також 10 Даний спосіб виділення L-форм мікобактерій з хвилин ріст сторонньої' мікрофлори знизився до проб зовнішнього середовища та продуктів тва1%, але виділяємість культур L-форм мікобактерій ринництва проводиться таким чином1 складала лише 55,9%. При застосуванні 10% розПроби ґрунтів, кормів передчасно гомогенізучину сірчаної кислоти при експозиції також 10 хвиють у колбах з стерильним фізіологічним розчином лин росту L-форм мікобактерій та секундарної' 1:4, відстоюють протягом 40 хвилин, а потім з семікрофлори не виявляли. реднього шару відбирають 10см3 проби у центрифужні пробірки Проби сметани розводять 1:10 Результати проведених досліджень свідчать стерильним фізіологічним розчином і переносять про те, що при застосуванні розробленого способу по 10см3 у центрифужні пробірки. Проби молока та виділення L-форм мікобактерій ріст сторонньої' кефіру також по 10см3 переносять у центрифужні мікрофлори менше на 60% і при цьому виділяєпробірки не розводячи. Центрифугують при режимі мість культур L-форм мікобактерій більша на 1000 об/хв протягом 10 хвилин, надосадову рідину 33,8% зливають, осад ресуспендують та заливають 3% Таблиця. Розчин кислоти Кількість проб 3% 5% 10% 68 68 68 68 Приклад 1 Приклад 2 Приклад 3 Прототип Комп'ютерна верстка Г ПаяпьнІков Виділено культур мкб. кількість відсоток 66,2% 45 55,9% 38 0,0% 0 32,4% 22 Підписне Кількість проросту 3% 1% 0% 63% Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 42, 01601