Спосіб виготовлення тест-систем для діагностики аутоімунних захворювань головного мозку та нирок у людей

Спосіб виготовлення тест-систем для діагностики аутоімунних захворювань головного мозку та нирок у людей, який включає виділення антигенів з тканин мозку та нирок людей, одержання формалінізованих еритроцитів, їх сенсибілізацію тканинним антигеном та стабілізацію в консервувальному розчині, який відрізняється тим. що екстракцію антигенів проводять при температурі 4°С і фіксованому значенні рН середовища. Винахід стосується галузей біологи', медицини та може бути використаний для діагностики і контролю ефективності лікування найпоширених аутоімунних захворювань. Найбільш поширеними захворюваннями з доказаною аутоімунною природою є розсіяний склероз та хронічний гломерулонефрит. Імунні процеси мають значення при атрофії мозку різного генозу, зокрема, при хворобі Альцгеймера |FilHt H., Lutne V., Reisberg В et al. //Senile demencie of Alzheimer type /Ed.Huttbn J.T. - Liss, New York. -1985 - P. 307-318; McRae-Dequeurce A., Booj S., Haglid K. et. al.//Neurorogy. -1976. - 26. P. 1054-1059}. У хворих на шизофренію виявляється цілий комплекс аутоантитіл до різноманітних нейрознтигенів тимуса, які мають загальні детермінанти з структурами мозку (Ganqufi R., Rubin B.S., Kelley R.H. et. al. //Ann. NY. Acad. Sci. -1987. - 496. - P 676685). Подальше вивчення ролі антитіл до нейрональних структур, нейротрансміттерів і їх рецепторів, які виявляються при багатьох неврологічних і психологічних захворюваннях, дозволить визнати їх участь в пато- і сантогенетичних механізмах при різних нозологічних формах патології ЦНС. Проведення клініко-імунологічних обстежень з визначенням наявності антитіл до нейрональних структур і нейромеадіторів доцільно для визначення факторів ризику з метою профілактики та ранньої діагностики захворювань, а також, для оцінки ефективності лікування. Групою авторів були розроблені еритроцитарні імунореагенти для діагностики аутоімунних пошкоджень підшлункової залози (К.В. Ким, П Н Дерябин, Б В. Каральник. Эритроцитарные иммуно-реагенты для диагностики аутоиммунных повреждений поджелудочной железы //Лабораторное дело, -1991 .-N11 .-С. 44-48). За допомогою реакції нейтралізації антитіл з одержаним діагностикумом можна з високою специфічністю визначити панкреатичні антигени Прототипом винаходу є виділення антигенів методом Dexter, Gaynes та Dridges в модифікації Forlaender [Руководство по иммунологии //Под ред проф О.Е Вяэова, проф. Ш.Х Ходжаева. М.: Медицина • 1973. - 390 сJ. Тканину подрібнювали на дрібні кусочки та відмивали дистильованою водою. Відмиті кусочки використовували для приготування гомогенату, із якого готували 10% розчин його в 1,8% розчині хлористого натрію з додаванням 0,25% фенолу. Гомогенат екстрагували на протязі 48 годин при температурі 37°С, часто перемішували Після центрифугування для видалення великих тканевих частинок, для осадження побічних білків до екстракту додавали крижану оцтову кислоту. Осаджені білки виділяли шляхом центрифугування. Надосадову прозору рідину змішували з рівною кількістю насиченого розчину сульфату амонію та залишали на 25 годин при температурі 0°С При таких умовах випала в осад достатня кількість білку Надосадну рідину зливали, а осад розчиняли в дистильованій воді Для видалення солей сульфа гу амонію розчин діалізувапи протягом 48 годин проти проточно) води. Потім розчин розбавляли дистильованою водою так, щоб вміст азоту за мікрометодом Кельдаля складав 15-20 мг%. CO со со < 34634 Однак, цей метод має низку недоліків - руйнація деяких тканинних антигенів шляхом протеолізу, коливання рН під час екстракції. В основу винаходу поставлене завдання створити спосіб виготовлення тест-систем для діагностики аутоімунних захворювань головного мозку та нирок у людей шляхом вибору температурного режиму та концентрації розчину (рН середовища), який дозволяє запобігти руйнації антигенів під час екстракції та стандартизації умов екстракції, що дозволить забезпечити високу ефективність діагностики аутоімуниих захворювань головного мозку та нирок Поставлена задача вирішується тим. що в запропонованому способі виготовлення тест-систем для діагностики аутоімунних захворювань головного мозку та нирок у людей, який включає виділення антигенів з тканини мозку та нирок людей, одержання формалінізованих еритроцитів, їх сенсибілізацію тканинним антигеном та стабілізацію тканинним антигеном та стабілізацію в консервуючому розчині, згідно винаходу, екстракцію антигенів проводять при температурі 4°С і в забуференому фізіологічному розчині при фіксованому значенні рН середовища. Спосіб здійснюється слідуючим чином. Наважку подрібненої тканини мозку (нирок) промивали водопровідною водою протягом трьох годин. Після закінчення промивання промивна вода була прозорою та не містила в своєму складі білку (проба на білок за допомогою сульфосаліциловоі кислоти була негативною). Готували 1 0 % гомогенат тканини з екстракційним розчином (забуферений фізіологічний розчин), залишали у холодильнику при температурі + 4°С на 24 години при періодичному перемішуванні. Відстояний верхній шар рідини зливали з осаду та центрифугували До освітленого центрифугату додавали такий же об'єм крижаної оцтової кислоти. Після центрифугування центрифугат змішували з рівним