Препарат тканинних біологічно активних речовин, який має регенаторну дію, та спосіб його одержання

1. Препарат тканевых биологически активных веществ, обладающий регенераторным действием, содержащий комплекс водорастворимых полипептидов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в состав комплекса водорастворимых полипептидов входят полилептиды с молекулярной массой 4-12 кДа с максимумом спектра поглощения в УФ-области 200-220 нм. 5743 олкосерил (депротеинизированный эксракт крови телят), тималин (эксракт тимуса), ирепар (экстракт печени), спленин (эксрзкт селезенки) и ряд других препаратов Иурашко В.В., Чечемова П.М. Солкосерил в 5 ечении язвенной болезни. - Советская меицина. - 1979, № 2. - с. 97-99; Козлов В.А., Іимбалюк А.В., Некачалов В,В. Влияние тиіалина на процессы регенерации при переомах нижней челюсти. - Стоматология. - 10 979. — № 5. — с. 1-4; Спесивцев ОТ., Гольанская Л.Д. Применение спленина в компексном лечении больных туберкулезом егких. - Проблемы туберкулеза. - 1985. - fsfe і.-с. 28-31). 15 Активность этих препаратов дала осноіание для поиска веществ полипептидной |рироды из других сырьевых источников. В астности известен препарат "солкосерил", одержащий комплекс водорастворимых 20 юлипептидов и амино-, кето- и оксикислоы, дезоксирибонуклеотиды и пурины. Преіарат получен путем экстракции крови ;рупного рогатого скота. Препарат стимули)ует ретикулоэндотелиальную систему, 25 улучшает усвоение кислорода тканями, уско)яет репаративные процессы в тканях [1]. Однако, солкосерил не оказывает прямого ярковыраженного нормализующего действия на процессы перекисного окисле- 30 ния липидов и гемокоагуляции, т.к. не содержит достаточной доли чистых юл и пептидов. Soltysiak-Pawluczuk D., fedrych A., Jastrzebsk! Z,. Czyzewska-Szafran H.. Danysz A.. Modulation of anticancer drug 35 lOxlcity by solcoseryl, Arch-lmmunol-TherExp-Warsz. 1991; 39(3), 253-259; Kryst L. Kowalik S., Bartkowski S., Hennlng G. Solcoseryl-dentys-tyczna pasta przyiegajacaw leczeniu ostrego popromiennego zapalenia 40 blony sluzowej Jamy ustnej, dzlasel I jezyka. Wieloosrod-kowe badanfa porownawoze SDAP і linomagu. Czas-Stomatol. 1990, Jul; 43(7); 412-418; Malov l.S. Vlilante nekotorykh provivoiazvennykh preparatov па gumoral'nyi 45 immunitet. Klln-Med-Mosk, 1991 Oct; 69(10); 71-74; Satoh H., Mori Y. Experimental study of protective effect of solcoseryl on clsplatln nephrotoxicity Gan-To-Kagaku-Ryoho. 1992 Jan; 19(1); 89-93). 50 Известен также фибринолитический фермент - люмброкиназа, содержащий три основные фракции, которые представлены химорипсинподобным, трипсинподобным ферментами и ферментом с уникальными 55 свойствами. Препарат получен путем солевой экстракции исходного сырья, в качестве которого используют кольчатых червей Lumbrlcus rubellus [2]. Фибринолитическая активность фермента больше 100 единиц плазминогенз или 250 урокиназных единиц на грамм. Молекулярный вес больше 20 кДа и изоэлектрическая точка 3,4. Известен также протеиназоингибирующий фермент, полученный путем солевой экстракции из целомической жидкости кольчатых червей Lumbricoldeus terrestrls, содержащий два белка с молекулярной массой 20 и 42 кДа [3]. Недостатком известных препаратов на основе кольчатых червей является то, что они не обладают выраженным регенераторным действием. В то же время недостатком способа получения препаратов путем солевой экстракции является недостаточная способность вытеснять связанные высокогидрофильные и сильно заряженные соединения, что может быть решено посредством использования кислотной экстракции [4]. Наиболее близким к описываемому способу получения заявляемого препарата является способ получения экстракта из тимуса, включающий уксусно-кислую экстракцию исходного сырья, в качестве которого используют тимусы крупного рогатого скота. Экстракцию сырья ведут 3% уксусной кислотой в течение трех суток с последующим отделением надосадочной жидкости при центрифугировании при 3000 об/мин. К надосадочной жидкости добавляют ацетон в соотношении 1:8. После формирования осадка жидкость удаляют, а осадок промывают ацетоном и эфиром, высушивают на воронке Бюхнера с получением целевого продукта, содержащего биологически активные вещества. Полученный этим способом препарат ускоряет развитие грануляционной ткани и эпителизацию ожоговых ран, но не оказывает влияния на характер построения новообразующейся соединительной ткани, ориентацию колагенових волокон, поскольку не обеспечивает получения требуемого спектра комплекса полипептидов [5]. В основу изобретения поставлена задача получения препарата тканевых биологических активных веществ, обладающих регенераторным действием с использованием для его получения кольчатых червей Elsenla foetida, что снижает себестоимость препарата и расширяет сырьевую базу за счет доступности исходного сырья. Поставленная задача решается тем, что в состав комплекса водорастворимых полипептидов препарата тканевых биологически активных веществ входят полипептиды с молекулярной массой 4-12 кДа с максимумом спектра поглощения в УФ области 200220 нм. 5743 экстракцией пептидные факторы массой 4Полипептидный препарат получают пу12 кДа могут быть регуляторами регенератем уксусно-кислой экстракции исходного ции. Увеличение молекулярной массы сырья, в качестве которого используют кольсвыше 12 кДа приводит к появлению у полчатых червей Eisenia foetlda. Lumbricoideus ferrestris и др, представителей кольчатых 5 ипептидных молекул свойств ферментов и иммуномодуляторов (см. Кетлинский С.А., червей. Биологическую массу червей, выдерСимбирцев А.С, Воробьев А.А. Эндогенные жанную в течение суток в физиологическом иммуномодуляторы. - СПб.: Гиппократ, растворе 0,9% NaCI, измельчают до размера 1992. -256 с.) и ведет к снижению регенера2x2x2 мм. После этого полученную массу заливают холодным (+4°С) ацетоном (особо 10 торного действия. При снижении молекулярной массы ниже 4 кДа у молекул также чистым), с соотношении 1:8. После 12 часов теряются регенераторные свойства, так как выдержки при 4°С ацетон сливают, массу эти вещества в основной своей массе предвысушивают. После этого смешивают в соотставлены гормонами. ношении 1:10с 3% раствором уксусной кислоты с 0,1 % хлорида цинка и 0,1 % хлорида 15 Эксперимент был проведен на 20 белых магния, в течение 72 ч при постоянном перекрысах линии "Wistar" обоих полов, средней мешивании (4°С). Жидкую часть смеси после массой 200 г. Животным был нанесен дозифильтрации через ткань и фильтры 0,2 мкм рованный дефект кожи спины размером 416 смешивают с ацетоном в соотношении 1:10, кв. мм, круглой формы под эфирным нарковыдерживают 12 ч при температуре 4°С. 20 зом. Исследованные животные были раздеДисперсную часть отмывают ацетоном и лены на 2 группы: эфиром в соотношении 1:10, высушивают. 1 гр - спонтанное заживление (5 крыс), Полученное вещество растворяют в дистил2 гр. - животным внутримышечно вводилированной воде рН = 4,5 (1:10) и лиофилили препарат на физиологическом растворе зируют. 25 (0,1 мл) в дозе 0,1 мг сухого вещества на крысу. Препарат вводили через час после Изучение физико-химических свойств нанесения дефекта, а затем каждый день в препарата потребовало проведения биуретечение 10 суток. товой реакции, которая характерна для пептидного типа связей, снятия спектров Смертности животных не наблюдалось. поглощения водного раствора препарата, а 30 Визуально наблюдали некоторые особеннотакже проведения жидкостной хроматограсти состояния раневой поверхности, у живофии. Результаты биуретовой пробы были потных 1 группы корка на ране была более зитивными. Спектр поглощения препарата темная и грубая, а у животных 2 группы имел характерный пик в УФ области (см, струп по отношению к подлежащим тканям фиг.1). Хроматографию проводили на прибо- 35 был более эластичным и подвижным. ре "Милихром-4" с применением колонки 1 Для объективности контроля процесса мм х 250 мм, заполненной сорбентом "Силазаживления раны проводили планиметрию сорб С-18", элюент: ацетонитрил:вода (1:1) в дефекта: полиэтиленовая пленка приклады0.1% ортофосфорной кислоте. Детекция валась к дефекту, его границы обрисовывапроводилась при длине волны 210 нм. Хро- 40 лись, затем контуры переносились на матограмма препарата представлена на бумагу, соответствующий участок ее вырефиг.2. зался и взвешивался. Вес сравнивали с эталоном площади и результат выражали в Таким образом препарат представляет квадратных миллиметрах. Эти измерения комплекс водорастворимых полипептидов с молекулярной массой 4-12 кДа, обладаю- 45 проводили 5 раз в течение 15 дней. щих щелочными свойствами, с максимумом Гистологические наблюдения кожи проспектра поглощения в УФ области (200-220 водили при обьективе 10-кратного увеличения нм), имеющих характерную хроматографии дальнейшем микрофотографировании. ческую кривую с 8 основными фракциями: Ткани фиксировались в 10% растворе нейтудельный вес - 10,4; 5,8; 2,9, 35,4; 6,6; 16,0, 50 рального формалина, заливались в парафин 12.7; 8,2%; время удерживания 8, 10, 17, 20, и окрашивались гематоксилин-эозином. 