Спосіб одержання позитивного контролю імуноферментних тест-систем, призначених для визначення антитіл до збудників torcн-інфекцій

Спосіб одержання позитивного контролю імуноферментних тест-систем, призначених для ви 3 19886 сукциніміділ-4-(N-малеїмідометил) циклогексан-1карбоксилату (SMCC) [4]. Приклад 1. Виділення моноклональних антитіл до пероксидази хрону із асцитичної рідини. Розморожували асцитичну рідину із вмістом МКАТ до ПХ та переносили її у центрифужну пробірку на 15мл. Пробірку поміщали у нагріту до 4550°С воду на 5 хвилин. Зважували сульфат натрію в кількості, потрібній для 18%-го насичення (вага на об'єм) асцитичної рідини, всипали у пробірку з асцитом та старанно струшували до розчинення сульфату натрію. Спостерігали помутніння, зумовлене випадінням в осад МКАТ. Пробірку центрифугували при 10000об./хв впродовж 5 хвилин у кутовому роторі. Після чого надосад видаляли, а осад антитіл розводили у 5мл деіонізованої води. Пробірку поміщали у нагріту до 45-50°С воду на 5 хвилин. Знову зважували сульфат натрію у кількості, потрібній для 16%-го насичення (вага на об'єм) розчину антитіл, всипали у пробірку та старанно струшували до розчинення сульфату натрію. Спостерігали помутніння, зумовлене випадінням антитіл в осад. Пробірку центрифугували при 10000об./хв впродовж 5 хвилин у кутовому роторі. Після чого надосад видаляли, а осад антитіл розводили у 2-3мл деіонізованої води. Одержаний розчин МКАТ фільтрували через фільтри з порами 0,45мкм. Для переведення МКАТ у фосфатний буфер використовували 0,02 М фосфатний буфер (рН 7,27,4) та колонку 1,5´20см з сефадексом G-25 зрівноважену фосфатним буфером. МКАТ, одержані раніше, в об'ємі 2-3мл наносили на гель, після поглинання розчину гелем наносили такий же об'єм буферу. Після поглинання гелем буферу колонку заповнювали фосфатним буфером доверху, вставляли адаптер та проводять елюцію фосфатним буфером із швидкістю 2мл/хв. Ви хід піку реєстрували при 280нм. Збирали фракцію МКАТ в окремий флакон, додавали 1% 10%-ого азиду натрію та зберігали при плюс 4°С до 6 місяців. Приклад 2. Одержання препарату IgM людини. Для виділення імуноглобулінів класу М використовували е углобулінову фракцію сироватки крові, яка крім IgM людини містила ще й a 2макроглобулін. З метою розділення згаданих білків сироватки застосовували їх осадження поліетиленгліколем (ПЕГ) 8000. При концентрації ПЕГ 5% IgM майже повністю втрачали розчинність та утворювали преципітат, який збирали центрифугуванням. У той же час a 2-макроглобулін залишався в надосаді, оскільки його фракціонування відбуваються при концентраціях 10-12% ПЕГ. Преципітат IgM розчиняли у мінімальній кількості фосфатного буферу та позбувалися від нерозчинних домішок центрифугуванням при 4000об/хв. упродовж 15хв. та фільтруванням через пори 0,2мкм. Останнім етапом очистки IgM була гель-фільтрація на колонці 2,5´100см з сефакрилом S-300. Імуноглобуліни класу М утворювали перший пік, а інші білки, що забруднювали препарат, - другий пік. Фракції першого піку об'єднували та концентрували зворотнім діалізом проти ПЕГ 40000 до 1/10 об'єму. Для усунення контамінації цільового препарату одержані 4 таким чином IgM обробляли 1%-м тритоном Х-100, після чого проводили ще один цикл хроматографії на сефакрилі S-300. Додавання детергенту запобігало агрегації молекул у препараті, що дозволило під час другого циклу хроматографії позбутися ще деякої кількості баластних білків. Фракції першого піку збирали, об'єднували та використовували для кінцевої перевірки чистоти ІgM у електрофорезі у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію та у імунодифузії за Оухтерлоні [5]. Приклад 3. Спосіб використання кон'югату моноклональних антитіл до пероксидази хрону з IgM людини. Сорбцію МКАТ до IgM людини у полістиролових планшетах проводили у 0,05М карбонатбікарбонатном буфері (рН 9,6) протягом ночі при 4°С в концентрації 2,5мкг/мл. Для відмивання використовували фосфа тно-сольовий буфер з додаванням 0,05% твін-20 (ФСБТ), рН 7,2-7,4. У лунки планшету вносили досліджувані зразки сироваток крові та позитивний контроль (кон’югат моноклональних антитіл до пероксидази хрону з IgM людини). Планшет інкубували 1 годину при 37°С і потім відмивали. Для виявлення зв'язаних антитіл використовували кон'югат рекомбінантного білкуантигену вірусу простого герпесу з пероксидазою хрону, який інкубували 1 годину при кімнатній температурі. Планшет тричі відмивали ФСБТ і один раз водою. Як субстрат використовували 0,003% розчин перекису водню в 0,15М нитратному буфері, рН 5,0, а як хромоген - орто-фенілендиамін. Реакцію зупиняли 2М сірчаною кислотою. Оптичну щільність при довжині хвиль 492нм і 630нм вимірювали на спектрофотометрі. Таким чином, пропонований метод одержання та позитивних контролів імуноферментних тестсистем із використанням моноклональних антитіл до ПХ дозволяє отримувати універсальні контролі діагностичних наборів для визначення IgM-антитіл до збудників інфекційних захворювань, які побудовані за принципом так званої «IgM-пастки». Перелік літературних джерел: 1. Brynda Е., Houskaa M., Brandenburgb A. et al. Optical biosensors for real-time measurement of analytes in blood plasma // Biosensors and Bioelectronics. - 2002. - Vol. 17, 8. - P.665-675. 2. Специфическая лабораторная диагностика TORCH-инфекций. Практическое пособие / Г.Е. Раевская, Л.П. Ми хайленко, Л.А. Ганова и др. - К.: Діапрофмед, 2004 - 108с. 3. Moffa D.J., Camele J. Evaluation of Liquichek immunology controls // Clinical Chemistry. - 1988. Vol. 34, 8. - P.1656-1657. 4. Levesque A., Letellier M., Grant A. Analytical evaluation of the CK-MB mass assay on the Technicon Immuno 1® system // Clinical biochemistry. 1997. - Vol. 30, 1. - P.11-16. 5. Nikolayenko I.V., Galkin O.Yu., Grabchenko N.I. et al. Preparation of highly purified human IgG, IgM, and Ig A for immunization and immunoanalysis // Ukrainica Bioorganica Acta. - 2005. - Vol. 2,2. - P.311. 4. Hermanson G.T. Bioconjugate techniques. San Diego: Academic Press, 2000. - P.461-469. 5 Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 19886 6 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601