Спосіб одержання фосфатиділетаноламіну

,ЛЛЯ СЛУЖЕБНОГО ПОЛЬЗОВАНИЯ СОЮЗ СОВЕТСНИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ РЄСПУ6ЛИН 9 JKJ К» - S U m 1615915 А1 ( 5 t ) 5 A 61 К 37/22, С 07 F 9/10 • ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГННТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ $ (21) 4696651/30-13 (22) 2 4 . 0 5 . 8 9 Г" t ) Харьковское предприятие по п р о и ^ о д с т ь у бактерийных; препаратов и Московский институт тонкой химической технологии им. М,В. Ломоносова (72) Г.К, Менделеева, Р Ж Меизелеев, В.И. Швец, Г.А. Сенников в Ю.М.Краснопольский 577.125.53(088.8) t (53) '(56) Авторское свидетельство СССР , * 1104707, к л . А 61 К 37/22, 1983 • (неяублик). Препаративная биохимия лилндов. Серия "Биологические и технические мембраны", - М.; Наука, 1981, с . 144, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФАТИДИЛЭТАНОЛАМИНА (57) Изобретение относится к способам п о л у ч е н и я индивидуальных фосфолипидов, используемых д л я приготовления л и п о - ' ' *альных п р е п а р а т о в и б и о л о г и ч е с к и И з о б р е т е н и е о т н о с и т с я к химии п р и •родных с о е д и н е н и й , а именно к с п о с о б а м п о л у ч е н и я индивидуальных ф о с ф о л и п и д о в , которые м о г у т быть и с п о л ь з о в а н ы при и з у ч е н и и с т р у к т у р ы и функций б и о л о г и ч е с к и х м е м б р а н , а также для получения лнпосомальных п р е п а р а т о в и б о л о г и ч е с ки активных э м у л ь с и й . Цель» и з о б р е т е н и я я в л я е т с я повыше-' иие выхода ц е л е в Ь г о п р о д у к т а . П р и м е р ] , 1 к г мозга крупного р о г а т о г о с к о т а , п р е д в а р и т е л ь н о очищенного от соединительной ткани, н а р е з а ют и гомогенизируют порциями по 100 г 47-90 • 2 активных э м у л ь с и й , и з у ч е н и я с т р у к т у * ры и функций б и о л о г и ч е с к и х м е м б р а н . Целью и з о б р е т е н и я я в л я е т с я повышение выхода ц е л е в о г о п р о д у к т а . Для э т р г о мозг крупного рогатого скота экстрагируют ацетоном, а затем смесью мотлиола и хлороформа, проводят отделение , водорастворимых примесей и хлороформный экстракт упаривают. Полученный • . осадок обрабатывают ацетоном,-а затем растворяют » смеси хлороформа'и метаиола с последующим удалением балласт,-1 иых лшшдов хлоридом кадмия. Мстанольный экстракт липидов концентрируют и добавляют дизтиловыя эфир в отношении соответственно (0,9-Ї f l)-(4 # 8-i5 # 2)» Полученный раствор липидов подвергают Хроматографии иа ДЭАЭ-сефадрксе А-25. Фосфатидилэтаноламии элюируют с сорбейта смесью хлороформі метанол і уксусная кислота в соотношении 50:50: J : ( 0 , 9 - 1 , ! ) • 3 табл. _ в ацетоне (4 мл ацетона на 1 г ткани). Гомогенаты объединяют и осадок ткани отделяют фильтрованием. Осадок мозговой ткани помещают в 2,7 п смеси хлороформ - метанол ^ 2 : 1 ) и перемешивают в течение і ,5 ч. Осадсх отделяют фильтрованием и смешивают с 1,3 л смеси хлороформ - метанол ( П 2 ) , п е ремешивают g течение 1 v, а затем ОСАДОК отделяют фильтрованием и удаляют. Фильтраты объединяют, добавляют ! , 3 л хлороформа и 1,1 л дистиллированной воды, перемешивают и после разделения слоев нижню» фазу отделяют (Л "£> 1615915 ла. Полученное липидное масло сушат и упаривают до 100 мл при температуре не Золее 40*С. К полученному концен-- „. на глубоком вакууме (I мм р т . с т , ) в*те-* триро,ванному раствору прибавляют 2 л ..' • чение 2 ч. Выход хроматографически чяс-, ацетона, предварительно охлажденного ' , того фосфатидилэтаноламина 4,2 г с до -20*С перемешивают в течение 1 кг мозговой ткани, ~ ч 30 мин и проводят фильтрование, Фильтр П р и м е Р 2. 