Набір моноклональних антитіл к3, к7, специфічних до імуноглобулінів класу g великої рогатої худоби, придатних до використання у імуноферментному аналізі

УКРАЇНА (19) UA (11) 16035 (13) U (51) МПК (2006) C12N 5/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ видається під відповідальність власника патенту (54) НАБІР МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ К3, К7, СПЕЦИФІЧНИХ ДО ІМУНОГЛОБУЛІНІВ КЛАСУ G ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ, ПРИДАТНИХ ДО ВИКОРИСТАННЯ У ІМУНОФЕРМЕНТНОМУ АНАЛІЗІ 1 2 Характеристика моноклональних антитіл Назва МКАТ К3 К7 Ізотип IgG1 IgG1 Константа афінності, 109моль/л 5,0 5,0 Титр антитіл у культуральній рідині* 1:800 1:1000 *тестування у непрямому твердофазному ІФА на IgG ВРХ (сорбція 2мкг/мл) Приклад 1. Одержання та очистка МКАТ із асцитичної рідини Для нагромадження значної кількості МКАТ гібридоми-продуценти антитіл культивували у черевних порожнинах мишей. Для цього за 10-14 днів до ін'єкції клітин мишам вводили внутрішньочеревно по 0,5мл пристану. Мінеральне масло служило сильним стимулятором асцитоутворення. Потім вводили від 106 до 107 гібридом-продуцентів МКАТ в 1мл середовища. Через 5-8 днів у мишей почи нала накопичуватися рідина в черевній порожнині. Її відбирали шляхом проколювання черевної стінки товстою голкою. З однієї миші за кілька разів вдавалося отримати від 5 до 10мл асцитичної рідини. Після центрифугування при 3000об/хв на протязі 5 хвилин асцит зберігали в замороженому стані. Антитіла, що знаходяться в асциті, осаджували сульфатом натрію (18% та 16%), розчиняли у дистильованій воді, переосаджували сульфатом (13) 16035 Таблиця (11) імуноферментних тест-системах для серологічної діагностики. Найбільш близьким до запропонованих є моноклональні антитіла, які взаємодіють із IgG ВРХ [2]. У порівнянні із вищезгаданим антитілами клони К3, К7 характеризуються більшою специфічністю та активністю у імуноферментному аналізі. Моноклональні антитіла продукуються гібридними клітинами, що одержані при злитті мієломних мишачих клітин Sp 2/0 та спленоцитів мишей лінії Balb/c. Клони МКАТ КЗ, К7 характеризуються наступними ознаками (Таблиця). UA Корисна модель стосується імунохімії та гібридомної технології і може бути використана для одержання моноклональних антитіл (МКАТ) до імуноглобулінів класу G великої рогатої худоби (ВРХ) та їхніх імуноферментних кон'югатів. Метою винаходу є одержання нових моноклональних антитіл до IgG ВРХ, придатних для використання у імуноферментному аналізі (ІФА). Відомі МКАТ до імуноглобулінів класу G ВРХ [1]. Проте згадані моноклональні антитіла направлені до підкласів імуноглобулінів класу G великої рогатої худоби і непридатні для використання у U (57) Набір моноклональних антитіл К3, К7, специфічних до імуноглобулінів класу G великої рогатої худоби, придатних до використання у імуноферментному аналізі, який характеризується тим, що моноклональні антитіла набору мають високі константу афінності та титр у культуральній рідині. (19) (21) u200601607 (22) 16.02.2006 (24) 17.07.2006 (46) 17.07.2006, Бюл. №7, 2006р. (73) ТОВАРИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ "НАУКОВО-ВИРОБНИЧА КОМПАНІЯ "ВІТРОТЕСТ" 3 16035 4 амонію (50%) та розчиняли у мінімальній кількості 4°С в концентрації 2,5мкг/мл. Для відмивання виводи. користовували фосфатно-сольовий буфер з додаПриклад 2. Спосіб одержання кон'югату монованням 0,05% твін-20 (ФСБТ), рН7,2-7,4. У лунки клональних антитіл з пероксидазою хрону. планшету вносили досліджувані зразки сироваток Кон'югацію МКАТ з пероксидазою хрону здійскрові ВРХ чи молока корів. Планшет інкубували 1 нювали у співвідношенні антитіл до ферменту 2:1 годину при 37°С і потім відмивали. Для виявлення (масові долі) методом періодатного окислення за зв'язаних антитіл використовували кон'югат МКАТ Р. Tijssen [3] із власними модифікаціями. до IgG ВРХ з пероксидазою хрону, який інкубували При окисленні пероксидазу хрону розчиняли у 1 годину при кімнатній температурі. Планшет тричі 0,1М бікарбонатному буфері, рН8,3, до концентравідмивали ФСБТ і один раз водою. Як субстрат ції 15мг/мл та додавали такий же об'єм 14мМ водвикористовували 0,003% розчин перекису водню в ного розчину періодату натрію. Суміш інкубували 0,15М цитратному буфері, рН5,0, а як хромоген протягом 2 годин при кімнатній температурі. Одеорто-фенілендиамін. Реакцію зупиняли 2М сірчаржаний таким чином розчин активованої пероксиною кислотою. дази додавали до розчину антитіл, які попередньо Оптичну щільність при довжині хвиль 492нм і діалізували проти 0,1М карбонатного розчину, 630нм вимірювали на спектрофотометрі. рН9,2. Суміш переносили у герметичну хроматогПерелік літературних посилань: рафічну колонку та додавали 1/3 частину сухого 1. Saegermana С., De Waeleb L., Gilsonb D. et сефадексу G25, інкубували протягом 3 годин при al. Evaluation of three semm i- ELISAs using кімнатній температурі. monoclonal antibodies and protein G as peroxidase По закінченні інкубації, розчин кон'югату елюconjugate for the diagnosis of bovine brucellosis // ювали з колонки та зупиняли реакцію додаванням Veterinary Microbiology. - 2004. - Vol. 100, 1-2. 1/20 об'ємні частини водного розчину NaBH4 P.91-105. (5мг/мл), залишаючи на 30хв. при кімнатній темпе2. Kittelbergera R., Reichela M., Meynella R. et ратурі. Після цього ще додавали 3/20 частини розal. Detection of antibodies against the core protein чину боргідриду натрію, інкубували протягом 60хв. p24 of the bovine leukaemia virus in cattle for Одержаний розчин пероксидазного кон'югату confirmatory serological testing // Journal of МКАТ переводили у 0,02М фосфатний буфер з і Virological Methods. - 1999. - Vol. 77, 1. - P.109-114. 0,15 М NaCl шляхом діалізу. 3. Tijssen P. Preparation of enzyme-antibody or Приклад 3. Спосіб використання кон'югату моenzyme-macromolecule conjugates // Laboratory ноклональних антитіл з пероксидазою хрону. techiques in biochemistry and molecular biology: Сорбцію рекомбінантного антигену збудника practice and theory of enzyme immunoassays / бруцельозу Brucella abortus у полістиролових Editors R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg. планшетах проводили у 0,05М карбонатAmsterdam: Elsevier, 1985. - P.221-241. бікарбонатном буфері (рН9,6) протягом ночі при Комп’ютерна верстка М. Ломалова Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601