22, 25, 27, 30 мин соответственно Для изучения влияния препарата на соВ исследованиях, проведенных авторастояние некоторых защитных систем были ми не выявлено токсичности препарата, но проведены исследования in vitro с кровью дальнейшее изучение продолжается. 55 интактных морских свинок. У животных отИзучение биологической активности бирали до 20 мл крови, которую стабилизипрепарата базировалось на том факте, что ровали 3,8% раствором цитрата натрия, олигохеты способны к регенерации больКровь, не смешивая, разделяли на 6 проб по ших участков тела, и на предположении, что 10 мл в каждой В дальнейшем каждая проба полученные из такого сырья уксуснокислой была вновь разделена на две части по 5 мл. 7 5743 лз которых одна должна была быть контэольной, а другая опытной. В контрольные пробы (К) вносили по 0,1 мл 0,15 М раствора МаСІ, а в опытные (О) - по 0,1 мл такого же заствора, который имел 0,1мг сухого препа- 5 эата (из расчета 0,02 мг препарата на 1 мл фови). Кровь с указанными добавками инкуэировали в течение 30 мин при 37°С. В плазме тичные пучки волокон новообразованной 8 соединительной ткани с расширенной васкуляризацией сосудами различного калибра. На микрофотографии 2 у животных, которым вводили препарат, отмечается немного другая картина. Эпидермис интенсивно перемещается по струпу. Сам струп более нежный. Направление соединительнотканных пучков более систематизировано. В целом процесс заживления дефекта более интенсивный и адекватный. На микрофотографии 3 представлено заживление кожного дефекта на 45 день после нанесения дефекта у контрольных животных. Эпидермис покрывает всю поверхность дефекта. На участке дефекта наблюдаются рыхлые хаотичные пучки соединительной ткани. У животных опытной группы {микрофотография 4) не обнаружено подобных изменений. Пучки соединительной ткани ориентированы и более компактны. Таким образом, препарат имеет выраженный регенераторный эффект, особенно в ранние сроки заживления раны. Как видно из приведенных в табл.2 данных, препарат в исследованиях in vitro вызывал умеренную гипокоагуляцию. Анализ данных табл.3 показывает, что препарат снижал активность супероксиддисмутазы, увеличивал спонтанный гемолиз эритроцитов и исходную концентрацию МДА в эритроцитах. После 1,5-часовой инкубации эритроцитов в прооксидантном буферном растворе под воздействием препарата повышалась концентрация МДА по сравнению с контрольными пробами. Возможно это отображает индуцированную препаратом оксидативную активность нейтрофилов, которая необходима для бактерицидной активности и очищения раневой поверхности от погибших клеток. Но, процент прироста МДА за время инкубации в опытной серии оказался существенно более низким, чем в контрольной, что указывает на мобилизацию антиоксидантной защиты под воздействием препарата, В целом заявляемый препарат обуславливает эффективное регенераторное действие, прост и дешев в производстве, не требует дорогого сырья и оборудования. 5743 10 T абли ца1 Динамика заживления раневого дефекта по данным планиметрии Дни иссле 3 6 8 10 15 433,0 455,0 464,0 389 0 109,0 + 10 1 + 15,2 + 20,2 + 21 7 + 5,4 422 7 326,3 307,3 281,7 86,5 + 9,2 + 19,6 + 24,2 + 23,5 + 8,2 р >0,05 р < 0,05 р < 0,05 р < 0,05 р < 0,05 97,4 71,7 66,2 72,4 79,4 2,6 28.3 33 8 27 6 20.6 , дований Площадь 1гр раневого дефекта 2гр. (кв.мм) % площади леченной раны от нелеченной % ускорения заживления раны Таблица2 Влияние препарата на показатели коагулограммы в исследованиях in vitro Время Каолиновое Тромбиновое Протромбиновое рекальцификз время с время, с время, с АЧТВ.с ции, С О К 60 71 81 55 97 127 67 К 1 0 К 100 I О К 30 20 57 29 64 72 75 50 92 95' 70 155 80 130 95 65 t = 2 52 р< 005 О К 41 46 50 55 30 37 45 42 47 27 27 44 48 47 59 63 22 24 47 51 40 57 65 21 27 73 180 90 101 " 220 t = 5.0 р 025 I t =5 0 р < 0 01 1 О 90 Х- 4 39 р- 001 11 5743 12 Табл ицаЗ пияние препарата на показатели своБоднорадикального окисления крови в опытах in vitro сод, ПРЭ, ЕД % гемолиза t (Э К Малоновый деальдегид, мкмоль/л I 0 ДО К инкубации 1 О после инкубации К 1 О % прироста К 1 О 41 1 56 2,75 - 2,94 3,36 2,16 8,89 5,53 164,5 156 ,0 16 1,12 2,16 2,72 0,72 3,36 4,81 7.93 568,1 136 ,0 43 1 27 2,32 3,10 0,72 5,29 5,29 7,69 634,7 21 1 00 2,44 2.29 0,72 3,12 0.96 9,37 33,3 200 3 38 1 27 2,83 3,18 1,20 3,36 2,16 6,97 80,0 107,4 12 1 50 2,21 2,70 1,41 3,52 4,45 7,53 115,6 113 ,9 t = 2,1 t - 1.7 г - 1.8 p < 0,05 p < 0,05 р < 0,05 Микрофотография 1 Заживление кожного дефекта у контрольных крыс на 21 день исследования X= 1,2 Р