Спосіб одержання позитивного контролю імуноферментних тест-систем для діагностики урогенітального хламідіозу

Спосіб одержання позитивного контролю імуноферментних тест-систем для діагностики уроге 3 19887 Для нагромадження значної кількості МКАТ гібридоми-продуценти антитіл культивували у черевних порожнинах мишей. Для цього за 10-14 днів до ін'єкції клітин мишам вводили внутрішньочеревне по 0,5мл пристану. Мінералне масло служило сильним стимулятором асцитоутворення. Потім вводили від 106 до 107 гібридом-продуцентів МКАТ в 1мл середовища. Через 5-8 днів у мишей починала накопичуватися рідина в черевній порожнині. Її відбирали шляхом проколювання черевної стінки товстою голкою. З однієї миші за кілька разів вдавалося отримати від 5 до 10мл асцитичної рідини. Після центрифугування при 3000об/хв. на протязі 5 хвилин асцит зберігали в замороженому стані. Антитіла, що знаходяться в асциті, осаджували сульфатом натрію (18% та 16%), розчиняли у дистильованій воді, переосаджували сульфатом амонію (50%) та розчиняли у мінімальній кількості води. Приклад 2. Одержання препарату IgA людини Імуноглобулінову фракцію сироватки, одержану шляхом преципітації сульфатом амонію, переводили гель-фільтрацією в 0,02М фосфатний буфер (рН 7,0). Із цієї фракції на колонці із протеїном G видаляли імуноглобуліни людини класу G. Проводили кілька циклів афінної хроматографії до повного припинення зв'язування колонкою IgG людини. Білки, що не зв'язалися з колонкою, осаджували сульфатом амонію, преципітат розчиняли в мінімальній кількості води та фільтрували через пори 0,2мкм. Наступним етапом була гельфільтрація на колонці 2,5´100см з сефакрилом S300. IgA сходили з колонки у фракціях першого піку. Другий пік формували інші білки сироватки з меншою молекулярною масою. Фракції першого піку збирали, об'єднували та використовували для перевірки чистоти IgA у електрофорезі у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію та у імунодифузії за Оухтерлоні [3]. Приклад 3. Спосіб використання кон'югату моноклональних антитіл до МОМР Chlamydia trachomatis з IgA людини. Сорбцію МОМР Chlamydia trachomatis у полістиролових планшетах проводили у 0,05М карбонат-бікарбонатному буфері (рН 9,6) протягом ночі Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 4 при 4°C в концентрації 2,5мкг/мл. Для відмивання використовували фосфатно-сольовий буфер з додаванням 0,05% твін-20 (ФСБТ), рН 7,2-7,4. У лунки планшету вносили досліджувані зразки сироваток крові та позитивний контроль (кон'югат моноклональних антитіл до МОМР Chlamydia trachomatis з IgA людини). Планшет інкубували 1 годину при 37°С і потім відмивали. Для виявлення зв'язаних антитіл використовували кон'югат МКАТ до IgA людини з пероксидазою хрону, який інкубували 1 годину при кімнатній температурі. Планшет тричі відмивали ФСБТ і один раз водою. Як субстрат використовували 0,003% розчин перекису водню в 0,15М цитратному буфері, рН 5,0, а як хромоген - орто-фенілендиамін. Реакцію зупиняли 2М сірчаною кислотою. Оптичну щільність при довжині хвиль 492нм і 630нм вимірювали на спектрофотометрі. Таким чином, пропонований метод одержання позитивних контролів імуноферментних тестсистем для діагностики хламідійної інфекції із використанням моноклональних антитіл, специфічних до основного білку зовнішньої мембрани Chlamydia trachomatis дозволяє використовувати його у всіх діагностичних наборах для визначення IgA до Chlamydia trachomatis, які побудовані за принципом непрямого ТІФА. Перелік літературних джерел: 1. Cevenini R., Donati М., Sambri V. et al. Reactivity of elementary and reticulate bodies of Chlamydia trachomatis LGV2 with monoclonal antibodies specific for the major outer membrane protein // FEMS Microbiology Letters. - 1987. - Vol. 42, 1.-P.4751. 2. Практичний посібник по роботі з імуноферментною тест-системою для визначення протихламідійних антитіл (DIA-Chlamydia) / Н.В. Іванська, А.В. Руденко, В.Т. Кругліков та ін. - К.: Діапрофмед, 2004 - 36с. 3. Tijssen P. Preparation of enzyme-antibody or enzyme-macromolecule conjugates // Laboratory techiques in biochemistry and molecular biology: practice and theory of enzyme immunoassays / Editors R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg. Amsterdam: Elsevier, 1985. - P.221-241. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601