Спосіб одержання контрінсулінового фактора, який блокує зв’язування інсуліну з його рецептором та має діабетогенну дію

Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии, к способам получения контринсулинового фактора, блокирующего связывание инсулина, который может найти применение при изучении этиологии и патогенеза сахарного диабета и других инсулинрезистентных состояний в экспериментальной эндокринологии, фармакологии и биохимии и патофизиологии. Наиболее близким к предлагаемому способу является "способ получения диабетогенного фактора" [1], согласно которому. кровь обрабатывают антикоагулянтом (цитратом или оксалатом натрия), отделяют плазму крови и обрабатывают ее охлажденным насыщенным раствором сернокислого аммония, осадок растворяют в физиологическом растворе, проводят диализ, диализат подвергают ультрацентрифугированию в градиенте плотности сахарозы и получают осадок диабетогенного фактора. Однако в рассмотренном способе из плазмы крови выделяется только одна (электрофоретически гомогенная) белковая фракция, обладающая диабетогенными свойствами, и не учитывается возможность наличия таких свойств у белков други х фракций. Кроме того, применение насыщенного раствора сульфата аммония вызывает не всегда обратимую денатурацию белков и может снижать биологическую активность конечного продукта. Недостатком способа является также его техническая сложность и длительное время, необходимое для проведения диализа и ультрацентрифугирования. В основу предложенного изобретения поставлена задача разработать более простой и специфичный способ получения в мягких условиях из плазмы крови фактора, блокирующего связывание инсулина с его рецепторами, с целью более полного извлечения из плазмы крови белковых фракций, обладающих соответствующей активностью. Поставленная задача решается тем, что контринсулиновый фактор получают из плазмы крови человека или животных, которую обрабатывают активированным углем, покрытым декстраном, а затем фракционируют методом аффинной хроматографии на агарозе с иммобилизированным инсулином с последующей элюцией целевого продукта HCl-глициновым буфером рН 2,5 и нейтрализацией до рН 7,4. Применение указанного буферного раствора для элюции контринсулинового фактора является оптимальным вариантом с точки зрения выхода конечного продукта и сохранения его биологических свойств. Способ осуществляется следующим образом. Плазму крови полученную от больных диабетом или здоровых людей, или же от животных (крыс), очищают от эндогенного инсулина известным способом путем добавления равного объема 1 %-ной суспензии активированного угля (Norit А) в 0,1%-ном водном растворе декстрана Т 70, инкубации при покачивании в течение 15 минут с последующим центрифугированием при 3000 об/мин, 15 минут. Полученную надосадочную жидкость пропускают через колонку, заполненную агарозой АН с иммобилизованным инсулином человека, промывают 0,25 М трис-буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCI и 0.1% тритона Х100; целевой продукт элюируют 0,1 М HCl-глициновым буферным раствором, рН 2,5 с последующей нейтрализацией раствора до рН 7,4 0,1 М раствором NaOH. Полученный бесцветный раствор содержит 5001000 мкг белка в 1 мл, выход конечного продукта составляет 200+27 мкг из 1 мл исходной плазмы крови больных диабетом (n=15) или 100+12 мкг из 1 мл донорской плазмы (n=10). При необходимости целевой продукт может быть диализован против дистиллированной воды, а затем сконцентрирован в 2-3 раза упариванием в потоке воздуха или лиофилизирован. Все описанные операции, кроме диализа, проводят при комнатной температуре. Полученный препарат хранится при -20°С до 3 месяцев. Пример 1. Для получения контринсулинового фактора берут 20 мл гепаринизированной крови крыс, центрифугир уют при 3000 об/мин в течение 15 мин, отделяют плазму крови и проводят обработку суспензией активированного угля как описано выше. Полученную после центрифугирования надосадочную жидкость пропускают через колонку 1x5 см, заполненную агарозой АН с иммобилизованным на ней инсулином, при скорости протекания раствора около 1 мл в минуту. Затем колонку промывают 30-ю мл 0,25 М трис-НСІ буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCI и 0,1% тритона Х-100. Элюцию целевого продукта проводят 0,1 М HCI-глициновым буферным раствором, рН 2,5 в объеме 5 мл и немедленно нейтрализуют до рН 7,4, добавляя 0,1 М раствор NaOH. Полученный элюат содержит 1200 мкг белка в 1 мл, выход конечного продукта составляет 120 мкг из 1 мл исходной плазмы крови крыс. Биологическую активность контринсулинового фактора проверяют путем однократного введения крысам 30 мкг препарата на 100 г массы тела в хвостовую вен у и дальнейшей (через 48 ч) постановки глюкозотолерантного теста, для чего крысам перорально вводят 40%-ный раствор глюкозы в дозе 300 мг на 100 г массы тела. Кровь отбирают до введения глюкозы, через 60, 120 и 180 мин, определяют содержание глюкозы и строят сахарную кривую. Повышение уровня глюкозы натощак по сравнению с соответствующими показателями у тех же животных до введения препарата, а также смещение во времени максимума содержания глюкозы в крови и замедление возвращения данного показателя к исходному уровню свидетельствует о наличии диабетогенной активности целевого продукта. Пример 2. Берут 20 мл гепаринизированной крови больного диабетом типа 2, не получавшего ранее терапию инсулином, или крови донора. Дальнейшие операции (отделение плазмы крови, ее обработку активированным углем, аффинную хроматографию) проводят согласно примеру 1. Полученный с колонки элюат содержит от 500 до 600 мкг белка в 1 мл, выход конечного продукта составляет 134 ±24 мкг из 1 мл исходной плазмы больных диабетом (n=15) или 60 ± 10 мкг из 1 мл донорской плазмы (n=10). Проверка биологического эффекта In vi vo проводится, как описано в примере 1. При введении крысам (n=10) контринсулинового фактора, полученного из плазмы крови людей, в количестве 30 мг на 100 г массы тела животных, уровень глюкозы в крови натощак составил 144 ± 12 мг% по сравнению с 80 ± 13 мг% у контрольных животных При инкубации полученного фактора количестве 0,30 нг (по содержанию белка) 5x109 эритроцитов здоровых доноров группы АВО в присутствии 300 ВК I инсулина и возрастающих количеств немеченого инсулина (5-10-50-100-200-10x105 нг) в объеме 0.7 мл в течение 18 ч при 4°С, определяют количество инсулиносвязывающих мест по методу Скетчарда. В данном примере число связывающих мест на 1 эритроцит в присутствии контринсулинового фактора снизилось на 75,0 ± 10,1% (n=10) по сравнению с соответствующим показателем, полученным при инкубации эритроцитов без контринсулинового фактора. Таким образом, полученный согласно заявляемому способу контринсулиновый фактор проявляет диабетогенные свойства в эксперименте на животных, ингибирует специфическое связывание инсулина с его рецепторами и может найти применение при изучении этиологии и патогенеза сахарного диабета в экспериментальной эндокринологии, фармакологии, биохимии и патофизиологии.