об'ємом насиченого розчину сульфату амонію і витримували в холодильнику при температурі 0°С протягом 4 0 годин. Суміш центрифугували. Осад добре перемішували з забуференим фізіологічним розчином та знову центрифугували Центрифугат переносили в діалізний мішок, герметизували і ставили на діаліз проти проточної води на 2 години. Потім діалізний мішок переносили в забуферений фізіологічний розчин і продовжували діаліз при температурі +4°С протягом 68 годин. Розчинений осад знімали з діалізу, переносили у стерильні пеніцилінові флакони, закривали гумовими пробками, після визначення вмісту білку за ГОСТ 13496 4-74. зберігали у замороженому вигляді при температурі -20°С протягом 1 місяця. Другий етап роботи заключався в приготуванні формалінізованих еритроцитів, їх сенсибілізація, стабілізація, консервація та одержання імунної сироватки. До цитратно) крові людини 1(0) резус негативний додавали забуференого фізіологічного розчину з рН 7,2. Перемішували обережно до утворення зависі еритроцитів До зависі додавали 5 0 % нейтрального формаліну. Одержану суміш розливали в дві конічні колби та прогрівали на водяній бані при температурі 37°С протягом 2-х годин при постійному перемішуванні За цей час еритроцити змінили колір з червоного на темношокопадний. Після прогрівання еритроцитів цент рифугували 10 хвилин при 1000 об/хв. Надосадну рідину зливали і проводили процедуру відмивання забуференим фізіологічним розчином. Відмивання повторювали два рази. Відмиті еритроцити поміщали в холодильник при температурі + 4°С на 4 8 годин. Після цього надосадну рідину зливали, до осаду додавали забуферений фізіологічний розчин і поміщали на дві доби в холодильник при температурі + 4°С. Після цього формалізовані еритроцити пригодні для сенсибілізації антигеном. Для сенсибілізації еритроцитів готували розчин антигену в забуференому фізіологічному розчині концентрацією 20 мг/л. З приготовлених раніше формалінізованих еритроцитів зливали надосадну рідину, осад еритроцитів старанно перемішували скляною паличкою та додавали сюди ж розчин антигену в співвідношенні 1 : 2 0 Суспензію еритроцитів поміщали на водяну баню при 37°С на 2 години, періодично розмішуючи шляхом обертання склянки. Потім завись еритроцитів центрифугували протягом 10 хвилин при 1000 об/хв, надосадну рідину зливали, додавали забуференого фізіологічного розчину. Процедуру відмивання повторювали 2 рази. Після відмивання сенсибілізованих антигеном еритроцитів надосадну рідину зливали, до осаду еритроцитів додавали консервуючий розчин з розрахунку 19 об'ємних частин на 1 об'ємну частину сенсибілізованих еритроцитів. Консервуючий розчин містить в собі 0,05 г азиду натрію та 0,1 г альбуміну биків ліофілізованого ( приведені наважки розчиняють в 100 мл забуференого фізіологічного розчину). Консервовані сенсибілізовані еритроцити розливали на 10 мл у стерильні пеніцилінові флакони. Закривали стерильними гумовими пробками та закручували алюмінієвою цЬольгою. Зберігали в холодильнику при температурі +4°С у вигляді 5 % зависі. Якість та чутливість отриманого діагностикума перевіряли реакцією з гіперімунною сироваткою. Для одержання імунної сироватки проводили імунізацію кроля породи срібляста шиншила масою 3 кг, який знаходився на стандартному віварійному раціоні. Імунізацію проводили гомогенатом тканини головного мозку молодих людей, які загинули від травм в віці 18-35 років. Для одержання гомогенату 0,6 г тканини мозку розтирали в фарфоровій стулці з 0,6 мл дистильованої води та 0,6 мл ад'юванта Фрейнда. Інтенсивно перемішували до одержання однорідної розовато-білоі суміші. 1 мл одержаної суміші вводили внутрішньошкірно в подушечки всіх кінцівок кроля. Через два тижні після першої імунізації проводили другу. Для цього брали наважку тканини мозку 0,8 мг і розтирали в фарфоровій ступці з 0,8 мл дистильованої води. Після одержання гомогенату приливали 0,8 мл ад'юванта Фрейнда та перемішували. 1,8 мл суміші вводили внутрішньошкірно в область обох лопаток, попередньо вивільнивши місце проколу від шерсті. Аналогічно через кожних два тижні проводили третю та четверту імунізацію. Через два тижні після останньої (четвертої) імунізації у кроля із вушної вени брали кров, із якої одержували сироватку шляхом цент 34634 рифугування протягом 10 хвилин при 1500 об/хв. Сироватку використовували для постановки реакції непрямої аглютинації. В гнізда планшету для імунологічних реакцій, починаючи з номера 2, розливали розчин натрію хлориду по 0,05 мл. В гнізда номерів 1 та 2 наливали 0,05 мл імунної сироватки. Розчин натрію хлориду та сироватки старанно перемішували, відбирали 0,05 мл суміші, переносили в гніздо З і т.д. до гнізда 12. Таким чином одержували слідуючі розведення: № гнізда Розведення 1 Сироватка 2 3 4 5 \ 1:1 1:2 1:4 1:8 Продовження 6 7 8 9 10 11 12 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 В два вільні гнізда планшета наливали 0,05 мл розчину натрію хлориду. Потім у всі гнізда приливали 0,05 мл однорідної суспензії діагностикума еритроцитарного. Вміст гнізд перемішували і залишали в термостаті при температурі 37°С на одну годину. Після закінчення терміну інкубації фіксували результат реакції. Титр аглютинації повинен бути не менше 1:256. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагарина, 101 (03122) 3 - 7 2 - 8 9 (03122) 2 - 5 7 - 0 3