Спосіб обробки проб об’єктів зовнішнього середовища

Корисна модель відноситься до ветеринарної мікробіології і може бути використана для передпосівної обробки проб об'єктів зовнішнього середовища (грунт, вода, підстилка) для виділення збудників туберкульозу, атипових мікобактерій та застосований в ветеринарній медицині як спосіб виділення при культуральному методі дослідження життєздатних культур мікобактерій при визначенні якості проведеної дезинфекції. Є відомий спосіб обробки проб з об'єктів зовнішнього середовища для виділення мікобактерій, суть якого полягає в слідуючому: проби з об'єктів зовнішнього середовища обробляють 10% розчином сірчаної кислоти протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, фільтрують через марлевий фільтр, фільтрат центрифугують при 4000об/хв протягом 15 хвилин, із осадку роблять мазки на мікроскопію та посіви на живильне середовище. [Алікаєва А.П. Методика исследования кормов, фекалий, почвы и других материалов из внешней среды для выявления микобактерий / Бюл. ВИЭВ, 1979. - Вып. 34. -С. 29-30] Існує також спосіб, який передбачає обробку проб з об'єктів зовнішнього середовища 18% розчином сірчаної кислоти з загальною експозицією 30 хвилин (15 хвилин отстоювання та 15 хвилин центрифугування), та подальшим відмиванням осаду стерильним фізіологічним розчином і висівом проб на живильні середовища. [Маккавейская А.Н. О стойкости туберкулёзной палочки в фецес и органах крупного рогатого скота // Сов. ветеринария, 1937. - № 7. - С. 68-70] Недоліком обох способів є високий ріст сторонньої мікрофлори (93.2 -96.6%) на живильних середовищах у зв'язку з чим знижується відсоток виділення мікобактерій та знижується чутливість культурального методу дослідження на туберкульоз. Аналіз відомих рішень передпосівної обробки показав, що при порівнянні обробок матеріалу різними хімічними речовинами (сірчаною, соляною, щавлевою кислотами, їдким натром та детергентами) більш доцільним є використання сірчаної кислоти. При цьому встановлено, що мікобактерії стійкі до впливу 15-20% розчинів сірчаної кислоти з експозицією до 2-2.5 годин. [Таджгалиев Н.М. Сравнительная оценка способов обработки материала на высеваемость микобактерий / Автореф. дис. ... канд. вет. наук. - М. - 1987.] Найбільш близькою за технічною суттю до заявляемого об'єкту є удосконалений спосіб обробки проб матеріалу, відібраних з об'єктів зовнішнього середовища для культурального дослідження на туберкульоз. Його суть: 50г досліджуємого матеріалу поміщають у колбу і ресуспендують у стерильному фізіологічному розчині 1:4, перемішують та отстоюють протягом 30-60 хвилин; потім середній шар відбирають стерильною піпеткою та переносять у центрифужні пробірки, які центрифугують при 1000 об/хв протягом 30 хвилин. Одержаний осад обробляють 18% розчином сірчаної кислоти, перемішують та повторно центрифугують 25 хвилин; надосадову рідину зливають, а до осадку добавляють по 5см 3 стерильного фізіологічного розчину і ретельно перемішують. Одержану суміш по 0.5см 3 висівають стерильною мірною піпеткою на живильне середовище ЛевенштейнаЙенсена. [Кассич Ю.Я., Ти хонов П.М. Совершенствование и сравнительное изучение методов обработки материала, отобранного из объектов внешней среды для культуральной диагностики туберкулёза // Ветеринария: Респ. межвед. тематич. науч. сб. - К. - 1984. - Вып. 59. - С. 16-18]. Це рішення може бути прототипом. Недоліком цього способу є високий ступінь росту на живильних середовищах банальної мікрофлори (40.0%), що впливає на собівартість та результативність проведених досліджень. