Набір моноклональних антитіл g3 ,g6, g7, специфічних до імуноглобулінів людини класу g, придатних до використання у імуноферментному аналізі

УКРАЇНА (19) UA (11) 16036 (13) U (51) МПК (2006) C12N 5/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ видається під відповідальність власника патенту (54) НАБІР МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ G3 ,G6, G7, СПЕЦИФІЧНИХ ДО ІМУНОГЛОБУЛІНІВ ЛЮДИНИ КЛАСУ G, ПРИДАТНИХ ДО ВИКОРИСТАННЯ У ІМУНОФЕРМЕНТНОМУ АНАЛІЗІ 1 2 Характеристика моноклональних антитіл. Константа афінності, Титр антитіл у культураль- Титр пероксидазного кон'юній рідині* гату** 109°моль/л G3 IgG2b 11,0 1:500 1:220000 G6 IgG2b 12,0 1:1000 1:220000 G7 IgG1 5,0 1:1000 1:64000 *тестування у непрямому твердофазному ІФА на IgG людини (сорбція 5мкг/мл) **тестування у прямому твердофазному ІФА на IgG людини (сорбція 5мкг/мл) Назва МКАТ Ізотип Приклад 1. Афінне виділення моноклональних антитіл G3 та G6 із асцитичної рідини. Розморожували асцитичну рідину з вмістом МКАТ та переносили її у центрифужну пробірку та освітлювали при 4000об/хв. протягом 30хв. Після цього асцитичну рідину фільтрували через фільтри з порами 0,45мкм. Для афінної очистки використовували колонку з білком А-сефарозою об'ємом 10мл. Перед нане сенням асцитичної рідини колонку промивали із швидкістю 1,5-2мл/хв 10 об'ємами 0,02М натрійкалій фосфатного буферу, рН°7,0-7,2. Фільтровану асцитична рідину в об'ємі 20мл пропускали через колонку зі швидкістю 1мл/хв. Після цього промивали колонку 10-15 об'ємами фосфатного буферу. Елюцію проводили за допомогою 0,1М лимонної кислоти в об'ємі 15мл. Вихід МКАТ реєстрували при 280нм. Пік, який виходив із колонки збирали у (13) 16036 Таблиця. (11) Найбільш близьким до запропонованих є моноклональні антитіла, які взаємодіють із IgG людини [2]. У порівнянні із вищезгаданим антитілами клони G3, G6, G7 характеризуються більшою специфічністю та активністю у імуноферментному аналізі. Моноклональні антитіла продукуються гібридними клітинами, що одержані при злитті мієломних мишачих клітин Sp 2/0 та спленоцитів мишей лінії Balb/c. Клони МКАТ G3, G6, G7 характеризуються наступними ознаками (таблиця). UA Корисна модель стосується імунохімії та гібридомної технології і може бути використана для одержання моноклональних антитіл (МКАТ) до імуноглобулінів людини класу G та їхніх імуноферментних кон'югатів. Метою винаходу є одержання нових моноклональних антитіл до IgG людини, придатних для використання у імуноферментному аналізі (ІФА). Відомі МКАТ до імуноглобулінів людини класу G [1]. Проте згадані моноклональні антитіла непридатні для використання у імуноферментних тест-системах для серологічної діагностики. U (57) Набір моноклональних антитіл G3, G6, G7, специфічних до імуноглобулінів людини класу G, придатних до використання у імуноферментному аналізі, який характеризується тим, що моноклональні антитіла набору мають високі константу афінності, титр у культуральній рідині та титр пероксидазного кон'югату. (19) (21) u200601608 (22) 16.02.2006 (24) 17.07.2006 (46) 17.07.2006, Бюл. № 7, 2006 р. (73) ТОВАРИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ "НАУКОВО-ВИРОБНИЧА КОМПАНІЯ "ВІТРОТЕСТ" 3 16036 4 флакон, що містить 2мл 1М трис-основи. рН одер7,4) та колонку 1,5x20см з сефадексом G-25 зрівжаного розчину мав становити 7,0-8,0, що контроноважену фосфатним буфером. МКАТ, одержані лювали за допомогою індикаторного паперу. Знараніше, в об'ємі 2-3мл наносили на гель, після чення рН корегували додаванням кислоти або поглинання розчину гелем наносили такий же трис-основи. Після виходу піка колонку промивали об'єм буферу. Після поглинання гелем буферу із швидкістю 2мл/хв 10 об'ємами 0,02М натрійколонку заповнювали фосфатним буфером довекалій фосфатного буферу до нейтрального рН. рху, вставляли адаптер та проводять елюцію фоМКАТ, одержані після афінної очистки, концесфатним буфером із швидкістю 2мл/хв. Вихід піку нтрували за допомогою насиченого розчину сульреєстрували при 280нм. Збирали фракцію