Спосіб одержання церулоплазміну

Изобретение относится к технологии получения фермента крови человека - церулоплазмина, и может быть использовано при производстве медицинских препаратов. Церулоплазмин - медьсодержащий белок альфа-2-глобулиновой фракции плазмы крови, относится к группе белков "острой фазы" и является одним из факторов естественной защиты организма. Он участвуе т в процессах транспорта меди, способен катализировать окисление многих биоорганических соединений, обладает радиозащитными и ан-тиоксидантными свойствами. Все это свидетельствует о возможности его широкого применения в клинике. Известные методы получения церулоплазмина основаны на сорбции его на ДЭАЭ-сорбентах с последующей очисткой методами гельфильтрации, солевого или спиртового осаждения, перекристаллизации. Существенным недостатком известных лабораторных и производственных способов получения церулоплазмина является применение дорогостоящих импортных сорбентов, что в значительной степени тормозит внедрение и выпуск данного примера отечественной промышленностью. ° Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ получения церулоплазмина [1], который используется нами в качестве способа-прототипа. Способ заключается,, в гомогенизации исходного сырья в растворе натрия хлористого, сорбции фермента из гомогената на гранулированную ДЭАЭ-целлюлозу, элюции на хроматографической колонке, осаждением белка этиловым спиртом, растворением осадка и доочисткой смесью спиртхлороформа, с последующей стерилизующей фильтрацией и лиофильным высушиванием конечного продукта. Недостатком данного способа получения церулоплазмина, как уже отмечалось, является использование импортной гранулированной ДЭАЭ-целлюлозы, приобретение которой за. рубежом требует определенных валютных средств (около 200 инвалютных рублей за 1 кг сорбента). В основу изобретения поставлена задача создать более дешевую и простую те хнологию промышленного получения лекарственного препарата церулоплазмина, не снижая его физико-химических свойств. Указанная задача решается путем использования в качестве сорбента активированной ДЭАЭ-целлюлозы отечественного производства, которая позволяет осуществлять сорбцию и элюцию препарата без применения хроматографических колонок, что, с одной стороны, значительно упрощает процесс и сокращает время элюирования, а с другой - исключает потери сорбента при элюировании и регенерации. Кроме того, применение указанного сорбента позволяет исключить из технологии стадию промежуточного осаждения церулоплазмина спиртом из элюента и окончательную очистку препарата осуществлять непосредственно после элюции 0,25 Μ раствором хлористого натрия. Сущность изобретения заключается в следующем: отходы производства гаммаглобулина (фракции бетаглобулинов сыворотки крови) гомогенизируют в 0,25 Μ растворе натрия хлористого, сорбируют церулоплазмин из полученного гомогената на активированной ДЭАЭ-целлюлозе при рН 6,3, освобождаются от балластных белков, промывая сорбент 0,12 Μ раствором натрия хлористого, элюируют церулоплазмин, помещая сорбент в сосуд с 0,25 Μ раствором натрия хлористого (при соотношении сорбент/элюат - 2/1), доводят ρΗ элюата до 5,2, температуру до 25°С, добавляют этиловый Пример 1. 3 кг осадка ІІІ фракции по Кону плацентарной сыворотки гомогенизируют в 14 л охлажденного до 4°С 0,05 Μ раствора хлористого натрия, доводят рН гомогената до 6.3, в полученную суспензию добавляют 300 г активированной ДЭАЭ-целлюлозы. Смесь оставляют при слабом перемешивании на 18 ч при температуре 4°С. Целлюлозу ос сорбированным церулоплаз-мином отмывают от неспецифических белков в мешке из х/б ткани, помещая ее в сосуд с 5 л охлажденного до 4°С 0,12 Μ раствора хлористого натрия (последнюю процедуру проводят трижды до величины оптической плотности отмывшейся от сорбента суспензии балластных белков при длине волны 280 нм (Е 280), равной 0,100). Отмытую ДЭАЭцеллюлозу с сорбированным на ней церулоплазмином в х/б мешке помещают на 1 ч в 0,5 л охлажденного до 4°С 0,25 Μ раствора хлористого натрия для десорбции церулоплазмина. Полученные 0,5 л элюата доводят раствором 1 н соляной кислоты до рН 5.2 и производят доочистку препарата от липопротеидных примесей добавлением этилового спирта и хлороформа до конечной концентрации 25 и 4 об. % соответственно. Смесь перемешивают 30 мин при температуре 25°С и образовавшийся осадок липопротеидов отделяют цетрифугированием в течение 1 ч при 3 тыс. об/мин. К полученному цетрифугату добавляют при перемешивании этиловый спирт до конечной концентрации его в растворе 55 об. % и оставляют для формирования осадка церулоплазмина при температуре минус 10°С на 18 ч. Образовавшийся осадок получают центрифугированием при 3 тыс. об/мин втечение 1 ч. Получено 1,36 г осадка, который был растворен и подвергнут стерилизующей фильтрации и лиофизилизации. Окончательный выход препарата в данном примере составляет 0,45 г церулоплазмина на 1 кг исходного сырья. Его оптический коэффициент - 0,04. Биологическая активность - 17 усл. ед. Препарат апирогенный. Πρимеρ 2. 30 кг осадка III фракции по Кону плацентарной сыворотки гомогенизиотмывшейся от сорбента суспензии при длине волны 280 нм, равной 0.100). Отмытую ДЭ АЭ-целлюлозу с сорбиро-ванным на ней церулоплазмином в х/б мешке помещают на 1ч в сосуд с 1,5 л о хлажденного до 40C 0,25 Μ раствора хлористого натрия для десорбции церулоплазми-на. Полученные 1,5 л элюата доводят раствором 1 н НС1 до рН 5,2, добавляют этиловый спирт и хлороформ до конечной концентрации в растворе 25 и 4 об.% соотвественно. Смесь перемешивают 30 мин при температуре 25°С, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием в течение 1 ч при 3 тыс. об/мин. К полученному центрифу-гату добавляют при перемешивании этиловый спирт до конечной концентрации его в растворе 55 об.% и оставляют для формирования осадка церулоплазмина при минус 10°С на 18ч. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 3 тыс. об/мин в течение 1 ч. Получили 15 г осадка церулоплазмина, который был растворен и подвергнут стерилизующей фильтрации и лиофилизации. Выход препарата церулоплазмина в данном примере 0,5 г/1 кг исходного сырья. Оптический коэффициент Ε 610/280 равен 0,042. Биологическая активность препарата составляла 17 условных единиц. Препарат апирогенен. Преимуществами заявляемого способа являются; 1. Использование активированной целлюлозы, что значительно упрощает стадию освобождения сорбированного на ней церулоплазмина от сопутствующих балластных белков, имеющих близкую сорбционную способность. 2. Осуществление элюции препарата церулоплазмина без применения хроматографических колонок, с одной стороны, значительно упрощает процесс и время элюирования, а с другой - исключает потерю сорбента при элюировании и регенерации. 3. Проведение элюции церулоплазмина 0,25 Μ раствором натрия хлористого позволяет исключить из технологии промежуточную стадию осаждения препарата этанолом, что значительно упрощает и удешевляет технологию получения препарата церулоплазмина.