Тест-система імуноферментна (dia-chlamydia) для виявлення антитіл класів а та g до chlamydia trachomatis у сироватках та плазмі крові людини

Тест-система імуноферментна (DIAChlamydia) для виявлення антитіл класів А та G до Chlamydia trachomatis у сироватках або плазмі крові людини, де в складі імуносорбенту використовують білки-антигени Chlamydia trachomatis, a як кон'югати - антивидові антитіла (проти імуноглобулінів людини), мічені ферментом, яка відрізняється тим, що на планшет сорбовано рекомбінантний білок-антиген МОМР-аналог Скінцевого фрагмента зрілого поверхневого білка оболонки Chlamydia trachomatis серовару L2, одержаний в Е сої і, в складі кон'югатів використано моноклональні антитіла проти імуноглобулінів людини класів А та G, мічені ферментом Винахід належить до біотехнологм, імунохімії та медицини і може бути використаний для проведення імунологічних досліджень, діагностичних аналізів інфікованості окремих людей та скринінгових досліджень груп населення на зараженість хламідюзом В Україні вітчизняних тест-систем для виявлення зараженості хламідійною інфекцією немає В Роси виробляється тест-система "ХпамиБест С trachomatis - lgG-стрип" виробництва ЗАО "ВекторБест", де на тверду фазу нанесено очищені білки Chlamydia trachomatis, а як кон'югат - антитіла проти імуноглобулінів класу G людини, мічені перокІснує також тест-система сидазою" [1] виробництва Helix "С tracho P E P ELISA-lgA" Biotehnologies (Ізраїль), де використовують специфічні синтетичні пептиди на ПІДЛОЖЦІ і як кон'югат - антитіла проти імуноглобулінів класу А людини, мічені пероксидазою [2] класів А та G, мічені ферментом Ферментативну реакцію визначають за допомогою розчину проявника, який містить субстрат та хромоген За одну постановку (2 години) можна проаналізувати 44 сироватки Приклад 1 Визначення антитіл проти Chlamydia trachomatis у сироватці крові хворого К , 1975 року народження Визначення проводять за відомою методикою [3] твердофазного імуноферментного аналізу Для цього вносять у лунки першої половини планшетаімуносорбента з фіксованими на ньому рекомбінантними білками по 80 мкл розчину для розведення сироваток та по 20мкл сироватки крові хворого для виявлення антитіл класу G (IgG), теж саме повторюють на другій половині планшета - для виявлення ІдА В три лунки вносять по 20мкл негативного контролю, а в ДВІ ІНШІ - по 20мкл позитивного контролю Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та шкубують при температурі 37°С протягом бОхв Після закінчення інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальноі піпетки та промивають лунки чотири рази розчином для промивання планшетів В лунки планшету вносять по ЮОмкл розчину В основу винаходу покладено завдання створити імуноферментну тест-систему на основі імуносорбенту з рекомбінантним білком-антигеном МОМР аналогом С-кінцевого фрагменту зрілого поверхневого білка оболонки Chlamydia trachomatis серовару L2, одержаним в Е соїі Антигени сорбують на поверхні полістиролових планшетів В складі кон'югатів використовують моноклональні антитіла проти імуноглобулінів людини ю о> 00 00 ю 58895 моноклонального кон'югату проти імуноглобулінів людини, мічених ферментом, в першу половину планшета вносять анти-lgG, в другу половину анти-lgA та інкубують планшет при 37°С у термостаті ЗОхв Після закінчення інкубації промивають лунки шість разів і вносять туди по ЮОмкл розчину проявника (розчин проявника з субстратом та хромогеном) та інкубують при 18-22°С у темряві ЗОхв Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 50мкл стоп-реагенту Не більше як через 1хв після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра Значення ОГ зразка прямо пропорційне КІЛЬКОСТІ антитіл у сироватці Значення КІЛЬКОСТІ антитіл проти Chlamydia trachomatis у сироватці хворого, визначене при застосуванні нашої тест-системи, порівнювали зі значеннями, отриманими при використанні тестсистеми виробництва ЗАО "Вектор-Бест" (Росія) Досліджені сироватки хворого було ідентифіковано в обох тест-системах як позитивні на наявність антитіл проти антигенів Chlamydia trachomatis Приклад 2 Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест-системи Використовуючи названі тест-системи, досліджували сироватки крові (по 20 достеменно позитивних та 100 достеменно негативних сироваток) Усі сироватки досліджували у чотирьох повторнос Комп'ютерна верстка Н Лисенко тях кожною тест-системою за описаною методикою (дві лунки для визначення IgG та 2 лунки - для визначення ІдА) Усі 20 позитивних сироваток показали наявність антитіл проти Chlamydia trachomatis (18 - IgG та 2 -ІдА) , що складає 100% чутливості 3 100 негативних сироваток у пропонованій тест-системі виявилися справді негативними всі 100 (специфічність - 100%) В порівнюваній тест-системі з Роси з 20 достеменно позитивних сироваток 18 були позитивними, 2 сироватки з антитілами класу А не були виявлені Чутливість становила 90% Специфічність порівняльної тестсистеми становила 100% Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення обох класів імуноглобулінів проти антигенів Chlamydia trachomatis у сироватках людей Пропонована тест-система проста й надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність Використана література 1 Инструкция по применению тест-системы "ХламиБест С trachomatis-lgG-стрип" производства ЗАО "Вектор-Бест", п Кольцове, Новосибирской обл , 2000, 16с 2 Afssaps № Т 78952 "С trach PEPELISA-lgA" for the detection of human IgA antibodies to Chlamydia trachomatis т serum" Helix Biotehnologies, Ізраїль, 1999p 3 AT Михайлов, В Н Симирский "Методы иммунохимического анализа в биологии развития" М "Наука", 1981 Підписано до друку 05 09 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна