Спосіб одержання контррецепторного фактора, який блокує зв’язування інсуліну з його рецептором та має діабетогенну дію

Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии, к способам получения контррецепторного фактора, блокирующего связывание инсулина, который может найти применение при изучении этиологии и патогенеза сахарного диабета и других инсулинрезистентных состояний в экспериментальной эндокринологии, фармакологии, биохимии и патофизиологии. Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения диабетогенного фактора, согласно которому кровь обрабатывают антикоагулянтом (цитратом или оксалатом натрия), затем выделенную плазму крови обрабатывают охлажденным насыщенным раствором сернокислого аммония, осадок растворяют в физиологическом растворе, проводят диализ, диализ подвергают ультрацентрифугированию в градиенте плотности сахарозы и получают осадок диабетогенного фактора. Однако в рассмотренном способе из плазмы крови выделяется только одна (электрофоретически гомогенная) белковая фракция, обладающая диабетогенными свойствами, и не учитывается возможность наличия таких свойств у белков други х фракций. Кроме того, способ требует применения больших количеств сульфата аммония и предусматривает длительные стадии диализа и ультрацентрифугирования. В основу предложенного изобретения поставлена задача разработать менее сложный технически и более специфичный способ получения из плазмы крови фактора, блокирующего связывание инсулина с его рецепторами, с целью более полного извлечения из плазмы крови белковых фракций, обладающих соответствующей активностью. Поставленная задача решается тем, что контррецепторный фактор получают из плазмы крови человека или животных, которую обрабатывают активированным углем, покрытым декстраном, а затем фракционируют методом афинной хроматографии на агарозе с иммобилизированными рецепторами инсулина с последующей элюцией целевого продукта HCl-глициновым буфером рН 2,5 и нейтрализацией до рН 7,4. Применение указанного буферного раствора для элюции контррецепторного фактора является оптимальным вариантом с точки зрения выхода конечного продукта и сохранения его биологических свойств. Способ осуществляется следующим образом. Плазму крови, полученную от больных диабетом или здоровых людей, или же от животных (крыс), очищают от эндогенного инсулина известным способом путем добавления равного объема 1 %-ной суспензии активированного угля (Norit А) в 0,1%-ном водном растворе декстрана Т 70, инкубации при покачивании в течение 15 мин с последующим центрифугированием при 3000 об/мин, 15 минут. Полученную надосадочную жидкость пропускают через колонку, заполненную агарозой с иммобилизованными рецепторами инсулина, промывают 0,25 М трис-буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCI и 0,1% тритона Х-100; целевой продукт элюируют 0,1 М HCl-глициновым буферным раствором, рН-2,5 с последующей нейтрализацией раствора до рН 7,4 0,1 М раствором NaOH. Полученный бесцветный раствор содержит 150 - 200 мкг белка в 1 мл. При необходимости целевой продукт может быть диализован против дистиллированной воды, а затем сконцентрирован в 2 - 3 раза упариванием в потоке воздуха или лиофилизирован. Все описанные операции, кроме диализа, проводят при комнатной температуре. Полученный препарат хранится при -20°С до 3 месяцев. Пример 1. Для получения контррецепторного фактора берут 20 мл гепаринизированной крови крыс, центрифугир уют при 3000 об/мин в течение 15 мин, отделяют плазму крови и проводят обработку суспензией активированного угля, как описано выше. Полученную после центрифугирования надосадочную жидкость пропускают через колонку 1 х 5 см, заполненную агарозой 4В с иммобилизованными на ней рецепторами инсулина, при скорости протекания раствора около 1 мл в минуту. За тем колонку промывают 30-ю мл 0,25 М трис-HCt буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCI и 0,1% тритона Х-100. Элюцию целевого продукта проводят 0,1 М HCl-глициновым буферным раствором, рН 2,5 в объеме 5 мл и немедленно нейтрализуют до рН 7,4, добавляя 0,1 М раствор NaOH. Биологическую активность контррецепторного фактора проверяют путем однократного введения крысам 30 мкг препарата на 100 г массы тела в хвостовую вен у и дальнейшей (через 48 ч) постановки глюкозотолерантного теста, для чего крысам перорально вводят 40%-ный раствор глюкозы в дозе 300 мг на 100 г массы тела. Кровь отбирают до введения глюкозы, через 60, 120 и 180 мин, определяют содержание глюкозы и строят сахарную кривую. Повышение уровня глюкозы натощак по сравнению с соответствующими показателями у тех же животных до введения препарата, а также смещение во времени максимума содержания глюкозы в крови и замедление возвращения данного показателя к исходному уровню свидетельствует о наличии диабетогенной активности целевого продукта. Пример 2. Берут 20 мл гепаринизированной крови больного диабетом типа 2, не получавшего ранее терапию инсулином, или крови донора. Дальнейшие операции (отделение плазмы крови, ее обработку активированным углем, аффинную хроматографию) проводят согласно примеру 1. Полученный с колонны элюат содержит от 500 до 600 мкг белка в 1 мл, выход конечного продукта составляет 134 ±24 мкг из 1 мл исходной плазмы больных диабетом (n=15) или 60 ± 10 мкг из 1 мл донорской плазмы (n=10). Проверка биологического эффекта In vi vo проводится, как описано в примере 1. При введении крысам (n=10) контррецепторного фактора, полученного из плазмы крови людей, в количестве 30 мг на 100 г массы тела животных, уровень глюкозы в крови натощак составил 108 ±3 мг%, а через 30, 60, 120 и 180 мин после внутрижелудочного введения 40%-ного раствора глюкозы (300 мг на 100 г массы тела) - соответственно 115 ± 14 мг%, 170 ± 18 мг%, 155 ± 15 мг%, 150 ± 12 мг% (n=6), в то время как у контрольных животных (n=10) соответствующие показатели составили 80 ± 13 мг% (исходный уровень), 130 ± 11 мг%, 124 ± 17 мг%, 97 ± 15 мг% и 80 ± 10 мг% в те же сроки, что и при исследовании опытных животных. При инкубации полученного фактора в количестве 0,36 нг (по содержанию белка) с 5 х 10 эритроцитов здоровых доноров группы АВО в присутствии 300 ВК 1 инсулина и возрастающих количеств немеченного инсулина (5 - 10 - 50 - 100 - 200 - 10×105 нг) в объеме 0,7 мл в течение 18 ч при 4°С, определяют количество инсулинсвязывающих мест по методу Скетчарда. В данном примере число связывающих мест на 1 эритроцит в присутствии фактора снизилось на 73,0 ± 9,5% по сравнению с соответствующим показателем, полученным при инкубации эритроцитов без контррецепторного фактора. Таким образом, полученный согласно заявляемому способу контррецепторный фактор проявляет диабетогенные свойства в эксперименте на животных, ингибирует специфическое связывание инсулина с его рецепторами и может найти применение при изучении этиологии и патогенеза сахарного диабета в экспериментальной эндокринологии, фармакологии, биохимии и патофизиологии.