Тест-система діагностична імуноферментна для визначення антитіл класу igg до brucella abortus у сироватках крові та в молоці великої рогатої худоби (“dia-brucella ab.-combi-v”)

Винахід належить до імунохімії, ветеринарної медицини та може бути використаний для проведення імунологічних досліджень, діагностичних аналізів сироваток крові та молока великої рогатої худоби на наявність антитіл класу IgG до Brucella abortus. Відомий тест для виявлення протибруцельозних антитіл тільки в сироватках крові ВРХ базується на імуноферментному аналізі (ІФА) [1]. Для визначення антитіл проти бруцел в молоці ця тест-система не призначена. В основу винаходу покладено завдання створити імуноферментну тест-систему для визначення наявності антитіл класу IgG до Brucella abortus в сироватках крові та молоці ВРХ на основі антигенів, виділених з очищених культур штаму збудника бруцельозу - Brucella abortus 1119. Антигени сорбують на поверхні полістиролових планшетів. В складі кон'югатів використовуються моноклональні антитіла (анти IgG ВРХ), мічені ферментом. Ферментативну реакцію визначають за допомогою проявника. За одну постановку (70хв) можна проаналізувати 88 сироваток. Інтенсивність забарвлення в лунках із зразками сироваток або молока пропорційна концентрації специфічних антитіл до Brucella abortus. Облік результатів проводять відносно інтенсивності забарвлення в лунках із контролем граничного значення (КГЗ) візуально або вимірюють оптичну густину суміші у лунках за допомогою спектрофотометра. Приклад 1. Визначення антитіл проти антигенів збудника бруцельозу в сироватці крові ВРХ. В кожну лунку стрипів планшету вносять по 80мкл розчину для розведення сироваток і по 20мкл зразків досліджуваних сироваток, залишивши вільними 5 лунок першого ряду (контрольні лунки). В одну лунку вносять 20мкл негативного контролю (К- - сироватка крові ВРХ, яка не містить антитіла проти Brucella abortus), а в другу 20мкл позитивного контролю (К+ - сироватка крові ВРХ, яка містить антитіла до Brucella abortus у високому титрі) і в три лунки по 20мкл контролю граничного значення (КГЗ) - низькотитражна позитивна сироватка. Накривають стрипи клейкою плівкою або кришкою та інкубують при кімнатній температурі 20хв. Після закінчення інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальної піпетки та промивають лунки чотири рази розчином для промивання планшетів. В лунки стрипів вносять по 100мкл розчину моноклонального кон'югату - анти IgG-BPX, міченого пероксидазою, та інкубують при кімнатній температурі 20хв. Після закінчення інкубації промивають лунки шість разів і вносять туди по 100мкл розчину проявника (перекис водню з хромогеном тетраметилбензидином) та інкубують при 18-22°С у темряві 30хв. Зупиняють кольорову реакцію, додаючи до всіх проб по 50 мкл стоп-реагенту. Не більше як через 1хв. після зупинення кольорової реакції проводять облік результатів візуально відносно інтенсивності забарвлення у лунках з КГЗ, або визначають оптичну густин у (ОГ) в лунках у дво хвильовому режимі за допомогою спектрофотометра. Приклад 2. Визначення антитіл проти антигенів збудника бруцельозу в молоці ВРХ проводять аналогічно прикладові 1, але зразки молока перед аналізом знежирюють центрифугуванням при 1500тис.об/хв протягом 15хв. Приклад 3. Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест-системи. Використовуючи названі тест-системи, досліджували сироватки крові та зразки молока (10 достеменно позитивних сироваток, 10 достеменно позитивних проб молока та 100 достеменно негативних зразків сироваток та молока). Усі зразки досліджували у чотирьох повторностях кожною тест-системою за описаною методикою. З 20 позитивних зразків наявність антитіл проти збудника бруцельозу показали 20, що становить 100% чутливості. З 100 негативних сироваток у пропонованій тест-системі виявилися справді негативними 95 (специфічність 95%). В порівняльній тест-системі з 20 достеменно позитивних зразків 1 проба молока визначена як негативна. Чутливість становила 95%. З 100 негативних зразків виявилися справді негативними 95 зразка (специфічність 95%). Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення антитіл проти антигенів збудника бруцельозу у сироватках та молоці ВРХ. Проста і надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність. Використана література: 1. Патент №48811 A UA Тест-система діагностична імуноферментна для визначення протибруцельозних антитіл в сироватках крові людини або великої рогатої худоби (ВРХ) Семиноженко В., Козаченко Л., Кириленко І. та ін. від 27.05.2002; 2. MacMillan A.P., Stack J. Bo vine bmcellosis. - In: Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, Office International des Epizootics, Paris, 2000, 4th Edition, 328-345. 3. А.Т.Ми хайлов, В.Н.Симирский ”Методы иммунохимического анализа в биологии развития”. М. ”На ука”, 1981.