Живильне середовище для виділення l-форм мікобактерій туберкульозу

Живильне середовище для виділення L-форм мікобактерій туберкульозу, сольовий розчин якого містить калій фосфорнокислий одноосновний, натрій фосфорнокислий двоосновний, магній сірчанокислий, натрій лимоннокислий (середній), залізо лимоннокислоаміачне, гліцерин, воду дистильовану з. додаванням до нього агар-агару, сахарози, 36353 вого розчину додають натрій глутаміновокислий одноосновний та глікокол при наступному співвідношенні компонентів, в г/л: Калій фосфорнокислий одноосновний 1,5 Натрій фосфорнокислий двоосновний 1,5 Магній сірчанокислий 0,5 Натрій лимоннокислий (середній) 1,5 Залізо лимонно-кисло-аміачне 0,05 Глікокол 2,0 Натрій глутаміновокислий одноосновний 10,0 Гліцерин 30 мл Вода дистильована до 1 л Дослідним шляхом встановлено, що додавання до складу сольового розчину живильного середовища глутамінату натрію, який є допоміжним джерелом азотистого харчування для МБТ, сприяє поліпшенню ростових властивостей цього середовища, що призводить до скорочення термінів виділення L-форм МБТ. Глікокол також є джерелом азотистого харчування для МБТ. Введення глікоколу до складу розчину замість дорогого Lаспарагіну дозволяє значно здешевити його і зробити доступним для використання в будь-якому протитуберкульозному закладі. Живильне середовище готують наступним чином. Для приготування 1 л живильного середовища за прописом (г/л води) беруть: Калій фосфорнокислий одноосновний 1,5 Натрій фосфорнокислий двоосновний 2,5 Магній сірчанокислий 0,5 Натрій лимоннокислий (середній) 1,5 Залізо лимонно-кисло-аміачне 0,05 Глікокол 2,0 Натрій глутаміновокислий одноосновний 10,0 Гліцерин 30 мл Вода дистильована до 1 л Солі у вказаному вище порядку додають в підігріту дистильовану воду, кожний інгредієнт після того, як розчинився попередній. Середовище фільтрують крізь паперовий фільтр, додають 0,3% агар-агару, розливають в колби по 700 мл та стерилізують в автоклаві при 1 атмосфері (120°С) протягом 30 хв. За кілька днів до посіву середовище розігрівають на водяній бані до температури 40-45°С, після чого додають стерильний розчин сахарози (на 100 мл дистильованої води 200 г сахарози, стерилізація в автоклаві при 0,5 атм 20 хв.) та 100 мл сироватки великої рогатої худоби або конячої сироватки. Вміст колби розливають у стерильні пробірки по 4,5 мл і перевіряють на стерильність протягом двох діб. Таким чином, кожна пробірка перед посівом містить напіврідке живильне середовище й 20% сахарози і 10%. сироватки. В банку зі свіжозібраним харкотинням в кількості 10-20 мл додають рівну кількість 3% HgS04 (для знищення неспецифічної мікрофлори) та скляне намисто (для механічної гомогенізації матеріалу) і протягом 10 хвилин ретельно все збовтують. Потім оброблений кислотою матеріал центрифугують протягом 10 хвилин при 1000 об/хв. Час контакту матеріалу з кислотою повинен не перевищувати 20 хвилин, щоб уникнути негативного впливу кислоти на життєздатність мікобактерій. Після центрифугування надосадову рідину зливають, осад збовтують і тричі відмивають сте рильним фізіологічним розчином хлористого натрію, центрифугуючи щоразу протягом 10 хвилин у тому ж режимі. До отриманого осаду додають 2 мл стерильного фізіологічного розчину хлористого натрію, ретельно перемішують і засівають по 0,2 мл на серію напіврідких живильних середовищ. Кожен зразок матеріалу засівається на 4 пробірки з напіврідким живильним середовищем (І, II, III та IV контрольна), в 3 перших пробірки безпосередньо перед посівом ex tempore додається суміш антибіотиків з метою уникнення росту забруднюючої неспецифічної мікрофлори. Як правило, для цього застосовується суміш пеніциліну і стрептоміцину, створюючи концентрацію в середовищі 1-5 од. кожного з вказаних антибіотиків. Ці концентрації пеніциліну і стрептоміцину не мають Lтрансформуючої дії. Четверта (контрольна) пробірка містить тільки поживне середовище, стабілізатор (сахарозу) і сироватку, ця пробірка служить контролем для виключення бактеріостатичної та Lтрансформуючої дії суміші антибіотиків, які додаються в середовище. Засіяні таким чином напіврідкі середовища ретельно перемішують за допомогою стерильної піпетки для рівномірного розподілення засіяного матеріалу та всіх інгредієнтів середовища. Кожен посів на L-форми супроводжується обов'язковим паралельним посівом на щільні живильні середовища (1 пробірка з середовищем ЛевенштейнаЙенсена та 1 пробірка з середовищем Фінна-11) для виявлення бактеріальних форм збудника, оскільки в ряді випадків MET виявляються в суміші типових бактеріальних та L-форм. В засіяних пробірках ватно-марлеві пробки замінюють на резинові, щоб запобігти висиханню середовища. Посіви інкубують в термостаті при 37°С. Облік результатів проводять щоденно, починаючи з 10-го дня інкубації, протягом 2-х місяців. Результати посіву враховують макроскопічно та за допомогою фазово-контрастної та світової мікроскопії. В позитивних випадках в товщі напіврідкого середовища можна бачити ніжний хмаркоподібний ріст у вигляді дрібних завислих колоній або ділянок помутніння середовища нерівномірної оптичної густини, які частіше розташовуються у верхніх шарах стовпчика живильного середовища. За допомогою пастерівської піпетки з ділянок видимого росту береться невелика крапля матеріалу, котра наноситься на предметне скельце, покривається покровним скельцем та мікроскопується в фазовоконтрастному мікроскопі. Препарат досліджується за допомогою іммерсійного фазового об'єктиву (х 90 Ф), окуляра (х 7 або х 10). Результати отриманих нами паралельних досліджень по виділенню L-форм МВТ на відомому напіврідкому живильному середовищі та середовищі, яке заявляється, показали, що на останньому ріст L-форм МБТ з'являється на 3-7 днів раніше, ніж на відомому середовищі. Таким чином, перевагами середовища, що пропонується є: - скорочення термінів виділення L-форм МБТ із патологічного матеріалу хворих, що в свою чергу сприяє прискоренню мікробіологічної діагностики туберкульозу. 2 36353 Це має велике практичне значення у зв'язку з ростом захворюваності на туберкульоз в нашій країні та погіршенням епідеміологічної ситуації з туберкульозу. - значне здешевлення досліджень за рахунок заміни дорогого L-аспарагіну на значно дешевший глікокол. Живильне середовище для виділення L-форм мікобактерій туберкульозу, що пропонується, може знайти широке застосування в бактеріологічних лабораторіях протитуберкульозних закладів. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. 3 36353 (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4