1 кг мозга крупного рат удаляют. К осадку прибавляют 2 л рогатого скота, предварительно очищенохлажденного ацетона и процесс, повтоного от соединительной ткани, нарезаряют еще 4 раза. Полученное липидное JQ ют и гомогенизируют порциями по 100 г масло растворяют в 150 мл хлороформа в ацетоне (4 мл ацетона на 1 г ткаи 7 л метанола и перемешивают в течет* ни). Гомогенаты объединяют и осадок ние 2 ч при комнатной температуре. ткани отделяют фильтрованием. Осадок Нерастворившийся осадок отделяют мозговой ткани помещают в 2,7 л смеси фильтрованием, а к фильтрату прилива- f5 хлороформ-метанол (2:1) и перемешивают 1,66 мл 50%-ного водного раствора ют в течение 1,5 ч. Осадок отделяют хлорида кадмия, интенсивно перемешифильтрованием и смешивают в 1,3 л вают и оставляют на 1 ч при комнатсмеси хлоформ-метанол ( 1 : 2 ) , перемеши-' ной температуре для формирования v вают в течение 1 ч, а затем осадок отосадка. Осадок отфильтровывают. Фильтре деляют фильтрованием и удаляют. Фильтрат упаривают при температуре не выраты объединяют, добавляют 1,3 л хлоше 40°С до объема 45 мл, К полученнороформа- и 1,1 л дистиллированной вому раствору прибавляют 220 мл диэтида, перемешивают и после разделения гового эфира и проводят центрифугиро•слоев нижнюю фазу отделяют и упаривание для отделения осадка при темпера- 25 вают до 100 мл при температуре не ботуре -5°С (2000 об/мин В течение 20 мин) лее 40*С. К полученному концентриро-* Полученный прозрачный раствор упариЕают ванному раствору прибавляют 2 л ацето- * при температуре не выше 40°С.Осадок лина, предварительно охлажденного до пидов растворяют в 30 мл хлороформа -20°С, перемешивают в течение 30 мин ( и наносят на колонку fЗО"2,8 см), за- зд и проводят фильтрование. Фильтрат уда-* полненную ДЭАЭ-сефадексом А-25*в баляют. К осадку прибавляют 2 л охлажратной форме и уравновешенную смесью денного ацетона и процесс повторяют .хлороформ-метанол (80:20). Колонку еще 4 раза. Полученное липидное маспоследовательно промывают смесью хло.по растворяют в 150 мл хлороформа и роформ-метанол ^80:20) в количестве П л метанола и перемешивают в течение I л 3 2 л метанола, 1,6 л смеси хлоро- 35 [2 ч при комнатной температуре, Нерастформ-метанол-уксусная кислота (50:50: (ворившийся осадок отделяют фильтрова:0,9^, собирая фракции по 400 мл, ,нием, а к фильтрату приливают 1,66 мл ^Фракции, содержащие фосфатидилэтанол-' 50%-ного раствора хлорида кадмия, инамин (по ТСХ), объединяют, добавляют .- тенсивно перемешивают и оставляют на 800 мл хлороформа и 480 мл воды. НижЛ ч при комнатной температуре для фор, ний слой промывают водой до рН промывмировання осадка. Осадок отфильтро- ^ ~ ной воды 6 с использованием бикарбо- • вывают. Фильтрат упаривают при темд ната натрия Н г бикарбоната натрия пературе не выше 40 С до объема 50 мл» в 0,5 л воды . Затем раствор обезвожи~45 К полученному раствору прибавляют вают сульфатом натрия и упаривают при 250 мл диэтилового эфира и проводят температуре не более 40°С, К полученцентрифугирование для отделения осадному липидному маслу прибавляют 10 мл ка при температуре -5°С (2000 об/мин в хлороформа и раствор лнпидов наносят течение 20 мин). Полученный прозрачна колонку