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб обробки проб об'єктів зовнішнього середовища, що містить ресуспендування проб фізіологічним розчином, одержання осаду центрифугуванням, обробку осаду розчином сірчаної кислоти, перемішування та повторне центрифугування з додаванням до осаду стерильного фізіологічного розчину, одержання суміші з висіванням її на живильне середовище шляхом культивування досліджуємих проб, передпосівної обробки їх 18% розчином сірчаної кислоти при експозиції 40 хвилин з послідуючим трьохразовим промиванням, щоб забезпечити спосіб передпосівної обробки проб зовнішнього середовища. Поставлене завдання вирішується додаванням до досліджуваних проб 1:4 стерильного фізіологічного розчину, фільтруванням суміші, культивуванням одержаного фільтрату в термостаті при 37°С протягом 24 годин, передпосівною обробкою досліджуємих проб 18% розчином сірчаної кислоти при експозиції 40 хвилин, промиванням стерильним фізіологічним розчином та висівом на живильні середовища. Порівняльний аналіз способу, що заявляється, і прототипу показує, що заявляємий спосіб обробки проб з об'єктів зовнішнього середовища відрізняється від відомого тим, що проводиться культивування досліджуваних проб, передпосівна обробка їх 18% розчином сірчаної кислоти при експозиції 40 хвилин з послідуючим трьохразовим промиванням центрифугу стерильним фізіологічним розчином та висів його на живильне середовище. Спосіб обробки проб об'єктів зовнішнього середовища дає можливість зменшити відсоток росту на живильних середовищах супутньої мікрофлори та підвищити висіваємість мікобактерій на живильному середовищі. Даний спосіб обробки проб з об'єктів зовнішнього середовища для виділення збудників туберкульозу та атипових мікобактерій проводиться таким чином: У стерильну колбу вносять наважку 50г вивчаємого тест-об'єкту, додають 200см 3 стерильного фізіологічного розчину, ретельно перемішують та фільтрують через двошарову стерильну марлю. Одержаний фільтрат проби в колбі розміщують у термостат при температурі 37°С на 24 години. Надалі стерильною піпеткою із середини вмісту колби відбирають по 10-12см у центрифужні пробірки, які центрифугують при режимі 1500 об/хв протягом 25 хвилин. Надосадову рідину зливають, а осад ресуспендують в 3-5см 3 18% розчину сірчаної кислоти і переносять стерильною піпеткою у стерильні центрифужні пробірки , доливають кислоту до 10-12см 3 і залишають на 20 хвилин при кімнатній температурі. Потім центрифугують у режимі 1500об/хв протягом 20 хвилин, надосадову рідину зливають над полум'ям горілки, осад ресуспендують в 3-5см 3 стерильного фізіологічного розчину, після чого додають до 10-12см 3 стерильного фізіологічного розчину, а потім центрифугують у тому ж режимі та ще двічі таким чином відмивають осадок від залишків кислоти. Осад після останнього центрифугування ресуспендують в 4-5см 3 стерильного фізіологічного розчину. З отриманої суміші роблять препарати-мазки, які забарвлюють за методом Ціля-Нільсена і мікроскопують та по 0.5см 3 висівають на поверхню живильного яєчного середовища для культивування мікобактерій. Пробірки з висівами ставлять у термостат при 37°С на 1-2 доби у горизонтальному положенні. Після чого парафінують та культивують у термостаті при 37°С протягом трьох місяців. Облік росту проводять через кожні 5-7 діб. Приклад № 1 Обробку проб з об'єктів зовнішнього середовища, попередньо контамінованих мікобактеріями, проводили за описаною методикою з застосуванням 15% розчину сірчаної кислоти та експозицією 30 хвилин. Приклад№2 Теж, що і в прикладі 1 при застосуванні 15% розчину сірчаної кислоти та експозиції 40 хвилин. Приклад №3 Теж, що і в прикладах 1, 2 при застосуванні 15% розчину сірчаної кислоти та експозиції 50 хвилин. Приклад №4 Теж, що і в прикладах 1, 2, 3 при застосуванні 18% розчину сірчаної кислоти та експозиції 30 хвилин. Приклад №5 Теж, що і в прикладах 1, 2, 3, 4 при застосуванні 18% розчину сірчаної кислоти та експозиції 40 хвилин. Приклад №6 Теж, що і в прикладах 1, 2, 3, 4, 5 при застосуванні 18% розчину сірчаної кислоти та експозиції 50 хвилин. Приклад №7 Теж, що і в прикладах 1, 2, 3, 4, 5, 6 при застосуванні 20% розчину сірчаної кислоти та експозиції 30 хвилин. Приклад №8 Теж, що і в прикладах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 при застосуванні 20% розчину сірчаної кислоти та експозиції 40 хвилин. Приклад №9 Теж, що і в прикладах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 при застосуванні 20% розчину сірчаної кислоти та експозиції 50 хвилин. Враховувались інтенсивність та швидкість росту виділених культур мікобактерій та відсоток проросту суп утньої мікрофлори (результати проведених досліджень наведені в таблиці). Із матеріалів таблиці видно, що при застосуванні 15%-х розчинів сірчаної кислоти для передпосівної обробки проб з експозицією 30, 40, 50 хвилин відсоток росту сторонньої мікрофлори (проріст) на живильному середовищі складає 80.0% і вище, інтенсивність росту виділених культур мікобактерій більш 50 колоній, а термін появи перших колоній 28-30 діб. При застосуванні 18% розчину сірчаної кислоти з експозицією 30 хвилин проріст складає 44.4%, а інтенсивність та швидкість росту культур мікобактерій не знижується. При застосуванні 18% розчину сірчаної кислоти з експозицією 40 хвилин проріст на живильних середовищах зменшується до 11.1%, інтенсивність та швидкість росту не знижується. При застосуванні 18% розчину з експозицією 50 хвилин проріст складає також 11.1%, але термін появи перших колоній на живильному середовищі скорочується на 10 діб, а кількість виділених колоній зменшується до 20 - 50 колоній. При застосуванні 20% розчинів сірчаної кислоти, хоча проріст сторонньої мікрофлори знижується до 6.6-8.9%, але відмічається зменшення кількості виділених колоній та сповільнення термінів появи перших колоній на живильних середовищах на 15-28 діб у порівнянні з обробкою 18% розчином сірчаної кислоти та експозицією 40 хвилин. Таблиця Приклад 1 Приклад 2 Приклад 3 Приклад 4 Приклад 5 Приклад 6 Приклад7 Приклад 8 Приклад 9 Прототип розчин сірчаної кислоти 15% 15% 15% 18% 18% 18% 20% 20% 20% 18% експозиція (хвилин) 30 40 50 30 40 50 30 40 50 30 кількість висіяних пробірок 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45 кількість росту банальної мікрофлори пробірок відсоток 42 93.3% 40 88.8% 36 80.0% 20 44.4% 5 11.1% 5 11.1% 4 8.9% 4 8.9% 3 6.6% 18 40.0% інтенсивність строки появи росту 1-х колоній # # # # # +++ +++ ++ + # 30 діб 28 діб 30 діб 28 діб 30 діб 40 діб 45 діб 45 діб 58 діб 28 діб + - ріст мікобактерій від 1 до 10 колоній на живильному середовищі ++ - ріст мікобактерій від 10 до 20 колоній на живильному середовищі +++ - ріст мікобактерій від 20 до 50 колоній на живильному середовищі # - ріст мікобактерій більше 50 колоній на живильному середовищі Результати проведених досліджень свідчать про те, що при застосуванні розробленого способу обробки проб об'єктів зовнішнього середовища ріст сторонньої мікрофлори менше на 31% і при цьому не відмічається змін у швидкості та інтенсивності росту культур мікобактерій на живильному середовищі.