МКАТ в фату амонію. Для цього до охолодженого препаокремий флакон, додавали 1% 10%-ого азиду нарату МКАТ додавали насичений розчин сульфату трію та зберігали при плюс 4°С до 6 місяців. амонію до 40-50% насичення. Витримували на Приклад 3. Спосіб одержання кон'югату монохолоді (4°С) 2-3 години, після чого центрифугуваклональних антитіл з пероксидазою хрону. ли 20хв. при 4000об/хв. при кімнатній температурі. Кон'югацію МКАТ з пероксидазою хрону здійсОсад МКАТ ресуспендували в розчині сульфату нювали у співвідношенні антитіл до ферменту 2:1 амонію 40%-ого насичення та переносили у (масові долі) методом періодатного окислення за центрифужні пробірки на 15мл. Центрифугували у Р. Tijssen [3] із власними модифікаціями. кутовому роторі при 10000об/хв. протягом 20хв. При окисленні пероксидазу хрону розчиняли у Надосад старанно видаляли, а осад МКАТ розчи0,1М бікарбонатному буфері, рН°8,3, до концентняли в мінімальній кількості (1-2мл) деіонізованої рації 15мг/мл та додавали такий же об'єм 14мМ води. Розчин переносили у мікропробірки та освітводного розчину періодату натрію. Суміш інкубуляли при 10000об/хв. протягом 10хв. Освітлені вали протягом 2 годин при кімнатній температурі. МКАТ переносили до спільного флакону. Одержаний таким чином розчин активованої пероКонцентрація МКАТ, одержаних таким спосоксидази додавали до розчину антитіл, які поперебом, коливалася від 20 до 40мг/мл. дньо діалізували проти 0,1М карбонатного розчиПриклад 2. Виділення моноклональних антитіл ну, рН°9,2. Суміш переносили у герметичну G7 із асцитичної рідини. хроматографічну колонку та додавали 1/3 частину Розморожували асцитичну рідину із вмістом сухого сефадексу G25, інкубували протягом 3 гомоноклональних антитіл та переносили її у дин при кімнатній температурі. центрифужну пробірку на 15мл. Пробірку поміщаПо закінченні інкубації, розчин кон'югату елюли у нагріту до 45-50°С воду на 5 хвилин. Зважуювали з колонки та зупиняли реакцію додаванням вали сульфат натрію в кількості, потрібній для 1/20 об'ємні частини водного розчину NaBН4 18%-го насичення (вага на об'єм) асцитичної ріди(5мг/мл), залишаючи на 30хв. при кімнатній темпени, всипали у пробірку з асцитом та старанно ратурі. Після цього ще додавали 3/20 частини розструшували до розчинення сульфату натрію. Спочину боргідриду натрію, інкубували протягом 60хв. стерігали помутніння, зумовлене випадінням в Одержаний розчин пероксидазного кон'югату осад МКАТ. Пробірку центрифугували при МКАТ переводили у 0,02М фосфатний буфер з 10000об./хв впродовж 5 хвилин у кутовому роторі. 0,15М NaCl шляхом діалізу. Після чого надосад видаляли, а осад антитіл розДжерела інформації: водили у 5мл деіонізованої води. Пробірку помі1. Климович В.Б., Самойлович М.П., Крутецкая щали у нагріту до 45-50°С воду на 5 хвилин. И.Ю. и др. Моноклональные антитела к подкласЗнову зважували сульфат натрію у кількості, сам IgG человека: получение и исследование спепотрібній для 16%-го насичення (вага на об'єм) цифичности // Иммунология. - 1998. - №3. - С.27розчину антитіл, всипали у пробірку та старанно 31. струшували до розчинення сульфату натрію. Спо2. Reimer C.B., Phillips D.J., Aloisio C.H. et al. стерігали помутніння, зумовлене випадінням антиEvaluation of thirty-one mouse monoclonal antibodies тіл в осад. Пробірку центрифугували при to human IgG epitopes // Hibridoma. - 1984. - Vol.3, 10000об./хв впродовж 5 хвилин у кутовому роторі. 3. - P.263-275. Після чого надосад видаляли, а осад антитіл роз3. Tijssen P. Preparation of enzyme-antibody or водили у 2-3мл деіонізованої води. enzyme-macromolecule conjugates // Laboratory Одержаний розчин МКАТ фільтрували через techiques in biochemistry and molecular biology: фільтри з порами 0,45мкм. practice and theory of enzyme immunoassays / Для переведення МКАТ у фосфатний буфер Editors R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg. використовували 0,02М фосфатний буфер (рН 7,2Amsterdam: Elsevier, 1985. - P.221-241. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601