с силикагелем /39»3 см), ный раствор упаривают при температууравновешенную хлороформом. Колонку 50 ре не выше 40 С. Осадок лнпидов растпоследовательно промывают 0,8 л смеворяют в 30 мл хлороформа и наносят си хлороформ-метанол ^95:5)и 4 л смена колонку (-30*2,8 см), заполненную си хлороформ-метанол-вода (65:25:4). ДЭАЭ-сефадексом А-25 в боратной форме, При помощи хроматографии в тонком уравновешенную смесью хлороформ-метаслое силикагеля обнаруживают фракции, нол (80:20), Колонку последовательно содержащие фосфатидилэтаноламин, котопромывают 1 л смеси хлороформ-метарые объединяют и упаривают при темпенол (8О:20),2 л метанола, 1,6 л смературе не более 40°С до лнпидного масси хлороформ-метанол-уксусная кислота 5 16159 '5 * ( 5 0 : 5 0 : ! ) , собирая фракции по 400 мл. нием, а к Фильтрату приливают 1,66 мл Фракции, содержащее фосфатидилэтанол50£~кого раствора хлорида кадмия, амин (по ТСХ), объединяют, добавляют интенсивно перемешивают и оставляют 800 мл хлороформа и 480 мл вода. Нижна 1 ч при комнатной температуре ним слой промывают водой до рН продля Формирования о с а д к а . Осадок о т мывной воды 6 с использованием бикарфильтровывают . Фильтрат упаривают боната натрия О г бикарбоната н а т при температуре не выше 40°С до о б ъ е рия в 0,5 л воды). Затем раствор обезма 55 мл, К полученному раствору привоживают сульфатом натрия и упаривают JQ бавляют 286 мл диэтилового эфира и при температуре не боле 40 С. К полупроводят центрифугирование для о т д е ченному липидному маслу прибавляют ления осадка при температуре -5йС 10 мл хлороформа и раствор лнпидов (2000 об/мин в течение 20 м и н ) . Полунаносят на колонку с силикагелем (39' ченный прозрачный раствор упаривают •3 с м ) , уравновешенную хлороформом. 15 при температуре не выше 40 С, Осадок Колонку последовательно промывают липидов растворяют в 30 мл хлорофор0,8 л смеси хлороформ-метанол (95:5)н ма и наносят на колонку ( 3 0 * 2 , 8 с м ) , 4 л смеси хлороформ-меташэл-воды ( 6 5 : заполненную ДЭАЭ-сефядоксом А-25 в : 2 5 : 4 ) , При помощи хроматографии в боратной форме и управновешенную сметонком слое силикагеля обнаруживают 20 сью хлоформ-метанол ( 8 0 : 2 0 ) . Колонфракции, содержание фосфатидилэтанолку последовательно промывают 1 л смеамин, которые объединяют и упаривают си хлоро&орм-метанол ( 8 0 : 2 0 ) и 2 л при температуре не более 40°С до л н метанола и 1,6 л смеси хлороформ-мепидного масла. Полученное лнпидиое танол-уксусная кислота ( 5 0 : 5 0 : 1,-1), масло сушат на глубоком вакууме (1 мм 25 собирая фракции по 400 мл, Фракции, р т . с т . ) в течение 2 ч . Выход хроматосодержание фосфатидилэтаноламин (по графически чистого фосфатидилэтаполТСХ), объединняют, добавляют 800 -чя амина 4,35 г с 1 кг мозговой ткани. хлороформа и 480 мл воды. Нижний слой промывают водой, до рН промывной воды П р и м е р З . 1 кг мозга крупного 6 с использованием бикарбоната н а т рогатого скота, предварительно очищен- 30 рия (1 г бикарбоната натрия в 0 , 5 л ного от соединительной ткани, нарезают воды). Затем раствор обезвоживают и гомогенизируют порциями по 100 г сульфатом натрия и упаривают при темв ацетоне (4 мл ацетона на 1 г т к а н и ) . пературе не более 40°С, К полученному Гомогенаты объединяют и осадок ткани липидному маслу прибавляют 10 мл хлоотделяют фильтрованием. Осадок мозго 35 роформа и раствор лнпидов наносят via вой ткани помещают в 2,7 л смеси хло колонку с силикагелем ^39 * 3 см ), у р а в ро&орм-метанол ( 2 : 1 ) и перемешивают новешенную хлороформом, Колонку пов течение 1,5 ч . Осадок отделяют следовательно промывают 0 , 8 л смеси фильтрованием и смешивают с 1,3 л смехлороформ-метанол ( 9 5 : 5 ) и 4 л смеси си хлороформ-метанол ( 1 ; 2 ) , перемеши- 40 хлороформ-метанол-вода ( 6 5 : 2 5 : 4 ) . При вают в течение I ч , а затем осадок помощи хроматографии в тонком слое отделяют фильтрованием и удаляют. силнкагеля обнаруживают фракции, с о Фильтраты объединяют, добавляют 1,3 л держащие фосфатидилзтаноламиїї, 'которые хлороформа и 1,1 л дистиллированной объединяют и уплэивают при і ^ « п е р а т у воды, перемешивают и после разделения д* ре не более 40°С до липидного масла. слоев нижнюю фазу отделяют и упариваПолученное липидное масло сушат на ют до 100 мл при температуре не более глубоком вакууме (1 мм р т . с т . ) в те~ 40°С. К полученному концентрированночение 2 ч . Выход хроматограіЬически му раствору прибавляют 2 л ацетона, чистого фосфатидилэтаноламин.1 4,4 г предварительно охлажденного до ~20 ь С, 5 Q с 1 кг мозговой ткани. перемешивают в течение 30 мин и проводят фильтрование. Фильтрат удаляютЗависимость выхода фосфатидилэта-' К осадку прибавляют 2 л охлажденноноламина в смеси суммарных фосфолипи— го ацетона и процесс повторяют еще дов при осаждении диэтиловым эфиром от 4 р а з а . Полученное липидное масло .-^ объемного отношения метаиольньій р а с растворяют в 150 мл хлороформа и 7 л метанола и перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуро» Нерастворившийся осадок отделяют фильтрооа твор лнпидов - дизтиловый эфир приведена в т а б л . 1 , t ' Как видно из т а б л . 1 , оптимальным являются отношения метанольного р а с т \ І6І59І5 высокие концентрации элюируют балластвора липидов и диэтилового эфира ( 0 , 9 ные компоненты. t, t)-(4,8-i5,2), так как использование Преимущества предлагаемого способа отношений, выходящих за указанный предел, приводит к снижению выхода ~ по сравнению с известным представлены в табл.3. фосфатидилэтаноламина» Повышение выхоФ о р м у л а и з о б р е т е н и я да при использовании отношения 1-4„6 приводит к значительному снижению в суммарных липидах фасфатидилэтаноламиСпособ получения босфатидилэтанол-» на. 10 амина путем гомогенизации тканей гоЗависимость выхода фосфатидилэталовного >юзга крупного рогатого сконоламина от объемного соотношения т а , экстракции липидов органическими элюирующеЙ смеси хроформ-метанол растворителями с последующими очистуксусная кислота приведена в табл.2. кой от балластных примесей и выдеКак видно .из табл.2, максимальное 15 лением целевого продукта колоночной количество фосфатидилэтаноламина при • хроматографией на сорбенте, о т.л^и элюировании смесью хроформ-метанол ч а ю щ и й с я тем, что, с целью уксусная кислота наблюдается при объ-* повышения выхода целевого продукта, емных соотношениях хлороформ-метанолперед хроматографией раствор липидов уксусная кислота 50:50:0,8-1,2.Иэме- 20 обрабатывают диэтиловым эфиром при нениє указанных соотношений приводит объемных соотношениях соответственно к значительному снижению выхода це^0,9-1,1): (4,8-5,2) и осадок отбрасылевого продукта - фосфатидиэтаноламивают, а элюировакие фосфатидилэтанолна, так как низкие концентрации укамина с сорбента проводят смесью' хлосусной кислоты не полностью элюируют 25 роформ ; метанол : уксусная кислота фосфатидклэтаноламин с сорбента, а 50:50: